CN102382810A - 预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵，特别是指一种预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法。包括发酵步骤，是将益生菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，发酵过程是在温度为30-37℃、pH值7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝雷丝孢酵母、淡紫拟青霉、细黄链霉菌、多粘芽孢杆菌和金龟子绿僵菌的等质量混合物，对发酵终产物吸附、固定化于草炭上制成益生菌菌剂。本发明解决了现有大棚蔬菜-黄瓜种植技术存在的重茬病、根腐病、枯萎病以及线虫病害等不足，具有生产成本低、发酵周期短、菌群密度高，可有效防止在大棚蔬菜种植过程中的死苗、黄苗、枯萎、花叶、根腐等土壤生态病状。同时，还能促进根生长、松土壮苗，降解农药、化肥残留，具有显著土壤生态修复作用。大棚黄瓜一季内可增产15-20％。
Description
所属技术领域
本发明属于微生物发酵，特别是指一种能够预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法。
背景技术
在大棚蔬菜大量种植的今天，由于大量使用化肥、农药，使得土壤生态系统受到严重破坏，再加上经济利益的驱使重茬种植普遍盛行，更使得土壤生态系统难以修复。近些年在大棚蔬菜的种植中各种病害、虫害增加，如根腐病、黄苗、花叶、枯萎病以及线虫虫害等，都是土壤生态系统遭受破坏的明证。为了改变这种现状，就必须从修复土壤生态系统入手，增加土壤中的有益菌，从而抑制那些容易感染植株病害的细菌和真菌。采用细菌-真菌联合、多菌种联合的技术方法，达到修复土壤生态系统，防止根腐病、枯萎病等重茬病，同时促进根生长，松土壮苗。益根生菌剂还具有降解农药、化肥残留污染的作用。菌剂经发酵工程完成后有效活菌数(cfu)在20亿以上即2-3×108cfu/g。采用细菌-真菌联合预防大棚黄瓜重茬病益根生菌菌剂及其高密度、高活性的生产工艺还未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种高密度、高活性的预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂制备方法。
本发明的技术设计构思是：
抗重茬益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂生产的菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的灭菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillus subtilis)、
地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝孢酵母CGMCC2.1193(←ACCC20055)(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)、多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacillus polymyxa)和金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)的等质量混合物，对发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的菌剂。
本发明中所用菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)中国科学院微生物研究所。
培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。
灭菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
所述的发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子；
C、将B步骤中制备的二级种子转接于三级扩大培养液：以5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.2-7.6；培养条件为：温度为30-37℃、发酵时间为12-24h，转速为300r/min。
所述的A步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
所述的B步骤中的二级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；
发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
所述的C步骤中的三级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；
发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间12-24h，通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
为能给所培养的菌群提供一定的营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定化较多的菌体。优选的实施方案是，所述的载体选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭。
为减少菌群的耗氧，延长保质期，防止污染。优选的实施方案是将吸附、固定化于草炭上制成的益生菌菌剂密封包装。其中更为优选的技术方案是密封包装是将益生菌菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。
本发明中各个反应步骤中培养基的灭菌采用常规灭菌方法，即压力为0.1Mpa，温度为121℃，灭菌时间为30min。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、在二、三级扩大培养时采用以可溶性淀粉培养基为主的培养基对混合后的菌种实现培养，大大降低了成本，缩短了发酵周期，提高了设备利用效率。
2、经检测，将发酵终产物(复合菌)固定化于草炭上，每克菌制剂的有效菌菌落数(cfu)可高达20亿以上(即2-3×109cfu/g)，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道。草炭不仅能为所培养菌提供一些营养成分，还由于
其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定较多的菌体。因此，一定量的有效菌菌剂一旦均匀加入黄瓜根围土壤中就可以很快形成优势菌群，发挥抗重茬、益根生的作用。
3、因土壤生态系统复杂，单一的菌或少量的菌是难以完成生态修复的。必须由细菌-真菌联合、多种菌联合，产生多种酶才能最终降解农药、化肥残留，达到松土状苗、促根生长、抗重茬病的目的。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。
实施例1
益根生菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的灭菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝孢酵母CGMCC2.1193(←ACCC20055)(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces liliacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)、多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacillus polymyxa)和金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)的等质量混合物，对发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的发酵菌剂。上述生产菌种均购于中国科学院微生物所菌种保藏中心(CGMCC)。
本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是：培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.6)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉，氮源选用玉米粉与硝酸盐的混悬液。
培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
所述的发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子；
C、将B步骤中制备的二级种子接于三级扩大培养液：以5％-10％的接种量转接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物，
发酵终点用分光光度法测定吸光值最大或用血球计数板显微计数法菌群数最大为发酵终点；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为32℃、pH值为7.4，发酵时间15h，通风量为8m3/h、搅拌转速为200转/min。
所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.4；培养条件为：温度为30℃、发酵时间20h，转速为200r/min。
所述的A、B、C步骤中的培养基的灭菌条件是：压力0.1MPa、温度121℃、时间30min。
所述的B、C步骤中的二、三级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；
发酵过程中培养温度为32℃、pH值7.4、发酵时间15h、通风量8m3/h、搅拌转速200r/min。
所述的载体选用占发酵终产物总质量5倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于草炭上，过筛。
将吸附、固定化于草炭上制成的益生菌菌剂密封包装，密封包装是将益根生菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。
实验效果：取上述制备的菌剂65kg，穴施于大棚黄瓜6500棵(约1亩)，平均每棵施10g菌剂直接加于黄瓜苗的根区。种植8个月(1季)后，与对照区相比，未发生任何霉菌病、烂根病和黄萎病等重茬病，检查根区土壤pH值仍在7.2左右，由土壤根结线虫形成的根部瘤状物显著减少，土壤线虫减少到0-1条/克土(比重-离心法)。黄瓜增产15-18％。
实施例2
益根生菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将益根生菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30℃、pH值为7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝孢酵母CGMCC2.1193(←ACCC20055)(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyceslilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)、多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacillus polymyxa)和金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)
本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是：
培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.6)为基本培养基，其中碳源选用马铃薯淀粉，氮源选用马铃薯淀粉与硝酸盐的混合物。
培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
所述的发酵过程包括下列工艺步骤：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子；
C、将B步骤中制备的二级种子接于三级扩大培养液：以10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物，发酵终点用分光光度法测定
吸光值最大或用血球计数板显微计数法菌群数最大为发酵终点；
其中步骤B、C的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的马铃薯淀粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐殖酸；发酵过程中培养温度为30℃、pH值为7.6、发酵时间为12h、通风量为10m3/h、搅拌转速为300r/min。
所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.6；培养条件为：温度为30℃、发酵时间为12h，转速为300r/min。
所述的A、B、C步骤培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
发酵过程中培养温度为30℃、pH值为7.6、发酵时间为15h、通风量为10m3/h、搅拌转速为300r/min。
所述的载体选用占发酵终产物总质量4倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于草炭上。
将吸附、固定化于草炭上制成的益根生菌剂密封包装，密封包装是将菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。
实验效果：取上述制备的菌剂65kg，穴施于大棚黄瓜6500棵(约1亩)，平均每棵施10g菌剂直接加于黄瓜苗的根区。种植8个月(1季)后，与对照区相比，未发生任何霉菌病、烂根病和黄萎病等重茬病，检查根区土壤酸碱度仍在中性左右(长期种植土壤会偏酸)，由土壤根结线虫形成的根部瘤状物显著减少，土壤线虫减少到0-1条/克.土(比重-离心法)。黄瓜增产15-20％。
Claims (9)
1.预防大棚黄瓜重茬病益生菌菌剂的制备方法，包括发酵步骤，是将抗重茬病益生菌菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，其特征在于所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1700(Bacillussubtilis)，地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)，贝雷丝孢酵母CGMCC2.1193(←ACCC20055)(Trichosporon behrendii)，淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)，细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)多粘芽孢杆菌CGMCC1.516(Paenibacilluspolymyxa)，金龟子绿僵菌CGMCC3.5672(Metarhizium anisopliae)的等质量混合菌液，将发酵终产物吸附、固定化于草炭上制成的菌剂。
2.根据权利要求1所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述的灭菌培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.6)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述的无菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
4.根据权利要求1所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述的发酵工程过程包括下列工艺步骤：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养制成二级种子；
C、将B步骤中制备的二级种子转接于三级扩大培养液：以5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物，发酵终点用分光光度法测定以吸光值最大或用血球板计数板显微计数法以菌群数最多为发酵终点；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值7.2-7.6、发酵时间12-24h，通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
5.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法，其特征在于所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值7.2-7.6；培养条件为：温度为30-37℃、发酵时间12-24h，转速为200-300r/min。
6.根据权利要求4所述的菌制剂的制备方法，其特征在于所述的A、B、C步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
7.根据权利要求4所述的菌制剂的制备方法，其特征在于所述的C步骤中的三级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；
发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.2-7.6、发酵时间12-24h，通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
8.根据权利要求1所述的发酵菌剂的制备方法，其特征在于所述的载体选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于载体上。
9.根据权利要求1或8所述的发酵菌剂的制备方法，其特征在于将吸附、固定化于草炭上制成的发酵菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。
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