CN102210332A - 促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促生根抗重茬香蕉土壤生态修复微生物菌剂及其制备方法，该微生物菌剂是将生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中在温度为30-37℃、pH值7.4-7.6的条件下进行好氧发酵，分别经一级扩大培养，将一级扩大培养液等质量混合，再进行二级、三级扩大培养，最后将发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的菌剂，生产菌种选用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贝雷丝酵母、淡紫拟青霉、细黄链霉菌、和多粘芽孢杆菌。本发明的微生物菌剂可有效防止在香蕉种植过程中的死苗、黄苗、枯萎、叶斑、根腐等土壤生态病状，生产成本低、发酵周期短、菌群密度高，还能促进根生长、松土壮苗，解除农药、化肥残留污染，具有土壤生态修复作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
在云南香蕉大量种植的今天，由于过量和不正确使用化肥、农药，使得土壤生态系统受到严重破坏，再加上经济利益的驱使重茬种植普遍盛行，更使得土壤生态系统损伤严重难以修复。近些年在香蕉的种植中各种病虫害增加，如根腐病、黄苗、叶斑病、枯萎病、黑星病以及根线虫虫害等，都是土壤生态系统遭受破坏的证明。
发明内容
本发明目的在于提供一种促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂及其制备方法，是一种高密度、高活性的促生根、抗重茬香蕉土壤生态修复微生物菌剂及制备方法。本发明采用细菌-真菌联合、多菌种联合的技术方法，以菌治菌，从修复土壤生态系统入手，增加土壤中的有益菌，从而抑制那些容易感染植株病害的细菌和真菌，达到修复土壤生态系统，防止根腐病、枯萎病等重茬病，同时促进根生长，松土壮苗，还具有降解农药、化肥残留污染的作用。菌剂生产完成后有效活菌数(cfu)在20亿以上即2-3×109cfu/g。
本发明的目的是这样实现的：
促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，是将促生根、抗重茬香蕉土壤生态修复微生物菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的灭菌培养基中在温度为30-37℃、pH值为7.4-7.6的条件下进行好氧发酵，分别经一级扩大培养，将一级扩大培养液等质量混合，再进行二级、三级扩大培养，最后将发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的菌剂，生产菌种选用枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌CGMCC1.1061(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝酵母CGMCC2.1193(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Stre ptomyces microflavus)和多粘芽孢杆菌CGMCC1.1516(Paenibacillus polymyxa)。
本发明上述的生产菌种均购于中国科学院微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。无毒、无害、无残留。
灭菌培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。
灭菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
本发明的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂的制备方法包括下列工艺过程：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养；
C、将B步骤中制备的二级扩大培养液接于三级扩大培养基：发酵培养基的体积比为5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物；
D、将发酵终产物吸附、固定化于载体上；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用3％玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐殖酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.4-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.4-7.6；培养条件为：温度为30-37℃、发酵时间为12-24h，转速为300r/min。
所述的A步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
所述的B步骤中的二级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发 酵培养基中的可溶性淀粉采用等质量的玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐殖酸；
发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.4-7.6、发酵时间为12-24h、通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
为能给所培养的菌群提供一定的营养成分，增加保质期，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定化较多的菌体。优选的实施方案是，所述的载体选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭。
为减少菌群的耗氧，增加保质期，防止污染。优选的实施方案是将吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌剂密封包装。其中更为优选的技术方案是密封包装是将微生物菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。
本发明中各个反应步骤中培养基的灭菌采用常规灭菌方法，即压力为0.1Mpa，温度为121℃，灭菌时间为30min。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、在二级扩大培养时采用以3％玉米粉取代可溶性淀粉培养基中的可溶性淀粉，对混合后的菌种实现扩大培养，大大降低了成本，缩短了发酵周期，提高了设备利用效率。
2、经检测，将发酵终产物(复合菌)固定化于草炭上，每克菌制剂的有效菌菌落数(cfu)可高达20亿以上(即2-3×109cfu/g)(常规的稀释平板法)，至今还未见如此高含菌量菌制剂的报道。草炭不仅能为所培养菌提供一些营养成分，还由于其网状结构，具有较大的比表面积，所以能在单位体积内附着、吸附固定化较多的菌体。因此，一定量的有效菌菌剂一旦均匀加入根围土壤中就可以很快形成优势菌群，发挥促生根、抗重茬、益生的作用。
3、因土壤生态系统复杂，单一的菌或少量的菌是难以完成修复的。必须由细菌-真菌联合、多种菌联合，产生多种酶才能最终降解农药、化肥残留污染，达到松土状苗、促根生长、抗重茬病的目的。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准。
实施例1
促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，是将微生物菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，各菌种先经一级扩大培养，然后等质量混合，再经二级、三级扩大培养，最后将发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的微生物菌剂。所述的发酵过程是在温度为30-37℃、pH值为7.4-7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌CGMCC11061(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝酵母CGMCC2.1193(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paeeilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)和多粘芽孢杆菌CGMCC1.1516(Paen ibacillus polymyxa)，上述生产菌种均购于中国科学院微生物所菌种保藏中心(CGMCC)。
本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是：无菌培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中用3％玉米粉替代可溶性淀粉。
无菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
所述的发酵过程包括下列工艺过程：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养；
C、将B步骤中制备的二级扩大培养液接于三级扩大培养基：发酵培养基的体积比为10％的接种量接入发酵培养基，进行好氧发酵制成发酵终产物，发酵终点用分光光度法测定吸光值最大或用血球板显微计数法菌群数最大为发酵终点；
D、将发酵终产物吸附、固定化于载体上；
其中步骤B的发酵过程中培养温度为35℃、pH值为7.4，发酵时间15h，通风量为8m3/h、搅拌转速为200转/min。，培养基的pH值为7.4；
所述的A、B、C步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1MPa、温度为121℃、时间30min。
所述的载体选用占发酵终产物总质量5倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于草炭上。
将吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌剂密封包装于内衬聚乙烯的包装内。室温下，保质期18个月。
实施例2
促生根抗重茬香蕉土壤生态修复微生物菌剂，是将微生物菌剂的生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行发酵，所述的发酵过程是在温度为30℃、pH值为7.6的条件下进行的好氧发酵，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC11061(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacilluslich eniformis)、贝雷丝酵母CGMCC2.1193(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)、和多粘芽孢杆菌CGMCC1.1516(Paenibacillus polymyxa)。
本实施例中所涉及的具体的工艺步骤和工艺参数是：
无菌培养基以可溶性淀粉培养基(可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4)为基本培养基，其中选用3％玉米粉代替可溶性淀粉。
无菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
所述的发酵过程包括下列工艺过程：
A、将保存的各斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子(每株菌各300mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养；
C、将B步骤中制备的扩大培养液接于三级扩大培养基：发酵培养基的体积比为5％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物，发酵终点用分光光度法测定吸光值最大或用血球板显微计数法菌群数最大为发酵终点；
D、将发酵终产物吸附、固定化于载体上；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用4％玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐殖酸；发酵过程中培养温度为30℃、pH值为7.6、发酵时间为12h、通风量为10m3/h、搅拌转速为300r/min。
所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值为7.6；培养条件为：温度为30℃、发酵时间为12h，转速为300r/min。
所述的A、B、C步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
所述的载体选用占发酵终产物总质量4倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于草炭上。
将吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内。室温下，保质期18个月。
Claims (9)
1.一种促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂及其制备方法，其特征在于：该微生物菌剂是将生产菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中在温度为30-37℃、pH值为7.4-7.6的条件下进行好氧发酵，分别经一级扩大培养，将一级扩大培养液等质量混合，再进行二级、三级扩大培养，最后将发酵终产物吸附、固定化于载体上制成的微生物发酵菌剂，生产菌种选用枯草芽孢杆菌CGMCC1.1061(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌CGMCC1.91(Bacillus licheniformis)、贝雷丝酵母CGMCC2.1193(Trichosporon behrendii)、淡紫拟青霉CGMCC3.4034(Paecilomyces lilacinus)、细黄链霉菌CGMCC4.891(Streptomyces microflavus)和多粘芽孢杆菌CGMCC1.1516(Paenibacillus polymyxa)。
2.根据权利要求1所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，其特征在于：所述的无菌培养基以可溶性淀粉培养基为基本培养基，可溶性淀粉培养基的配方为：可溶性淀粉20.0g，硝酸钾1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.4，其中碳源选用玉米粉或可溶性淀粉中的一种，氮源选用可溶性淀粉与硝酸盐的混合或玉米粉与硝酸盐的混合中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，其特征在于：所述的无菌培养基中还添加占培养基总质量0.5％的腐植酸。
4.根据权利要求1所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括下列工艺过程：
A、将保存的斜面菌种先用平板划线法活化后，挑取单菌落，分别经试管、三角瓶扩大培养制成一级种子液(每株菌各300-400mL)；
B、将A步骤中制备的一级种子液进行等质量混配，对混配后的种子液进行二级扩大培养；
C、将B步骤中制备的二级扩大培养液接于三级扩大培养基：发酵培养基的体积比为5％-10％的接种量接入发酵培养基进行好氧发酵制成发酵终产物，发酵终点用分光光度法测定吸光值最大或用血球 板显微计数法菌群数最大为发酵终点；
D、将发酵终产物吸附、固定化于载体上；
其中步骤B的发酵培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用3％玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值7.4-7.8、发酵时间12-24h，通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
5.根据权利要求4所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述的A步骤一级种子的制备过程中的培养基采用可溶性淀粉培养基，培养基的pH值7.4-7.8；培养条件为：温度为30-37℃、发酵时间12-24h，转速为200-300r/min。
6.根据权利要求4所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述的A、B、C步骤中的培养基的灭菌条件是：压力为0.1Mpa、温度为121℃、时间30min。
7.根据权利要求4所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述的B步骤中的二级扩大培养培养基采用可溶性淀粉培养基，发酵培养基中的可溶性淀粉采用3％玉米粉替代，发酵培养基中加入占培养基总质量0.5％的腐植酸；发酵过程中培养温度为30-37℃、pH值为7.4-7.8、发酵时间12-24h，通风量为8-10m3/h、搅拌转速为200-300r/min。
8.根据权利要求1所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，其特征在于：所述的载体选用占发酵终产物总质量4-5倍的草炭，将发酵终产物-菌液直接喷洒、搅拌于载体草炭上。
9.根据权利要求1或8所述的促生根抗重茬香蕉种植土壤生态修复微生物菌剂，其特征在于：将吸附、固定化于草炭上制成的微生物发酵菌剂密封于内衬聚乙烯的包装袋内，室温下，保质期18个月。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111012 |