CN104531588A - 一种防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌株、包括该菌株的微生物有机肥料、生产方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业集约化生产技术领域，提供一种综合防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌SQR-7、用其制成的微生物有机肥料，以及在防控连作烟草青枯病中的应用。SQR-7菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2013年4月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.7497。包括该菌株的微生物有机肥料，对烟草青枯病的生物防治率达80％以上。结合土壤化学改良剂预处理土壤，对连作土壤进行消毒，降低病原菌数量，既改善了土壤微生物区系，抑制病原菌的生长，也促进了烟草的生长，大大提高了烟草的抗病能力。

Description

一种防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌株、包括该菌株的微生物有机肥料、生产方法及应用

技术领域

本发明属于农业集约化生产技术领域，涉及一种综合防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌SQR-7、用其制成的微生物有机肥料，以及在防控连作烟草青枯病中的应用。

背景技术

烟草是我国主要的经济作物。烟草青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害，是烟草的主要病害之一，危害严重，谓之“烟癌”，广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区。在中国，此病在河南、山东、江苏、云南、广西、河北、湖南、广东、福建等烟区普遍发生，发病严重时产量损失80％左右，成为影响我国烟草产量及质量的罪魁祸首之一。烟草青枯病致病菌(Ralstonia solanacearum)能通过土壤、流水(灌溉等)、种子等方式传播，对环境有很强的适应能力。青枯菌侵染初期，植株表现为生长受限，矮小，畸形，易感病，在高温高湿的条件下，病害发展迅速，发病严重的田块发病率达100％，造成绝收。大量的使用化学农药造成对生态环境的破坏，而目前还没有有效的化学农药防治烟草青枯病。生物防控结合农艺措施的综合措施对青枯病的防控及保护环境都具有重要的作用。

另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥产品的原料；大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)流失于土壤-植物系统之外，明显地削弱了我国农业可持续发展的能力。如将这些固体有机废弃物制成商品有机肥，再施入土壤，必将提高土壤肥力，促进农业生产。如果将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用于功能菌的载体，也有利于功能菌在土壤中的定殖，发挥其作用，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中，烟草青枯病防治效果不明显，并且化学防治剂破坏环境等问题，提供一种使用高效拮抗菌SQR-7、用其制成的微生物有机肥料、结合土壤预处理的综合方法，防治效率达到80％以上，确保烟草种植业的可持续发展。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一种防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌株SQR-7，该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2013年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.7497，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该菌株主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，芽孢为椭圆形，菌落周边不规则，不透明，表面有褶皱，具运动性。发酵葡萄糖、麦芽糖、木糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、V-P(Voges-Proskauer)反应、吲哚反应均为阳性，而甲基红反应、丙二酸利用、酒石酸盐利用、硫化氢产生均为阴性，最适生长温度30℃，最适pH为7.0。

2.本发明还提供用上述1提供的高效拮抗菌生产的微生物有机肥料。

3.用上述1提供的菌株生产的微生物有机肥料，该肥料中包括有1×10⁸个/g以上的拮抗菌SQR-7、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％，有机质质量比含量为30～35％。

4.上述3提供的微生物有机肥的生产方法，其包括如下步骤：

1)将上述1提供的菌株SQR-7接种于NA培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，通气量范围为30～100％，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，形成SQR-7液体菌剂，该菌剂中含菌或芽孢量≥1×10⁹个/ml；

2)将SQR-7液体菌剂按20L/吨的量接种到有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为防除连作烟草青枯病的微生物有机肥料；其中， 有机肥由腐熟的牛粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物按照质量比1∶1混合组成。

5.上述4提供的微生物有机肥料的生产方法，其中，步骤(1)所用NA培养液配制方法为：以配制1L培养基为例，葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，酵母提取物0.5g溶于少量水，定容至1L，pH值调至7.0-7.2，121℃灭菌20min。

6.上述5提供的微生物有机肥料的生产方法，其中，步骤(2)所用腐熟后的牛粪堆肥发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

7.本发明还提供上述1提供的高效拮抗菌株SQR-7在防控连作烟草青枯病中的应用。

8.本发明还提供上述2或3提供的微生物有机肥料在防控连作烟草青枯病中的应用。

9.本发明还提供一种防控连作烟草青枯病的土壤预处理方法，该方法为用碳酸氢铵325kg/公顷和生石灰750kg/公顷，均匀撒在土壤表层，浇透水，附上农用薄膜，薄膜四周用土壤覆盖以防漏气，预处理土壤10天后，揭开薄膜翻耕土壤，晾晒。

9.本发明还提供上述2或3提供的微生物有机肥料在防控连作烟草青枯病中的使用方法，其步骤为：(1)土壤预处理：以上述9所述的方法预处理土壤；

(2)施加微生物有机肥料：烟苗移栽时，以每株烟苗100g的量向步骤1预处理后的土壤施加上述2或3提供的微生物有机肥。

本发明的有益效果：

1.本发明为一种能克服或消除连作烟草青枯病的综合防控措施和方法。

其中微生物有机肥料与目前市场上的产品相比具有如下优点：

1)该肥料产品中含有抑制烟草青枯病病原菌生长的高效菌株即解淀粉芽孢杆菌SQR-7。试验结果表明，在连作烟草土壤上施用本产品结合土壤预处理后，烟草青枯病的生物防治率达80％以上。

2)该肥料为有机肥，含有丰富的有机质(含量30-35％)，有机氮含量为4％，而且大部分为氨基酸和小分子多肽，易于被植物吸收利用。本产品总磷含量为4％，大多数为有效磷，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。相比之下，含磷化肥施入土壤后生物有效性较差。有机肥料中含有的丰富营养也 为其中的拮抗菌提供了生长繁殖的条件，使在土壤中易于定殖，从而发挥防病作用。

3)由于是微生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列环境污染问题，因而有利于烟草的无公害生产，农民可以不用或少用化学农药，节省开支。同时，该微生物肥料还有增产功能，可为农民增加收入。

2.本发明还包括一种用土壤化学改良剂预处理土壤的方法，利用农用碳酸氢铵和生石灰对连作土壤进行消毒，降低病原菌数量，具有成本低，方便获得，消毒效果良好的优点。

3.本发明综合利用土壤化学改良剂和微生物有机肥，能显著抑制病原菌的生长，改良土壤微生物区系，增加拮抗微生物在根围的定殖能力，从而更有效地防控烟草青枯病。

附图说明

图1拮抗菌SQR-7拮抗烟草青枯菌的对峙图

图2盆栽试验防控效果

T1：按常规施用当地烟草专用无机复合肥，作为对照组；

T2：在T1的基础上加100g/株的普通有机肥；

T3：在T1的基础上加100g/株的微生物有机肥；

T4：移栽前用碳酸氢铵和生石灰预处理土壤，用薄膜覆盖10天，揭膜使土壤透气3天，用化肥补足与T1相同的N、P、K量；

T5：在移栽前对土壤用石灰和碳酸氢铵进行土壤预处理，用薄膜覆盖10天，揭膜使土壤透气3天，用化肥补足与T1相同的N、P、K量，再加100g/株微生物有机肥。

图3：大田试验防控效果

T1、T2、T3、T4、T5处理如盆栽试验

图4：土壤预处理对土壤pH的影响

图5：不同处理条件下青枯菌数量变化

BP：移栽前；TD：土壤消毒10天后

T1、T2、T3、T4、T5处理如盆栽试验

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

防控连作烟草青枯病的微生物有机肥料的生产

(一)菌株的分离和鉴定

采集已经发生连作障碍并出现严重青枯病病症的烟草植株和根际土壤，样品低温保存，采用Kelman’s TTC Agar选择培养基分离病原菌---茄科劳尔氏菌(Ralsotnia solanacearum)。然后以茄科劳尔氏菌为指示菌，采集连作烟草青枯病发病田块中的健康植株的根际土壤，分离拮抗菌。再通过盆栽试验最终复筛出高效拮抗菌株SQR-7，菌种在30％甘油中-70℃保存。

菌株SQR-7的主要生物学特性为：革兰氏染色阳性G⁺，细胞形状为杆状，具运动性，形成椭圆形芽孢，菌落周边不规则，不透明，表面有褶皱，如图1所示。发酵葡萄糖、麦芽糖、木糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇产酸，能水解淀粉和液化明胶，接触酶、柠檬酸盐利用、硝酸盐还原反应、V-P(Voges-Proskauer)反应、吲哚反应均为阳性，而甲基红反应、丙二酸利用、酒石酸盐利用、硫化氢产生均为阴性，最适生长温度30℃，最适pH为7.0。经生理生化特性和16S rRNA基因序列分析，SQR-7属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。2013年4月19日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.7497。

(二)菌剂生产

1)将菌株SQR-7接种于NA培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，通气量范围为30～100％，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，形成SQR-7拮抗菌菌液，其中，拮抗菌细胞和芽孢总量≥1×10⁹个/ml；

所用NA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨l0g，酵母提取物0.5g溶于少量水，定容至1L，pH值调至7.0-7.2，121℃灭菌20min。

2)将SQR-7拮抗菌菌液按20L/吨的量接种到有机肥(由腐熟的牛粪堆肥 和菜粕的微生物酶解混合物按照质量比1_∶1组成)中进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度30-55℃，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，即为含有拮抗菌SQR-7的微生物有机肥。

其中所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

其中菜粕的微生物分解混合物制备方法为(公知公用，见发明专利ZL200610086126.0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)，菌株SQR-7发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量55-65％和pH6.0-7.5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50℃时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50℃共5天，每次翻堆时调节含水量和pH，使它们分别维持在55-65％和6.0-7.0，发酵终止时进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕的微生物分解混合物，其为含氨基酸的混合材料。

用上述拮抗菌所生产的微生物有机肥即为防控连作烟草青枯病的微生物有机肥料，该肥料中含有1×10⁸个/g以上的拮抗菌SQR-7、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％、有机质质量比含量为30～35％。

实施例2

烟草青枯病的防控试验

(一)土壤预处理方法

用碳酸氢铵325kg/公顷(＝67.4kg N)和生石灰750kg/公顷，均匀撒在连作土壤表层，浇透水，附上农用薄膜，四周用土覆盖以防漏气。预处理土壤10天后，揭开薄膜翻耕土壤，晾晒。

(二)微生物有机肥的使用

土壤预处理后，烟苗移栽时，以每株烟苗100g的量，采用穴施施加上述微生物有机肥。

(三)盆栽实验

供试土壤为烟草连作土，青枯病发病严重。烟草为青枯病敏感型“红花大金元”。分5个处理，分别如下：

1)T1：按常规施用当地烟草专用无机复合肥，作为对照组；

2)T2：在T1的基础上加100g/株的普通有机肥；

3)T3：在T1的基础上加100g/株的微生物有机肥；

4)T4：移栽前用碳酸氢铵和生石灰预处理土壤，用薄膜覆盖10天，揭膜使土壤透气3天，用化肥补足与T1相同的N、P、K量；

5)T5：在移栽前对土壤用石灰和碳酸氢铵进行土壤预处理，用薄膜覆盖10天，揭膜使土壤透气3天，用化肥补足与T1相同的N、P、K量，再加100g/株微生物有机肥。每处理10个重复，每重复10kg病土/盆。

结果如表1，烟草自移栽100天后，对照(T1)病情指数达到82.5％，施用微生物有机肥(T3)可以显著降低烟草青枯病的发病率，其防治效果达到66.7％。用石灰-薄膜覆盖处理(T4)，防治效果达到81.8％。而土壤先用石灰-碳铵-薄膜覆盖处理后再施用微生物有机肥的处理(T5)，表现出最好的防治效果达到87.9％。表明对于土传病害严重的土壤，先进行土壤预处理，然后再施用微生物有机肥能有效控制连作土壤烟草青枯病的发生(图2)。

烟草青枯病病情级数(以烟草病情分级行业标准划分)：0级：全株无病；1级：茎部偶有退绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎；2级：茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎；3级：茎部黑色条斑到达烟株顶部，或发病一侧三分之二以上叶片萎焉；4级：病株基本枯死。

病情指数＝[∑(病情级数×此级菌株数)/(最高级数×总株数)]×100％。

防病效果＝100×(对照病情指数-处理感病指数)/对照病情指数

表1不同处理对烟草青枯病的防治效果(100天)

(四)田间试验

2011年至2012年，进行了2年的大田试验。试验地位于贵州省福泉市龙场镇皂角井村一块青枯病发病严重的大田。试验设5个处理，具体处理同盆栽试验，每个处理3个重复，每个重复60株烟，总计180株烟，随机区组排列。移栽前 采用穴施添加微生物有机肥(每株烟苗100g)。

土壤碳酸氢铵和生石灰浇水覆膜预处理后，土壤pH显著增加，原始pH为6.56，预处理10天后，增加至7.85，如图4所示。

两年大田试验结果表明，综合防控措施(T5)可以显著地减少大田青枯病害的发生，防控效果均高于80％，显著优于单独施加生物有机肥或土壤化学改良剂，如表2所示。

表2大田不同处理对烟草青枯病的防治效果(5周)

田间试验结果表明，使用土壤化学改良剂消毒土壤能显著降低青枯菌的数量，如图5所示，移栽前土壤青枯菌数量为3.34log拷贝数/g土，消毒10天后，数量下降至2.77log拷贝数/g土。在整个烟草生育期中，综合防控处理(T5)始终显著抑制了青枯菌在植株根际的生长。

本发明专利研制出一种能显著防控连作烟草青枯病发生的综合防控方法，包括微生物有机肥料产品和两种化学改良剂的应用，防治率达80％以上(两年贵州大田试验)。本方法的作用机制在于土壤改良剂的预处理病土，有效降低了病原菌的数量，然后再使用含有拮抗菌的微生物肥料进一步抑制病原菌的生长。微生物有机肥中丰富的营养改善了土壤微生物区系，也有利于拮抗菌的定殖，从而抑制病原菌的生长；另一方面，微生物有机肥中丰富的营养也促进了烟草的生长，大大提高了烟草的抗病能力。

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种防控连作烟草青枯病的高效拮抗菌株SQR-7，该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，于2013年4月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.7497。

2.用权利要求1所述的高效拮抗菌生产的微生物有机肥料。

3.用权利要求1所述菌株生产的微生物有机肥料，其特征在于：该肥料中包括有1×10⁸个/g以上的拮抗菌SQR-7、全氮质量比含量为4～5％，全氮中质量比90％以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6～10％，有机质质量比含量为30～35％。

4.权利要求3所述微生物有机肥的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的菌株SQR-7接种于NA培养液，进行液体发酵生产，其发酵条件为：初始pH范围为7.0-7.2，培养温度30℃，通气量范围为30～100％，170转/分钟，发酵中后期形成芽孢，形成SQR-7液体菌剂，该菌剂中含菌或芽孢量≥1×10⁹个/ml；

2)将SQR-7液体菌剂按20L/吨的量接种到有机肥中进行固体发酵，发酵温度为30-50℃，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7天后结束，使拮抗菌含量达到1×10⁸个/g以上，最后在温度不超过60℃的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30％以下，包装出厂即为防控连作烟草青枯病的微生物有机肥料；其中，有机肥由腐熟的牛粪堆肥和菜粕微生物酶解混合物按照质量比1∶1混合组成。

5.权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其特征在于，步骤1所用NA培养液配制方法为：以配制1L培养基为例，葡萄糖10g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，酵母提取物0.5g溶于少量水，定容至1L，pH值调至7.0-7.2，121℃灭菌20min。

6.权利要求5所述微生物有机肥料的生产方法，其特征在于：步骤2所用腐熟后的牛粪堆肥其发芽指数为98％以上，有机质质量比含量≥35％，有机氮质量比含量为1.2-2％，含水量质量比25-30％。

7.权利要求1所述的高效拮抗菌株SQR-7在防控连作烟草青枯病中的应用。

8.权利要求2或3所述的微生物有机肥料在防控连作烟草青枯病中的应用。

9.一种防控连作烟草青枯病的土壤预处理方法，其特征在于：用碳酸氢铵325kg/公顷和生石灰750kg/公顷，均匀撒在土壤表层，浇透水，附上农用薄膜，薄膜四周用土壤覆盖以防漏气，预处理土壤10天后，揭开薄膜翻耕土壤，晾晒。

10.权利要求2或3所述的微生物有机肥料在防控连作烟草青枯病中的使用方法，其特征在于：(1)土壤预处理：以权利要求9所述方法对土壤进行预处理；

(2)施加微生物有机肥料：烟苗移栽时，以每株烟苗100g的量向步骤1预处理后的土壤施加权利要求2或3所述的微生物有机肥。