CN103966126A - 一种枯草芽孢杆菌及微生物菌剂和它们在生态修复中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为CCTCC NO：M2013498。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到：(1)将本发明如上所述的枯草芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。本发明还提供了如上所述的枯草芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在生态修复中的用途。通过上述技术方案，本发明能够显著的促进绿化植物的根系生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了边坡的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，含有该枯草芽孢杆菌的微生物菌剂以及它们在生态修复中的用途。
背景技术
生态修复是指停止对生态的干扰和破坏，利用生态系统的自我恢复能力，辅以人工措施，使遭到破坏的生态系统逐步恢复或使生态系统向良性循环方向发展的过程。
生态修复中比较重要的一部分工作是边坡治理工作，边坡治理主要工作就是要稳定边坡。该过程的任务是清除危石、降坡削坡，将未形成台阶的悬崖尽量构成水平台阶，把边坡的坡度降到安全角度以下，以消除崩塌隐患；之后就要对已经处理的边坡进行复绿，使其进一步保持稳定。
在对边坡的复绿过程中，常用的植物包括胡枝子(Lespedeza bicolorTurcz.)和/或紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)等灌木，但是在实际使用过程中发现上述植物的根系的发达程度不高，难以进一步保持边坡的稳定性。
发明内容
本发明的发明人分离了一株枯草芽孢杆菌，发现其能够显著的促进胡枝子和紫穗槐的根系生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了边坡的稳定性，由此得到了本发明。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为CCTCC NO：M2013498。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到：将本发明如上所述的枯草芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。
本发明还提供了如上所述的枯草芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在生态修复中的用途。
通过上述技术方案，本发明能够显著的促进绿化植物的根系生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了边坡的稳定性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是本发明的发明人从天津静海县的土壤样本中分离的纯培养物，其保藏编号为CCTCC NO：M2013498，保藏日期为2013年10月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于中国武汉武汉大学，分类命名为Bacillus subtilis。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为CCTCC NO：M2013498。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到：将本发明如上所述的枯草芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。
其中，步骤(1)中，种子液中的活菌浓度没有特别的限制，可以为枯草芽孢杆菌培养过程中常用的浓度，例如可以为(5-50)×109CFU/mL。其中，培养的条件没有特别的限制，培养的条件使得种子液中的活菌浓度可以为(5-50)×109CFU/mL，例如，培养的温度可以为28-35℃，培养的时间可以为10-40小时。在培养的过程中，可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。
其中，发酵的条件和发酵后的物料中的活菌浓度没有特别的要求，可以为枯草芽孢杆菌发酵过程中常用的条件和浓度，作为本发明优选的一种实施方式，步骤(2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为(5-500)×108CFU/mL，在该优选实施方式中的活菌浓度下，获得的发酵后的物料作为微生物菌剂使用，能够更好地在边坡土壤中定植并建立微环境。例如发酵的时间可以为20-200小时，温度可以为28-36℃。
其中，所述液态培养基可以为常规的各种能够培养枯草芽孢杆菌的液态培养基，例如包括但不限于牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
其中，所述固态培养基可以为常规的各种能够发酵扩大枯草芽孢杆菌数目的固态培养基，例如所述固态培养基可以含有秸秆、木屑、豆饼粉、面粉、淀粉、米糠和麸皮中的至少一种；且所述固态培养基还可以含有2-10g/kg的磷酸二氢钾和1-10g/kg的硫酸亚铁，以补充枯草芽孢杆菌快速生长时所需的无机盐。
其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述固态培养基含有400-700g/kg的秸秆、100-300g/kg的豆饼粉、2-10g/kg的磷酸二氢钾和1-10g/kg的硫酸亚铁。其中，该固态培养基还可以含有余量的水和/或其它成分。在该优选方式中，一方面能够让枯草芽孢杆菌在发酵过程中快速生长，另一方面获得的发酵后的物料作为微生物菌剂使用，能够更好地在边坡土壤中定植并建立微环境。
其中，秸秆可以粉碎为能用于发酵的常规的大小，例如长度可以为5-10mm，宽度可以为3-8mm，厚度可以为3-8mm。秸秆可以为为各种来源的秸秆，例如包括玉米秸秆、高粱秸秆、水稻秸秆、小麦秸秆和大豆秸秆中的至少一种。
其中，发酵后的物料可以直接作为微生物菌剂使用，也可以通过包括干燥和/或造粒等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂使用。
本发明还提供了如上所述的枯草芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在生态修复中的用途。
其中，在本发明的一种优选的实施方式中，将如上所述的枯草芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂在生态修复中用于构建边坡。
其中，在本发明特别优选的一种优选的实施方式中，在边坡基础上铺设袋装土壤，所述袋装土壤包括柔性袋体和容纳在该柔性袋体内部的土壤，并且在所述袋装土壤上种植植物；其中，在容纳于所述柔性袋体内部的土壤中掺入如上所述的枯草芽孢杆菌或如上所述的微生物菌剂；所述植物包括胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和/或紫穗槐(Amorpha fruticosaLinn.)。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明本发明的枯草芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CCTCC NO：M2013498的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35℃和80转/分振荡下培养至活菌浓度为1010CFU/mL，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液均匀地淋洒到100kg发酵培养基中(发酵培养基含有600g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30℃下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
实施例2
本实施例用于说明本发明的枯草芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CCTCC NO：M2013498的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35℃和80转/分振荡下培养至活菌浓度为5×109CFU/mL，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液均匀地淋洒到100kg发酵培养基中(发酵培养基含有500g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、200g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30℃下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的枯草芽孢杆菌的活菌数为109CFU，所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
实施例3
本实施例用于说明本发明的枯草芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CCTCC NO：M2013498的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在32℃和100转/分振荡下培养至活菌浓度为2×109CFU/mL，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液均匀地淋洒到100kg发酵培养基中(发酵培养基含有450g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、150g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30℃下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的枯草芽孢杆菌的活菌数为5×108CFU，所得到的发酵后的物料即为本实施例的微生物菌剂。
对比例1
将购自ATCC的商品号为23857TM的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在35℃和80转/分振荡下培养至活菌浓度为1010CFU/mL，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液均匀地淋洒到100kg发酵培养基中(发酵培养基含有600g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)，翻拌均匀后在30℃下发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每千克固体培养基中的枯草芽孢杆菌的活菌数为1010CFU，所得到的发酵后的物料即为本对比例的微生物菌剂。
测试实施例1
本测试实施例在室外盆栽实验中测定本发明的微生物菌剂在促进胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的根系生长中的作用。
室外盆栽使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮0.561g/kg、全磷1.14g/kg、全钾14.98g/kg、速效氮39.19mg/kg、速效磷16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。盆栽试验盆高50cm、上直径30cm、下直径23cm，每盆加土8.2kg，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂100g作为实验处理，并以加入100g的发酵培养基(含有600g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)作为空白对照。
在不同的盆中植入相同大小的胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)幼苗，分别用于在30天、60天和90天后，测定胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的地下部分的生物量(即地下部分的鲜重)，并以实验处理的地下部分的生物量除以空白对照的地下部分的生物量，计算增重比，结果如表1所示。
表1
通过表1的数据可见，本发明的枯草芽孢杆菌菌剂能够显著的促进胡枝子和紫穗槐的根系生长并达到更高的发达程度。
测试实施例2
本测试实施例通过边坡原位监测来测定本发明的微生物菌剂在促进胡枝子(Lespedeza bicolor Turcz.)和紫穗槐(Amorpha fruticosa Linn.)的根系生长以及在稳定水渠边坡中的作用。
修复边坡位于北京市门头沟区法城，将裸露的边坡作为修复的对象。
首先制备作为实验处理和空白对照的袋装土壤，该袋装土壤为内装土壤的植生袋(107×74cm)，每袋装入250kg土壤。分别在每袋的250kg土壤中加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂3kg作为实验处理，并以加入3kg的发酵培养基(含有600g/kg的秸秆(玉米秸秆，已粉碎为约10mm长，5mm宽，5mm厚的大小)、300g/kg的豆饼粉、5g/kg的磷酸二氢钾、5g/kg的硫酸亚铁和余量的水)作为空白对照。
在边坡基础上的不同区域铺设上述各组袋装土壤，每组袋装土壤铺设宽度为10米；边坡基础的深度为15米，坡度为22度，离坡脚2米处设置高1.5米的挡土墙，在挡土墙靠坡一侧的0.7米高度处设置土压力计(采用江苏海岩工程材料仪器有限公司生产的振弦式土压力计，型号TYJ-2021)以测定侧向土压力。在铺设好的袋装土壤上种植胡枝子幼苗和紫穗槐幼苗，种植时间为3月，种植密度为约每平方米4株。
在种植后的3个月后，测定连续无降雨干旱20天时以及降雨后第3天的各组边坡区域的侧向土压力，并以实验处理的侧向土压力除以空白对照的侧向土压力，以计算减压比，结果如表2所示。此外，在各组边坡区域随机取样(每区域取样10次，每次1kg土壤)袋装土壤并(每区域取样10次，每次1kg土壤)测定袋装土壤中的根系组织重量，并以实验处理的根系组织重量除以空白对照的根系组织重量，以计算根系增重比，结果如表2所示。
表2
| 微生物菌剂 | 根系增重比 | 干旱减压比 | 降雨减压比 |
| 实施例1 | 1.246 | 0.838 | 0.622 |
| 实施例2 | 1.232 | 0.845 | 0.635 |
| 实施例3 | 1.224 | 0.853 | 0.643 |
| 对比例1 | 1.025 | 0.996 | 0.978 |
通过表2的数据可见，本发明的枯草芽孢杆菌菌剂能够显著的促进胡枝子和紫穗槐的根系生长并达到更高的发达程度，从而进一步增加了边坡的稳定性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于：该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为CCTCC NO：M2013498。
2.一种微生物菌剂，其特征在于：该微生物菌剂通过包括如下步骤的制备方法制备得到：
(1)将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌接种到液态培养基中，培养得到种子液；
(2)将所述种子液接种到固态培养基中并进行发酵，得到发酵后的物料。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：步骤(1)中，培养的条件使得种子液中的活菌浓度为(5-50)×109CFU/mL。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：步骤(2)中，发酵的条件使得发酵后的物料中的活菌浓度为(5-500)×108CFU/mL。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的微生物菌剂，其特征在于：所述液态培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
6.根据权利要求2-4中任意一项所述的微生物菌剂，其特征在于：所述固态培养基含有秸秆、木屑、豆饼粉、面粉、淀粉、米糠和麸皮中的至少一种；且所述固态培养基还含有2-10g/kg的磷酸二氢钾和1-10g/kg的硫酸亚铁。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于：所述固态培养基含有400-700g/kg的秸秆、100-300g/kg的豆饼粉、2-10g/kg的磷酸二氢钾和1-10g/kg的硫酸亚铁。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在生态修复中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在生态修复中用于构建边坡。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 102311 Beijing Mentougou District Qingshui town double pond Jian Applicant after: Beijing Mountain Eco Science Technology research institute Applicant after: BEIJING JINYUANYI ECOLOGICAL ENVIRONMENT INDUSTRY CO., LTD. Address before: 102311 Beijing Mentougou District Qingshui town double pond Jian Applicant before: Beijing Mountain Eco Science Technology research institute Applicant before: Beijing Jinyuanyi Ecological Engineering Technology Center |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |