CN103191914B

CN103191914B - 里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用

Info

Publication number: CN103191914B
Application number: CN201310104049.7A
Authority: CN
Inventors: 滕应; 马文亭; 骆永明; 李振高; 刘五星; 吴龙华
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2013-03-28
Filing date: 2013-03-28
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2033-03-28
Also published as: CN103191914A

Abstract

里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，将株高约10cm的伴矿景天幼苗扦插到待修复土壤中，在植株根际施加里氏木霉FS10-C发酵液或微生物制剂，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的70%wt，植物生长60～150天后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。本发明提高了镉污染农田土壤的植物修复效率；该木霉制剂提高了伴矿景天植物修复效率，增强了土壤微生物生物量，改善了土壤的微生态环境，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。

Description

里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用

技术领域

本发明涉及镉污染农田土壤的修复方法，具体涉及里氏木霉FS10-C联合伴矿景天在农田镉污染土壤修复中的应用。

背景技术

镉（Cd）是生物毒性最强的重金属元素之一。近年来，由于工业“三废”的排放，以及不合理的农业管理措施，导致土壤Cd污染日益严重，影响植物的生长，造成农作物产量和品质下降。因此，Cd污染土壤的治理与修复越来越引起全球范围内的高度重视。目前，在Cd污染土壤的众多治理方法中，超积累植物提取土壤中Cd是最具良好生态效应的土壤修复改良方法，其中伴矿景天是镉的超积累植物。为进一步提高植物修复效率，采用微生物与植物联合修复的手段，提高超积累植物对Cd污染土壤的修复效率成为Cd污染土壤生物修复发展的新趋势。木霉属（Trichoderma）作为一种优良的微生物资源，不仅对植物病原真菌具有拮抗效应，还能促进植物种子萌发、植株生长，提高作物产量。因此，本发明利用重金属污染土壤中筛选获得了里氏木霉（Trichoderma reesei）FS10-C，研发镉污染农田土壤的木霉强化植物修复方法，为Cd污染土壤的生物修复提供技术支撑。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种里氏木霉FS10-C联合伴矿景天在农田镉污染土壤修复中的应用。为进一步强化伴矿景天对镉污染土壤的修复效果，寻找一种微生物与伴矿景天联合修复的方式，提高伴矿景天对镉的提取效率，以期尽快恢复农田土壤的生产能力。

技术方案：保藏编号为CGMCC No.3970的里氏木霉(Trichoderma reesei)FS10-C联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年07月01日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3970。

应用实施步骤为：将株高约10cm的伴矿景天幼苗扦插到待修复土壤中，在植株根际施加里氏木霉FS10-C发酵液或微生物制剂，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的70%wt，植物生长60～150天后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。

发酵液的施加方式为：a.在移栽伴矿景天幼苗时，先将制备好的发酵液以鲜土重10%的施加量，分别在培养90d和130d时向植物根际部位追加一次木霉发酵液；b.将伴矿景天幼苗放入穴中；c.将土压紧实。

微生物制剂的施加方式为：在移栽伴矿景天幼苗后，将制备好的木霉微生物制剂以鲜土重4%的施加量撒到土壤表面。

有益效果：（1）里氏木霉FS10-C联合伴矿景天处理污染土壤，显著提高了镉污染农田土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进处理效果的现象；（2）木霉发酵液和固体制剂施用方法简单，同时可以提高土壤微生物生物量，改善土壤的微生态环境；（3）环境友好，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。

附图说明

图1镉污染水平下伴矿景天地上部镉浓度；

图2镉胁迫对里氏木霉FS10-C生长的影响；

图3液体培养下镉对里氏木霉FS10-C生长抑制率；

图4不同镉胁迫对里氏木霉FS10-C形态的影响；

图5里氏木霉FS10-C发酵液对伴矿景天地上部Cd浓度的影响；

图6里氏木霉FS10-C发酵液对伴矿景天地上部Cd积累量的影响；

图7里氏木霉FS10-C对修复后土壤中微生物生物量碳的影响；

图8里氏木霉FS10-C制剂对伴矿景天地上部镉含量的影响；

图9里氏木霉FS10-C对伴矿景天地上部镉提取修复效率的影响；

图10里氏木霉FS10-C对修复后土壤中微生物生物量碳的影响。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述：

实施例1：木霉发酵液对伴矿景天修复镉污染土壤的处理

1材料与方法

1.1供试土壤

采自南京栖霞山清洁的铁质湿润淋溶土（黄棕壤），其基本理化性质为：pH5.38（H₂O），有机质21.3g/kg，碱解氮162.3mg/kg，速效磷11.7mg/kg，速效钾82.2mg/kg，阳离子交换量16.5cmol/kg，总镉含量0.05mg/kg。土壤样品自然风干后过2mm筛，以供盆栽模拟试验用。

1.2供试植物

伴矿景天苗，为实验室自行培育的幼苗。

1.3供试菌种

里氏木霉（Trichoderma reesei）菌株FS10-C（保藏编号：CGMCC No.3970），菌丝白色棉絮状，绿色孢子、产黄色素。

1.4培养基

斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），称200g马铃薯洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，向其中加20g葡萄糖、18g琼脂，用去离子水溶解至1000mL，121℃灭菌20min。

液体培养基：采用马铃薯葡萄糖培养基，组成同上，不加琼脂。

1.5木霉发酵液制备

将里氏木霉FS10-C菌种在PDA斜面上进行活化，约7d后产孢子，用无菌水将孢子洗下后接种于PDA液体培养基中，于28℃、150～180r/min的恒温摇床上培养7d，即为木霉发酵液，混匀后待用。

1.6盆栽试验实施

本试验涉及的土壤Cd污染水平3个：0、5、15mg/kg Cd，分别接种木霉发酵液，同时以灭活发酵液为对照，共6个处理，重复3次。将上述过筛后的土壤分别和NPK基础肥料（以N 0.15g/kg，P₂O₅ 0.10g/kg，K₂O 0.15g/kg干土计，其中N、P、K分别以(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄和KCl的形式加入）拌匀。再分别加入不同含量的Cd（以分析纯CdCl₂·2.5H₂O形态加入），与土壤充分混合后，加入去离子水，制备得到0、5、15mg/kg的Cd模拟污染土壤，并进行土壤预培养。在培养过程中使盆中土壤保持田间最大持水量的70%wt，土壤培养7d后，用于盆栽试验。把上述培养的土壤分装于塑料盆中，每盆装土500g。移栽幼苗前将鲜土重10%wt的木霉发酵液（即每盆加50mL）或灭活发酵液加入土壤中，施加方式为穴施。3d后定苗，每盆3株。生长过程中用去离子水浇灌，并用称重法保持土壤含水率为最大田间持水量的70%。在培养90d和130d时，分别向植物根际部位追加一次木霉发酵液或灭活发酵液，用量均为土重的10%。植物生长150d后，用不锈钢剪刀沿土面剪取地上部，测定植株鲜重。用去离水冲洗后，105℃杀青30min，80℃烘干测干重。用不锈钢植物粉碎机磨碎植物，备用。

1.7植物及土壤中重金属含量的测定

植物样品用HClO₄:HNO₃（优级纯，v:v=2:3）的混合酸液消煮；土壤用HCl:HNO₃（优级纯，v:v=4:1）的混合酸液消煮。土壤中重金属有效态：土样风干后过1mm尼龙筛，用1mol/LNH₄OAc（pH7）按1:5的土液质量比提取，振荡、离心后，过滤出上清液待测。上述重金属含量均用石墨炉原子吸收分光光度计（Varian SpectrAA-220FS）进行测定。

1.8土壤pH

用蒸馏水浸提，1:2.5的土水质量比提取后用pH电极测定。

1.9土壤微生物生物量碳

鲜土过2mm筛后调节含水率为最大田间持水量的40%左右，再培养7d后，于25℃黑暗条件下氯仿熏蒸24h，同时，另称等量的土壤置于另一干燥器中，为不熏蒸对照处理。24h后用0.5mol/L K₂SO₄溶液提取（土水质量比1:4）土壤总有机碳，300r/min振荡30min后过滤。上清液中总有机碳含量用自动总有机碳分析仪进行测定。

2研究结果

2.1里氏木霉FS10-C对伴矿景天生物量的影响

根据1.6所述设计盆栽实验，表1为收获时伴矿景天地上部生物量。从表1中可以看出，在加入灭活发酵液的对照组中，伴矿景天的地上部鲜重和干重均随着土壤Cd添加浓度的升高而呈现降低趋势，在15mg/kg Cd处理中地上部鲜重和干重分别仅为0mg/kg Cd处理时的62.8%和62.3%。而加入木霉发酵液的处理其地上部生物量要大于各自加入灭活发酵液的对照。不同Cd处理下，鲜重较对照提高了10.9%（0）、21.5%（5mg/kg）、38.0%（15mg/kg），干重分别提高了17.1%（0）、21.0%（5mg/kg）、42.5%（15mg/kg）。可见木霉发酵液的加入对伴矿景天的生长有明显的促进作用。同时，可以看出随着Cd污染水平的加大，木霉发酵液对伴矿景天的促生作用越明显。

表1里氏木霉FS10-C发酵液对伴矿景天生物量的影响

（注：表中数据为平均值±标准差(n=3)。多重比较采用LSD法。同列数据中具有相同字母的数据无显著性差异(p≥0·05)，“-”表示无数据；下同）

2.2里氏木霉FS10-C对伴矿景天地上部镉含量的影响

从图5、6可以看出，伴矿景天地上部Cd浓度及Cd积累量随着土壤Cd处理水平的提高都显著升高，在5和15mg/kg Cd处理时，Cd含量分别达到388和739mg/kg，而Cd积累量则达到了0.68和1.19mg/pot。在各个Cd处理水平下，与加入灭活发酵液的对照相比，加入木霉发酵液对伴矿景天地上部Cd含量未产生显著影响，而地上部Cd的积累量则有所上升，且在15mg/kg Cd处理时达到显著水平（P<0.05），比对照提高了46.2%，达到了1.74 mg/pot。

2.3里氏木霉FS10-C对伴矿景天修复后土壤微生物生物量碳的影响

土壤微生物生物量碳是应用较多的衡量微生物活性和数量的重要指标之一。从图7可以看出，Cd污染土壤中微生物生物量碳略高于无污染土壤，但无显著差异。而加木霉发酵液处理组，土壤微生物生物量碳要高于对照，在Cd 0、5和15处理下分别比对照高18.4、21.9%和68.4%，其中Cd 15mg/kg处理下差异达显著水平。

实施例2：木霉固体制剂对伴矿景天修复镉污染土壤的处理

1材料与方法

1.1供试菌株

里氏木霉菌株FS10-C（T.reesei FS10-C）（保藏编号：CGMCC No.3970）。

1.2供试土壤

采自于浙江沿海东部某典型废旧电子垃圾回收位点附近的基本农田保护区。土壤类型为水稻土，成土母质为海相沉积物，系统分类属铁聚水耕人为土。该地区由于废旧金属酸洗回收及垃圾焚烧拆解而导致农田土壤重金属含量超标，其基本理化性质及土壤重金属污染情况见表2。

表2供试土壤的主要理化性质及重金属含量

1.3供试植物

伴矿景天苗，采自浙江沿海东部某重金属污染修复基地。采回后于珍珠岩、蛭石（v:v=1:1）中培育两周左右，待长出根后即可移栽入盆。

1.4培养基

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：称200g马铃薯洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，向其中加20g葡萄糖、18g琼脂，用去离子水溶解至1000mL，121℃灭菌20min。

1.5微生物制剂载体

实验区采集的紫花苜蓿洗净，105℃杀青30min，80℃烘干，粉碎后过1mm筛待用。

1.6木霉固体制剂的制备

以紫花苜蓿粉末为木霉繁殖的载体即培养基，将紫花苜蓿洗净烘干粉碎后，调节其含水量为50%wt。分装到15cm培养皿中，每个培养皿中约60g，灭菌121℃30min。在无菌条件下，吸取孢子悬液加入到苜蓿培养基中，28℃恒温培养箱中培养3d左右。待长出少量白色菌丝时，于无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀。目的是使木霉布满整个培养基。隔2d后重复上次操作，直到整个苜蓿培养基都长满绿色的木霉孢子即可。将所有的木霉制剂倒入无菌操作箱中，混匀，其pH为7.71（灭活后pH7.07）。

1.7盆栽试验实施

试验设置三种处理，处理一：CK对照为不施加木霉制剂，处理二：施加灭活木霉制剂；处理三：施加木霉制剂。四次重复。木霉制剂施加量为供试土壤质量的4%，施加方式为表面撒施。供试土壤风干后过2mm筛，装盆，每盆500g土，将木霉制剂及灭活木霉制剂按上述方式施加。取已发根的伴矿景天苗移栽至花盆中，每盆定苗3株。生长过程中用去离子水浇灌，并保持土壤的含水量为最大田间持水量的70%。60d后收获。沿土面剪下植物地上部，测定植株鲜重。用去离子水冲洗后，105℃杀青30min，80℃烘干测干重，用玻璃研钵磨碎后备用。土样风干后过筛备用，并保留部分根际鲜土供土壤微生物指标分析用。

1.8植物及土壤中重金属含量

同实施例1中1.7所述。

1.9土壤pH

同实施例1中1.8所述。

1.10土壤微生物生物量碳

同实施例1中1.9所述。

2研究结果

2.1里氏木霉FS10-C制剂对伴矿景天生长的影响

表3为不同处理下修复60d后伴矿景天地上部生物量。从图中可以看出，其地上部生物量从大到小依次为：木霉制剂处理＞灭活木霉制剂处理＞对照。其中，施加灭活木霉制剂处理组和木霉制剂处理组鲜重分别高于对照114.8%、194.2%；干重分别高于对照70.0%、117.0%。说明里氏木霉FS10-C代谢产物在灭菌后仍然对植物产生促生作用，而不灭菌的里氏木霉FS10-C制剂作用更加持久、明显。

表3里氏木霉FS10-C制剂对伴矿景天地上部生物量影响

处理	鲜重g	干重g
			对照	7.1±1.50c	0.47±0.05c
灭活木霉制剂	15.25±3.97b	0.78±0.12ab
			木霉制剂	2089±534a	102±028a

2.2里氏木霉FS10-C制剂对伴矿景天地上部镉含量的影响

图9、10为修复60d后伴矿景天地上部Cd浓度及提取修复效率。从中可看出，施加灭活木霉制剂对伴矿景天地上部Cd浓度无显著影响，而施加木霉制剂可显著增加伴矿景天地上部Cd浓度，其值高于对照19.4%。

植物地上部积累的重金属总量与污染土壤中重金属的总量的比例直接反映了植物修复的效果和应用潜力。植物提取修复效率=植物地上部的重金属积累量/（每盆土壤重量×修复前土壤重金属浓度）×100%。施加灭活木霉制剂和制剂处理下修复提取效率达到了24.2%和37.6%，分别高于对照61.3%、150.7%。

2.3里氏木霉FS10-C制剂对伴矿景天修复后土壤微生物生物量碳的影响

图10为修复后土壤微生物生物量碳，从中可以看出，木霉制剂和灭活木霉制剂处理能显著增加微生物生物量碳，提高土壤中微生物活性。这两种处理下生物量碳分别高于对照35.2%和45.6%。

Claims

1.保藏编号为CGMCC No.3970的里氏木霉(Trichoderma reesei)FS10-C联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，其特征在于实施步骤为：伴矿景天苗采回后于珍珠岩、蛭石体积比=1:1中培育两周左右，待长出根后即可移栽入盆；马铃薯葡萄糖培养基：称200g马铃薯洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，向其中加20g葡萄糖、18g琼脂，用去离子水溶解至1000mL，121℃灭菌20min；实验区采集的紫花苜蓿洗净，105℃杀青30min，80℃烘干，粉碎后过1mm筛待用；以紫花苜蓿粉末为木霉繁殖的载体即培养基，将紫花苜蓿洗净烘干粉碎后，调节其含水量为50%wt；分装到15cm培养皿中，每个培养皿中约60g，灭菌121℃ 30min；在无菌条件下，吸取孢子悬液加入到苜蓿培养基中，28℃恒温培养箱中培养3d左右；待长出少量白色菌丝时，于无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀；目的是使木霉布满整个培养基；隔2d后重复上次操作，直到整个苜蓿培养基都长满绿色的木霉孢子即可；将所有的木霉制剂倒入无菌操作箱中，混匀，其pH为7.71，灭活后pH 7.07；木霉制剂施加量为供试土壤质量的4%，施加方式为表面撒施；供试土壤风干后过2mm筛，装盆，每盆500g土，将木霉制剂及灭活木霉制剂按上述方式施加；取已发根的伴矿景天苗移栽至花盆中，每盆定苗3株，生长过程中用去离子水浇灌，并保持土壤的含水量为最大田间持水量的70%，60d后收获。