CN103923659B - Nta及微生物菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用NTA及微生物菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法，它是由螯合剂NTA与微生物菌液组成，其中螯合剂NTA与微生物菌液的摩尔比为5‑15mmol·kg^‑1NTA：15 mmol·kg^‑1菌液；所述的微生物菌菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为(2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。实验结果表明：10 mmol·kg^‑1NTA与15mL微生物菌液联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染效果最好。

Description

NTA及微生物菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及NTA及微生物菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法。

背景技术

污水中含有大量的重金属元素，在土壤中积累会影响植物对养分的吸收和利用，也会打乱植物的代谢平衡在北京郊区进行田间实验，结果表明污灌影响了夏玉米的株高、叶面积指数，使其产量和干物质明显减少。污灌区作物品质的污染主要表现是农产品中重金属含量超标以及营养成分的改变。有研究表明,使用污水灌溉泥田大米的各个品质指标均比清水灌溉泥田的有明显下降。也有研究检测污水灌溉的土地上生长的马铃薯、甜菜等农产品, 结果表明其中Cd含量与土壤溶液中Cd含量呈线性相关。

农业环境保护所在1997年对全国24个省市300多个污染区的农产品进行调查，结果表明小麦、玉米重金属超标率为15.5%、14.0% ,重金属污染主要以汞、铬、镉、砷等为主。污水灌溉还会使小麦和水稻的蛋白质含量降低,随着污灌年限的延长,作物的品质会逐年下降。污灌还会明显的降低蔬菜中维生素C含量,其他营养成分的含量则是有增有减。

污水中的重金属主要富集在污灌区土壤表层 0-20 cm之间。土壤对重金属的吸附降低了重金属向地下的迁移。有研究表明长期污灌的地区, 当地的地下水没有受到重金属的污染，多数情况下,污灌水中的重金属并不会对地下水产生明显的影响。也有研究表明,土壤中的重金属尤其是 Cd会随淋溶时间的增加表现出向下迁移的趋势, 从而对地下水造成威胁。总之，污灌的污水中有一部分污染物是被土壤吸附，而另一部分则会向土壤下层移动，最终对浅层地下水造成一定的影响。

污水灌溉一方面造成土壤和农产品污染，使得污染物在作物或者胜出中积累，然后通过食物链进入人，继而导致各种慢性疾病的发病率上升；另一方面长期的污灌会导致地下水水体污染，人们日常饮水或牲畜饮用后也会危害人畜健康；还有长时间的污水灌溉，对直接接触的农民身体状况也会有影响。如江西的赣州和大余以及广东的韶关和曲江、湖南、陕西等19个地区都有个别地区产生“镉米”的情况，如果长期食用这样的农产品，会对人的身体健康造成危害。

由于直接用大量未经处理的污水灌溉，水质超标，污灌面积又盲目扩大，造成土壤和作物及地下水的污染，污水灌溉已经是造成我国农村水环境恶化的主要原因之一。污水灌溉大部分是农民自发的，他们多数是在得不到清水的情况下，自发的引入城市生活及工业废水作为灌溉水源，这在我国北方大中城市的近郊区是很普遍的。

传统的土壤重金属污染修复技术有排土填埋法、稀释法、淋洗法、物理分离法和化学法等。与传统的处理方式相比,植物修复的主要优点是成本低,处理设施简单,适合大规模的应用,利于土壤生态系统的保持,对环境扰动小,具有美学价值等特点。

在土壤重金属污染的生物修复中应用较早、较广泛的是植物修复技术。植物修复就是利用植物吸收、累积和固定土壤中的重金属污染物,将其转移到根部或地上部分,然后在适当的生长阶段进行收获,经过处理后,灰化回收重金属或进行填埋。陈同斌等首次报到了蜈蚣草能大量富集As的研究结果,同时分析了该植物不同器官对重金属的富集量,发现蜈蚣草不同器官组织中As的含量为羽片>叶柄>根系,说明As在该植物体中容易向上运输和富集,显示出蜈蚣草对As有极强的耐性和独特的富集能力。Sun等研究发现,生长在含Cd矿渣土壤里的东南景天植株茎和叶中Cd含量明显高于根部,而生长在非Cd矿区的东南景天植株根部Cd含量则明显高于茎叶中的含量,从而证实东南景天对Cd也有较强的富集作用。田胜尼等通过与鹅冠草的比较认为,香根草无论是对Cu、Pb、Zn单一污染还是复合污染都有较好的修复功能。叶春和研究了紫花苜蓿对Pb污染土壤的修复及活化机理,从X-ray微区分析结果看出,细胞间隙Pb含量最高,细胞壁和液泡次之,胞质中最低; Pb在紫花苜蓿体内主要以难溶的形式存在,紫花苜蓿对Pb的耐受与植物络合素的形成有关。由于紫花苜蓿生物量高,所以,紫花苜蓿可以当作是土壤Pb污染的一种理想修复植物。植物根系分泌物能改变土壤根际环境，可使多价态的 Cr、Hg、As的价态和形态发生改变，影响其毒性效应。植物的根毛可直接从土壤交换吸附重金属增加根表固定。但是，有的用于修复重金属污染土壤的超富集植物的生长周期长、生物量相对较小，对于某些生物有效性低的重金属的富集效率低，这使得单一的使用植物修复受到限制。

现实中土壤中污染物种类繁多，复合污染普遍，污染程度与厚度差异大，同时地球表层的土壤类型多，其组成、性质、条件的区域差异明显，而且修复后土壤再利用式的空间规划要求不同。因此，单项修复技术往很难达到修复目标，而开发复合修复模式就成为土壤污染修复的主要研究方向。

现今开始投入应用的复合修复技术的主要类型有植物/微生物联合修复、动物/植物联合修复以及化学/物化-生物联合修复。植物/微生物联合修复的机理是高等植物与土壤微生物在生长过程中往往存在协同作用，一方面植物可以提供土壤微生物生长所需的碳源，同时又经叶茎向根部输送氧气，形成有利于氧化的微环境，促进好氧微生物对污染物的分解作用。化学/物化-生物联合修复能够发挥化学或物理修复的周期短、见效快的优势，结合非破坏性的生物修复特点，发展基于化学-生物修复技术是最具应用潜力的污染土壤修复方法。如利用有机络合剂的配位溶出,增加土壤溶液中重金属浓度，提高植物的吸收效率，从而实现强化诱导植物吸取修复。因此，提高植物吸收富集重金属的方法，除了使用和继续发现富集能力强和生物量大的超富集植物以外，我们可以在植物修复过程中添加人工或者天然的螯合剂以及其它的强化措施来提高植物吸收富集重金属的能力。

螯合剂诱导植物提取修复重金属，它一方面可以增加重金属在土壤中的溶解度，另一方面可以提高重金属根际扩散能力，还能促进重金属从根系向地上部转运。钱猛等在Cu、Zn、Pb、Cd复合污染土壤上种植海州香薷，施用5 mmol·kg^-1EDTA后，Cu、Zn、Pb、Cd的浓度分别比对照提高27.4、3.2、17.6和89.5倍。Stanhope 等研究表明，随着 EDTA 浓度的增加，土壤中 Cu、Zn、Cd、Pb、Ni可溶态重金属的含量占总重金属含量的比例呈线形提高。螯合诱导植物修复过程中螯合剂的使用时间很重要，一般是在植物收获前 1~2 周内加入，此时植物生长发育成熟，短时间内处理后对生长量影响较小，植物提取的重金属总量会大幅增加。

通过温室大棚盆栽实验，研究螯合剂和表面活性剂单独或复合处理辅助金福菇修复重金属污染土壤的效果。结果表明，高浓度的EDTA使金福菇的生物量比对照降低，子实体Pb、Cu和Cd的浓度分别比对照提高15~88倍、0.8~3.3倍和0.5~0.6倍. 单独添加表面活性剂时，各处理生物量与对照没有显著差异，且重金属浓度变化幅度没有单独添加EDTA的处理大。EDTA和SDS（十二烷基磺酸钠）浓度比为2 : 1（ES3）时，子实体Cd浓度达到最大值。在螯合剂和表面活性剂辅助下，金福菇修复复合重金属污染土壤具有很大的潜能。

Belimov等从生长在含高浓度Cd土壤里的印度芥菜根际分离出11株耐受Cd的细菌菌落,发现这些菌落体内所含的脱氨酶可促进芥菜根部生长,并提高印度芥菜根系对Cd的吸收富集。假单胞菌菌株BS2产生的生物活化剂鼠李糖脂液可去除可渗虑的Cd、Pb离子以及那些被结合的金属离子。将根瘤细菌体接种于Brassica juncea,大大提高了植物地上部分的生物量,改善了尾矿中Zn、Pb的生物有效性。Chanmugathas等报道,在营养充分的条件下,微生物可以促进Cd的溶解,从土壤中溶解出来的Cd主要是和低分子量的有机酸结合在一起。接种巨大芽胞杆菌和胶质芽胞杆菌的混合微生物制剂可以促进植物生长,使植物生物量提高,生育期提前,并能很好地促进土壤中重金属的活化和植物对重金属元素的吸收和累积。

这些研究大多是以可食用的作物为研究对象，通过添加螯合剂促进植物积累重金属，但是有的螯合剂在提高植物体内重金属含量的同时降低了植物的生物量，并且螯合剂本身不容易降解，那么这可能会对后期的植物处理以及螯合剂的渗漏迁移造成一定的隐患。

超富集植物修复重金属污染土地耗时太长、修复范围仅能局限在植物根系所能延伸的范围、对重金属具有一定的选择性，用一种超富集植物难以全面清除土壤中的所有污染物，因而经济上并不一定很合理。草坪植被有防风固沙、涵养水源、净化空气、绿化土地、保持水土和调节小气候等作用。

目前多数报道和研究均表明我国污水灌溉土壤有不同程度的重金属污染，这对环境还有人类的危害是显而易见的，并且目前实验室的研究成果还暂时不能应用于大田，找到可行的、适用于修复污灌土重金属的方法或技术很必要。土壤重金属污染具有复杂性、不可逆性和表聚性等特点，单一治理方法很难将其去除干净，两种或两种以上修复技术相结合的修复技术，能够较好发挥各自的优点，更加利于土壤重金属污染的修复。组合修复技术是近年来研究比较火热的修复技术。

用草坪植物修复污灌土，添加可降解的螯合剂，微生物作为辅助，使草坪植物积累更多的重金属，这不但能避免重金属进入食物链危害人类，同时还可将草皮卷应用于城市绿化，另外草坪植物较强的再生性也适合用于修复。污灌土重金属含量达标以后可以继续应用于农业生产。

城市污泥是污水处理过程中产生的沉淀物质，污水处理厂产生的污泥量约为处理水体积的0.15%~1.00%。它是一种以有机成分为主、组分复杂的混合物，其中包含有潜在利用价值的有机质、氮、磷、钾以及各种微量元素，其pH值为6~7，总碱度约为200 mg/l，很适合微生物的繁殖与生长。因次，其微生物含量相当丰富。并且，污泥作为一个高渗环境，对其中的微生物存在一个自然驯化的过程。但是有关城市污泥微生物的分类鉴定方面的研究还很少，对城市污泥微生物的利用更是尚无文献报道。本实验从污泥原液中取出菌液，在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养分离，从而鉴定污泥有效微生物的组成，以便后期将其应用于草坪建植方面的研究。

天津地处华北平原的东北部，由于干旱化趋势加剧、上游修水坝建水库等，致使工农业用水短缺。另一方面，大量工业和生活污水排入渤海，这些污水已经成为天津弥补农业用水不足的重要措施，由此而形成了长达几十年的污灌区。目前重金属污染土壤的修复技术很多，其中植物修复具有良好的社会、经济、环境综合效益，适用于大规模污染土壤的修复。另外，添加螯合剂能促进植物提取更多的重金属。微生物修复技术在治理重金属污染方面有成本低、环境友好、无二次污染等优势，也有很好的应用前景。城市污泥化学组成因污水来源不同而异，但一般都含有一定量的Cu、Pb、Zn、Ni、Cr、Cd、Hg等重金属。如果从城市污泥中提取微生物，则提取的微生物可能对重金属具有抗性，因此，用于土壤重金属污染修复有潜在的应用价值。一般认为重金属污染土壤使用单一的修复技术很难达到预期的效果，如果采用植物修复，再辅以化学、微生物等措施来增加重金属的有效性，可以促进植物的生长和吸收，提高植物的修复效率。高羊茅是禾本科羊茅属多年生草坪植物，其具有抗逆性强、再生性强、生物量高等特点，将其用于重金属修复具有一定的应用价值和意义。将氨三乙酸（NTA）与城市污泥中提取的微生物和植物联合起来修复污灌土壤重金属污染的研究，尚无文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种及NTA及微生物菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法。本发明在优化实验的基础上，利用NTA与污泥混合菌液联合高羊茅提取方法，进行污灌区土壤重金属修复研究，为新型螯合剂和污泥微生物强化植物修复土壤重金属污染提供理论依据。为实现此目的，本发明提供如下的技术方案：

一种含有NTA及微生物菌液的菌剂，其特征在于它是由螯合剂NTA与微生物菌液组成，其中螯合剂NTA的加入量为5-15mmol·kg^-1NTA：微生物菌液的加入量为，向相应的处理组添加15 mmol·kg^-1菌液；所述的菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液。配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。

本发明进一步公开了含有NTA及微生物菌液的菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法，包括:

（1）材料的处理：

草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea L.)为实验材料；

菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液；配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。

螯合剂选用氨三乙酸；

将采集的土壤去除草根、石块后平摊于透明塑料布上，放置于通风处，自然风干2~3 d后，过2 mm筛备用。土壤有机质含量3.62%，全氮量0.19%，全磷量5.4 g·kg^-1，全钾量787.3 mg·kg^-1，pH7.28，土壤含水量4.13%，电导率0.44 ms·cm^-1。土壤中Cd、Cu和Zn的含量分别为7.13、146.31和795.56 mg·kg^-1，分别是土壤环境质量二级标准（GB156182-1995）的23.8、1.5和3.2倍；

（2）实验方法：

分别以直径为7 cm、高度为8 cm的聚乙烯塑料杯为培养容器，加入170 g供试土壤，每杯播种0.5 g高羊茅种子，植物生长15d，向相应的处理组添加菌液，植物生长25d，按照实验设计分别将相应浓度的NTA和菌液，按所需剂量一次性施加于相应处理组的基质表面； NTA处理10d后收获草坪植物，实验周期为35天，草坪植物培养在实验室内进行，经常调换位置以保证光照一致，培养期间室内温度17~31℃，相对湿度38~60%，培植期间正常供水，以维持植物正常生长；其中相应浓度的NTA指的是：

5 mmol·kg^-1NTA；10 mmol·kg^-1NTA；15 mmol·kg^-1NTA；

向相应的处理组添加菌液指的是加入：

5mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

10mmol·kg^-1NTA+15mL菌液或

15mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

（3）生物量的测定：播种35d后收获草坪植物，分为地上和地下部，经去离子水反复冲洗后，将其放入烘箱中，80℃条件下烘干至恒重，测其干重，最后用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cu、Zn含量。

本发明更进一步公开了含有NTA及微生物菌液的菌剂在联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染方面的应用。其中所述的修复污灌土重金属污染指的是：对高羊茅地上和根部Cd、Cu、Zn含量和积累量的修复作用。

本发明更进一步公开了含有NTA及微生物菌液的菌剂在联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染方面的应用。其中菌剂指的是10 mmol·kg^-1NTA与15mL微生物菌液混合液。

本发明通过试验所达到的结论：采用10 mmol·kg^-1NTA与15mL微生物菌液联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染。

本发明更加详细的制备方法如下:

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用我国北方比较常见草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea L.)为实验材料。

污泥取自天津纪庄子污水处理厂，采用稀释分离法制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的污泥悬浮液，根据所分离的微生物，取相应浓度的污泥悬浊液，摇匀后吸取0.2 mL不同浓度的污泥悬浮液加入预先倒好的平板中（真菌用马丁氏琼脂平板，放线菌用高氏一号琼脂平板，细菌用牛肉膏蛋白胨平板）培养。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落性状和形态特征对菌株归类和统计数量，确定相应的优势菌，对其编号并保存（颜艳伟等，2011）。对优势菌进行基因扩增后，送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较，确定本实验所用菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌。将分离出的三种菌种纯化培养2代，取活化菌种，接入装有200mL液体培养基的三角瓶中，180 r/min适温培养，选用600 nm波长进行比浊测定，确定微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液。配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。

螯合剂选用氨三乙酸（NTA），分子式为N(CH₂COOH)₃，购于国药集团化学试剂有限公司，为分析纯。

供试土壤取自天津市西青区污灌区，将采集的土壤去除草根、石块后平摊于透明塑料布上，放置于通风处，自然风干2~3 d后，过2 mm筛备用。土壤有机质含量3.62%，全氮量0.19%，全磷量5.4 g·kg^-1，全钾量787.3 mg·kg^-1，pH7.28，土壤含水量4.13%，电导率0.44ms·cm^-1。土壤中Cd、Cu和Zn的含量分别为7.13、146.31和795.56 mg·kg^-1，分别是土壤环境质量二级标准（GB156182-1995）的23.8、1.5和3.2倍。

1.2 实验设计

实验设计是：不加NTA和菌液的对照（I）；5 mmol·kg^-1NTA（II）；10 mmol·kg^-1NTA（III）；15 mmol·kg^-1NTA（IV）；只加菌液（V）；5 mmol·kg^-1NTA+菌液（VI）；10 mmol·kg^{- 1}NTA+菌液（VII）；15 mmol·kg^-1NTA+菌液（VIII）。每个处理3次重复。

1.3 草坪植物培养

以直径为7 cm、高度为8 cm的聚乙烯塑料杯为培养容器，加入170 g供试土壤，每杯播种0.5 g高羊茅种子。植物生长15d，向相应的处理组添加15 mL菌液，其他各处理组添加15mL蒸馏水。植物生长25d按照实验设计分别将相应浓度的NTA按所需剂量溶于蒸馏水，一次性施加于相应处理组的基质表面；对照用等量的蒸馏水浇灌。NTA处理10d后收获草坪植物，实验周期为35天。草坪植物培养在实验室内进行，经常调换位置以保证光照一致。培养期间室内温度17~31℃，相对湿度38~60%。培植期间正常供水，以维持植物正常生长。

1.4 指标测定

生物量的测定：播种35d后收获草坪植物，分为地上和地下部，经去离子水反复冲洗后，将其放入烘箱中，80℃条件下烘干至恒重，测其干重。

重金属含量的测定：秤取植物样品0.1 g，用硝酸: 高氯酸: 硫酸（8: 1: 1）消解后，所得溶液用蒸馏水定容至25 mL，最后用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属（Cd、Cu、Zn）含量。

1.5 数据分析处理

采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。

2 研制结果分析

2.1 NTA和微生物对高羊茅生物量的影响

不同处理对高羊茅生物量的影响见表1。结果表明，5 mmol·kg^-1NTA处理增加了高羊茅地上干重，比对照增加4.7%。而10、15 mmol·kg^-1NTA处理抑制了高羊茅地上干重，比对照降低了2.1%、11.5%。但单独添加NTA的3个处理与对照没有显著差异（P＞0.05）。添加菌液的处理显著增加了地上生物量，尤其以单独添加菌液的处理最为明显，和对照相比，增加了27.6%；5 mmol·kg^-1NTA+菌液、10 mmol·kg^-1NTA+菌液、15 mmol·kg^-1NTA+菌液处理与对照相比，地上生物量分别增加了21.8%、20.3%、19.7%，但加菌液的4个处理间差异不显著（P＞0.05）。除15 mmol·kg^-1NTA处理外，各个处理的地下生物量均比对照有所上升，但只有单独添加菌液处理显著增加了高羊茅根部干重，比对照提高了50%，其他各处理与对照无显著差异（P＞0.05）。15 mmol·kg^-1NTA+菌液处理比单独添加菌液的处理高羊茅地下生物量显著降低了32.1%。

表1不同处理对高羊茅生物量的影响

处理	地上生物量（g/容器）	地下生物量（g/容器）
			不加NTA和菌液	0.340±0.016bc	0.110±0.016b
5 mmol·kg-1NTA	0.356±0.023b	0.138±0.006ab
			10 mmol·kg-1NTA	0.333±0.030bc	0.121±0.013b
15 mmol·kg-1NTA	0.301±0.030c	0.101±0.025b
			15mL菌液	0.434±0.050a	0.165±0.027a
5mmol·kg-1NTA+15mL菌液	0.414±0.018a	0.135±0.021ab
			10mmol·kg-1NTA+15mL菌液	0.409±0.017a	0.132±0.034ab
15mmol·kg-1NTA+15mL菌液	0.407±0.029a	0.112±0.019b

同列数据不同字母表示差异显著（P<0.05）

2.2 NTA和微生物协同对高羊茅地上部重金属含量的影响

从表2可以看出，单独添加 NTA处理的高羊茅地上部Cd含量随NTA浓度的增加呈上升趋势，高浓度NTA处理显著高于对照（P＜0.05）。NTA+菌液处理中高羊茅地上部Cd含量均显著高于对照，分别提高了64%、116%、90%。其中10 mmol·kg^-1NTA+菌液处理组中高羊茅地上部Cd含量达到最大，是同浓度NTA单独处理的1.35倍。单独添加NTA处理高羊茅地上部Cu含量是逐渐递增的，10、15 mmol·kg^-1NTA处理显著高于对照（P＜0.05）。10 mmol·kg^-1NTA+菌液、15 mmol·kg^-1NTA+菌液处理中高羊茅地上部Cu含量显著高于对照，提高了92.8%、110.5%。但是单独添加NTA与同浓度NTA+菌液处理中高羊茅地上部Cu含量差异不显著（P＞0.05）。单独添加15 mmol·kg^-1NTA和NTA+菌液的所有处理高羊茅地上Zn含量显著高于对照（P＜0.05），尤其以5 mmol·kg^-1NTA+菌液处理最为明显，是对照的15.15倍。与单独添加NTA处理相比，NTA和菌液联合添加对高羊茅地上部Cd和Zn含量的提高较为显著。单独添加菌液处理中高羊茅地上Cd、Cu、Zn含量与对照组差异不显著（P＞0.05）。螯合剂与菌液联合使用后能够有效提高高羊茅地上部重金属的含量，有利于其提取积累重金属。

表2不同处理下高羊茅地上部重金属含量（ug/g）

处理	Cd	Cu	Zn
				不加NTA和菌液	4.76±1.12d	12.00±2.71c	3.00±0.13c
5 mmol·kg-1NTA	6.17±0.71cd	14.21±3.50c	8.92±2.60bc
				10 mmol·kg-1NTA	7.63±1.65bc	21.63±4.55ab	15.17±2.67bc
15 mmol·kg-1NTA	8.42±1.09ab	25.58±1.95a	34.83±11.33a
				15mL菌液	4.79±1.54d	11.04±3.98c	3.92±1.81c
5mmol·kg-1NTA+15mL菌液	7.79±0.62bc	16.63±4.57bc	45.46±9.52a
				10mmol·kg-1NTA+15mL菌液	10.29±1.32a	23.13±4.18ab	20.71±8.58b
15mmol·kg-1NTA+15mL菌液	9.04±0.52ab	25.26±2.78a	20.13±8.34b

同列数据不同字母表示差异显著（P<0.05）

2.3 NTA和微生物协同对高羊茅根部重金属含量的影响

由表3可知，单独添加菌液处理中高羊茅地上Cd、Cu、Zn含量与对照差异不显著（P＞0.05）。NTA与菌液联合添加的3个处理中高羊茅根部Cd含量显著高于对照，其中15mmol·kg^-1 NTA+菌液处理含量最大，是对照的2.72倍，但是与同浓度NTA单独处理相比差异不显著（P＞0.05）。高浓度NTA处理与高浓度NTA+菌液处理高羊茅根部Cu的含量均显著高于对照（P＜0.05），其中15 mmol·kg^-1 NTA 处理含量最大，是对照的2.10倍。高羊茅根部Zn的含量除了5 mmol·kg^-1NTA和单独添加菌液处理，其它处理均高于对照，并且差异显著（P＜0.05）。NTA与菌液共同添加对高羊茅根部Cd、Cu、Zn含量的提高有一定效果。

表3不同处理下高羊茅根部重金属含量（ug/g）

处理	Cd	Cu	Zn
				不加NTA和菌液	5.00±0.75c	15.67±9.75bc	5.54±2.89cd
5 mmol·kg-1NTA	7.08±2.70bc	22.83±2.98abc	11.50±1.39c
				10mmol·kg-1NTA	7.83±3.79bc	27.08±3.64a	18.83±6.18b
15mmol·kg-1NTA	8.58±2.77abc	32.83±5.78a	31.58±4.25a
				15mL菌液	6.25±1.64bc	13.00±4.99c	3.92±1.84d
5mmol·kg-1NTA+15mL菌液	10.92±4.00ab	24.00±2.70ab	18.25±2.95b
				10mmol·kg-1NTA+15mL菌液	10.92±3.09ab	29.83±6.77a	23.75±2.75b
15mmol·kg-1NTA+15mL菌液	13.58±3.01a	27.33±2.75a	22.83±5.55b

同列数据不同字母表示差异显著（P<0.05）

2.4 NTA和微生物协同对高羊茅重金属积累量的影响

从表4、5可知，10mmol·kg^-1NTA+菌液处理高羊茅地上部Cd积累量达到最大值，是对照的2.62倍。NTA+菌液处理组均能提高高羊茅地上部对Cu的积累量，15mmol·kg^-1NTA+菌液处理与单独添加NTA的三个处理相比有显著性差异（P＜0.05）。对于Zn的积累，5mmol·kg^-1NTA+菌液处理显著高于其他七组，是对照组的18.34倍。在NTA+菌液组中，随着添加NTA浓度的增大，高羊茅地上部Zn的累积量呈递减趋势，但是均显著高于对照（P＜0.05）。单独添加菌液组高羊茅地上部和根部Cd、Cu、Zn的积累量与对照没有显著差异（P＞0.05）。NTA+菌液处理高羊茅根部Cd积累量显著高于对照的（P＜0.05）。10mmol·kg^-1NTA+菌液处理高羊茅根部Cu积累量最大，是对照的2.09倍。NTA+菌液的三个处理之间高羊茅根部Zn积累量没有显著性差异（P＞0.05），但是均显著高于对照组。

表4不同处理下高羊茅地上部重金属积累量

同列数据不同字母表示差异显著（P<0.05）

表5不同处理下高羊茅根部重金属积累量

同列数据不同字母表示差异显著（P<0.05）

3 研制结论

对高羊茅地上和根部Cd、Cu、Zn含量和积累量的提高有一定促进作用，但是只有10mmol·kg^-1NTA+菌液处理中高羊茅地上Cd含量显著高于10 mmol·kg^-1NTA处理，5 mmol·kg^-1NTA+菌液处理中高羊茅地上和根部Zn含量显著高于5 mmol·kg^-1NTA处理，说明NTA与菌液联合添加能够显著提高高羊茅吸收重金属的最佳配比有待进一步研究。综合修复效果，可考虑用10 mmol·kg^-1NTA与微生物菌液联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂均有市售。其中施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌均由市售，也可以根据实施例1的方法加以配制。所述的马丁氏琼脂平板培养基、高氏一号琼脂平板培养基、牛肉膏蛋白胨平板培养基均有市售。

实施例1

1 材料与方法

1.1 试验材料

城市污泥来自天津纪庄子污水处理厂。

1.2 菌株的培养

称取污泥10 g，放入盛有90 g无菌水的锥形瓶中加入玻璃珠，放在摇床上振摇20min。采用稀释分离法制备10^－2、 10^－3、10^－4、10^－5、10^－6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10^－2、10^－3、10^－4，放线菌取10^－3、10^－4、10^－5，细菌取10^－4、10^－5、10^－6)，摇匀后吸取0.2 mL加入到预先倒好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板，此培养液1000 ml加1%孟加拉红水溶液3.3 ml。临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0.3 ml;放线菌用高氏一号琼脂平板，临用时每100 ml培养基中加入10%苯酚2滴;细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀。每处理重复3次，28℃培养。

根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。每种培养基上确定5种优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。优势菌定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10%以上的菌称之为优势菌。每个样品中最多的菌落数达不到10%的，取菌落数最多的前两种作为该样品的优势菌。

1.3 菌种的鉴定

1.3.1 优势细菌的鉴定

将分离到的优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃ 培养，观察 18 － 24h菌龄的菌落形态、细菌的形态特征、培养特性，采用革兰氏染色法、芽孢染色法和荚膜染色法进行染色。

挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版。采用通用引物 27f/1492r(27F:5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’;1492R:5’GGTTACCTTGT TACGACTT 3’)进行 PCR 扩增 16SrRNA 基因。PCR 反应程序如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。

1.3.2 优势真菌的鉴定

将分离到的优势真菌接种到马丁氏培养基上，28℃ 培养 7 天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10 × 40 倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态（魏景超，1929）。参照有关资料进行形态学鉴定。

挑取单菌体溶于100 μL高纯水中 ，在沸水中煮10 min 裂解菌体 ，使DNA释放出来，直接作为PCR反应的模版版。采用通用引物 通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3’)和ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC -3’）进行 PCR 扩增18SrDNA 基因。PCR 反应程序如下：94℃ 2min；94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃1 min， 25个循环；72℃ 10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在 NCBI 网站上用BLAST 软件与 GenBank 核酸数据库中相关种属的16SrDNA和18srDNA序列进行同源性比较。

1.3.3优势放线菌的鉴定

将分离到的优势放线菌接种到高是一号培养基上，28℃ 培养 7-10 天后，采用印片法观察放线菌形态（沈萍，1999）。分子鉴定同 1. 3. 1 优势细菌的分子鉴定。

2 结果与分析

2.1 牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的形态及菌落计数

2.1.1 污泥微生物在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数统计

表6培养基上细菌菌落数情况

污泥	原液	10-4	10-5	10-6
					菌落数	菌落数>300，无法计数	992×104	402×105	170×106

2.1.2 牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌的形态特征

表7 牛肉膏蛋白胨培养基的细菌情况

编号	颜色	表面形态	形状
				1	黄色	表面光滑，边缘有细小皱褶，菌落较小	圆形为主
2	橘红	表面圆润，光滑，菌落较小	圆形为主
				3	浅黄	粗糙，颗粒状	圆形
4	透明	光滑透亮，菌落中等	不规则
				5	乳白	不光滑，略光亮，边缘呈锯齿状	圆形为主

注：编号1、2、3、4、5为牛肉膏蛋白胨培养基上的物种优势菌种，编号6、7、8、9、10为马丁氏培养基上的五种优势菌种，编号11、12、13、14、15为高氏一号培养基上的物种优势菌种。

2.1.3牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌染色结果

表8 牛肉膏蛋白胨培养基的细菌染色结果

编号	革兰氏染色	芽孢染色	荚膜染色
				1	+	—	—
2	—	—	+
				3	—	—	+
4	+	—	—
				5	—	—	—

注：+表示阳性，—表示阴性。

2.1.4牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌纯化结果

2.1.5 牛肉膏蛋白胨培养基上5中菌株的PCR结果

表9牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果

编号	相关属	相关种	拉丁名	相似度
					1	节杆菌属	Soli	Arthrobacter soli	99%
2	金黄杆菌属	Haifense	Chryseobacterium haifense	98%
					3	假单胞菌属	施氏假单胞菌	Pseudomonas stutzeri	99%
4	微杆菌属	乳微杆菌	Microbacterium lacticum	99%
					5	苍白杆菌属	根际苍白杆菌	Ochrobactrum rhizosphaerae	98%

2.1.6牛肉膏蛋白胨培养基上5种优势菌鉴定结果

将5种优势菌的菌落形态，染色结果对比《伯杰细菌鉴定手册》及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株1为节杆菌属的Arthrobacter soli ，菌株2为金黄杆菌属的Chryseobacterium haifense ，菌株3为假单胞菌属的施氏假单胞菌，菌株4为微杆菌的乳微杆菌，菌株5为苍白杆菌属根际苍白杆菌。

2.2.2 马丁氏培养基上微生物的形态及菌落计数

2.2.1 污泥微生物在马丁氏培养基上的菌落数统计

表10培养基上细菌菌落数情况

污泥	原液	10-2	10-3	10-4
					菌落数	菌落数>300，无法计数	480×102	173×103	62×104

2.2.2 马丁氏培养基上5种优势菌的形态特征

表11马丁氏培养基的细菌情况

编号	颜色	表面形态	形状	菌落直径
					6	黑色	菌丝绒毛状	圆形	10mm
7	绿色	菌丝棉絮状	不规则	19mm
					8	黄绿色	菌丝棉絮或绒毛状	不规则	15mm
9	白色	菌丝蜘蛛网状	圆形	7mm
					10	青黄色	菌丝	不规则	13mm

2.2.3 5种优势菌显微镜下观察结果

将分离纯化得到的5种优势菌置于光学显微镜(10 × 40 倍)下观察，得到结果如下：菌株6菌丝绒毛状，初期白色，后灰白色至黑色。菌丝无隔、多核、分枝状，分枝顶端着生球形孢子囊。菌株7木呈不定型棉絮状，其表面的颜色多呈绿色。菌丝有隔分枝。分生孢子梗是菌丝的短侧枝，在分枝末端形成瓶状小梗。菌株8菌丝棉絮或绒毛状有隔，分枝，分生孢子梗分枝。菌株9菌丝蜘蛛网状，白色，无隔而分枝。菌株10菌丝鹦鹉绿色，菌丝各细胞之间有横隔膜，孢子梗发生于气生菌丝，顶端明显膨大，帚状枝双轮生，梗颈明显，孢子球形。

.2.2.4马丁氏培养基上5种优势菌纯化结果

.2.2.5 马丁氏培养基培养基上5中菌株的PCR结果

表12牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果

编号	相关属	相关种	拉丁名	相似度
					6	毛霉属	梨形毛霉	Mucor piriformis	97%
7	木霉属	里氏木霉	Trichoderma reesei	98%
					8	曲霉属	黄曲霉	Aspergillus flavus	99%
9	水霉属	寄生水霉	S.arasitica coker	98%
					10	镰刀菌属	keratoplasticum	Fusarium keratoplasticum	99%

2.2.6马丁氏培养基上5种优势菌鉴定结果

将5种优势菌的菌落形态、镜下观察结果及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株6属于毛霉属的梨形毛霉，菌株7属于木霉属的里氏木霉，菌株8属于曲霉属的黄曲霉 ，菌株9属于水霉属的 寄生水霉，菌株10属于镰刀菌属的keratoplasticum。

2.3 高氏一号培养基上微生物的形态及菌落计数

2.3.1 污泥微生物在高氏一号培养基上的菌落数统计

表13培养基上细菌菌落数情况

污泥	原液	10-3	10-4	10-5
					菌落数	菌落数>300，无法计数	789×103	248×104	83×105

2.2.3.2 高氏一号培养基上5种优势菌的形态特征

表14高氏一号培养基的细菌情况

编号	颜色	表面形态	形状	菌落直径
					11	灰白色	粗糙，有干粉，有细小皱褶，菌落较小	圆形为主	5mm
12	白色	粗糙，有干粉，有细小皱褶，菌落较小	圆形为主	3mm
					13	橘红	光滑，干燥，难以挑取，规则，	圆形	1mm
14	橘黄	光滑透亮，菌落中等	不规则	2mm
					15	黄	圆润光滑，透亮，	不规则	4mm

2.3.3高氏一号培养基上5种优势菌纯化结果

2.3.4 高氏一号培养基上5中菌株的PCR结果

表15 牛肉膏蛋白胨培养基上菌株PCR结果

编号	相关属	相关种	拉丁名	相似度
					11	链霉菌属	灰黄链霉菌	Streptomyces griseoflavus	98%
12	链霉菌属	白色链霉菌	Streptomyces albus	98%
					13	链霉菌属	极暗黄链霉菌	Streptomyces fulvissimus	99%
14	涅斯捷连科氏菌属	嗜盐涅斯捷连科氏菌	Nesterenkonia halophila	97%
					15	新鞘脂菌属	新鞘氨醇杆菌	Novosphingobium sp.	97%

2.3.5高是一号培养基上5种优势菌鉴定结果

将5种优势菌的菌落形态及PCR结果相结合，分析鉴定其相应的种属。鉴定结果如下：菌株11为链霉菌属的灰黄链霉菌，菌株12为链霉菌属的白色链霉菌，菌株13为链霉菌属的极暗黄链霉菌，菌株14为涅斯捷连科氏菌，菌株15为新鞘脂菌属的新鞘氨醇杆菌。

3结论

后期实验是从以上15种优势菌中选取三种菌株，其中细菌、丝状真菌和放线菌各一种，将其培养后应用于草坪植物建植体系中。根据对这15种菌株作用分析，最终选定假单胞菌、木霉和链霉菌这三种。这三种从污泥中分离得到的施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌的生化特性与购买的施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌的生化特性相同，固所分离的菌株没有保藏。它们都能产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物的生长，还可以产生代谢物质或通过竞争作用来抑制或阻挠根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。但是以污泥为菌种来源的微生物菌剂应用对植物生长和生理特性影响方面的研究较少；而其在草坪植物中的应用则更无文献报道。因此本实验后期将选取这三种菌，为污泥微生物菌剂在草坪建植初期中的应用以及胁迫条件下的草坪建植提供科学依据。同时作为试验也可以采用施氏假单胞菌购买于上海桑戈生物科技有限公司、

里氏木霉购自于上海信裕生物科技有限公司、灰黄链霉菌购自于中国医学科学院医药生物技术研究所来进行试验。

实施例2

含有NTA及微生物菌液的菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法：

（1）材料的处理：

草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea L.)为实验材料；

菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液；配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。

螯合剂选用氨三乙酸；

将采集的土壤去除草根、石块后平摊于透明塑料布上，放置于通风处，自然风干2~3 d后，过2 mm筛备用。土壤有机质含量3.62%，全氮量0.19%，全磷量5.4 g·kg^-1，全钾量787.3 mg·kg^-1，pH7.28，土壤含水量4.13%，电导率0.44 ms·cm^-1。土壤中Cd、Cu和Zn的含量分别为7.13、146.31和795.56 mg·kg^-1，分别是土壤环境质量二级标准（GB156182-1995）的23.8、1.5和3.2倍；

（2）实验方法：

分别以直径为7 cm、高度为8 cm的聚乙烯塑料杯为培养容器，加入170 g供试土壤，每杯播种0.5 g高羊茅种子，植物生长15d，向相应的处理组添加菌液，植物生长25d按照实验设计分别将相应浓度的NTA按照实验设计分别将相应浓度的NTA和菌液，一次性施加于相应处理组的基质表面； NTA处理10d后收获草坪植物，实验周期为35天，草坪植物培养在实验室内进行，经常调换位置以保证光照一致，培养期间室内温度18℃，相对湿度40%，培植期间正常供水，以维持植物正常生长；其中相应浓度的NTA指的是：10 mmol·kg^-1NTA；向相应的处理组添加菌液指的是加入：10mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

（3）生物量的测定：播种35d后收获草坪植物，分为地上和地下部，经去离子水反复冲洗后，将其放入烘箱中，80℃条件下烘干至恒重，测其干重，最后用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cu、Zn含量。

实施例3

含有NTA及微生物菌液的菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法：

（1）材料的处理：

草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea L.)为实验材料；

菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液；配制成复合微生物菌液，其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板。

螯合剂选用氨三乙酸；

将采集的土壤去除草根、石块后平摊于透明塑料布上，放置于通风处，自然风干2~3 d后，过2 mm筛备用。土壤有机质含量3.62%，全氮量0.19%，全磷量5.4 g·kg^-1，全钾量787.3 mg·kg^-1，pH7.28，土壤含水量4.13%，电导率0.44 ms·cm^-1。土壤中Cd、Cu和Zn的含量分别为7.13、146.31和795.56 mg·kg^-1，分别是土壤环境质量二级标准（GB156182-1995）的23.8、1.5和3.2倍；

（2）实验方法：

分别以直径为7 cm、高度为8 cm的聚乙烯塑料杯为培养容器，加入170 g供试土壤，每杯播种0.5 g高羊茅种子，植物生长15d，向相应的处理组添加菌液，植物生长25d按照实验设计分别将相应浓度的NTA按照实验设计分别将相应浓度的NTA和菌液，一次性施加于相应处理组的基质表面； NTA处理10d后收获草坪植物，实验周期为35天，草坪植物培养在实验室内进行，经常调换位置以保证光照一致，培养期间室内温度30℃，相对湿度55%，培植期间正常供水，以维持植物正常生长；其中相应浓度的NTA指的是：10 mmol·kg^-1NTA；向相应的处理组添加菌液指的是加入：15mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

（3）生物量的测定：播种35d后收获草坪植物，分为地上和地下部，经去离子水反复冲洗后，将其放入烘箱中，80℃条件下烘干至恒重，测其干重，最后用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cu、Zn含量。

Claims (2)

1.一种采用含有NTA及微生物菌液的菌剂强化高羊茅修复污灌区土壤重金属的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）材料的处理：

草坪植物高羊茅(Festuca arundinacea L.)为实验材料；

菌液为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌，按照施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌体积1：1：1的比例混合，配制成复合微生物菌液；其中施氏假单胞菌和灰黄链霉菌的菌落数分别为 (2.15±0.03)×10⁹/ml，(2.07±0.07)×10⁹/ml，里氏木霉每毫升的菌落数蔓延整个平板；

螯合剂选用氨三乙酸；

将采集的土壤去除草根、石块后平摊于透明塑料布上，放置于通风处，自然风干2~3 d后，过2 mm筛备用；

（2）实验方法：

分别以直径为7 cm、高度为8 cm的聚乙烯塑料杯为培养容器，加入170 g供试土壤，每杯播种0.5 g高羊茅种子，植物生长15d，向相应的处理组添加菌液，植物生长25d，按照实验设计分别将相应浓度的NTA和菌液，按所需剂量一次性施加于相应处理组的基质表面； NTA处理10d后收获草坪植物，实验周期为35天，草坪植物培养在实验室内进行，经常调换位置以保证光照一致，培养期间室内温度17~31℃，相对湿度38~60%，培植期间正常供水，以维持植物正常生长；其中相应浓度的NTA指的是：

5 mmol·kg^-1NTA；10 mmol·kg^-1NTA；15 mmol·kg^-1NTA；

向相应的处理组添加菌液指的是加入：

5mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

10mmol·kg^-1NTA+15mL菌液或

15mmol·kg^-1NTA+15mL菌液；

（3）生物量的测定：播种35d后收获草坪植物，分为地上和地下部，经去离子水反复冲洗后，将其放入烘箱中，80℃条件下烘干至恒重，测其干重，最后用TAS-990原子吸收分光光度计测定消化液中重金属Cd、Cu、Zn含量。

2.权利要求 1所述含有NTA及微生物菌液的菌剂在联合高羊茅强化修复污灌土重金属污染方面的应用；其中所述的修复污灌土重金属污染指的是：对高羊茅地上和根部Cd、Cu、Zn含量和积累量的修复作用。