CN104738091B - 一种抗花生连作复合菌剂的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗花生连作复合菌剂的制备及应用，复合菌剂包括抗连作花生生防菌和化感物质降解菌剂，本发明的复合菌剂对花生连作化感物质降解效率高，能有效抑制连作花生病害，减少化学农药的用量和其在土壤中的累积，对于环境污染极为重要，降解后的产物能够被细菌作为碳源转化为无害物质，增加土壤碳源，有利于作物根系对降解物质的吸收，不会对环境产生污染；该复合菌剂稳定性好，连续培养后不会发生基因突变，能够稳定遗传，能够增加土壤中有益细菌的数量，提高土壤肥力，而且本发明复合菌剂的制备方法简单，提取工艺简单，而且制备过程中不加入有毒物质，使用简单。有利于提高我国花生等作物的质量和产量。
Description
技术领域
本发明属于生物防治复合菌剂技术领域，尤其涉及一种抗花生连作复合菌剂的制备及应用，即抗花生连作化感物质降解菌和生防菌复合菌剂的制备及其应用。
背景技术
众所周知花生是重要的油料作物之一，中国是最大的花生生产国，种植总面积占世界总面积的20.4％，总产量占40.8％；2013年中国花生播种面积为471万公顷，花生总产量为1700万吨。连作花生植株矮小、生育不良，产质量下降，病虫害加剧，连作3年后减产幅度为10％～40％。据张思苏等人多年试验和调查结果，连作花生一般生长不良，减产10％以上，高者达30％以上，且随着连作年限的增加，减产愈重。花生连作多年，土壤微生物的数量与组成发生了改变，细菌数量减少，真菌数量增加。花生是我国主要的经济作物，其产量及质量关系着国计民生。我国花生面积大、产区相对集中，花生主产区常常多年连片、大规模种植，连作十分普遍，花生连作障碍已经成为影响花生高产的主要因素之一。花生连作后病害加重、产量下降。目前，生产中急需一种有效、安全、环保的抗花生连作障碍及其病害的新技术。
控制花生病害的一般方法是使用化学农药，然而，长期使用化学农药会导致病原菌产生抗药性而降低化学药剂的防病效果，同时长期使用化学药剂会造成农药残留超标和环境污染。生物防治是控制植物病害的一种新途径，它主要是利用生防菌与植物病原微生物之间的拮抗作用，抑制植物病原菌的生长。我国多数厂家生产的菌剂大多为单一菌种，功能单一，效果不显著，且花生抗连作专用菌剂在我国还很少有生产使用。
我们多年研究结果表明，花生连作障碍的主要原因是土壤生物学环境恶化、花生病害加重和邻苯二甲酸等化感物质化感作用。以花生化感物质降解菌和病害生防菌为核心的微生物修复新技术是降低花生连作障碍的有效途径。该复合菌剂降低连作给花生生产带来的风险、改善土壤微生物区系、保持土壤肥力、减低花生病害发病率，降低农药的使用量和残留，减少环境污染，有利于农业的可持续发展，提高花生及相关产品的食品安全性，提高花生品质和花生出口创汇竞争能力，对花生生产具有重要的理论和生产指导意义。
发明内容
针对现有技术中化学农药防治所存在的环境污染和病害发生严重等问题，本发明的目的是提供一种可有效分解花生化感物质降解菌和抗多种病原菌的生防菌复合菌剂，还涉及它在花生抗连作性能的应用。使用本发明所述复合菌剂，可以减少化学农药的用量及其在土壤中的累积，防止环境污染，有利于提高作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。
所述化感物质降解菌剂包括油酸降解菌株、邻苯二甲酸降解菌株和十六烷酸降解菌株，所述抗连作花生生防菌为黄色蓝状菌(Talaromyces flavus)qw12，其保藏编号为CGMCC 5067，保藏日期为2011年7月22日；所述油酸降解菌株为里拉微球菌(Micrococcuslylae)O6，其保藏编号为CGMCC 5064，保藏日期为2011年7月22日；所述邻苯二甲酸降解菌株为理氏勒米诺氏菌(Leminorella richardii)L2，其保藏编号为CGMCC 5063，保藏日期为2011年7月22日；所述十六烷酸降解菌株为紫金牛叶杆菌(Phyllobacteriummyrisacearum)C3，其保藏编号为CGMCC 5065，保藏日期为2011年7月22日；上述四种菌种均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
(1)菌种来源
土壤采集于山东省连续种植花生多年的花生地，分别是花生连作1年、2年、4年、7年的土壤，土壤类型是河潮土，土壤质地类型为砂土，花生品种为 花育16号。将样品花生根部的土样用刷子刷入自封袋，并采集根系周围2mm范围内的的土壤，总共收集土重约500g左右，冷藏用于微生物的筛选测定及化感物质的分离鉴定。
(2)菌种筛选
营养琼脂培养基(NA培养基)：蛋白胨5.0g；牛肉浸膏3.0g；葡萄糖2.5g；酵母粉1.0g；琼脂粉16.0-18.0g；蒸馏水1000ml；pH7.0-7.2。另配制NA液体培养基。马丁氏琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红100mL，琼脂15-20g，pH自然，蒸馏水800mL，临用前加入0.03％链霉稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。无碳基础培养基(CM培养基)：K2HPO4 7.5g；KH2PO4 2.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2·2H2O 15mg；NaCl 0.5g；(NH4)2SO4 2.0g；蒸馏水1000ml；pH7.2-7.6。种子培养基：蛋白胨5.0g；牛肉浸膏3.0g；葡萄糖2.5g；酵母粉1.0g；蒸馏水1000ml；pH7.0-7.2PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000mL，pH自然。
筛选步骤：取新鲜土样10g加入到分别含有油酸2％、邻苯二甲酸1‰、十六烷酸2％的100mlCM培养基中，置于150-200r/min，30℃-40℃摇床上培养24-72h。继代培养三次，吸取100μl培养液接种到NA平板上，30℃培养24h，然后根据菌落的不同形态随机挑取单菌落纯化3代后保存，待测定它们的降解效能。
向添加化感物质1g/L的CM培养基中接种后，在170r/min，30℃摇床上培养7天，不接种的处理为对照，每处理重复3次。用1:1的乙醇乙醚混合萃取液萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发，甲酯化，冷却后用正己烷萃取，用气象色谱仪检测，分选降解效率高、遗传稳定的菌株。
生防菌筛选步骤：土壤自然风干后过20目筛，采用土壤稀释分离法制备10－310－4、10－5、10－6的土壤悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的土壤悬浮液，真菌取10－3、10－4，用马丁氏琼脂培养基进行涂布。每处理重复3次，28℃培养，计数真菌的菌落数，统计每克土中真菌的总数。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。
将分离到的优势真菌接种到马铃薯培养基(PDA)上，26℃培养7天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10×40倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态。参照有关资料进行形态学鉴定。用CTAB法提取优势真菌的DNA，采用真菌核糖体18SrDNA的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。回收扩增产物，送至北京诺赛基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的DNA序列进行同源性比较。最终将菌株确定为黄色蓝状菌。
(3)菌种培养
将(2)中筛选出的菌种利用不同方式进行培养。斜面培养：斜面划线接种后放 于30℃的恒温培养箱中，细菌培养24h，真菌培养5天。种子培养：用接种针取1-2环斜面菌接入种子培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养72h。摇瓶培养：用移液枪将种子液按1％(V/V)的接种量接入发酵培养基(添加化感物质)中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡细菌培养72h，真菌培养5天
(4)复合菌剂的制备配比和载体选择
获得的复合菌剂中里拉微球菌OD值为0.5-0.8,理氏勒米诺氏菌OD值为0.6-0.8,紫金牛叶杆菌OD值为0.3-0.5。黄色蓝状菌自然生长5天，选取泥炭土，硅藻土，麸皮为载体，将一定量的载体高温灭菌，在无菌条件下将上述复合菌剂与载体混合均匀，进行培养。每7天计数微生物的活菌数并通过测定活菌数试验和大田试验研究不同菌肥的促生效果。
本发明获得的复合菌剂的主要成分为化感物质降解菌和抗连作花生生防菌的复合菌剂，理氏勒米诺氏菌有效活菌数8.9×107-6.2×108cfu/ml，里拉微球菌有效活菌数2.4×107-1.16×108cfu/ml，紫金牛叶杆菌有效活菌数6×108-3.8×109cfu/ml。其中最佳配比化感物质降解菌剂有效活菌总数1.37×109-3×1010cfu/ml。抗连作花生生防菌有效活菌数为2.4×107-1.12×108cfu/ml。按每小区200ml与3Kg麸皮混合均匀施入土壤，施入土壤后对花生茎腐病、焦斑病、网斑病、褐斑病均有显著的抑制作，产量提高5％-15％。
本发明的有益效果为：
施用复合菌剂的能够提高连作花生开花期过氧化氢酶，以及整个生育期的磷酸酶和脲酶活性，能显著提高根际细菌数量。与现有技术相比，本复合菌剂根据菌种特性添加6.5％氯化钠组分优化营养条件和培养条件，采用生物技术中常用方法，制备条件简单温和，提取工艺简单，同时具备降解花生化感物质和防治花生连作病害的优点，使用简单，大大降低了劳动强度，提高了工作效率：另外采用生物技术，以天然花生根际土壤中存在的菌种为主，能够高效的降解长期塑料薄膜覆盖残留的邻苯二甲酸、十六烷酸、油酸等根际连作残留的化感物质，抑制花生焦斑病、网斑病、褐斑病等常发叶部病害病菌的生长，有效防治植物病害，减少化学农药的用量和其在土壤中的累积，对于防治环境污染极为重要，降解后的产物能够被细菌作为碳源转化为无害物质，增加土壤碳源，有利于作物根系对降解物质的吸收，不会对环境产生污染；该复合菌剂稳定性好，连续培养后不会发生基因突变，能够稳定遗传，能够增加土壤中有益细菌的数量，提高土壤肥力，也有利于提高我国花生等作物的质量和产量，经济效益和社会效益十分显著。
本发明中抗花生连作复合菌剂的制作方法，与现有的按菌剂体积比混合发酵相比，正交实验设计高效率、快速经济，这种方法利用了微生物对数期具有增长速度快、细胞代谢能力最强、细菌很少死亡的特点。实际发酵生产中在保证营养物质补充、代谢产物排出、pH稳定、温度稳定等情况下可以扩大培养，使微生物始终处于对数期，以最快速度达到稳定期，活菌数达到最大，微生物活性最高且菌间协同作用明显。载体能够为微生物生长提供特定场所，且对微生物存活有直接影响，选用合适的载体对于菌剂的稳定性具有重要意义，使用 未经发酵的麸皮做载体孔隙大，施入土壤中能增加土壤的透气性，提高土壤的溶氧量，增加其在土壤中的繁殖速率，提高抗花生连作的功效，代谢后的产物能做为碳源被微生物利用，保持微生物活性，促进其效果。
附图说明
图1-1筛选的里拉微球菌细菌菌落形态。
图1-2筛选的理氏勒米诺氏菌细菌菌落形态。
图1-3筛选的紫金牛叶杆菌细菌菌落形态。
图2筛选的黄色蓝状菌真菌菌落。
图3复合菌剂的气相色谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)菌种来源
土壤采集于山东省连续种植花生多年的花生地，分别是花生连作1年、2年、4年、7年的土壤，土壤类型是河潮土，土壤质地类型为砂土，花生品种为花育16号。将样品花生根部的土样用刷子刷入自封袋，并采集根系周围2mm范围内的的土壤，总共收集土重约500g左右，冷藏用于微生物的筛选测定及化感物质的分离鉴定。
(2)菌种筛选
营养琼脂培养基(NA培养基)：蛋白胨5.0g；牛肉浸膏3.0g；葡萄糖2.5g；酵母粉1.0g；琼脂粉16.0-18.0g；蒸馏水1000ml；pH7.0-7.2。另配制NA液体培养基。马丁氏琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红100mL，琼脂15-20g，pH自然，蒸馏水800mL，临用前加入0.03％链霉稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。无碳基础培养基(CM培养基)：K2HPO4 7.5g；KH2PO4 2.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；CaCl2·2H2O 15mg；NaCl 0.5g；(NH4)2SO4 2.0g；蒸馏水1000ml；pH7.2-7.6。种子培养基：蛋白胨5.0g；牛肉浸膏3.0g；葡萄糖2.5g；酵母粉1.0g；蒸馏水1000ml；pH7.0-7.2PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，水1000mL，pH自然。
筛选步骤：取新鲜土样10g加入到分别含有油酸2％、邻苯二甲酸1‰、十六烷酸2％的100mlCM培养基中，置于180r/min，30℃摇床上培养36h。继代培养三次，吸取100μl培养液接种到NA平板上，30℃培养24h，然后根据菌落的不同形态随机挑取单菌落纯化3代后保存，待测定它们的降解效能。向添加化感物质1g/L的CM培养基中接种后，在170r/min，30℃摇床上培养7天，不接种的处理为对照，每处理重复3次。用1:1的乙醇乙醚混合萃取液萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发，甲酯化，冷却后用正己烷萃取，用气象色谱仪检测。从而选取降解效率高、遗传稳定的菌株。
生防菌筛选步骤：土壤自然风干后过20目筛，采用土壤稀释分离法制备10－310－4、10－5、10－6的土壤悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的土壤悬浮液，真菌取10－3、10－4，用马丁氏琼脂培养基进行涂布。每处理 重复3次，28℃培养，计数真菌的菌落数，统计每克土中真菌的总数。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。
将分离到的优势真菌接种到马铃薯培养基(PDA)上，26℃培养7天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10×40倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态。参照有关资料进行形态学鉴定。用CTAB法提取优势真菌的DNA，采用真菌核糖体18SrDNA的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。回收扩增产物，送至北京诺赛基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的DNA序列进行同源性比较。最终将菌株确定为黄色蓝状菌。
(3)菌种培养
斜面培养：斜面划线接种后放于30℃的恒温培养箱中，细菌培养24h，真菌培养5天。种子培养：用接种针取1-2环斜面菌接入种子培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养72h。摇瓶培养：用移液枪将种子液按1％(V/V)的接种量接入发酵培养基(添加化感物质)中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养细菌培养72h，真菌培养5天。
(4)复合菌剂的制备配比和载体选择
获得的复合菌剂为里拉微球菌OD值为0.8，理氏勒米诺氏菌OD值为0.6,紫金牛叶杆菌OD值为0.5。黄色蓝状菌自然生长5天。选取泥炭土，硅藻土，麸皮为载体，将一定量的载体高温灭菌，在无菌条件下将上述复合菌剂与载体混合均匀，进行培养。每7天计数微生物的活菌数并通过测定活菌数试验和大田试验研究不同菌肥的促生效果。
本实施例制备复合菌剂理氏勒米诺氏菌有效活菌数6.2×108cfu/ml，里拉微球菌有效活菌数1.16×108cfu/ml，紫金牛叶杆菌有效活菌数3.8×109cfu/ml。其中化感物质降解菌剂有效活菌总数3×1010cfu/ml。抗连作花生生防菌有效活菌数为1.12×108cfu/ml。按每小区200ml与3Kg麸皮混合均匀施入土壤，施入土壤后对花生茎腐病、焦斑病、网斑病、褐斑病均有显著的抑制作用，产量提高12.5％。
各菌生长对数期为水平设计L9(34)正交表
实施例2
(1)菌种来源
菌种来源同实施例1.
(2)菌种筛选
培养基同实施例1.
筛选步骤：取新鲜土样10g加入到分别含有油酸2％、邻苯二甲酸1‰、十六烷酸2％的100mlCM培养基中，置于170r/min，30℃摇床上培养72h。继代培养三次，吸取100μl培养液接种到NA平板上，30℃培养24h，然后根据菌落的不同形态随机挑取单菌落纯化3代后保存，待测定它们的降解效能。
向添加化感物质1g/L的CM培养基中接种后，在170r/min，30℃摇床上培养7天，不接种的处理为对照，每处理重复3次。用1:1的乙醇乙醚混合萃取液萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发，甲酯化，冷却后用正己烷萃取，用气象色谱仪检测。从而选取降解效率高、遗传稳定的菌株。
生防菌筛选步骤：土壤自然风干后过20目筛，采用土壤稀释分离法制备10－310－4、10－5、10－6的土壤悬浮液。根据所分离的微生物，取不同浓度的土壤悬浮液，真菌取10－3、10－4，用马丁氏琼脂培养基进行涂布。每处理重复3次，28℃培养，计数真菌的菌落数，统计每克土中真菌的总数。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点，从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌，进行编号保存，待进一步鉴定。
将分离到的优势真菌接种到马铃薯培养基(PDA)上，26℃培养7天后，描述菌落质地、形状、大小、隆起形状和颜色等，同时在光学显微镜(10×40倍)下观察菌株的分生孢子和分生孢子梗形态。参照有关资料进行形态学鉴定。用CTAB法提取优势真菌的DNA，采用真菌核糖体18SrDNA的通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。回收扩增产物，送至北京诺赛基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的DNA序列进行同源性比较。最终将菌株确定为黄色蓝状菌。
(3)菌种培养
斜面培养：斜面划线接种后放于30℃的恒温培养箱中，细菌培养24h，真菌培养72h。种子培养：用接种针取1-2环斜面菌接入种子培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养72h。摇瓶培养：用移液枪将种子液按1％(V/V)的接种量接入发酵培养基(添加化感物质)中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养细菌培养72h，真菌培养72h。
(4)复合菌剂的制备配比和载体选择
获得的复合菌剂为里拉微球菌OD值为0.6,理氏勒米诺氏菌OD值为0.7, 紫金牛叶杆菌OD值为0.3。黄色蓝状菌自然生长3天。选取泥炭土，硅藻土，麸皮为载体，将一定量的载体高温灭菌，在无菌条件下将上述复合菌剂与载体混合均匀，进行培养。每7天计数微生物的活菌数并通过测定活菌数试验和大田试验研究不同菌肥的促生效果。
该实施例获得的复合菌剂理氏勒米诺氏菌有效活菌数5.2×107cfu/ml，里拉微球菌有效活菌数9.0×107cfu/ml，紫金牛叶杆菌有效活菌数3.5×107cfu/ml，化感物质降解菌剂有效活菌总数3×1010cfu/ml，抗连作花生生防菌有效活菌数为1.12×108cfu/ml。按每小区200ml与3Kg麸皮混合均匀施入土壤，施入土壤后对花生茎腐病、焦斑病、网斑病、褐斑病均有显著的抑制作，产量提高4.4％。
表1 复合菌剂对花生叶片病抑病效果和产量的影响
Claims (6)
1.一种抗花生连作复合菌剂，其特征在于，包括抗花生病原微生物生防菌和分解化感物质的降解菌剂，根据菌种特性添加6.5％氯化钠组分优化营养条件和培养条件，以及筛选能同时适应上述菌种生长的麸皮作为载体，其用量为3Kg+200ml菌液，增加其在土壤中的繁殖速率，提高抗花生连作的功效，所述菌种均保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述分解化感物质的降解菌剂包括油酸降解菌株、邻苯二甲酸降解菌株和十六烷酸降解菌株，所述抗花生病原微生物生防菌为黄色蓝状菌(Talaromyces flavus)qw12，其保藏编号为CGMCC 5067，所述油酸降解菌株为里拉微球菌(Micrococcus lylae)06，其保藏编号为CGMCC 5064，所述邻苯二甲酸降解菌株为理氏勒米诺氏菌(Leminorellarichardii)L2，其保藏编号为CGMCC 5063，所述十六烷酸降解菌株为紫金牛叶杆菌(Phyllobacterium myrisacearum)C3，其保藏编号为CGMCC5065；
该抗花生连作复合菌剂的制作方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)菌种培养
斜面培养：斜面划线接种后放于30℃的恒温培养箱中，细菌培养24h，真菌培养5天；
(2)复合菌剂的制备配比和载体选择
斜面保藏的细菌菌株使用种子培养基活化，之后取1％接种量接入种子培养基进行培养测定OD600，真菌采用称干重法确定微生物生长对数期，以菌种为因素，各菌生长对数期为水平设计L9(34)正交表，通过气相色谱法和平板对峙试验测定其效果并优选出当复合菌剂中里拉微球菌OD值为0.8，理氏勒米诺氏菌OD值为0.6，紫金牛叶杆菌OD值为0.5，黄色蓝状菌自然生长5天，称干重为0.524g时为复合菌剂的最佳配比，降解菌群对化感物质的降解率89.35％，是对照的2.92倍，单独选取麸皮为载体在无菌条件下取200ml上述复合菌剂与3kg的载体混合均匀，进行培养，每7天计数微生物的活菌数并通过测定活菌数试验和大田试验研究不同菌肥的促生效果。
2.根据权利要求1所述一种抗花生连作复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂中里拉微球菌OD值为0.5-0.8，理氏勒米诺氏菌OD值为0.6-0.8，紫金牛叶杆菌OD值为0.3-0.5，黄色蓝状菌自然生长5天，干重为0.524g。
3.根据权利要求1所述一种抗花生连作复合菌剂，其特征在于，所述理氏勒米诺氏菌有效活菌数8.9×107-6.2×108cfu/ml，所述里拉微球菌有效活菌数2.4×107-1.16×108cfu/ml，所述紫金牛叶杆菌有效活菌数6×108-3.8×109cfu/ml，其中最佳配比化感物质降解菌剂有效活菌总数1.37×109-3×1010cfu/ml，所述抗连作花生生防菌有效活菌数为2.4×107-1.12×108cfu/ml。
4.根据权利要求1所述一种抗花生连作复合菌剂，其特征在于，所述步骤(1)中的菌种培养可以选择种子培养：用接种针取1-2环斜面菌接入种子培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养72h。
5.根据权利要求1所述一种抗花生连作复合菌剂，其特征在于，所述步骤(1)中的菌种培养可以选择摇瓶培养：用移液枪将种子液按V/V为1％的接种量接入添加化感物质的发酵培养基中，250ml三角瓶的装液量为100ml，置于170r/min，30℃振荡培养细菌培养72h，真菌培养5天。
6.一种如权利要求1所述的抗花生连作复合菌剂在防治花生病害中的应用，其特征在于，所述病害包括茎腐病、焦斑病、网斑病和褐斑病。
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