CN106434374A - 棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用 - Google Patents

棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用。本发明从湖南衡东县含镉土壤中分离到一株棘孢木霉HD228，其保藏编号为CGMCC No.12870。该菌具有高镉吸附能力，并对水稻具有促生作用，对镉胁迫水稻具有解毒作用。因此，棘孢木霉HD228具有在镉污染水稻田土壤修复过程中发挥双重功效的潜力，可为镉污染土壤微生物修复工程提供良好的菌种。本发明对镉污染水稻田镉污染修复具有重要的理论与现实意义。

Description

棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用
技术领域
本发明涉及微生物学及生态修复技术领域，具体地说，涉及一种棘孢木霉及其在重金属污染修复中的应用。
背景技术
2012年，据报道全国镉严重污染土地已超过1.33万hm2。湖南是镉污染重灾区，采样测定发现湖南衡东大浦镇工业园附近田块镉含量甚至达到130mg/kg，是土壤环境质量二级标准值的433倍，而攸县、湘阴、长沙、常宁等部分地区水稻田也受到不同程度镉污染。水稻镉污染主要直接来源为土壤，镉污染稻田土壤修复的任务越来越紧迫。镉污染稻田土壤修复的方法有物理化学方法、生物修复、微生物修复等方法。传统的物理化学修复方法收效较快但工程量大，需要消耗大量能源或化学制品等，成本较高，某些钝化剂的使用甚至会造成修复污染土壤同时对土壤理化性质产生不良作用，从而影响土壤的后续利用。生物修复方法操作不便，而利用微生物吸附的方法有广阔的应用前景。微生物数量多、比表面积大、代谢活性旺盛，可通过多种机制包括主动吸收、结晶、螯合、化学形态改变、离子交换、胞内外沉淀、细胞壁或色素吸附等与重金属发生作用而减少环境中重金属含量或改变其生物有效性，使微生物修复较物理、化学、生物修复等修复技术操作简单、处理费用低、效果好。木霉菌广泛存在于土壤当中，来源广，且对营养物质、通气量、温度、pH的变化相对不敏感，易于发酵，适合于大规模生产，成本低。经济上和生态上、操作上的多重优势使木霉在重金属污染治理中具有巨大潜力和广阔的应用前景。国内外有从废水、煤矿区和工业区等土壤中筛选到具有高耐镉能力和镉吸附能力的真菌，如臭曲霉菌、青霉菌、酵母菌等相关报道，但从水稻田土壤筛选到的耐镉真菌较少，适应重金属污染环境是应用微生物进行生物修复的前提，本土微生物更能适应重金属污染稻田土壤特殊环境。因此，筛选镉污染水稻田耐镉真菌并研究其镉吸附特性等，可丰富稻田镉污染微生物修复菌种资源。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐镉的棘孢木霉菌HD228。
本发明的另一目的是提供菌株HD228在重金属污染修复中的应用。
为了实现本发明目的，本发明从湖南衡东县含镉土壤中分离到一株木霉菌HD228，该菌在PDA培养基平板上，菌落生长迅速(图2a)，黑暗条件下30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为56mm、28mm，40℃抑制生长；白色透明菌丝紧贴平板快速延伸，36h左右形成白色绒状菌落；48h左右从菌落中部开始形成绿色孢子，菌落外围逐渐产生孢子，整个菌落慢慢变成绿色，随着孢子渐渐成熟，菌落变为深绿色，无黄色色素分泌；菌落背面也呈绿色。分生孢子梗(图2b)以相对主轴90℃或接近90℃伸出，通常对生。孢子梗呈安瓿瓶形，分生孢子为球形或椭球形(图2c)，大小为(2.5-3μm)×(3-4μm)，表面粗糙，布满小突起。菌株HD228在生长后期散发椰子香味。按照《真菌鉴定手册》索引表进行菌株形态鉴定。
菌株HD228的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，将其ITS序列在GenBank中进行比对，并构建菌株HD228的系统进化树(图1)。
综合菌株形态特征、ITS基因序列系统进化分析结果，鉴定其为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.12870，保藏日期2016年8月8日。
棘胞木霉HD228能在pH 4-8、温度20-35℃条件下良好生长，最适生长和耐镉pH为5，最适培养温度为30℃。
将不含Cd2+平板上的生长7d的HD228菌体刮入不含Cd2+的PDA液体培养基中，150rpm摇床28℃培养7d后8000rpm离心15min，在无菌条件下分别称取0.1g、0.5g、1g、1.5g(为菌丝体干重，取1g湿菌丝体置于60℃烘箱中烘干，直至菌丝质量恒定不变，计算湿菌丝体干重)菌丝体分别接种于100mg/L和200mg/L的含Cd2+PDA液体培养基中，为避免培养基对Cd2+的吸附，分别以100mg/L、200mg/L不加菌丝体为对照，150rpm摇床28℃培养7d后8000rpm离心15min，用原子吸收分光光度法测定上清液中Cd2+浓度；用下面的公式计算菌株镉吸附率；所有试验均设三次重复，结果取平均值。
镉吸附率Ar(100％)＝(Cc－Ct)/Cc×100％
式中，Cc为对照上清液的Cd2+终浓度(mg/L)；Ct为菌丝吸附后上清液中Cd2+浓度(mg/L)。
菌株HD228菌丝添加量为1.5g时，镉吸附率为79.88％。菌丝添加量为1.5g和1.0g时镉吸附率差异不显著。Cd2+初始浓度一定时，镉吸附率随HD228菌丝量的增加而升高。
菌株HD228对Cd2+最高耐受浓度为22mM，Cu2+对菌株HD228的MIC值(最低抑制浓度)为40mM，Zn2+和Pb2+对菌株HD228的MIC值均高于80mM。菌株HD228的菌落直径与重金属浓度呈负相关，Cd2+浓度为20mM时菌落不规则。
本发明还提供含有所述棘孢木霉HD228的菌剂。
本发明还提供所述棘孢木霉HD228在重金属污染修复中的应用。所述应用是将菌株HD228的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液喷施于重金属污染的土壤中。
本发明所述重金属包括Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+等。
本发明还提供所述棘孢木霉HD228在制备重金属污染降解试剂中的应用。其中，所述重金属污染降解试剂中的活性成分为菌株HD228的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液。
本发明还提供所述棘孢木霉HD228在植物(例如水稻)抗镉促生中的应用。所述应用是将菌株HD228的菌丝体、菌饼、发酵液、菌体裂解液或孢子悬液接种至水稻的根、茎、叶片上，优选在水稻分蘖期和扬花期分别喷施菌株HD228的发酵液。
实验表明，菌株HD228的适量发酵液对水稻种出苗、幼苗生长无抑制作用，HD228发酵液用量40mL(每200g土壤)对水稻生长具有促进作用，对镉胁迫具有解毒作用。耐镉真菌HD228具有应用于镉污染水稻田治理的潜力。
水稻田中的菌株HD228发酵液以每亩100-1000毫升施用于水稻田，可有效降低稻米中的镉含量。
还可以将棘孢木霉HD228制备成液体制剂，每毫升制剂含有109～1012个分生孢子，每公斤液体制剂用600-800倍清水混匀，水稻移栽后进行灌根处理。
本发明提供的具有高镉吸附能力的耐镉木霉菌对水稻具有促生作用，对镉胁迫水稻具有解毒作用。因此，棘孢木霉HD228具有在镉污染水稻田土壤修复过程中发挥双重功效的潜力，可为镉污染土壤微生物修复工程提供良好的菌种。本发明对镉污染水稻田镉污染修复具有重要的理论与现实意义。
附图说明
图1为基于菌株HD228ITS区基因序列构建的系统发育树。
图2为本发明棘孢木霉HD228的形态特征；其中，a为HD228在PDA培养基上的菌落形态特征，b为HD228的分生孢子梗、分生孢子和具隔菌丝，c为HD228的分生孢子。
图3为本发明实施例2中菌丝不同添加量对镉的吸附率影响；其中，a、b、c分别表示添加不同菌丝量时Cd2+吸附率差异显著(p<0.05)。
图4为本发明实施例3中不同重金属离子对HD228菌株生长的影响；其中，a、b、c、d、e分别表示在同一种重金属不同浓度培养基中菌落直径差异显著(p<0.05)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1菌株HD228的分离与鉴定
1、菌株的分离
土壤样品采自湖南省衡东县，属于湘江流域稻田，采样点用GIS地图工具(Garmin)定位采集一季晚稻田5-20cm土壤2kg，混匀后分装于两个无菌密封袋，一袋置于冰盒中4℃保存，一袋风干测定土壤重金属含量及pH值等。土壤样品中Cd、Cu、Zn、Pb含量分别为32.09mg/kg、30.9mg/kg、347.9mg/kg、86.0mg/kg，土壤pH值为4.7。
取4℃保存的土壤10mg溶于90mL无菌去离子水中，磁力搅拌30min制备土壤悬浮液。取土壤悬浮液1mL接种于含2mM Cd(NO3)2的PDA液体培养基中，并加入链霉素(30mg/L)抑制细菌生长，振荡培养箱中28℃、150rpm条件下耐镉真菌富集培养7d。取耐镉真菌富集培养稀释液100μL涂布于2mM Cd2+PDA平板上，28℃培养7d后生长良好的菌落依次转接于更高浓度(4mM、8mM、16mM)Cd2+PDA平板上，梯度驯化培养，筛选得到镉耐性最强的菌株作为进一步研究的供试菌株。
2、菌株的鉴定
(1)耐镉真菌HD228的形态学分析：将棘孢木霉HD228单点接种于PDA培养基平板上，分别于25℃、30℃、35℃、40℃黑暗培养，7d后测量菌落直径，观察产孢情况，正反面菌落颜色和可溶性色素有无；菌丝、分生孢子梗、分生孢子器观察用电子扫描显微镜。按照《真菌鉴定手册》索引表进行菌株形态鉴定。
2、菌株HD228的ITS基因序列PCR扩增与序列测定：
灭菌牙签挑取真菌菌丝100mg，用Omega真菌DNA小量提取试剂盒提取分离真菌DNA。ITS序列是使用最广泛的真菌标记序列，用ITS通用引物ITS-1(5’-TCCTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS-4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增ITS序列。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45s,55℃退火45s，72℃延伸1min，35次循环；72℃7min，10℃终止反应。PCR产物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司测定，菌株HD228的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。登录NCBI的GenBank数据库中进行Blast，比对ITS基因序列，并从中获得参考序列进行系统进化分析(图1)。
本发明采用Cd2+浓度梯度压力驯化法从镉污染稻田土壤中分离到耐镉菌株HD228。综合菌株的形态特征、ITS基因序列系统进化分析结果，鉴定其为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，Cd吸附率可达79.88％；Cd2+最高耐受浓度为22mM；且其他几种常见重金属Pb、Zn、Cu对菌株HD228的最低抑制浓度(MIC)也很高。菌株HD228菌落直径与重金属浓度呈负相关，镉离子浓度在20毫摩尔时菌落不规则。
棘胞木霉HD228能在pH 4-8、温度20-35℃条件下良好生长，最适生长和耐镉pH值为5，最适培养温度为30℃。温度和pH均不影响耐镉能力。
在PDA培养基平板上，菌落生长迅速(图2a)，黑暗条件下30℃、35℃培养72h，菌落半径分别为56mm、28mm，40℃抑制生长；白色透明菌丝紧贴平板快速延伸，36h左右形成白色绒状菌落；48h左右从菌落中部开始形成绿色孢子，菌落外围逐渐产生孢子，整个菌落慢慢变成绿色，随着孢子渐渐成熟，菌落变为深绿色，无黄色色素分泌；菌落背面也呈绿色。分生孢子梗(图2b)以相对主轴90℃或接近90℃伸出，通常对生。孢子梗呈安瓿瓶形，分生孢子为球形或椭球形(图2c)，大小为(2.5-3μm)×(3-4μm)，表面粗糙，布满小突起。菌株HD228在生长后期散发椰子香味。
实施例2耐镉菌株HD228对镉的吸附能力试验
将不含Cd2+平板上的生长7d的HD228菌体刮入不含Cd2+的PDA液体培养基中，150rpm摇床28℃培养7d后8000rpm离心15min，在无菌条件下分别称取0.1g、0.5g、1g、1.5g(为菌丝体干重，取1g湿菌丝体置于60℃烘箱中烘干，直至菌丝质量恒定不变，计算湿菌丝体干重)菌丝体分别接种于100mg/L和200mg/L的含Cd2+PDA液体培养基中，为避免培养基对Cd2+的吸附，分别以100mg/L、200mg/L不加菌丝体为对照，150rpm摇床28℃培养7d后8000rpm离心15min，用原子吸收分光光度法测定上清液中Cd2+浓度；用下面的公式计算菌株镉吸附率；所有试验均设三次重复，结果取平均值。
镉吸附率Ar(100％)＝(Cc－Ct)/Cc×100％
式中，Cc为对照上清液的Cd2+终浓度(mg/L)；Ct为菌丝吸附后上清液中Cd2+浓度(mg/L)。
菌株HD228菌丝添加量为1.5g时，镉吸附率为79.88％。菌丝添加量为1.5g和1.0g时镉吸附率差异不显著。Cd2+初始浓度一定时，镉吸附率随HD228菌丝量的增加而升高。
菌株HD228对Cd2+最高耐受浓度为22mM，Cu2+对菌株HD228的MIC值(最低抑制浓度)为40mM，Zn2+和Pb2+对菌株HD228的MIC值均高于80mM。菌株HD228的菌落直径与重金属浓度呈负相关，Cd2+浓度为20mM时菌落不规则。(图3)
实施例3菌株HD228镉耐性及其他重金属耐性试验
取16mM Cd2+平板上分离的HD228菌丝，先后接种于20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM等Cd2+浓度的PDA平板上，28℃培养7d，直至菌落不长出，此Cd2+浓度即为Cd对HD228的MIC值；用直径5mm打孔器在长有HD228单菌落的PDA平板上打出菌碟，接种于含Pb(NO3)2(0、5mM、10mM、20mM、40mM、80mM)、ZnSO4(0、10mM、20mM、40mM、80mM)、CuSO4(0、5mM、10mM、20mM、30mM)PDA平板上，28℃培养7d，用直尺十字交叉法测定菌落直径，平板上菌落直径大小可以反映真菌生长的生物量大小。研究菌落生物量大小与镉污染水稻田常见的其他几种重金属离子浓度的关系，用以探究HD228对它们的耐性水平，即测MIC值；所有试验均设三次重复。
HD228能在22mM的Cd2+平板上生长良好，当浓度为Cd2+浓度23mM时，无菌落形成，由此得出Cd对其MIC值为23mM。随重金属离子浓度升高，各菌落直径均减小，说明各重金属对菌株HD228生长均有抑制作用。在Cu2+浓度为40mM时，无菌落长出，Pb2+、Zn2+为80mM时，菌落均能生长，但受到明显抑制，只有少量菌丝出现，未形成菌落。在Cu2+浓度为40mM时，HD228未长出，Pb2+、Zn2+为80mM时，菌落均能生长，但受到明显抑制，少量菌丝长出，未形成菌落，Zn2+对其抑制作用略小于Pb2+，Cu、Zn、Pb对HD228的MIC值分别为40mM、>80mM、>80mM。以上所有重金属的MIC值均远高于土壤环境质量二级标准浓度(pH≤6.5，Pb：250mg/kg，Zn：200mg/kg，Cu：50mg/kg，Cd：0.3mg/kg)，说明菌株HD228对这几种重金属均有耐性。MIC值与耐性成正比，HD228对以上几种重金属的耐性强弱顺序为：Zn2+>Pb2+>Cu2+>Cd2+。(图4)
由于镉污染源中常常含有多种其他重金属，导致镉污染土壤常常是多种重金属复合污染。菌株HD228在PDA固体培养基上生长时能耐高浓度镉22mM，对Pb、Zn、Cu也具有很强的耐性。通常能吸附某种重金属的微生物不只对这一种重金属具有吸附特性，耐镉菌株HD228能耐多种重金属的特性将有利于其适应复合污染土壤环境，发挥吸附多种重金属的潜力。
实施例4菌株HD228对水稻生长以及对镉胁迫水稻生长的影响
微生物应用于水稻田进行镉污染治理的前提是其对水稻生长安全，不诱发疾病，不抑制生长。某些真菌在自然界中常常引发作物腐烂、致病，某些真菌甚至产生毒素影响作物生长。幼苗对环境胁迫敏感，故进行HD228对水稻致病情况和对出苗率、幼根、幼苗生长影响研究，按A组设计试验处理；同时设计处理组B探究菌株HD228是否对镉胁迫水稻具有解毒作用。种植土为采自湖南省农科院的水稻田土壤(Cd含量为0.28mg/kg)，200mL烧杯中各加入风干土壤200mg。均在播种前施加HD228发酵液(发酵液为HD228在PDA液体培养基中150rpm、30℃振荡培养7d，分子孢子含量为109～1012个/mL发酵液)并充分搅拌均匀，每杯加入10颗出芽整齐(芽长为谷粒长的2/3)水稻种，水稻种先用30％H2O2灭菌10min，灭菌去离子水清洗5次后浸种、破胸、催芽处理。每个处理3次重复。A组处理：HD228发酵液0、20mL、40mL、60mL、80mL，B组处理：每杯加入CdCl2溶液使土壤Cd2+浓度为200mg/kg，HD228发酵液0、20mL、40mL、80mL，CdCl2溶液先加在发酵液中，各补充无菌去离子水至总体积为120mL，充分混匀后倒入烧杯中搅拌均匀。12h昼(32℃)夜(26℃)交替培养，2d后统计出苗率，8d后测定水稻苗长、苗鲜重、根鲜重。计算平均苗长和根长。
添加HD228发酵液处理的水稻在生长过程中未出现病征，所有水稻种均出苗，出苗率均为100％，即HD228不影响水稻种出苗且对水稻生长安全。HD228发酵液20-40mL能显著促进苗长增加；20-60mL显著促进苗鲜重增加，80mL用量苗长增加不显著；60-80mL显著促进根鲜重增加，20mL时根鲜重显著低于对照。根系吸收营养物质供地上部分生长使用，地上部分的增长是植物生物量增加的重要体现，因而HD228发酵液施加量为40mL/200g土壤时对水稻的促生作用最佳(表1)。
当添加Cd2+200mg/kg时，水稻生长受到明显抑制，但添加耐镉真菌发酵液后，水稻生长状况有所改变：HD228发酵液20-40mL显著增加苗长，40mL显著增加苗鲜重，40-80mL显著增加根鲜重，80mL对苗长有显著抑制作用，因而40mL剂量对镉胁迫水稻植株生物量的增加效果最佳(表1)。
表1耐镉真菌HD228对水稻生长的影响
还可以将菌株HD228发酵液以每亩300毫升施用于水稻田，采用喷雾器，在水稻分蘖盛期和扬花期分别喷洒1次，可有效降低稻米中的镉含量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HD228，其保藏编号为CGMCC No.12870。
2.含有权利要求1所述棘孢木霉HD228的菌剂。
3.权利要求1所述棘孢木霉HD228在重金属污染修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是将菌株HD228的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液喷施于重金属污染的土壤中。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述重金属包括Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+。
6.权利要求1所述棘孢木霉HD228在制备重金属污染降解试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重金属污染降解试剂中的活性成分为菌株HD228的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液。
8.权利要求1所述棘孢木霉HD228在植物抗镉促生中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述应用是将菌株HD228的菌丝体、菌饼、发酵液、菌体裂解液或孢子悬液接种至水稻的根、茎、叶片上，优选在水稻分蘖期和扬花期分别喷施菌株HD228的发酵液。
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