CN109022286A - 一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法 - Google Patents

一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于降低农作物重金属含量的固体微生物菌剂，以农作物下脚料为基料，微生物固体发酵后生产出能够降低农作物重金属的菌剂。其中：所述重金属主要为铅，所述物料包括米糠和麸皮，所述微生物为实验室从土壤中分离的一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。本发明可以解决目前农作物重金属超标，对人体和农业经济发展造成严重损失以及重金属污染土地修复难的问题。同时可以解决农作物下脚料的再利用问题。

Description

一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及环境污染的微生物修复技术。具体涉及一种能够减少粮果蔬吸收重金属铅的棘孢木霉菌株，以及含有该棘孢木霉菌的微生物菌剂，还涉及它们在减少粮果蔬吸收重金属铅方面的应用。
背景技术
重金属污染是目前国际上严峻的土壤污染问题之一。铅及其化合物是常见的环境重金属污染物，主要来源于人类的生活和生产活动。煤燃烧、汽车尾气排放、蓄电池生产、矿石开采、肥料使用等都会导致铅元素进入大气、水和士壤，由此引发铅环境污染问题。研究证明，铅进入植物体造成根系伤害外，叶片中的铅将取代中心镁离子，破坏叶肉中叶绿体结构和影响叶绿素酶的活性，引起叶绿素含量下降。叶绿素遭受破坏后，光合作用能力减弱。同时它还可以通过植物根系在植物体内富积，并且可以通过食物链进入人体和动物体内危害其健康。
据2014年全国土壤污染调查公报显示，全国土壤总的超标率为16.1％，其中轻微、轻度、中度和重度污染点位比例分别为11.2％、2.3％、1.5％和1.1％。污染类型以无机型为主，有机型次之，复合型污染比重较小，无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8％。其中无机污染物主要以镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌、镍8种为主。传统的土壤重金属污染治理往往采取先停耕治理然后复耕的方法，费时费力。由于土壤污染可来源于灌溉水、大气循环等，治理完成一段时间后往往会再次污染。
因此，本发明可以在很大程度上解决土壤重金属污染治理反复的问题，利用从土壤中分离所得的一株棘孢木霉菌株发酵制得菌剂。在植物生长过程中施用，可有效减少植物体对铅的富集，调节植物根圈微生物菌群，并可作为有机肥料供植物生长利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂。可以避免土壤修复过程中治理反复，在农作物耕种的同时一同施用，并能够作为有机肥料提供一部分植物生长所需养分。同时提高农作物下脚料米糠、麸皮的利用价值。
本发明的生产技术方案如下：
本发明涉及一种木霉，从土壤分离纯化中得到。利用形态特征，培养性状，生理生化特征等微生物学 特征以及ITS rDNA序列同源性分析等方法鉴定该木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。该菌株已于 中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号。保藏日期为2016年01月14日，保藏号为CGMCC No.12071。
(1)以重量分数计，麸皮58份，米糠38.5份，硫酸锌2份，蛋白胨1份，蔗糖0.5份，加入75％的去离子水配制成固体培养基，灭菌后备用。
(2)对棘孢木霉菌株进行培养，得种子液；
将步骤(2)所得种子液接种到步骤(1)的固体培养基上发酵。
(3)发酵产品取出后烘干粉碎即得微生物菌剂。
(4)本发明所述的微生物菌剂制备方法中，步骤(1)所述的固体培养基配制完成后盛装在第发酵盒中灭菌并进行后续的培养，培养基厚度2.5cm。
步骤(4)所述发酵盒外覆有耐高温的聚丙烯塑料袋，并在开口处塞有棉塞，以保证通气，保持水分。
本发明所述的微生物菌剂制备方法中，步骤(2)所得的种子液的制备包括如下步骤：
(5)固体培养皿培养：将棘孢木霉菌种在无菌条件下接种于固体PDA培养基，在20-30℃，优选25℃下，培养2-5天，优选3天。
(6)种液发酵：将制好的孢子悬液在无菌环境下按2％的比例接种到配好的PD液体种子培养基上，在 20-30℃，优选25℃；摇床转速120-180rpm，优选160rpm；培养36-72小时，优选48小时，得种子液。
步骤(6)所述孢子悬液是在无菌环境下用无菌水洗固体培养皿培养好的棘孢木霉真菌孢子，并用无菌水稀释至107cfu/mL所得。
上述固体PDA培养基和液体PD培养基均按常规方法制备。
步骤(2)所述发酵具体条件为在在20-30℃，优选25℃；培养15-20天，优选18天。
本发明所制得的微生物菌剂有效活菌数在30亿/克以上，有机质含量70％以上。
本发明微生物菌剂的使用方法：将上述微生物菌剂拌种并在植物生长期内加水根部冲施。
本发明微生物菌剂的使用量：固体菌剂每亩初次使用量为2kg，后期追施2-3次，每次0.5kg左右。
本发明的有益效果是：利用麸皮和米糠作为培养主要基质，可以充分利用农作物下脚料，提高资源利用率，戌本低廉。本微生物菌剂制备方法可以在很大程度上减少菌剂制作过程的工序步骤，米糠和麸皮可以直接作为棘孢木霉菌丝体和孢子的载体以及保护剂，省掉了后期复配的工作。进一步的，棘孢木霉可以有效利用米糠和麸皮中的纤维素，菌剂在施用后可以很大程度上保证菌株后续的营养需求，同时可为植物根圈其他微生物所利用，提高植株根圈微生物的活跃程度，在降低植株体内重金属铅的含量的同时促进植株更加健康的生长。
具体实施方式
实例1
一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法，挑取活化完成的棘孢木霉菌种接种于PDA培养基于培养箱25℃条件下培养3天。待平板长满绿色的棘孢木霉孢子，用无菌水冲洗，制成孢子浓度为1 ×107cfu的孢子悬液。取配制好的菌悬液2mL接至装有100mL PD培养液的250mL锥形瓶中，25℃，160r/min 震荡培养48小时。培养完成后将种子液接种于灭菌的固体培养基。盒装固体培养基配制方法如下：取麸皮180g、米糠120g、硫酸锌6g、蛋白胨3g、蔗糖1.5g，加入225ml去离子水充分拌匀。125℃灭菌30min。在保证充足光照的条件下26℃培养。培养期间适当翻动培养基以使菌株更加充分的利用营养物质，产生更多的菌株和孢子。18天后菌丝体生长充分，孢子产生量达到峰值。终止发酵，将发酵完成的固体培养基取出于40℃干燥箱干燥。水分含量达到5％时干燥终止，粉碎后即得棘孢木霉发酵菌剂，包装后常温避光保存。
实例2
一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法，将活化后的菌株接种于PDA培养基，26℃培养箱培养3天。待平板长满绿色的棘孢木霉孢子，用无菌水冲洗，制成孢子浓度为1×107cfu的孢子悬液。取孢子悬液50ml接种于无菌的固体培养盒。盒装固体培养基配制方法如下：取麸皮180g、米糠120g加入225ml营养液充分拌匀。125℃灭菌30min。其中营养液的配方如下：硫酸锌2.5％，蛋白胨1.5％，蔗糖1％。在保证充足光照的条件下26℃培养。培养期间适当翻动培养基以使菌株更加充分的利用营养物质，产生更多的菌株和孢子。18天后菌丝体生长充分，孢子产生量达到峰值。终止发酵，将发酵完成的固体培养基取出于40℃干燥箱干燥。水分含量达到5％时干燥终止，粉碎后即得棘孢木霉发酵菌剂，包装后常温避光保存。
实例3
一种用于降低粮果蔬重金属含量的发酵菌剂的制备方法，将活化后的菌株接种于PDA培养基，26℃培养箱培养3天。待平板长满绿色的棘孢木霉孢子，用无菌水冲洗，制成孢子浓度为1×107cfu的孢子悬液。取孢子悬液2ml接种于装有固体培养基的250ml三角瓶。瓶固体培养基配制方法如下：取麸皮12g、米糠 8g、硫酸锌0.8g、蛋白胨0.4g、蔗糖0.2g，加入13ml去离子水充分拌匀。125℃灭菌30min。在保证充足光照的条件下26℃培养。培养期间适当翻动培养基以使菌株更加充分的利用营养物质，产生更多的菌株和孢子。18天后菌丝体生长充分，孢子产生量达到峰值。终止发酵，将发酵完成的固体培养基取出于40℃干燥箱干燥。水分含量达到5％时干燥终止，粉碎后即得棘孢木霉发酵菌剂，包装后常温避光保存。

Claims (8)

1.一种可以降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述发酵制剂由一株棘孢木霉菌经固体发酵制成。
2.根据权利要求1所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，发酵培养基按重量份计包括如下配比麸皮60重量份，米糠40重量份，硫酸锌4重量份，蛋白胨2重量份，蔗糖1重量份，棘孢木霉发酵液40重量份。
3.根据权利要求1所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述木霉菌株为从土壤中筛选所得棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，ZZY，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12071。具有降低重金属污染土地农作物体内重金属的作用。
4.根据权利要求1所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述发酵制剂在农作物生长期内同肥料一同施用，无需进行土壤修复后再行耕种。
5.根据权利要求1所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述发酵菌剂在降低农作物重金属含量的同时可以作为植物生长的有机肥料，减少化学肥料的使用。
6.根据权利要求2所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述棘孢木霉发酵液的制备如下：将液体发酵培养基于121℃条件下灭菌20min，冷却后接种棘孢木霉孢子悬液。摇床转速160rpm，25℃培养48h。
7.根据权利要求6所的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述棘孢木霉孢子悬液制备方法如下：固体平板培养基接种后生长72h，待产孢量达到最大值后用无菌水将孢子洗下，稀释得到孢子浓度为107cfu/mL的孢子悬液。
8.根据权利要求2所述的降低农作物重金属含量的木霉真菌发酵制剂，其特征在于，所述发酵培养基接种后25℃全光照培养7天。收获发酵产物于鼓风干燥箱40℃烘干，得所述发酵制剂成品。
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