CN101618066A

CN101618066A - 核桃青皮总单宁的制备及其在抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN101618066A
Application number: CN200910070038A
Authority: CN
Inventors: 司传领; 朱振元; 刘忠; 刘鹏涛; 惠岚峰
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2009-08-04
Filing date: 2009-08-04
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2029-08-04
Also published as: CN101618066B

Abstract

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种核桃青皮总单宁的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。它以核桃青皮为原料，经提取、萃取、沉淀、分离纯化而得到核桃青皮总单宁。以本发明制备的核桃青皮总单宁颜色浅、纯度高，制备方法具有得率高、生产成本低、工艺简单规范的特点。本发明所制备的核桃青皮总单宁对肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

核桃青皮总单宁的制备及其在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物技术领域，具体涉及一种以核桃青皮为原料制备核桃青皮总单宁的方法及用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见疾病，在我国城市人口中，肿瘤是第一位死因，占全部死亡率的1/4，肿瘤亦是当今医学界的一大难题。在恶性肿瘤的三大疗法中，药物治疗占有重要的地位，发展速度也最快，合成的化学类抑肿瘤药物绝大多数是以天然抗癌活性成分为先导化合物，抗癌药物的开发，包括计算机模拟和仿生设计都是以天然抗癌活性成分为基础的。为了应对癌症给人类健康所造成的巨大威胁，世界各国恶性肿瘤药物开发科学工作者们尤为重视植物中具有抗肿瘤活性的天然产物。因此，从各种植物中筛选安全、高效、低毒的天然抗肿瘤活性成分单体或组分(分子群)成为近年来国内外科学家研究的重点课题。

胡桃属(Juglans)植物为胡桃科(Juglandaceae)落叶乔木，其果实一般统称核桃(或胡桃)。核桃青皮为核桃未成熟时包围在核桃外部的一层厚厚的绿皮，随着核桃逐渐成熟青果皮会逐渐变黑，最后自然脱落。核桃青皮的药用历史悠久，据《本草纲目》等祖国传统医学专著及当代国内外植物图鉴记载，胡桃属青皮辛、苦、涩、微寒，广泛以其入药用以抑制多种肿瘤生长、治疗白血病、清热、解毒、止痢、明目、消炎等，在德国和法国民间核桃青皮作为止痛药、抗肿瘤药物等。到目前为止，对核桃青皮抗肿瘤活性考察虽有零星报道，但对核桃青皮总单宁抗肿瘤活性成分的研究与开发尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种自动化程度高、操作简便、工艺规范、生产成本低、产率高的核桃青皮总单宁制备方法。

本发明的另一个目的是提供核桃青皮总单宁在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

本发明提出的核桃青皮总单宁的制备方法，包括如下步骤：

(1)以干燥、粉碎的核桃青皮为原料，按质量比为1∶1～1∶30加入体积百分浓度为1％～100％的乙醇水溶液，常温或加热提取，或利用常压回流提取装置提取，或微波或超声波辅助提取1～5次，每次10min～96h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1％～60％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量1～10倍的水，搅拌，加入粗提物质量1～10倍的正己烷萃取1～10次，分离，向正己烷萃取剩余相加入粗提物质量1～10倍的二氯甲烷萃取1～10次，分离，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提物质量1～10倍的乙酸乙酯萃取1～10次，分离，得到乙酸乙酯萃取相和最后的水相；

(3)将乙酸乙酯萃取相减压浓缩为原体积的10～80％，冷却、离心、分离纯化得到浅黄色沉淀即为核桃青皮总单宁。

优选的是：提取用乙醇水溶液的体积百分浓度为95％。

提取的次数最好为3次。

用本发明制备的核桃青皮总单宁的含量为70％～90％。核桃青皮总单宁含量为各类丹宁含量总和，其测定参照文献(Makkar H.P.S，et al.，Bioresource Technology，1993，45(1)：69～71)。经后续HPLC分离纯化和MS、¹H及¹³C-NMR等现代波谱技术对化合物的结构解析、化合物理化性质等的检测，本发明所制备的核桃青皮总单宁中含有大量的没食子酸(gallicacid)、鞣花酸(ellagic acid)、1，2，6-三没食子酰葡萄糖(1，2，6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranoside)、1，3，6-三没食子酰葡萄糖(1，3，6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranoside)、1，2，4，6-四没食子酰葡萄糖(1，2，4，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranoside)、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranoside)、2，3-O-4，4′，5，5′，6，6′-HHDP-(α/β)-D-葡萄糖(2，3-O-4，4′，5，5′，6，6′-HHDP-(α/β)-D-glucopyranoside)和长梗马铃素(pedunculagin)等单宁类化合物。

用本发明制备的核桃青皮总单宁颜色浅、纯度高，制备方法具有得率高、生产成本低、工艺简单规范的特点。

核桃青皮总单宁在制备抗肿瘤药物中的应用。

以MTT法检测抗肿瘤活性，结果显示核桃青皮总单宁及对照组柔红霉素对急性淋巴母系胞白血病T(Molt-4细胞)细胞系半数抑制生长浓度IC₅₀值相近，表明核桃青皮总单宁对Molt-4细胞株生长具有显著抑制作用，可用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1为核桃青皮总单宁的制备流程图。

具体实施方式

参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明是从胡桃科(Juglandaceae)胡桃属(Juglans)任何一种核桃树的核桃青皮中制备总单宁。

实施例1漾濞泡核桃树核桃青皮总单宁的制备

(1)以3.0kg漾濞泡核桃树(Juglans sigillata Dode，又名三台泡核桃、铁核桃、深刻纹泡核桃、茶泡核桃等)核桃青皮为原料，干燥、粉碎后，按质量比为1∶4加入95％的乙醇溶液，以常压回流提取装置提取3次，每次72h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的5％，得粗提取物；

(2)加入粗提物质量3倍的水，搅拌，加入粗提取物质量3倍的正己烷萃取，萃取4次，分离，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物质量3倍的二氯甲烷萃取，萃取3次，分离，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提取物质量3倍的乙酸乙酯，萃取5次，分离乙酸乙酯萃取相和最后的水相，将乙酸乙酯萃取相减压浓缩为原体积的20％，得浓缩的乙酸乙酯萃取相；

(3)将乙酸乙酯萃取相减压浓缩为原体积的20％，冷却、离心、分离纯化得到浅黄色沉淀即为的核桃青皮总单宁。

实施例2野核桃树核桃青皮总单宁的制备

(1)以干燥、粉碎的4.0kg野核桃树(Juglans cathayensis Dode，别名巴核桃、山核桃等)核桃青皮为原料，每次用10kg 80％乙醇水溶液超声波提取2次，每次1h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的2％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量2倍的水，搅拌，加入粗提取物质量2倍的正己烷萃取，萃取4次，分离，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物质量2倍的二氯甲烷萃取，萃取4次，分离，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提取物质量2倍的乙酸乙酯，萃取4次，分离乙酸乙酯萃取相和最后的水相；

(3)将乙酸乙酯萃取相减压浓缩至原体积的30％，冷却、离心、分离纯化得到浅黄色沉淀即为的核桃青皮总单宁。

实施例3核桃楸树核桃青皮总单宁的制备

(1)以5.0kg干燥、粉碎的核桃楸树(Juglans mandshurica Maxim，又名胡桃楸等)核桃青皮为原料，按质量比为1∶20加入体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，加热35～40℃提取5次，每次24h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的10％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量4倍的水，搅拌，加入粗提取物质量6倍的正己烷萃取，萃取2次，分离，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物质量6倍的二氯甲烷萃取，萃取2次，分离，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提取物质量6倍的乙酸乙酯，萃取2次，分离乙酸乙酯萃取相和最后的水相；

(3)将乙酸乙酯萃取相减压浓缩至原体积的35％，冷却、离心、分离纯化得到浅黄色沉淀即为的核桃青皮总单宁。

实施例4普通核桃树核桃青皮总单宁的制备

(1)以3.5kg干燥、粉碎的普通核桃树(Juglans regia Linn，又名核桃、中国核桃、胡桃等)的核桃青皮为原料，按质量比为1∶2加入体积百分浓度为60％的乙醇水溶液，常温提取3次，每次96h，过滤，滤液减压浓缩至原体积的6％，得粗提物；

(2)加入粗提物质量4倍的水，搅拌，加入粗提取物质量4倍的正己烷萃取，萃取2次，分离，向正己烷萃取剩余相中加入粗提取物质量4倍的二氯甲烷萃取，萃取3次，分离，向二氯甲烷萃取剩余相加入粗提取物质量4倍的乙酸乙酯，萃取5次，分离乙酸乙酯萃取相和最后的水相；

(3)将乙酸乙酯萃取相减压浓缩至原体积的25％，冷却、离心、分离纯化得到浅黄色沉淀即为的核桃青皮总单宁。

实施例5核桃青皮总单宁对白血病细胞生长的抑制作用

(1)供试药物的配制：取实施例1所得核桃青皮总单宁经高压灭菌，以乙醇溶解为80mg/ml后作为供试药，实验前以培养液稀释至所需浓度。以柔红霉素为对照组药品，以生理盐水稀释至50μg/ml，实验前以培养液稀释至所需浓度。

(2)肿瘤细胞株的选用与培养：肿瘤细胞选用急性淋巴母细胞白血病Molt-4细胞。培养液为含10％小牛血清的RPMI1640培养基(Gibco)，另添加适量的HEPES及抗菌素(100μg/ml的链霉素和100U/ml的青霉素)，37℃培养箱内静置培养，隔天换培养液。当细胞生长至活力良好，于对数生长期时将细胞株调整细胞浓度为5×10⁵个细胞/ml备用。

(3)以MTT法测定细胞毒性：细胞毒性的测定参照文献(Mosmann T，Journal ofImmunological Methods，1983，65：55～63)。具体是，取Molt-4细胞，以Hank’s液洗3次，以培养液稀释，接种于96孔板(5×10⁴个细胞/孔/100μl)，加入10μl不同浓度的核桃青皮总单宁或柔红霉素或同体积培养液，药物设8个浓度，每个浓度4个复孔，置于37℃、5％的CO₂条件下培养44h后每孔再加入10μl MTT，继而再培养4h，最后加入0.4N盐酸异丙醇100μl终止反应。混匀后于波长595nm下测定光密度值(OD)，以公式IC₅₀＝(1-OD_实验组/OD_对照组)×100计算而得其抑制率(IC₅₀，半数抑制生长浓度)。

(4)实验结果：本发明实施例1所制备核桃青皮总单宁对急性淋巴母系胞白血病Molt-4细胞半数抑制生长浓度IC₅₀为23.8μg/ml，而对照组柔红霉素对Molt-4细胞的半数抑制生长浓度IC₅₀为17.2μg/ml。此结果表明，本发明所制备的核桃青皮总单宁对抑制Molt-4细胞生长具有良好的作用。

Claims

1.一种核桃青皮总单宁的制备方法，其特征按顺序包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的核桃青皮为胡桃科胡桃属中任何一种核桃树的核桃青皮。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述提取用溶液为乙醇水溶液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述提取用乙醇水溶液的体积百分浓度为1％～100％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述提取的方法包括常温提取、加热提取、利用常压回流提取装置提取、微波辅助提取及超声波辅助提取。

6.根据权利要求1所述方法制备的核桃青皮总单宁在制备抗肿瘤药物中的应用。