CN102370695B - 一种青龙衣活性提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药活性提取物及其制备方法和用途，特别涉及一种从中药青龙衣中提取的有效部位及其制备方法和用途。本发明所述青龙衣活性提取物可以采用乙醇渗漉、回流、超声波提取或CO₂超临界提取，再经过醇沉、洗脱、截留、回流、浓缩、干燥等步骤制得。本发明以青龙衣活性提取物的抗癌活性为指标，对青龙衣的有效部位进行了筛选，以不同含量提取物进行药效试验，结果证实本发明所述青龙衣活性提取物中治疗癌症的有效组分主要为总萘醌类；药效试验结果表明其消炎止痛的有效组分主要为总黄酮、总鞣质及极性小分子类；提高免疫功能作用的物质主要为多糖。

Description

一种青龙衣活性提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种中药活性提取物及其制备方法和用途，特别涉及一种从中药青龙衣中提取的有效部位及其制备方法和用途。

背景技术

根据世界卫生组织报告，2000年全球新发癌症病人1010万人，死亡620万人，现患癌症病例2240万。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球总人口将达80亿，癌症新发病例将达2000万，将有1200万人死于癌症。中国每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡人数为160万人。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。

癌症是瞩世关注的重大难题，现今治疗癌症的药物主要为化学药，在杀伤癌细胞同时，机体内正常细胞亦被破坏，其引发的毒副作用是不可逆的。目前公开上市的中药抗癌药，以提取有效部位作为治疗癌症的药物并不多见。关于青龙衣提取物抗癌活性虽有报道，仅为单一某部位的疗效，但整体疗效并不显著，众所周知，癌症给患者带来不仅是肿瘤增大、转移、扩散，而伴随着是一种全身机体的消耗，难以忍受的疼痛，免疫力的低下，放、化疗的毒副作用等都可引发死亡，亟待发明一种抗癌疗效显著、毒副作用低、服用剂量小、并能有效调节全身症状的抗癌药物。本发明所述中药活性提取物是从胡桃科植物核桃楸Juglans mandshurica Maxim.和胡桃Juglans regia L.的未成熟果实的外果皮(称为青龙衣)中经过提取、分离、精制，于青龙衣不同部位分别得到具有抗癌、消炎、止痛、提高免疫功能作用的总活性提取物。

发明内容

本发明的目的是提供一种青龙衣活性提取物，本发明的另一个目的是提供该青龙衣活性提取物的制备方法，本发明还有一个目的是提供该青龙衣活性提取物在制备抗癌、消炎、止痛、提高免疫功能药物中的应用。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所述的青龙衣活性提取物由如下方法制成：

(1)取适量青龙衣粉碎，加4～12重量倍30～95％的乙醇进行渗漉提取；提取液备用，提取后的药渣挥散溶剂备用；取提取液于60℃以下减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

(2)取(1)中挥散溶剂的备用药渣，加4～12倍水煎或超声波提取1～3次，每次0.5～3小时，合并水提液，浓缩成相对密度为1.06～1.30的清膏，加乙醇使含醇量达50～90％，于4～8℃放置12～48小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法可进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣醇提粗提物水溶解或拌少量树脂并干燥，上样，过大孔吸附树脂柱，具体步骤为：先用水和/或5～20％的乙醇溶液洗脱，至洗脱液基本无色，将水或低浓度的乙醇弃去，再用50～95％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集该洗脱液，回收乙醇，将其干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，即得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用适量的95％的乙醇、丙酮、乙醚中的一种或几种洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水溶解，滤过，再将滤液超滤，截留5000～200000分子量的化合物，加0.5～4％活性炭脱色，回流0.5～1.5小时，滤过，滤液浓缩，干燥，即得青龙衣提取物C；

(6)将(5)中所述截留5000～200000分子量的化合物替换为截留30000～100000分子量的化合物，即得青龙衣提取物C’。

上述步骤(1)中所述加4～12重量倍30～95％的乙醇进行渗漉提取还可采用加4～12重量倍30～95％的乙醇进行回流提取或超声波提取1～3次，每次0.5～3小时替代，制得青龙衣醇提粗提物；

或取适量青龙衣粉碎，过20目筛，再以0.5～2重量倍30～100％的乙醇为夹带剂或不加夹带剂，用CO₂超临界提取替代，制得青龙衣CO₂超临界萃取物A；具体参数为：萃取釜温度40～55℃，萃取压力20～35MPa，流速15～45L/h，提取时间1～4小时，分离釜1：温度35～45℃，分离压力8～15MPa；分离釜2：温度30～35℃，分离压力5～7MPa。

若步骤(1)采用不加夹带剂的CO₂超临界提取法制得青龙衣CO₂超临界萃取物A时，则不用将萃取液于60℃以下减压回收乙醇，而直接将萃取液干燥即可；

上述步骤(3)中所述大孔吸附树脂为中、低极性树脂，包括D101、D201、南开大学生产的非极性系列D1、D2、D4、D6、D8、DM2、DS2、X-5、AB-8等、沧州宝恩化工HPD100、HPD400、DM130、ADS-17等、上试101、102、401等、日本三菱化成DiaionHP-10、DiaionHP-20、美国Amberlite XAD-1、XAD-2等。

上述步骤(1)、(3)、(4)、(5)中所述的干燥方法可以为烘干或减压干燥或喷雾干燥或冷冻干燥等。

将上述步骤(1)、(4)、(5)制得的青龙衣CO₂超临界萃取物A、青龙衣提取物B、青龙衣提取物C混合即得青龙衣活性提取物1；

或将上述步骤(3)、(4)、(5)制得的青龙衣提取物A’、青龙衣提取物B、青龙衣提取物C混合即得青龙衣活性提取物2；

或将上述步骤(1)、(4)、(6)制得的青龙衣CO₂超临界萃取物A、青龙衣提取物B、青龙衣提取物C’混合即得青龙衣活性提取物3；

或将上述步骤(3)、(4)、(6)制得的青龙衣提取物A’、青龙衣提取物B、青龙衣提取物C’混合即得青龙衣活性提取物4。

本发明所述青龙衣活性提取物为青龙衣CO₂超临界萃取物A、青龙衣提取物A’、青龙衣提取物B、青龙衣提取物C、青龙衣提取物C’、青龙衣活性提取物1、2、3、4中的任意一种；

其中，青龙衣提取物A’中主要含总萘醌类、总黄酮及总鞣质类物质；青龙衣提取物B主要为小分子极性物质；青龙衣提取物C与C’主要为多糖类物质。

本发明所述的青龙衣活性提取物1、2、3、4中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量不少于20％(优选为20％～40％)，且多糖含量不少于30％(优选为30％～40％)；优选的青龙衣活性提取物4中总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量不少于30％(优选为30％～40％)，且多糖含量不少于30％(优选为30％～40％)；

本发明所述青龙衣活性提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成药学上可接受的胶囊剂、丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、注射剂、口服液等。

上述药物用于治疗癌症时，日服用制剂量应当含相当生药量30g以上的青龙衣活性提取物；所述日服用制剂量是指每日服用的总片数、总粒数或总丸数等。

本发明以青龙衣活性提取物的抗癌活性为指标，对青龙衣的有效部位进行了筛选，以不同含量提取物进行药效试验，结果证实提取物中治疗癌症的有效组分主要为总萘醌类；药效试验结果表明消炎止痛作用主要为总黄酮、总鞣质及极性小分子类；提高免疫功能作用的物质主要为多糖。本发明符合中医多靶点作用的整体治疗理论，对青龙衣药材进行合理地综合利用，进而使其抗癌、消炎止痛、提高免疫功能有效地结合。经药效学及毒理学试验证明，本发明所述青龙衣活性提取物具有较好的抗癌作用，有效组分明确，毒副作用小，有利于保证药物的安全性和有效性。

下述实验例用于进一步说明但不限于本发明。

下述实验例1-5均采用以下实验材料及仪器：

1药物

青龙衣活性提取物1，由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例7的方法制备。

青龙衣活性提取物2，由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例1的方法制备。

青龙衣活性提取物3，由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例4的方法制备。

青龙衣活性提取物4由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例5的方法制备。

青龙衣CO₂超临界萃取物A由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例4中的方法制备。

青龙衣提取物B由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例6中的方法制备。

青龙衣提取物C由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例1中的方法制备。

青龙衣提取物A’由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例3中的方法制备。

青龙衣提取物C’由黑龙江省中医研究院中药所按本发明实施例5中的方法制备。

环磷酰胺片，天津金世制药有限公司生产。批准文号国药准字H12021006。

阿司匹林片，由桂林南药股份有限公司生产。批准文号国药准字H45021385。

盐酸曲马多片，深圳海王药业有限公司生产。批准文号国药准字H20033331。

2动物

SPF级BALB/c裸鼠，由中国医学科学研究院实验动物研究所提供。

清洁级昆明种小鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

3瘤株

人胃腺癌BGC-823，肉瘤S180，由黑龙江省肿瘤研究所提供。

4主要仪器与试剂

超净工作台：苏州净化有限公司；BASIC半自动生化分析仪：美生公司；OLYMPUS显微镜(日本)；二氧化碳培养箱：日本Yamato公司。

实验例1青龙衣活性提取物对肉瘤S180小鼠体内抑瘤实验研究

实验用清洁级小鼠165只，雄性，均按常规方法接种S180肿瘤细胞。分别从传代7天的小鼠腹中取出生长良好的S180乳白色腹水，以1∶2无菌生理盐水稀释至细胞数为5.8×10⁷个/mL，以0.2mL/只接种于小鼠腋下。接种次日，随机分为11组，每组15只，均为ig给药，每天1次，连续10天。停药次日，颈椎脱臼处死小鼠，剥取皮下实体瘤瘤块，分别称重，计算出瘤重及抑瘤率，结果见表1。

表1青龙衣活性提取物对S180小鼠体内抑瘤实验结果(

n＝15)

1)与模型组比较P＜0.01

表1结果表明，青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物A’、C、C’组和阳性对照组均能抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长。其中青龙衣活性提取物1、2、3、4抑瘤率明显优于其它各实验组，从抑瘤实验结果得出活性提取物4为优选组，青龙衣提取物A’组抑瘤率高于青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物C、C’组，从而可以得出青龙衣活性提取物4中抑瘤活性成分为青龙衣提取物A’。与模型组相比青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物A’组和阳性对照组具有显著性差异(P＜0.01)。

实验例2青龙衣活性提取物对人胃腺癌BGC-823荷瘤裸鼠体内抑瘤作用

细胞株BGC-823，培养于RPM1640培养液中，于37℃5％二氧化碳饱和湿度培养箱内培养，细胞处于对数生长期时，用0.25％的胰蛋白酶+0.02％的EDTA消化传代，每3-4天传代1次。裸鼠适应环境5天，将对数生长期的BGC-823细胞消化后制成3.1×10⁷/mL细胞悬液，在BALB/c裸鼠背部皮下各注射0.2mL。瘤块长到直径长为3-6mm时将裸鼠随机分为11组，每组10只，均为ig给药，每天1次，连续24天，每周监测瘤体积，停药次日，剥取皮下实体瘤瘤块，分别称重，计算出瘤重及抑瘤率。实验结果见表2。

表2青龙衣活性提取物对BGC-823荷瘤裸鼠瘤体监测及体内抑瘤实验结果(

n＝10)

1)与模型组比较P＜0.01

表2结果表明，青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物A’、C、C’组和阳性对照组均能抑制人胃腺癌荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长，从瘤体监测结果表明药物作用后期对肿瘤生长抑制明显。其中青龙衣活性提取物1、2、3、4抑瘤率明显优于其它各实验组，从瘤体监测结果和抑瘤实验结果得出活性提取物4为优选组，青龙衣提取物A’组抑瘤率高于青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物C、C’组，从而可以得出青龙衣活性提取物中抑瘤活性成分为青龙衣提取物A’。与模型组相比青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物A’组和阳性对照组具有显著性差异(P＜0.01)。

实验例3青龙衣活性提取物对S180小鼠免疫功能的影响

实验用清洁级小鼠110只，雄性，均按常规方法接种S180肿瘤细胞。分别从传代6天的小鼠腹中取出生长良好的S180乳白色腹水，以1∶3无菌生理盐水稀释至细胞数为3.2×10⁷个/mL，以0.2mL/只接种于小鼠腋下。接种次日，随机分为11组，均为ig给药，每天1次，连续10天，小鼠停药次日，尾静脉注射1∶4稀释的印度墨汁，0.1ml/10g体重；在注入印度墨汁后1分钟和11分钟分别用毛细管从小鼠眼内静脉丛取血25ul，用0.1％Na₂CO₃溶液2ml稀释；用0.1％Na₂CO₃溶液2ml调零点后，将待测样品倒入石英杯中，放入紫外分光光度计中，于650nm波长处测出OD值；颈椎脱臼处死小鼠，取肝、脾称重，并计算吞噬指数和矫正吞噬指数。结果见表3。

吞噬指数矫正吞噬指数

表3青龙衣活性提取物对S180荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(n＝10)

²⁾与模型组比较P＜0.05

表3实验结果表明，青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣提取物C及C’组小鼠巨噬细胞吞噬功能较其它各组明显增强，且与模型组、青龙衣CO₂超临界萃取物A、青龙衣提取物A’、青龙衣提取物B组相比具有显著性差异(P＜0.05)，其中青龙衣提取物C’组小鼠吞噬指数与青龙衣活性提取物各组接近，从而得出青龙衣活性提取物中具有增强免疫功能的物质为青龙衣提取物C’。

实验例4青龙衣活性提取物镇痛实验研究

取清洁级昆明种小鼠150只，体重18～22克，雌雄各半，每只鼠均腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，在15min内低于5次和高于50次扭体反应的小鼠舍弃，取110只合格的小鼠，称重后随机分11组，每组10只，均为ig给药，每天1次，连续10天，末次药后1小时，每只鼠均腹腔注射0.6％醋酸0.2ml/只，观察记录注射致痛剂后15分内各鼠扭体反应次数。结果见表4。

表4青龙衣活性提取物对小鼠扭体痛的影响(

n＝10)

1)与模型组比较P＜0.01

表4实验结果表明，青龙衣活性提取物1、2、3、4组、青龙衣提取物B组小鼠在15分钟内的扭体次数明显少于模型组而略高于阳性对照组，且与模型组相比具有显著性差异(P＜0.01)，其中青龙衣提取物B组小鼠扭体次数与青龙衣活性提取物1、2、3、4组接近，从而得出青龙衣活性提取物组中具有镇痛作用的物质为青龙衣提取物B。

实验例5青龙衣活性提取物对二甲苯所致小鼠耳肿的影响

实验用清洁级小鼠110只，雌雄各半。称重后随机分为11组，每组10只，均为ig给药，每天1次，连续5天，末次给药后1h，用二甲苯0.1ml涂于小鼠右耳，左耳对照，半小时后处死小鼠，将两耳剪掉，对称打片后称其片重，并计算片重差，结果见表5。

表5青龙衣活性提取物对二甲苯所致小鼠耳肿的影响(n＝10)

¹⁾与模型组比较P＜0.01    ²⁾与模型组比较P＜0.05

表5实验结果表明，各组小鼠均具有对抗二甲苯所致的耳肿胀的作用，其中青龙衣活性提取物1、2、3、4组抗炎作用明显，与模型组相比具有极显著性差异(P＜0.01)，青龙衣CO₂超临界萃取物A组、青龙衣提取物B、A’组小鼠与模型组相比具有显著性差异(P＜0.05)。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

具体实施方式

实施例1：青龙衣活性提取物口服液的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣3000g，酌予粉碎，加10倍量50％的乙醇，进行渗漉提取，提取后的药渣备用；在60℃将提取液减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

(2)将(1)中备用药渣先后加7、5、4倍水煎提取3次，各次分别为2、1、0.5小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.08的清膏，加乙醇使含醇量达80％，于6℃放置48小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣醇提粗提物加水溶解，上样，过D2大孔吸附树脂，具体步骤为：加水洗脱至洗脱液基本无色，将水弃去，再用80％乙醇洗脱至洗脱液无色，收集该洗脱液，60℃减压回收乙醇，60℃减压干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用95％乙醇1500ml、丙酮1500ml洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水适量溶解，滤过，将滤液超滤，截留5000～200000分子量的化合物，加4％活性炭脱色，回流1小时，滤过，取滤液干燥，得青龙衣提取物C；

(6)将上述提取物A’、B、C合并即得青龙衣活性提取物2，收率7％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为30％，且多糖含量为32％；

步骤2：青龙衣活性提取物口服液的制备

取210g上述青龙衣活性提取物2，加入常规辅料，按照常规工艺制备成口服液；每日服用口服液的量应当含相当生药量不低于30g。

实施例2：青龙衣活性提取物颗粒剂的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣3000g粉碎，分别加6、5、5倍量95％的乙醇回流提取3次，每次3、2、1小时，合并提取液，提取后的药渣备用；在40℃将提取液减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

(2)将(1)中备用药渣先后加10、8倍水煎提取2次，各次为3、1.5小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.25的清膏，加乙醇使含醇量达60％，于4℃放置12小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣醇提粗提物拌少量树脂并干燥，上样于大孔吸附树脂HP-20柱，具体步骤为：先用少量水洗脱，后用15％乙醇洗脱至洗脱液基本无色，将水及乙醇弃去，再用95％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集该洗脱液，60℃减压回收乙醇，60℃减压干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用95％的乙醇1500ml、丙酮1500ml洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水适量溶解，滤过，将滤液超滤，截留30000～100000分子量的化合物，加0.5％活性炭脱色，回流2小时，滤过，干燥，得青龙衣提取物C’；

(6)将上述提取物A’、B、C’合并即得青龙衣活性提取物4，收率6.0％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为36％，且多糖含量为36％；

步骤2：青龙衣活性提取物颗粒剂的制备

取180g上述青龙衣活性提取物4，加入常规辅料，按照常规工艺制备成颗粒剂；每日服用颗粒剂的量应当含相当生药量不得少于30g。

实施例3：青龙衣活性提取物丸剂的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣3000g粉碎，加12倍量65％的乙醇，进行超声波循环提取3小时，滤过，提取后的药渣备用；在55℃将提取液减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

(2)将(1)中备用药渣加8倍水，60℃超声波提取2次，各次1.5、1小时，合并提取液，浓缩成相对密度为1.18的清膏，加乙醇使含醇量达75％，于5℃放置24小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣醇粗提物加水溶解，上样，过DM130大孔吸附树脂，具体步骤为：先用少量水洗脱，后用10％的乙醇洗脱至洗脱液基本无色，将水及乙醇弃去，再用75％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集该洗脱液，60℃减压回收乙醇，60℃减压干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用95％的乙醇1500ml、丙酮1500ml、乙醚1000ml洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水适量溶解，滤过，将滤液超滤，截留30000～100000分子量的化合物，加2％活性炭脱色，回流30分钟，滤过，滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物C’；

(6)将上述提取物A’、B、C’合并即得青龙衣活性提取物4，收率6.1％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为32％，且多糖含量为38％；

步骤2：青龙衣活性提取物丸剂的制备

取183g上述青龙衣活性提取物4，加入常规辅料，按照常规工艺制备成丸剂；每日服用丸剂的量应当含相当生药量不得少于30g。

实施例4：青龙衣活性提取物片剂的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣5000g粉碎，过20目筛，用CO₂进行超临界提取，萃取釜温度50℃，压力32MPa，流速40L/h，提取时间3小时，分离釜1温度44℃，压力12MPa，釜2温度34℃，压力7MPa；提取后的药渣备用；合并萃取液并将其干燥，即得青龙衣CO₂超临界萃取物A；

(2)将(1)中备用药渣加6倍水煎提取3次，每次1小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.22的清膏，加乙醇使含醇量达68％，于7℃放置40小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；

(3)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(4)将(2)中备用沉淀物分别用95％乙醇2500ml、丙酮2500ml洗涤，抽干得多糖粗提物，将其加水适量溶解，滤过，将滤液超滤，截留30000～100000分子量的化合物，加3％活性炭脱色，回流1.5小时，滤过，滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物C’；

(5)将上述提取物A、B、C’合并即得青龙衣活性提取物3，收率5.0％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为22％，且多糖含量为35％；

步骤2：青龙衣活性提取物片剂的制备

取250g上述青龙衣活性提取物3，加入常规辅料，按照常规工艺制备成片剂；每日服用片剂的量应当含相当生药量不低于30g。

实施例5：青龙衣活性提取物胶囊剂的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣5000g粉碎，加8倍量60％的乙醇，进行渗漉提取；提取液备用，提取后的药渣挥散溶剂备用；取提取液于58℃减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

(2)将(1)中备用药渣先后加8、7倍水煎提取2次，分别提取2、1.5小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.20的清膏，加95％乙醇使含醇量达75％，于4℃放置24小时，取出滤过，滤液浓缩，同上法进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣醇提粗提物加水溶解，上样，过大孔吸附树脂AB-8，具体步骤为：用少量水洗脱，再用10％的乙醇洗脱至洗脱液基本无色，将水及乙醇弃去，再用95％的乙醇洗脱，收集该洗脱液，回收乙醇，将其干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用95％乙醇2500ml、丙酮2500ml洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水适量溶解，滤过，取滤液超滤，截留30000～100000分子量的化合物，加2％活性炭脱色，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物C’；

(6)将上述提取物A’、B、C’合并即得青龙衣活性提取物4，收率5.2％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为38％，且多糖含量为38％；

步骤2：青龙衣活性提取物胶囊剂的制备

取260g上述青龙衣活性提取物4，加入常规辅料，按照常规工艺制备成胶囊剂；每日服用胶囊剂的量应当含相当生药量不少于30g。

实施例6：青龙衣活性提取物散剂的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣3000g粉碎，过20目筛，加2重量倍70％的乙醇为夹带剂，用CO₂进行超临界提取，萃取釜温度48℃，压力28MPa，流速30L/h，提取时间2小时，分离釜1温度42℃，压力10MPa，釜2温度32℃，压力6MPa；提取液备用，提取后的药渣备用；在50℃将提取液减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣CO₂超临界萃取物A；

(2)将(1)中备用药渣先后加9、8倍水煎提取2次，分别煎3、2小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.10的清膏，加95％乙醇使含醇量达60％，于6℃放置30小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法可进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(1)中所得青龙衣CO₂超临界萃取物A拌少量树脂并干燥，上样于大孔吸附树脂D101柱上，先用少量水洗脱，再用20％的乙醇洗脱至洗脱液基本无色，将水及乙醇弃去，再用75％的乙醇洗脱至洗脱液无色，收集该洗脱液，回收乙醇，将其干燥，即得青龙衣提取物A’；

(4)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(5)将(2)中备用沉淀物分别用95％乙醇1000ml、丙酮1000ml洗脱，乙醚500ml洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水溶解，滤过，将滤液超滤，截留30000～100000分子量的化合物，加1％活性炭脱色，加热回流1小时，滤过，滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物C’；

(6)将上述提取物A’、B、C’合并即得青龙衣活性提取物4，收率5.3％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为37％，且多糖含量为37％；

步骤2：青龙衣活性提取物散剂的制备

取159g上述青龙衣活性提取物4，加入常规辅料，按照常规工艺制备成散剂；每日服用散剂的量应当含相当生药量不低于30g。

实施例7：青龙衣活性提取物微丸的制备

步骤1：青龙衣活性提取物的制备

(1)取青龙衣3000g粉碎，过20目筛，加0.5重量倍85％的乙醇为夹带剂，用CO₂进行超临界提取，萃取釜温度45℃，压力30MPa，流速25L/h，提取时间2.5小时，分离釜1温度40℃，压力9MPa，釜2温度30℃，压力5MPa；提取后的药渣备用；将萃取液减压回收乙醇，干燥，即得青龙衣CO₂超临界萃取物A；

(2)将(1)中备用药渣先后加10、7倍水煎提取2次，分别煎2、1小时，合并水煎液，浓缩成相对密度为1.12的清膏，加95％乙醇使含醇量达65％，于7℃放置40小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法可进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

(3)将(2)中备用滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物B；

(4)将(2)中备用沉淀物分别用95％乙醇1000ml、丙酮1000ml洗脱，乙醚500ml洗脱，抽干，加水溶解，滤过，将滤液超滤，截留5000～200000分子量的化合物，加1.5％活性炭脱色，加热回流50分钟，滤过，滤液浓缩，干燥，得青龙衣提取物C；

(5)将上述提取物A、B、C合并即得青龙衣活性提取物1，收率6.8％，其中，总黄酮、总萘醌、总鞣质三者之和的含量为25％，且多糖含量为32％；

步骤2：青龙衣活性提取物微丸的制备

取204g上述青龙衣活性提取物1，加入常规辅料，按照常规工艺制备成微丸；每日服用微丸的量应当含相当生药量不少于30g。

Claims (6)

1.一种青龙衣活性提取物，其特征在于该青龙衣活性提取物为青龙衣CO₂超临界萃取物A、青龙衣提取物C、青龙衣提取物C’中的任意一种；

该青龙衣活性提取物由如下方法制成：

（1）取适量青龙衣粉碎，加4～12重量倍30～95%的乙醇进行渗漉提取；提取液备用，提取后的药渣挥散溶剂备用；取提取液于60℃以下减压回收乙醇得清膏，即得青龙衣醇提粗提物；

或取适量青龙衣粉碎，过20目筛，以0.5～2重量倍30～100%的乙醇为夹带剂，用CO₂超临界提取，具体参数为：萃取釜温度40～55℃，萃取压力20～35MPa，流速15～45L/h，提取时间1～4小时，分离釜1：温度35～45℃，分离压力8～15MPa，分离釜2：温度30～35℃，分离压力5～7MPa；提取后的药渣挥散溶剂备用；提取液于60℃以下减压回收乙醇，制得青龙衣CO₂超临界萃取物A；

或取适量青龙衣粉碎，过20目筛，不加夹带剂，用CO₂超临界提取，具体参数为：萃取釜温度40～55℃，萃取压力20～35MPa，流速15～45L/h，提取时间1～4小时，分离釜1：温度35～45℃，分离压力8～15MPa，分离釜2：温度30～35℃，分离压力5～7MPa；提取后的药渣挥散溶剂备用；将萃取液干燥，制得青龙衣CO₂超临界萃取物A；

（2）取（1）中挥散溶剂的备用药渣，加4～12倍水煎或超声波提取1～3次，每次0.5～3小时，合并水提液，浓缩成相对密度为1.06～1.30的清膏，加乙醇使含醇量达50～90%，于4～8℃放置12～48小时，取出滤过，滤液备用，沉淀物备用；同法可进行二次醇沉，得滤液合并备用，沉淀物备用；

（3）将（2）中备用沉淀物分别用适量的95%的乙醇、丙酮、乙醚中的一种或几种洗脱，抽干得多糖粗提物，将其加水溶解，滤过，再将滤液超滤，截留5000～200000分子量的化合物，加0.5～4%活性炭脱色，回流0.5～1.5小时，滤过，滤液浓缩，干燥，即得青龙衣提取物C；

（4）将（3）中所述截留5000～200000分子量的化合物替换为截留30000～100000分子量的化合物，即得青龙衣提取物C’。

2.如权利要求1所述的青龙衣活性提取物，其特征在于其制备方法步骤（1）中所述加4～12重量倍30～95%的乙醇进行渗漉提取替换为加4～12重量倍30～95%的乙醇进行回流提取或超声波提取1～3次，每次0.5～3小时。

3.如权利要求1所述的青龙衣活性提取物，其特征在于其制备方法步骤（1）、(3)中所述的干燥方法为烘干、减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

4.如权利要求1所述的青龙衣活性提取物，其特征在于青龙衣提取物C与C’主要为多糖类物质。

5.如权利要求1-4任一所述的青龙衣活性提取物，其特征在于青龙衣活性提取物加入常规辅料，按照常规工艺，制成药学上接受的胶囊剂、丸剂、散剂、片剂、颗粒剂、注射剂或口服液。

6.如权利要求1-4任一所述的青龙衣活性提取物在制备抗癌、消炎、止痛、提高免疫功能的药物中的应用，其特征在于日服用制剂量的该药物中的青龙衣活性提取物含相当生药量30g。