CN102805768A - 一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用，所述的抗肺癌药物包括用于预防和/或治疗肺癌的药物。本发明证实猫爪草提取物具有较好的抗肺癌作用，能够有效地抑制人肺癌细胞的生长，如人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460等，对正常细胞毒性低，高效低毒，可用于制备治疗抗肺癌药物的用途。

Description

一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。

背景技术

肺癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国肺癌发病率在城市中占常见恶性肿瘤的首位，在农村占第三位。肺癌的恶性程度高，生物学特性复杂，且预后差，目前治疗是以手术、化疗、放疗为主，西医治疗在缩小瘤体方面有一定的优势，而中医治疗除具有直接抗肿瘤的作用外，还可以配合放疗和化疗，起到增效减毒的作用，增强患者对放疗和化疗的耐受性，提高生存质量，对某些晚期肺癌无法手术者，可服抗癌中药延长生存期，因此，综合治疗是首选。

中药猫爪草(Radix Ranunculus ternati)系毛茛科植物小毛茛(Ranunculus ternatus Thunb)的干燥块根，别名：三散草(浙江)、猫爪儿草(河南)、猫爪子(河南)、鸭脚板(安徽)、金花草(广西)，是20世纪50年代河南信阳地区新发现的一种草药，我国各省区均有分布，文字记载首见于《中药材手册》，《中华人民共和国药典》自1977年版开始收载。猫爪草性温，味甘、辛，入肝、肺经，具有清热解毒、消肿散结、止咳祛痰等功效，临床用于治疗肺结核、淋巴结结核、咽喉炎、疟疾等症。如中国专利申请CN 200810121086.8公开了一种运用大孔树脂制备猫爪草总苷提取物的方法及用途。它是在粉碎的猫爪草药材或猫爪草饮片中，加入6～15倍体积百分比浓度为10％-80％的乙醇，加热回流提取，过滤，合并提取液，减压回收乙醇，提取液通过填充有大孔树脂的层析柱，用水洗涤树脂，水洗脱液弃去；用含体积百分比浓度为20～95％含水乙醇洗脱，流速为2～4BV/H，乙醇洗脱液减压浓缩至相对密度为1.1～1.25，减压或喷雾干燥，得猫爪草总苷。猫爪草总苷含量不低于20％、猫爪草苷D含量不低于1.0％重量的猫爪草总苷提取物，用于治疗结核病。

近年来，猫爪草多与其它多味中药材一起使用，在中医临床上用于治疗癌症，对肺癌、淋巴癌、甲状腺瘤、乳腺肿瘤等疾病已显示出较好的治疗效果。如中国专利ZL200810195060.8公开了一种抗肺癌A549细胞增殖的中药提取物，它是由原料药猫爪草、金荞麦、鱼腥草、仙鹤草、冬瓜子、山茨菇、苏木、红花、法半夏、胆南星、沙参、玉竹、麦冬按一定重量配比制成；其制法是：首先将上述13味原料药加水煎煮，过滤收集提取液，浓缩得全方提取液I；然后取提取液I用石油醚萃取，得精制提取液II；最后将精制提取液II经大孔树脂柱富集、蒸馏水洗脱后用乙醇洗脱，收集洗脱液浓缩至10g生药/ml，即得中药提取物，经药效学试验结果表明该中药提取物对肺癌A549细胞的增殖有显着的抑制作用。其仅是针对13味药材复配对抑制肺癌A549细胞的增殖的作用的研究，没有涉及单味猫爪草的药理研究。

目前，有关猫爪草的化学成分的研究报道不多，已有的研究资料表明，猫爪草主要含氨基酸、有机酸及糖类。近十年来，国内许多学者对猫爪草脂溶性成分进行了较深入的研究，分离到包括酯类、脂肪酸、甾醇及苷类等的十多种单体成分。但单味猫爪草已有的药理作用研究资料主要集中在抗结核菌及其它菌方面。有关单味猫爪草抗肿瘤方面的研究资料并不多，至今尚未见猫爪草有效成分抗肺癌作用的报道。

猫爪草的药用历史较短，虽然近年来由于与其它多味中药材复配具有较好的抗肿瘤活性倍受人们关注，但仍存在不少问题：(1)猫爪草资源广泛，但开发利用度不够，制剂生产未成规模；(2)猫爪草的有效成分不明确，活性部位也不明确，故应针对猫爪草药理作用着重进行其有效部位及有效成分的筛选，以期为猫爪草的进一步开发利用提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种猫爪草提取物在制备抗肺癌药物中的应用。该提取物的主要成份为总皂苷。

一种猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。所述的抗肺癌的药物包括用于预防和/或治疗肺癌的药物。

所述的猫爪草提取物中含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量为20％～80％。

所述的猫爪草提取物的制备方法，包括：

将干燥的猫爪草粉碎，用乙醇水溶液加热回流提取，醇提液回收乙醇后用石油醚萃取，水层以水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氢氧化钠水溶液萃取，正丁醇层浓缩至浸膏，干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。

为了更好的提取猫爪草中的人参皂苷Rg1等皂苷及其它抗癌成分，优选：

所述的乙醇水溶液中乙醇的体积百分浓度为50％～95％，进一步优选乙醇的体积百分浓度为95％。

用乙醇水溶液加热回流提取的次数为至少3次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的4倍量～10倍量(进一步优选为5倍量～8倍量)，每次提取时间为1小时～4小时。

石油醚萃取的条件为：在50℃～100℃至少萃取3次，每次萃取时间为1小时～4小时。

以水饱和的正丁醇萃取的次数为4次～8次。

所述的氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L～1mol/L。

用氢氧化钠水溶液萃取的次数为2次～5次。

所述的猫爪草提取物可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等中的任何一种剂型。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明制备猫爪草提取物，方法简单、成本低廉。实验证明，本发明的猫爪草提取物能够有效地抑制人肺癌细胞的生长，如人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞NCI-H460等，对正常细胞毒性低，高效低毒，可用于制备治疗抗肺癌药物的用途。因此本发明所提供的猫爪草提取物对制备抗肺癌药物具有重要意义。

附图说明

图1为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；

图2为100μg/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；

图3为RPMI1640培养液(阴性对照)对人大细胞肺癌细胞NCI-H460细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；

图4为100μg/ml猫爪草提取物对人大细胞肺癌细胞NCI-H460细胞体外增殖的影响的显微镜下图片；

图5为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞凋亡的影响图片；

图6为50μg/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞凋亡的影响图片；

图7为RPMI1640培养液(阴性对照)对人肺腺癌细胞A549细胞周期的影响图片(横坐标代表DNA含量，纵坐标代表计数细胞数，C代表G₀/G₁期细胞数量，D代表G₂/M期细胞数量，E代表S期细胞数量)；

图8为50μg/ml猫爪草提取物对人肺腺癌细胞A549细胞周期的影响图片(横坐标代表DNA含量，纵坐标代表计数细胞数，C代表G₀/G₁期细胞数量，D代表G₂/M期细胞数量，E代表S期细胞数量)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

水饱和的正丁醇：将正丁醇和蒸馏水混合(混合比例为1∶1，体积比)，振摇，混匀，放置过夜(或利用超声，超声时间为10min，这样不必过夜)。得到的混合液分层，上层为水饱和的正丁醇，下层为正丁醇的饱和水溶液。

实施例1、猫爪草提取物的制备

精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为95％乙醇水溶液加热回流提取4次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的8倍量，每次提取2h，滤过，醇提液回收乙醇后得到提取物，提取物加温水至1g生药/ml，加入石油醚在50℃萃取4次，每次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为1∶1，每次萃取4小时，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剩余水层用水饱和的正丁醇萃取5次，正丁醇萃取液用0.1mol/L NaOH水溶液萃取2次，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量在80％。

实施例2、³H-TdR掺入法观察猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞增殖的影响

1、实验材料

(1)RPMI1640培养液：250ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号20110720。

(2)0.25％(质量百分比)胰蛋白酶(Trypsin)：含0.02％(质量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)，100ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号11090901。

(3)超级新生牛血清(即胎牛血清，FCS)：200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，批号080304。

(4)氚-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)：中国科学院上海应用物理研究所生产，浓度1mci/ml，比度4ci/mM，批号100430，使用前用Hank′s液配成20μci/ml。

(5)96孔平底培养板：美国Costar公司生产；

(6)A549细胞株(人肺腺癌细胞)：浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供，液氮保存。NCI-H460细胞株(人大细胞肺癌)：浙江省医学科学院药物所提供，液氮保存。

2、实验仪器

(1)二氧化碳培养箱：3165型，美国Forma公司生产。

(2)液闪仪：2050型，PACKARD公司生产。

(3)XS-24细胞收集仪：浙江绍兴坡圹医疗器械厂生产。

(4)GS-6R离心机：Beckman公司生产。

(5)HR40-II-A2医用净化工作台：A2型，30％外排，70循环，青岛海尔特种电器有限公司生产。

(6)BS210S电子天平：Sartorius公司生产。

(7)CK40-F200倒置显微镜：日本OLYMPUS公司生产。

(8)YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器：嘉兴市中新医疗仪器有限公司生产。

3、实验方法及结果

取2种对数生长期人肺癌细胞株(A549、NCI-H460)，按肿瘤药敏试验方法制成5×10⁴个细胞/ml浓度单细胞悬液(贴壁细胞株用质量百分比0.1％胰蛋白酶消化后配置)，取100μl分别加至96孔平底培养板中，37℃、5％(体积分数)CO₂培养箱培养24h后分别加入不同浓度(6.25～200μg/ml)的实施例1中的猫爪草提取物100μl(溶剂为含10％FCS的RPMI1640培养液)，每一药物浓度做3个复孔，同时作含10％(质量百分比)FCS(胎牛血清)的培养液对照，37℃、5％CO₂培养箱培养48h后分别加入含0.3μci³H-TdR的培养液50μl，继续培养16h，常规收集细胞，测定每个样品每分钟脉冲数(cpm)，用三孔的平均cpm计算出不同浓度猫爪草提取物对2种人肺癌细胞株的抑制率。按下列公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝(1-实验组平均cpm值/对照组平均cpm值)×100％。结果见表1～表2和图1～图4。

表1：猫爪草提取物对A549细胞体外增殖的抑制率(％)

表2：猫爪草提取物对NCI-H460细胞体外增殖的抑制率(％)

由表1～表2及图1～图4可见，不同剂量的猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞株均有较好的抑制作用，而且具有较好的量效关系；相同剂量下猫爪草提取物(猫爪草总皂苷)对A549细胞株的抑制作用优于对NCI-H460细胞株的抑制作用。

实施例3、集落形成试验法观察猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞集落形成的影响

1、实验材料

(1)RPMI1640培养液：250ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号20110720。

(2)0.25％(质量百分比)胰蛋白酶(Trypsin)：含0.02％(质量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)，100ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号11090901。

(3)超级新生牛血清：200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，批号080304。

(4)24孔平底培养板：美国Costar公司生产；

(5)A549细胞株(人肺腺癌细胞)：浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供，液氮保存。NCI-H460细胞株(人大细胞肺癌)：浙江省医学科学院药物所提供，液氮保存。

(6)瑞氏染液：中北生控科技股份有限公司生产，批号101102。

2、实验仪器

(1)二氧化碳培养箱：3165型，美国Forma公司生产。

(2)GS-6R离心机：Beckman公司生产。

(3)HR40-II-A2医用净化工作台：A2型，30％外排，70循环，青岛海尔特种电器有限公司生产。

(4)BS210S电子天平：Sartorius公司生产。

(5)CK40-F200倒置显微镜：日本OLYMPUS公司生产。

(6)YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器：嘉兴市中新医疗仪器有限公司生产。

3、实验方法及结果

取对数生长期A549、NCI-H460细胞以100个/ml浓度，每孔1ml接种于24孔板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后分别加入不同浓度(6.25～200μg/ml)的实施例1中的猫爪草提取物1ml(溶剂为含10％FCS的RPMI1640培养液)，同时设10％FCS的RPMI1640培养液对照，37℃、5％CO₂培养箱中静置10d，弃去培养液，用瑞氏染液染色，肉眼计数细胞克隆数，结果以集落形成率(％)表示：集落形成率＝集落数/接种细胞数×100％。结果见表3～表4。

表3：猫爪草提取物对A549细胞集落形成的影响(％)

表4：猫爪草提取物对NCI-H460细胞集落形成的影响(％)

由表3～表4可见，与空白对照组相比，不同剂量的猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞株的集落形成均有较好的抑制作用，而且具有较好的量效关系。

实施例4、猫爪草提取物对A549细胞凋亡的影响

1、实验材料

(1)RPMI1640培养液：250ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号20110720。

(2)0.25％(质量百分比)胰蛋白酶(Trypsin)：含0.02％(质量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)，100ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号11090901。

(3)超级新生牛血清：200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，批号080304。

(4)6孔平底培养板：美国Costar公司生产；

(5)A549细胞株(人肺腺癌细胞)：浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供，液氮保存；

(6)Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒：北京庄盟国际生物基因科技有限公司生产，批号20110608。

2、实验仪器

(1)二氧化碳培养箱：3165型，美国Forma公司生产。

(2)GS-6R离心机：Beckman公司生产。

(3)HR40-II-A2医用净化工作台：A2型，30％外排，70循环，青岛海尔特种电器有限公司生产。

(4)BS210S电子天平：Sartorius公司生产。

(5)CK40-F200倒置显微镜：日本OLYMPUS公司生产。

(6)YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器：嘉兴市中新医疗仪器有限公司生产。

(7)XL-4型流式细胞仪：美国Beckman Coulter公司生产。

3、实验方法及结果

将A549细胞以1×10⁵个/ml接种于6孔板中，每孔4ml，24h后分别加入12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的实施例1中的猫爪草提取物4ml(溶剂为含10％FCS的RPMI1640培养液)，同时设10％FCS的RPMI1640培养液对照，48h后用0.25％胰蛋白酶消化，1500r/min离心5min，PBS缓冲液洗2次，收集1-5×10⁵个细胞，1500r/min离心5min后弃上清，加入500μl的1×Binding Buffer(结合缓冲液)，加入5μl Annexin V-FITC(用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的磷酯结合蛋白)，10μl PI(碘化丙啶)，混匀，室温下避光反应5-15min，1h内进行流式细胞仪检测。结果见表5和图5～图6。

表5猫爪草提取物对A549细胞凋亡的影响(％)

由表5及图5～图6可见，与空白对照组相比，不同剂量的猫爪草提取物均能诱导A549细胞凋亡，且细胞凋亡率随着剂量的增加而增加。

实施例5、猫爪草提取物对A549细胞周期的影响

1、实验材料

(1)RPMI1640培养液：250ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号20110720。

(2)0.25％(质量百分比)Trypsin(胰蛋白酶)：含0.02％(质量百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)，100ml/瓶，吉诺生物医药技术有限公司生产，批号11090901。

(3)超级新生牛血清：200ml/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司生产，批号080304。

(4)6孔平底培养板：美国Costar公司生产；

(5)A549细胞株(人肺腺癌细胞)：浙江省肿瘤医院肿瘤研究所提供，液氮保存；

(6)细胞周期检测试剂盒：南京凯基生物科技发展有限公司生产，批号111228。

2、实验仪器

(1)二氧化碳培养箱：3165型，美国Forma公司生产。

(2)GS-6R离心机：Beckman公司生产。

(3)HR40-II-A2医用净化工作台：A2型，30％外排，70循环，青岛海尔特种电器有限公司生产。

(4)BS210S电子天平：Sartorius公司生产。

(5)CK40-F200倒置显微镜：日本OLYMPUS公司生产。

(6)YXQ-208SD电热蒸汽灭菌器：嘉兴市中新医疗仪器有限公司生产。

(7)XL-4型流式细胞仪：美国Beckman Coulter公司生产。

3、实验方法及结果

将A549细胞以5×10⁴个/ml接种于6孔板中，每孔3ml，24h后分别加入12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml的实施例1中的猫爪草提取物3ml(溶剂为含10％FCS的RPMI1640培养液)，同时设10％FCS的RPMI1640培养液对照，48h后用0.25％胰蛋白酶消化，1500r/min离心5min，PBS缓冲液洗2次，调整浓度为1×10⁶个/ml，用1ml单细胞悬液离心去上清，加入体积分数为70％的冷乙醇水溶液500μl固定过夜，4℃保存。第二天用PBS缓冲液洗去固定液，加100μl RNaseA(RNA水解酶)37℃水浴30min，再加入400μl PI染色混匀，4℃避光30min，上机检测。结果见表6和图7～图8。

表6猫爪草提取物对A549细胞周期的影响(％)

由表6及图7～图8可见，与空白对照组相比，不同剂量的猫爪草提取物能将A549细胞有效地阻滞在G₀/G₁期，减少其进入有丝分裂期S，且随着剂量的增加作用增强。

实施例6、猫爪草提取物对小鼠lewis肺癌抑制作用的应用

1、实验材料

实验动物：C57BL/6J种小鼠，体重18-22g，全为雌性，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证：SCXK(沪2008-0016)，动物合格证号：0055924。饲养于浙江省中医药研究院实验动物室内，实验动物使用许可证：SYXK(浙2009-0122)。

瘤株：Lewis肺癌瘤株，中科院上海药物所提供，浙江省中医药研究院基础所液氮保存。

2、实验方法与结果：

取C₅₇BL/6J种雌性小鼠2只，右腋皮下接种液氮复苏的Lewis肺癌细胞悬液(1×10⁷个细胞/ml)0.2ml/只，常规饲养10天后，脱颈椎处死，75％(质量百分比)乙醇水溶液浸泡消毒，纱布吸干乙醇，剥离皮下肿瘤块剪碎，加无菌生理盐水制成1×10⁷个细胞/ml细胞悬液。取C₅₇BL/6J种小鼠，均皮下注射上述Lewis肺癌细胞悬液0.2ml/只，次日分组、称重，实验设实施例1中的猫爪草提取物高剂量(1.44g/kg/天)、中剂量(0.72g/kg/天)、低剂量(0.36g/kg/天)组，同时设水阴性对照组，各组动物每日给药(连续18天)，停药次日，称体重，处死小鼠、剥离实体瘤、称瘤重，计算抑瘤率(％)，结果见表7。

表7猫爪草提取物对小鼠Lewis肺癌生长的影响

注：*表示与模型组比较P＜0.05。

由表7可见，猫爪草提取物三个剂量组瘤重明显低于模型组(P＜0.05)，猫爪草总皂苷高剂量、中剂量组对小鼠Lewis肺癌抑瘤率(％)分别为41.9％及30.2％，说明猫爪草提取物对小鼠Lewis肺癌有较好的抑制作用。

实施例7、猫爪草提取物对A549裸鼠移植瘤的抑制作用的应用

1、实验材料

实验动物：4-6周龄BALB/Cnu/nu裸鼠，雌性，体重16-18g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证：SCXK(沪2007-0005)，动物合格证号：00526450。饲养于浙江省中医药研究院实验动物室内，实验动物使用许可证：SYXK(浙2009-0122)。

2、实验方法与结果：

取生长良好的A549裸鼠2只，脱颈椎处死，75％乙醇浸泡消毒，纱布吸干乙醇，剥离皮下肿瘤，用无菌生理盐水配成1×10⁷个/ml细胞悬液。取BALB/C裸鼠，均右腋皮下注射上述A549细胞悬液0.2ml/只，在肿瘤长到100mm³以上，开始分组、称重、给药。分别设实施例1中的猫爪草提取物高剂量(1.44g/kg/天)、中剂量(0.72g/kg/天)、低剂量(0.36g/kg/天)组，同时设水阴性对照组，各组动物每日灌胃给予不同剂量猫爪草提取物，连续30天，每周分别用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)和横径(b)。计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝1/2ab²。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(RTV)，RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。并计算相对肿瘤增殖率T/C(％)：T/C％＝TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。停药次日，称体重，处死小鼠、剥离实体瘤、称瘤重，计算抑瘤率(％)。抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％，结果见表8。

表8猫爪草提取物对A549细胞周期的影响

注：*表示与模型组比较P＜0.05，d表示天。

由表8可见，猫爪草提取物高、中、低剂量组的肿瘤体积与模型组相比差异显著(P＜0.05)；猫爪草总皂苷高、中剂量组对A549裸鼠移植瘤的抑瘤率(％)分别为44.3％及31.1％，说明猫爪草提取物对A549瘤株有较好的抑制作用。

实施例8、猫爪草提取物的制备

精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为50％乙醇水溶液加热回流提取3次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的4倍量，每次提取1h，滤过，醇提液回收乙醇后得到提取物，提取物加温水至1g生药/ml，加入石油醚在100℃萃取3次，每次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为1∶1，每次萃取1小时，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剩余水层用水饱和的正丁醇萃取4次，正丁醇萃取液用1mol/L NaOH水溶液萃取5次，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量在20％。

实施例9、猫爪草提取物的制备

精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为80％乙醇水溶液加热回流提取5次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的7倍量，每次提取4h，滤过，醇提液回收乙醇后得到提取物，提取物加温水至1g生药/ml，加入石油醚在80℃萃取5次，每次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为1∶1，每次萃取2小时，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剩余水层用水饱和的正丁醇萃取8次，正丁醇萃取液用0.5mol/L NaOH水溶液萃取4次，正丁醇液回收，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量在70％。

实施例10、猫爪草提取物的制备

精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为85％乙醇水溶液加热回流提取5次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的5倍量，每次提取3h，滤过，醇提液回收乙醇后得到提取物，提取物加温水至1g生药/ml，加入石油醚在65℃萃取4次，每次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为1∶1，每次萃取3小时，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剩余水层用水饱和的正丁醇萃取6次，正丁醇萃取液用0.8mol/L NaOH水溶液萃取3次，正丁醇液回收，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量在75％。

实施例11、猫爪草提取物的制备

精密称取干燥的猫爪草5000g，粉碎成粗颗粒(粒径200目)，用体积百分浓度为60％乙醇水溶液加热回流提取5次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的10倍量，每次提取3h，滤过，醇提液回收乙醇后得到提取物，提取物加温水至1g生药/ml，加入石油醚在70℃萃取4次，每次石油醚的体积与加温水后提取物的体积比为1∶1，每次萃取3小时，石油醚萃取液回收石油醚，得石油醚提取物。剩余水层用水饱和的正丁醇萃取6次，正丁醇萃取液用0.3mol/L NaOH水溶液萃取3次，正丁醇液回收，正丁醇层浓缩至浸膏，置真空干燥箱干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。该猫爪草提取物含总皂苷以人参皂苷Rg1计，重量百分含量在50％。

实施例12

参照实施例2～实施例7中的方法分别测试实施例8～实施例11中猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞增殖的影响，对A549、NCI-H460细胞集落形成的影响，对A549细胞凋亡的影响，对A549细胞周期的影响，对小鼠lewis肺癌抑制作用的应用，对A549裸鼠移植瘤的抑制作用的应用，发现：随着猫爪草提取物中人参皂苷Rg1的重量百分含量增加，猫爪草提取物对A549、NCI-H460细胞增殖的影响、对A549、NCI-H460细胞集落形成的影响、对A549细胞凋亡的影响、对A549细胞周期的影响、对小鼠lewis肺癌抑制作用的应用及对A549裸鼠移植瘤的抑制作用的应用更好。

Claims (10)

1.一种猫爪草提取物的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物在制备抗肺癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肺癌的药物包括用于预防和/或治疗肺癌的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物中人参皂苷Rg1的重量百分含量为20％～80％。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，所述的猫爪草提取物的制备方法，包括：

将干燥的猫爪草粉碎，用乙醇水溶液加热回流提取，醇提液回收乙醇后用石油醚萃取，水层以水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液再用氢氧化钠水溶液萃取，正丁醇层浓缩至浸膏，干燥至无溶剂残留，得猫爪草提取物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为50％～95％。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用乙醇水溶液加热回流提取的次数为至少3次，每次乙醇水溶液的用量为猫爪草重量的4倍量～10倍量，每次提取时间为1小时～4小时。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，石油醚萃取的条件为：在50℃～100℃至少萃取3次，每次萃取时间为1小时～4小时。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，以水饱和的正丁醇萃取的次数为4次～8次。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的氢氧化钠水溶液的浓度为0.1mol/L～1mol/L。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用氢氧化钠水溶液萃取的次数为2次～5次。

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