CN108456258A - 一种铁皮石斛硒多糖制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品医药加工技术领域,具体涉及一种铁皮石斛硒多糖制备方法。本发明通过铁皮石斛多糖的提取、提纯、硒化和提纯,最终从铁皮石斛中得到一种全新的铁皮石斛硒多糖。本发明首次提供了一种快速制备铁皮石斛多糖及铁皮石斛硒多糖的方法,并通过铁皮石斛多糖及其硒多糖体外清除羟基自由基能力考察了其抗氧化能力,表明铁皮石斛多糖及其硒多糖都具有一定的抗氧化能力,可作为抗衰老抗氧化保健食品原料。本发明还提供了一种全新的多糖硒化反应的催化剂,便于投入工业生产,且对后续进一步的深入研究提供了理论基础。
Description
技术领域
本发明属于食品医药加工技术领域,具体涉及一种铁皮石斛硒多糖制备方法。
背景技术
铁皮石斛为兰科属多年附生草本植物,被称为九大仙草之一,为名贵中药材,是国家重点保护中药材,石斛最早记载于2000多年以前的《神农本草经》,将其列为上品,主伤中,除痹,下气,补五脏虚劳赢若,强阴,久服厚肠胃。甄权在其《药性论》中补充石斛具有健阳,补肾积精,养肾气,益力等功效。《本草纲目》记载铁皮石斛除了以上作用外,还具有长肌肉,逐皮肤邪热痱气,脚膝疼冷痹弱,定志除惊,轻身延年,益气除热,壮筋骨,暖水脏,益智清气,治发热自汗,痈疽排脓内塞等功效,《中华人民共和国药典》单列铁皮石斛,其性味甘,微寒。归胃、肾经。铁皮石斛素有“千金草”、“软黄金”和“植物黄金”之盛誉。
铁皮石斛的化学成分主要有石斛多糖、生物碱、蛋白质、黄酮类、金属元素及挥发油等,具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力、缓解体力疲劳和清咽等功效,其中多糖为其主要药效成分,含量在10%到40%甚至更高。
硒元素是人体必需微量元素,而无机硒具有毒性,安全剂量小,有机硒化物是一类新型化合物,具有抗病毒,抗肿瘤,抗炎,抗衰老,促进生长、保护视觉器官,解毒,防治心血管疾病及预防肝部疾病等药理活性,硒具有独特的生化性质和药理作用,开发含硒化合物极具意义。
硒多糖是一种有机硒化物,兼具硒和多糖二者的活性。硒多糖具有拮抗重金属、体外抗氧化、增强或调节机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、降血糖等多种生理活性作用,是一种良好的生物补硒剂,在保健品以及药物的开发中具有重要意义。目前硒多糖已经开始用于临床,对硒多糖的保健品和药品的开发研制已经陆续开展,如复方硒多糖胶囊等。
硒化铁皮石斛多糖的相关研究尚未见报道,研究铁皮石斛硒多糖的制备方法,对铁皮石斛多糖及其硒多糖产品的深入开发具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛硒多糖制备方法。
为实现上述发明目的,本发明所采用的技术方案是:一种铁皮石斛硒多糖制备方法,包括如下步骤:
(1)硒化反应:将所述精制铁皮石斛多糖置于容器中,以蒸馏水将其完全溶解;再加入亚硒酸钠,按重量比,精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.1~1;再加入阳离子交换树脂,按重量比,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:0.5~2;持续加热搅拌,反应温度为60~70℃,反应2~24h,反应完毕,停止加热,分离催化剂,冷却,得铁皮石斛硒多糖溶液;
(2)提纯:将所述铁皮石斛硒多糖溶液加入2000Da透析袋,蒸馏水透析至亚硒酸钠被完全除去;再将透析袋内反应液冷冻干燥,得铁皮石斛硒多糖。
优选的,所述铁皮石斛硒多糖中,硒元素含量为1.6~3.0mg/g。
优选的,所述阳离子交换树脂为氢型732离子交换树脂。
优选的,所述加热搅拌的反应温度为65℃;反应时间为2h。
优选的,所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.5或1:0.3。
优选的,所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.5时,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:0.5;所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.3时,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:1.8。
优选的,所述精制铁皮石斛多糖的制备方法为:
(1)将铁皮石斛茎切段、打碎、煮沸、过滤,滤渣加热水洗至不粘手,合并滤液和洗涤液,得铁皮石斛提取液;浓缩所述铁皮石斛提取液,得铁皮石斛浓缩液;在铁皮石斛浓缩液中边搅拌边加无水乙醇,调酒精度≥80%,生成沉淀,冰箱冷冻静置2h以上,减压抽滤,反复醇洗至不再有色素,抽干,得铁皮石斛粗多糖;
(2)将铁皮石斛粗多糖加水复溶,加铁皮石斛粗多糖重量0.2%的α-淀粉酶干粉,搅拌反应至不含淀粉;再加sevage试剂脱去蛋白,减压浓缩除去sevage试剂,得除去淀粉和蛋白的铁皮石斛粗多糖溶液,再将该溶液浓缩至原体积的1/5,加无水乙醇调节酒精度为80%,得白色絮状多糖,再冷冻、减压、抽滤、干燥,得精制铁皮石斛多糖。
优选的,步骤(2)所述搅拌反应的温度为55~65℃。
优选的,步骤(2)所述干燥的温度为70℃。
相应的,所述方法制备的铁皮石斛硒多糖。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明首次提供了一种快速制备铁皮石斛多糖及铁皮石斛硒多糖的方法,并通过铁皮石斛多糖及其硒多糖体外清除羟基自由基能力考察了其抗氧化能力,表明铁皮石斛多糖及其硒多糖都具有一定的抗氧化能力,可作为抗衰老抗氧化保健食品原料。
2、本发明提供了一种全新的多糖硒化反应的催化剂,便于投入工业生产,且对后续进一步的深入研究提供了理论基础。
3、本发明首次提出,硒多糖中的硒元素并非越多越好,并公开了铁皮石斛硒多糖中的最适硒元素含量为3mg/g,对铁皮石斛硒多糖后续在人体/动物中实际应用时具有重要的现实意义;对其它硒多糖的制备具有重要的指导意义。
4、本发明发现,按重量比,铁皮石斛多糖:亚硒酸钠:阳离子交换树脂=1:0.3:1.8时,制备的铁皮石斛硒多糖具有硒元素含量适宜、收率极高的特点。
说明书附图
图1为铁皮石斛多糖单糖组成图;
图2为精制铁皮石斛多糖红外光谱图;
图3为亚硒酸钠红外光谱图;
图4为铁皮石斛硒多糖红外光谱图;
图5为铁皮石斛多糖、亚硒酸钠、铁皮石斛硒多糖红外光谱图;
图6为硒含量标准曲线图;
图7为铁皮石斛多糖和铁皮石斛硒多糖抗氧化能力示意图。
具体实施方式
本发明的操作步骤如下:
1、提取铁皮石斛多糖
将铁皮石斛茎切成2~3cm小段,经打浆机打碎,煮沸,100目滤网过滤,滤渣加热水(70℃以上)洗至药渣手捏不再粘手、不含多糖为止,合并滤液和洗涤液,得到铁皮石斛提取液,经旋转蒸发仪在60℃左右减压浓缩,对浓缩液边搅拌边加无水乙醇,调酒精度80%以上,逐渐生成絮状沉淀,冰箱冷冻静置2h以上,减压抽滤,反复醇洗至不再有色素,抽干,得到铁皮石斛粗多糖。
2、铁皮石斛粗多糖提纯
将步骤1得到的铁皮石斛粗多糖加水复溶,加铁皮石斛粗多糖重量0.2%的α-淀粉酶(干粉),于55~65℃搅拌酶水解除淀粉,以碘水检测至不含淀粉;加sevage(V/V,正丁醇:氯仿=1:4)试剂脱去蛋白,60℃减压浓缩除去正丁醇和氯仿。除去淀粉蛋白后的多糖溶液,浓缩至原体积的1/5,加无水乙醇调节酒精度为80%,得白色絮状多糖,冰箱冷冻2h以上,减压抽滤,烘箱70℃干燥,得精制铁皮石斛多糖。
3、硒化反应
称取步骤2制取的精制铁皮石斛多糖1.0g,加入三口烧瓶中,加入蒸馏水将其溶解,加入0.1g~1g亚硒酸钠,再加入0.5g~2g阳离子交换树脂,作为催化剂,持续加热搅拌,反应2~24h后,停止加热,过滤分离催化剂,冷却,得含有铁皮石斛硒多糖的反应液。
4、铁皮石斛硒多糖提纯
将步骤3所得反应液加入2000Da透析袋,蒸馏水透析,直至pH试纸呈中性,透析液以VC检测呈无色,说明亚硒酸钠已被除去,透析袋内溶液经冷冻干燥,得到铁皮石斛硒多糖。
下面结合具体的实施例对本说明做进一步解释。
实施例一:制备铁皮石斛多糖
(1)称取500g铁皮石斛茎鲜条,剪断成2~3cm,分批次加水,打浆机中打浆煮沸,过滤,沸水洗滤渣,合并滤液洗渣液,共计得多糖提取液5L。浓缩至约1L,加无水乙醇调节乙醇浓度为80%醇沉,冷冻醇沉液,抽滤,80%乙醇反复洗涤粗多糖沉淀,除去色素等,多糖加水复溶至约2L,加α-淀粉酶粉末1.0g于约60℃搅拌水解除去淀粉,以碘水检测至不显蓝黑色,水解液以5:2体积比加Sevage试剂(正丁醇:氯仿=1:4),于分液漏斗中,脱除蛋白,反复多次,至两相界面不含蛋白,浓缩除去有机溶剂,浓缩至约1L,加无水乙醇,调节乙醇含量约80%,得白色絮状多糖,冰箱冷冻2h以上,抽滤,烘箱70℃干燥,得白色精制铁皮石斛多糖34g,以鲜重计,精制铁皮石斛多糖收率6.8%。
用HPLC法测定其单糖组成,主要由甘露糖和葡萄糖构成,具体如图1所示。
(2)精制铁皮石斛多糖红外光谱图如图2所示。由图可知,3420cm-1,2888cm-1,1735cm-1,1636cm-1,1382cm-1,1254cm-1,1066cm-1,875cm-1,809cm-1,612cm-1为铁皮石斛多糖的特征吸收峰。
实施例二:制备铁皮石斛硒多糖
(1)取实施例一中精制铁皮石斛多糖14份,每份1g,分别溶解于50mL蒸馏水中,待完全溶解后,分别加入亚硒酸钠0.1g、0.5g、1g,再分别加入氢型732离子交换树脂0.5g、1g、1.5g、2g,反应2~24h,而后停止反应,过滤去除催化剂,将反应液转入2000Da透析袋,蒸馏水透析,以pH试纸检测直至溶液呈中性,VC检测无色,说明亚硒酸钠除尽,透析液经冷冻干燥,得铁白色长絮状皮铁皮石斛硒多糖。
各组别具体加入的亚硒酸钠、氢型732离子交换树脂的量,及反应温度和反应时间如表1所示。
表1各组实际参数
需要特别说明的是,发明人在实际操作中,试验的具体参数组合远不止表1中所示。因篇幅受限,无法将全部试验放入本说明书中,故只截取了表1中这些具有代表性的数据以说明一般规律。其中,组14的参数选择虽然没有完全按照表1中其它参数所遵循的规律,但其最终结果非常特别,故也列入表1。因组14的试验数据不符合一般规律,为验证其可重复性,发明人以与组14完全相同的参数作为组15,再次进行了一次试验。
另外,发明人考察了多种阳离子交换树脂,均可顺利完成硒化反应。但氢型732阳离子交换树脂相对更廉价易得,为了方便,说明书中均选用此。
(2)铁皮石斛硒多糖的红外光谱分析
亚硒酸钠红外光谱如图3所示;以组1制备的铁皮石斛硒多糖为例,其红外光谱图如图4所示;结合图2,将图2、3、4综合到同一张图中,如图5所示。
由图4、5可知,铁皮石斛硒多糖中特征吸收有3420cm-1,2892cm-1,1652cm-1,1382cm-1,1308cm-1,1247cm-1,1150cm-1,1065cm-1,1031cm-1,941cm-1,871cm-1,809cm-1,759cm-1,614cm-1等。分析可知,经硒化反应后,多糖的基本结构未发生明显变化,多糖分子中1735cm-1处归属为分子中醛基,而硒化后1735cm-1处峰明显消失,推测分子中醛基在反应过程中,被亚硒酸钠逐步加成而减少,硒多糖中1147cm-1,1031cm-1,941cm-1处为亚硒酸酯特征吸收。
(3)各组硒化效果测定。
1)测定各组别制备的铁皮石斛硒多糖中的硒含量。绘制硒含量标准曲线,如图6所示;并分别对上述各组铁皮石斛硒多糖进行原子荧光测试,计算得各组中硒元素的含量。测定和计算方法按照GB 2009.03-017中的“氢化物原子荧光法”进行。样品使用微波消解法制备。
2)计算各组中铁皮石斛硒多糖的收率。
计算公式为:收率=铁皮石斛硒多糖收量/最初加入的铁皮多糖质量*100%。
各组别硒化效果具体如表2所示。
表2各组效果展示
发明人利用本发明技术方案实践时发现,硒元素含量并非越高越好,硒元素超过3mg/g时,铁皮石斛硒多糖出现难溶于水的现象,对后续制药等进一步使用造成了阻碍。
由表2的组1~3可以看出:亚硒酸钠的添量与铁皮石斛硒多糖中硒元素的含量呈正相关关系,1g铁皮石斛多糖中添加0.5g亚硒酸钠时,硒元素含量最接近临界值。从组2、4~6可以看出,阳离子交换树脂的用量与铁皮石斛硒多糖的收率呈负相关关系,这可能是由于树脂中的氢离子使铁皮石斛多糖水解而导致的;在不影响硒化反应正常进行的情况下,1g铁皮石斛多糖中添加0.5g的阳离子交换树脂可以达到较好的效果。从组7~13可以看出,温度和反应时间对硒化反应的影响不大。一般认为硒化反应进行十数小时甚至以上才能反应完全,但利用本发明的技术方案,在2h时即可基本反应完成,继续延长时间,并不会显著提高收率或硒元素含量。
另外,在组14的特定亚硒酸钠和氢型732离子交换树脂用量条件下,亚硒酸钠用量较小、阳离子交换树脂更高,反而得到了硒元素较高、收率极高的铁皮石斛硒多糖。组15的数据与组14几乎完全相同,证明该技术方案确实具有可重复性。
实施例三:铁皮石斛多糖和铁皮石斛硒多糖的抗氧化能力
以羟自由基清除率为指标考察铁皮石斛硒多糖和铁皮石斛多糖的抗氧化性能。其中,铁皮石斛多糖选择实施例1制备的精制铁皮石斛多糖;铁皮石斛硒多糖选择实施例2组别2制备的铁皮石斛硒多糖。
各处理组如下所示:
(1)空白对照组:1mL水+0.5mL EDTA-Fe+1mL PBS+1mL番红花+1mL双氧水;
(2)阳性对照组:1mL水+0.5mL EDTA-Fe+1mL PBS+1mL番红花+1mL PBS;
(3)多糖组:铁皮石斛多糖管1mL铁皮石斛多糖+0.5mL EDTA-Fe+1mL PBS+1mL番红花+1mL双氧水;
(4)硒多糖组:铁皮石斛硒多糖管:1mL铁皮石斛硒多糖+0.5mL EDTA-Fe+1mL PBS+1mL番红花+1mL双氧水。
将上述各组别,分别摇匀在37℃水浴反应30min,于520nm测定吸光度。其中PBS缓冲液(150mM,pH=7.4),番红花(360μg/mL),H2O2(3%),EDTA-Fe(2mM)。EDTA-Fe和样品需要水溶,其余用PBS缓冲液溶解。羟自由基清除率=A样品/A对照×100%。每个数据测三次取平均值。
具体清除效果如图7所示。
由图7可以看出,本发明制备的铁皮石斛多糖和铁皮石斛硒多糖均具有良好的清楚羟自由基的能力,可实际应用于抗衰老等方面。
Claims (10)
1.一种铁皮石斛硒多糖制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)硒化反应:将所述精制铁皮石斛多糖置于容器中,以蒸馏水将其完全溶解;再加入亚硒酸钠,按重量比,精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.1~1;再加入阳离子交换树脂,按重量比,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:0.5~2;持续加热搅拌,反应温度为60~70℃,反应2~24h,反应完毕,停止加热,分离催化剂,冷却,得铁皮石斛硒多糖溶液;
(2)提纯:将所述铁皮石斛硒多糖溶液加入2000Da透析袋,蒸馏水透析至亚硒酸钠被完全除去;再将透析袋内反应液冷冻干燥,得铁皮石斛硒多糖。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛硒多糖制备方法,其特征在于:所述铁皮石斛硒多糖中,硒元素含量为1.6~3.0mg/g。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:所述阳离子交换树脂为氢型732离子交换树脂。
4.根据权利要求1所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:所述加热搅拌的反应温度为65℃;反应时间为2h。
5.根据权利要求1所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.5或1:0.3。
6.根据权利要求5所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.5时,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:0.5;所述精制铁皮石斛多糖:亚硒酸钠=1:0.3时,精制铁皮石斛多糖:阳离子交换树脂=1:1.8。
7.根据权利要求1所述铁皮石斛硒多糖,其特征在于:所述精制铁皮石斛多糖的制备方法为:
(1)将铁皮石斛茎切段、打碎、煮沸、过滤,滤渣加热水洗至不粘手,合并滤液和洗涤液,得铁皮石斛提取液;浓缩所述铁皮石斛提取液,得铁皮石斛浓缩液;在铁皮石斛浓缩液中边搅拌边加无水乙醇,调酒精度≥80%,生成沉淀,冰箱冷冻静置2h以上,减压抽滤,反复醇洗至不再有色素,抽干,得铁皮石斛粗多糖;
(2)将铁皮石斛粗多糖加水复溶,加铁皮石斛粗多糖重量0.2%的α-淀粉酶干粉,搅拌反应至不含淀粉;再加sevage试剂脱去蛋白,减压浓缩除去sevage试剂,得除去淀粉和蛋白的铁皮石斛粗多糖溶液,再将该溶液浓缩至原体积的1/5,加无水乙醇调节酒精度为80%,得白色絮状多糖,再冷冻、减压、抽滤、干燥,得精制铁皮石斛多糖。
8.根据权利要求7所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:步骤(2)所述搅拌反应的温度为55~65℃。
9.根据权利要求7所述的铁皮石斛硒多糖,其特征在于:步骤(2)所述干燥的温度为70℃。
10.以权利要求1~9任意一项所述方法制备的铁皮石斛硒多糖。
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