CN102660485B - 一株抗铜细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抗铜细菌及其应用。抗铜细菌DGS6，于2010年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4817。菌株DGS6不仅能够溶解液体培养基中不溶性碳酸铜，而且能活化土壤中的Cu。菌株DGS6能够有效的促进海洲香薷、玉米和油葵根系的伸长生长。盆栽实验表明DGS6能够促进植物的生长，提高植物的生物量。实验结果显示：与对照相比，接入菌株DGS6后，玉米的地上部和根系干重分别增加了49%、35%，油葵增加85%、42%。因此保藏号为CGMCC NO.4817的假单胞菌DGS6能在促进植物生长中应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株抗铜细菌及其应用。
背景技术
目前，土壤作为人类赖以生存的生态环境的重要组成部分，受重金属污染日趋严重。全世界平均每年排放Hg约1.5万吨，Cu 340万吨，Pb 500万吨，Mn 1500万吨，Ni100万吨。我国土壤重金属污染也相当严重，每年释放到环境中的有毒重金属高达数百万吨，其中Pb为34.6万吨，Cd为3.9万吨（Nriagu和Pacyna，1988）。
土壤中的有害金属的污染直接影响土壤质量、水质状况、作物生长、农业产量及品质等并通过食物链富集到人体和动物中，危害人畜健康，引发人类癌症和其它疾病等（Muchuweti等，2006）。例如，Pb的过量摄入会提高龋齿的发病率，导致贫血、高血压、神经衰弱、心肌损伤等（Manaham，1984）。Cd的过量摄入则能抑制人体生长，影响氨基酸脱羧酶、组氨酸酶、淀粉酶、过氧化氢酶等酶系统的活力，干扰Cu、Co和Zn等微量元素的代谢，引起一系列疾病；Cd还能与磷强烈结合使得骨质磷酸钙中的钙过量排泄，导致骨质疏松软化、变形、骨折和疼痛，发生“痛痛病”。
另外，土壤的重金属污染还间接导致生态环境的其他组成部分-大气和水体的污染。含污染物质浓度较高的污染表土容易在风力和水力作用下分别进入到大气和水体中，导致大气污染、地表水和地下水污染以及生态系统退化等其它次生生态环境问题。
而且，土壤重金属污染相比大气污染和水体污染而言，具有长期性、隐蔽性、不可逆性、易迁移以及不能完全被分解或消逝的特点，因此危害严重、治理困难。如何有效地防治和解决土壤重金属污染问题越来越受到世界各国的重视。
土壤重金属污染是一个极为重要的环境问题，传统的治理主要采用物理或化学方法，这些方法费用高、设备复杂，对大面积的污染效果差。与传统措施相比，植物修复技术是一种支持可持续性发展的环境修复技术，并以其高效、经济、清洁、美观等优势解决了环境中的持久性污染物问题，占领了世界重金属污染土壤的修复市场，倍受人们青睐（万云兵等，2002；Marques等，2009）。但是随着研究的深入，人们发现超积累植物往往植株矮小、生物量较低、生长速度慢、生长周期长，而且受到土壤水分、盐度、酸碱度的影响，对固定态和沉淀态的重金属不易吸收，难以在实际中应用。
传统的土壤重金属污染治理主要采用物理或化学方法，这些方法费用高、设备复杂，对大面积的污染效果差。与传统措施相比，植物修复技术是一种支持可持续性发展的环境修复技术，并以其高效、经济、清洁、美观等优势解决了环境中的持久性污染物问题，占领了世界重金属污染土壤的修复市场，倍受人们青睐（万云兵等，2002；Marques等，2009）。但是随着研究的深入，人们发现超积累植物往往植株矮小、生物量较低、生长速度慢、生长周期长，而且受到土壤水分、盐度、酸碱度的影响，对固定态和沉淀态的重金属不易吸收，难以在实际中应用。
土壤细菌是环境中的一类重要微生物资源，具有分布广泛、种类繁多、表面积巨大、带电、繁殖快速和代谢旺盛等特点（Burd等，2000）。细菌在生长过程中会不断向体外分泌小分子有机酸、无机酸和大分子物质。细菌本身及其产生的各种物质广泛参与水体、土壤、矿渣和沉积物等环境中的物理、化学和生物化学反应，改变环境粘土矿物表面的物理化学特性，分解矿物或者形成新的矿物等，进而影响多种矿物元素的迁移转化。在重金属污染环境中，细菌种群结构、生理代谢会产生各种变化以响应重金属的胁迫，其可以通过对重金属的吸附富集、氧化还原、成矿沉淀、淋滤、协同植物吸收等作用修复重金属污染土壤（Gadd，2004）。
微生物强化植物修复重金属污染技术是利用与植物共生的真菌、细菌等微生物的联合作用降解污染物，达到修复的目的。目前研究发现，微生物主要通过促进植物生长，提高植物的生物量及促进重金属溶解，提高重金属的生物有效性两个方面提高植物修复重金属的效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株抗铜细菌。
本发明的另一目的是提供该细菌的应用。
一株抗铜细菌DGS6，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.），于2010年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4817。
所述的保藏号为CGMCC NO.4817的假单胞菌DGS6在促进植物生长中的应用。
所述的植物优选海洲香薷、玉米或油葵。
所述的保藏号为CGMCC NO.4817的假单胞菌DGS6在修复铜污染土壤中的应用。
有益效果：
本发明采用传统的微生物分离、纯化方法，从Cu污染土壤中分离、筛选得到一株抗高浓度Cu的细菌菌株DGS6（CGMCC NO.4817）。实验结果表明，DGS6（CGMCC NO.4817）不仅能够溶解液体培养基中不溶性碳酸铜，而且能活化土壤中的Cu。根的伸长试验表明，DGS6（CGMCC NO.4817）能够有效的促进海洲香薷、玉米和油葵根系的伸长生长。盆栽实验表明DGS6（CGMCC NO.4817）能够促进植物的生长，提高植物的生物量。实验结果显示：与对照相比，接入DGS6（CGMCCNO.4817）后，玉米的地上部和根系干重分别增加了49%、35%，油葵增加85%、42%。尽管该菌株对玉米和油葵体内Cu含量没有影响，但是能够提高玉米与油葵Cu吸收总量，从而达到提高植物修复效率的目的。
附图说明
图1菌株DGS6生长曲线。
图2DGS6在平板上的菌落形态。
图3接菌处理对Cu污染土壤中Cu可溶性的影响。
图4DGS6（CGMCC NO.4817）对不同Cu化合物的溶解试验。
图5DGS6（CGMCC NO.4817）对海州香薷（A）、玉米（B）和油葵（C）根系伸长的影响（图中数据柱上所标字母a,b,c如相同，则表示两个值在P＜0.05水平上没有差异；字母不同，则表示两个值在P＜0.05水平上有显著差异）。
图6不同处理下玉米和油葵的生物量，A：玉米地上部，B：油葵地上部，C：玉米根系，D：油葵根系（图中数据柱上所标字母a,b如相同，则表示两个值在P＜0.05水平上没有差异；字母不同，则表示两个值在P＜0.05水平上有显著差异）。
生物材料保藏信息
DGS6，分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.4817，保藏日期为2010年4月29日。
具体实施方式
实施例1
1.1菌株分离纯化
土样采自南京市汤山镇伏牛山铜矿尾菜园土和安基山尾矿土、铜陵凤凰山和铜官山尾矿土的植物根际土。在一周内将土样采用稀释平板涂布法（沈萍等，1999）和平板划线法进行菌株分离、纯化。部分土样风干保存，以进行土样养分和重金属元素分析，主要测定土壤中水溶态Cu、可交换态Cu和总Cu含量。菌株分离纯化的具体步骤如下：
（1）倒平板将有氮培养基配制好，混合均匀，高压蒸汽灭菌后倒平板。有氮培养基配方为：蔗糖10g，(NH4)2SO41.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2，琼脂15g。
（2）制备土壤稀释液取1g土样放入盛99mL无菌水并装有玻璃株的三角瓶中，置于恒温摇床中振荡20min后，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5等浓度的土壤稀释液。
（3）涂布取0.1mL不同浓度的土壤稀释液分别涂布于固体有氮培养基上，每个浓度分别设置三个重复。
（4）培养将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养24h，然后进行菌落观察和计数。
（5）挑单菌落挑选适合稀释度的平板（单菌落约几个到30个），选择菌落清晰、生长饱满且形态不同的细菌菌落。
（6）划线纯化将所选择的不同单菌落在含铜的固体有氮培养基平板（Cu2+浓度10mg·L-1，Cu2+在配制有氮培养基时以CuSO4形式加入）上进行划线，置于28℃恒温培养箱中培养。
（7）镜检将培养好的菌株进行简单染色后镜检，观察其是否已被纯化。假如还含有杂菌，则需继续划线分离
采用稀释平板涂布法和平板划线法从采集于安徽铜陵凤凰山、铜官山尾矿，南京市汤山镇伏牛山和安基山尾矿的Cu污染土壤和污染矿区植物根系样品中分离得到形态不同的细菌100多株。
1.2菌株对Cu的抗性（初筛）
将分离所得到的菌株依次转接到Cu浓度分别为20、30、50和100mg·L-1的固体有氮培养基平板中（Cu2+在配制有氮培养基时以CuSO4形式加入），每组设置三个重复。将菌株接种到含Cu培养基上后，大部分菌株因Cu的毒害作用无法生存。其中26株细菌对Cu的抗性较强，能在含Cu量为100mg·L-1的固体平板上生长。将这些分离得到的Cu抗性约为100mg·L-1的菌株转接到有氮培养基斜面中，4℃保存，用于后续试验。
1.3抗Cu菌株对培养基中不溶性Cu的活化效果（复筛）
将细菌转接到含难溶性Cu的液体有氮培养基中（总Cu浓度为200mg·L-1，Cu以沉淀态的碳酸铜形式加入并混合均匀，有氮培养基配方（不加琼脂）：蔗糖10g，(NH4)2SO41.0g，K2HPO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。
将细菌转接到含难溶性Cu的液体有氮培养基中后，30℃，摇床中培养60h后，10000r·min-1离心5min，测定上清液中的Cu含量及溶液pH值。与对照组相比，若溶液中Cu含量升高，则说明所接菌株对难溶性Cu具有活化作用，Cu浓度越高说明活化效果越明显。
抗铜菌株对培养液中难溶性Cu的活化实验结果表明，菌株SM2和DGS6能够活化培养液中部分沉淀态的Cu，与不接菌的对照相比，菌种SM2和DGS6使培养液中的Cu2+浓度增加了65%和72%。将菌株DGS6送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.4817。
1.4供试菌株生长曲线测定
将菌株DGS6(CGMCC NO.4817)接种于有氮液体培养基中活化16h，取出2mL转入盛有100mL的有氮液体培养基的250mL三角瓶中，三角瓶置于28℃摇床中振荡（150r·min-1）。以未接种的有氮培养液作为空白对照，选择600nm的波长，用紫外分光光度计测定不同培养时间细菌悬浮液的OD600nm值，以OD600nm值为纵坐标、生长时间作横坐标，绘制细菌的生长曲线。
如图1所示，在有氮培养基中，以2%的接种量接入菌株时，DGS6(CGMCC NO.4817)生长快速，延滞期很短，大约4h后就开始进入对数生长期，16h左右达到最高菌体浓度。
1.5菌株DGS6的菌体、菌落形态和生理生化特性
菌株的菌落、菌体特征和生理生化特性是细菌鉴定的重要形态指标和生理指标。DGS6(CGMCC NO.4817)在有氮培养基上的菌落形态和显微镜下的菌体特征见图2，DGS6(CGMCC NO.4817)为革兰氏染色阴性菌，杆状，有鞭毛，菌落为圆形，边缘整齐，乳白色，表面光滑、较平坦，有光泽。培养24h左右，菌落周围形成乳白色混浊环，在斜射日光下或白炽灯下可见。能水解淀粉，能发酵葡萄糖产酸，氧化酶阳性，可以液化明胶。
1.6菌株鉴定
采用SDS高盐沉淀法提取菌体总DNA（Miller等，1988）。将提取的基因组DNA稀释十倍后，经琼脂糖电泳检测其质量发现，所提取的基因组DNA浓度较高，纯度较好，基本上没有RNA杂带，稀释十倍后溶液中DNA浓度大约为50ng·μL-1。将原DNA溶液稀释100倍后，作为PCR扩增的模板DNA，进行16S rDNA的PCR扩增。扩增菌体16S rDNA的引物为：5′端引物为5′–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′（SEQ ID NO.1），3′端引物为5′–TACCTTGTTACGACTT–3′（SEQ ID NO.2）。扩增反应体系为：dNTP(20mmol·L-1)5μL，10×Taq聚合酶反应缓冲液5μL，5′端引物（25pmol·μL-1）2μL，3′端引物（25pmol·μL-1）2μL，Mg2+（25mmol·L-1）6μL，菌体DNA（约50ng·μL-1）1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL（5U·μL-1），H2O 28.5μL，反应体系总体积50μL。反应条件为：94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min，32个循环；最后72℃延伸10min。结果获得一条清晰的条带，将该条带切胶回收后，直接送上海英骏生物技术有限公司测序。
将DGS6(CGMCC NO.4817)的16S rDNA序列与Blast得到的相似性较高的16S rDNA序列与其生理生化分类接近的属的模式菌株的16S rDNA序列进行聚类分析，从16S rDNA聚类结果来看，DGS6(CGMCC NO.4817)属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。
实施例2菌株DGS6对Cu的活化作用
2.1土样采集
土样采自南京市汤山镇伏牛山铜矿附近受污染的菜园中，土样风干后，去除石头颗粒、植物根系等，过2mm筛。以进行土样养分和重金属元素分析，主要测定土壤中水溶态Cu、可交换态Cu等。部分样品在玛瑙研钵中磨细，过100目筛用于总Cu含量测定。
2.2供试菌株对土壤中Cu的活化试验
50mL离心管中分别装入灭菌、不灭菌处理的供试土壤3.00g。供试菌株在液体有氮培养基中培养16h后，取对数生长期的DGS6菌液(CGMCC NO.4817)3.0mL倒入7mL离心管中10000r·min-1离心3min，倒去上清，加无菌水清洗菌体2次。将清洗后的菌体加入装土样离心管中，加入无菌的去离子水作为空白对照，每个处理设3个重复。将离心管置于摇床中28℃、200r·min-1振荡24h，10000r·min-1离心10min，倒出上清液测定Cu2+含量及溶液pH值。
如图3所示，在铜污染土壤中加入DGS6菌悬液处理后，显著提高上清液中的Cu2+含量。但是随DGS6(CGMCCNO.4817)处理时间的延长，上清液中的Cu2+含量显著减少。接菌后，灭菌土壤中铜的活化效果要好于非灭菌土壤，其原因主要是非灭菌土壤中存在一定量的土著微生物，接菌后，接入的供试菌株与已高度适应该土壤的土著微生物竞争，只有在供试菌株具有高度竞争性的情况下，该菌株才能生存甚至变为优势菌群。所以菌株在非灭菌土壤中的生存能力一般低于灭菌土，导致活化效果也低于灭菌土。
2.3供试菌株对培养液中不同含铜化合物的活化作用
在100mL有氮培养基中分别加入不同的含铜化合物（碳酸铜、氢氧化铜、草酸铜）。使最终Cu浓度为100mg·L-1。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)预培养16h后，调节OD600值为0.5，以4%的接种量接入培养基中。28℃，200r·min-1培养48h。10000r·min-1离心10min，测定上清液Cu2+浓度及pH值。
菌株对不同形态的Cu化合物的活化能力是不同的，由图4可见，与对照相比，DGS6(CGMCCNO.4817)对碳酸铜的活化能力较强。即土壤中重金属的形态分布不同，菌株对土壤中的重金属的活化能力也会不一样。
实施例3菌株对植物生长和吸收Cu的影响
3.1菌株DGS6对海洲香薷、玉米和油葵根系伸长的影响
将菌株DGS6(CGMCC NO.4817)在有氮培养液中培养24h，将纯培养物进行4℃离心，弃去上清，无菌水洗涤两次后，重悬浮于无菌水中，在600nm处调整菌悬液光密度为0.5±0.02。将海洲香薷、玉米、油葵种子浸于70%酒精中1min，再用1%次氯酸钠消毒10min，立即用无菌水充分洗涤5次以上。室温下将种子置于菌悬液或无菌水中浸泡3h后，再放置于培养皿中用无菌水、Cu溶液或菌液湿润过的滤纸上，稍微倾斜（防止水淹及种子）放置于28℃恒温箱中，暗培养4d后测定根长（Belimov等，2001）。每皿20粒饱满种子（海洲香薷种子可多放些），每个处理设置4个重复。
由图5可见，在无Cu毒害情况下，与不接种的对照相比，接种DGS6(CGMCC NO.4817)能够明显促进海洲香薷、玉米和油葵根系的伸长生长。根系是受重金属影响最敏感的部位。5mg·L-1Cu处理下，与无菌对照相比，接种DGS6(CGMCC NO.4817)能够降低Cu对海洲香薷和玉米根系伸长的抑制作用，但对油葵根系伸长无显著缓解效果。
3.2菌株对盆栽玉米和油葵的生长和吸收金属的影响
3.2.1土样采集
所用土壤是采自中国江苏省南京市汤山镇伏牛山铜矿（32°03′N，118°47′E）附近的菜园表层0-15cm的土。该土的主要重金属污染物为Cu。土壤中的水提态Cu含量为0.29mg·kg-1，醋酸铵提取态Cu含量为2.83mg·kg-1，总Cu含量达1230mg·kg-1（见表1），严重超过国家二级标准。土壤其它理化性质见表1。
土样风干、混匀后过2mm筛。以KH2PO4的形式加入P（80mg P kg-1风干土样）和K（100mg K kg-1风干土样）到土样中（Shen等，2002）。施肥过后，对土样进行多个的干湿循环，平衡大约40d后，按标准方法取少量土样研磨，用于下一步的分析。土壤基本理化性质测定参考土壤农业化学分析方法（中国土壤学会，2000）测定。其中土壤pH值采用0.01mol·L-1CaCl2（pH 6.0）浸提（土∶水=1∶5），用pH计测定。土壤质地采用比重计法测定，阳离子交换量（CEC）采用醋酸铵（pH 7.0）交换法，有机质含量采用重铬酸钾容重法测定，全氮含量采用半微量凯氏法。土壤生物有效态重金属含量采用醋酸铵提取法，即称5.0g土壤样品（<2mm）于50mL塑料瓶中，加25mL 1mol·L-1的醋酸铵，经恒温（25℃）水浴摇床水平振荡（120r·min-1）2h，取出后，放在桌面上静置10–15min，过滤取上清液，用原子吸收分光光度计测定滤液中Cu的含量。土壤重金属总量采用HNO3与HClO4（V∶V=4∶1）的混合液消解法。称2.0g土壤样品（孔径小于2mm）用10mL去离子水在室温下水平振荡2h，离心，取上清液，测定土壤中水提取态Cu含量（鲁如坤，2000）。
表1.供试土壤的理化性质
注：OM：土壤有机质；EC:土壤溶液电导率；质地：①>0.05mm②0.05～0.001mm③<0.001mm;CEC:阳离子交换量
3.2.2植物的栽种、收获及金属测定
在塑料盆中分别装入600g灭菌后的上述土壤，每盆分别播入经表面消毒的并浸种至露白的玉米、油葵，加水至饱和，之后保持约60%的含水量。出苗7d左右间苗，每盆留玉米3株、油葵3株。出苗15d后，植株在铜污染土壤中生长良好，向植株根部接入培养至对数生长后期的DGS6(CGMCCNO.4817)，同时设置浇灌无菌水（对照组）、浇灌有氮培养基（培养基组）处理，合计共三个处理组。DGS6处理组每盆接入离心后用无菌水重悬的菌液15mL，10d后再浇灌菌液一次，共2次；培养基组每盆中加有氮培养基15mL；对照组每盆中加无菌水15mL，从浇灌菌液、水、培养基后20d收苗。从植株离地面0.5cm处剪取植物地上部。将植株地上部和根系用自来水洗净后，再去离子水清洗3遍，置于烘箱中，80℃烘至恒重，称地上部和根系干重。
样品中Cu含量的测定方法：烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎混匀，称取植物干样0.2000g置于消煮管中，用HNO3–HClO4（V∶V=87∶13）混合液消煮（Zhao等，1994），TAS–986火焰原子吸收分光光度计（AAS）测定Cu含量。分析过程中，以美国国家标准和技术协会认准的标样NIST（SRM 2709）作为QA/QC的一部分用于消煮。实验还中设置了适当的空白与重复以检测准确性与精确性。标准土样（NIST SRM 2709）的重金属回收率将被控制在90±5%范围。分析所用试剂均采用优级纯，所用水均为去离子水。
图6显示了在Cu污染土壤中，加入无菌去离子水（对照）、加入有氮培养基、接种DGS6(CGMCC NO.4817)三种不同处理下玉米、油葵地上部和根系的干重。由图6可以看出接入DGS6(CGMCC NO.4817)的盆钵中，玉米和油葵地上部生物量均高于其它处理，分别为对照的1.49和1.35倍；接入DGS6(CGMCC NO.4817)后，玉米和油葵根系生物量也高于其它处理，与对照相比，玉米和油葵根系干重分别比对照高85%和42%。可见DGS6(CGMCC NO.4817)对玉米和油葵的生长具有促进作用。
由表2可知，玉米根系吸收的Cu总量显著高于油葵。这主要是因为玉米的须根系发达，其生物量显著大于油葵的生物量，接种DGS6(CGMCC NO.4817)后生物量更是显著增加。与对照相比，加入培养基并没有显著影响植株对Cu的吸收。尽管接种DGS6(CGMCC NO.4817)和SM2均没有增加玉米和油葵植株内Cu的含量，但是接种DGS6(CGMCC NO.4817)，显著促进了玉米和油葵地上部及根系的生长，因此植物修复的效率也受到一定的影响。接种DGS6(CGMCC NO.4817)后，玉米和油葵地上部吸收的总Cu量为对照的1.29和1.56倍，而根系Cu的量则均为对照的1.60倍。
表2接种细菌DGS6和SM2对玉米和油葵吸收的总Cu量的影响（μg·pot-1）
数值为四个重复的平均值±标准偏差。数值后面的字母（a,b,c）如相同，则表示两个值在P＜0.05水平上没有差异；字母不同，则表示两个值在P＜0.05水平上有显著差异。
3.2.3接菌处理对盆栽玉米和油葵吸收Fe和P的影响
玉米和油葵植株内磷含量参照史瑞和和鲍士旦（1980）的方法。取植物干样约0.1g，加入1ml 50%的HClO4和5mL浓H2SO4，摇匀后过夜，再于消煮炉中消煮，直至消煮液变为无色，冷却后用去离子水定容至25mL，摇匀静置。取1mL消煮液，加入10mL去离子水，2滴2，4-二硝基苯酚显色液，用4mol·L-1的NaOH调至刚出现黄色为止，再用2mol·L-1的H2SO4调至无色。加入2.5mL钼锑抗试剂（钼酸铵+酒石酸锑钾十抗坏血酸），用去离子水定容至25mL，摇匀，反应30min，于700nm波长下测定吸光值，以不加样品的消煮液作为空白。以分析纯KH2PO4作为标准样品制作标准曲线。
铁含量测定采用酸消煮、原子吸收分光光度计测定方法（具体消煮及测定方法见上述样品中Cu含量的测定方法）。
表3接菌处理对玉米和油葵吸收铁Fe的影响
数值后面的字母（a,b,c）如相同，则表示两个值在P＜0.05水平上没有差异；字母不同，则表示两个值在P＜0.05水平上有显著差异。
表4接菌处理对玉米和油葵吸收铁Pi的影响
数值后面的字母（a,b,c）如相同，则表示两个值在P＜0.05水平上没有差异；字母不同，则表示两个值在P＜0.05水平上有显著差异。
由表3、4可见接种菌株DGS6(CGMCC NO.4817)显著提高了玉米和油葵地上部Fe、Pi含量。接种DGS6(CGMCC NO.4817)显著促进了玉米和油葵根部对Pi的吸收，但对油葵地上部Pi含量影响不大。Fe和Pi是植物生长所必需的营养元素之一，缺少任意一种都不利于植物的健康生长。DGS6(CGMCC NO.4817)能够促进植物对Fe和Pi的吸收，这可能是DGS6(CGMCCNO.4817)促进植物生长的重要原因。
3.3菌株在植物根系的定植情况
取根际土1.00g于99mL无菌水中，进行系列稀释，涂平板，采用平板计数法分析土壤中抗性细菌、真菌、放线菌和细菌的数量。并根据。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)的形态、重金属和抗生素抗性等指标检测该菌株是否在植物根际定植。
一个具有应用价值的菌株应该在植物的生长季节可以很快在植株的根际定植（Defreitas和Germida，1992）。本实施例测定了DGS6在玉米和油葵根际的定植情况(表5和6)，发现接种。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)一个月后，显示DGS6可以在玉米和油葵的根际定植，从而发挥刺激植物生长，提高植物修复Cu的效率的作用。。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)能很快在植物根际定植，为其在强化植物修复重金属污染土壤的实际应用提供了可行性依据。
表5假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)在玉米根际土壤中的定植情况
表6。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)在油葵根际土壤中的定植情况
本实施例表明：假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)能够显著地促进玉米、油葵和海州香薷根系的伸长。盆栽试验表明。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)能够刺激玉米和油葵对Fe和P的吸收，显著的促进玉米和油葵根系和地上部的生长，虽然对植株体内Cu的含量影响不大，但是由于植株生物量的增大。植物提取的总Cu含量显著增加。结果显示。假单胞菌属DGS6(CGMCC NO.4817)能够很快的在玉米和油葵的根际定植，发挥刺激植物生长，提高植物修复Cu的效率的作用。
Claims (3)
1.抗铜细菌DGS6，分类命名为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），于2010年4月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.4817。
2.权利要求1所述的抗铜细菌DGS6在促进海洲香薷、玉米或油葵生长中的应用。
3.权利要求1所述的抗铜细菌DGS6在修复铜污染土壤中的应用。
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