CN106944473A - 一种牧草‑微生物联合修复铀污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牧草‑微生物联合修复铀污染土壤的方法，目的在于解决单一生物修复难以良好解决重金属污染的问题，促进生物修复的效率。其包括如下步骤：微生物复合体系的构建；将牧草种植于铀污染土壤中，并将微生物复合菌定殖于牧草上，通过牧草与微生物的联合作用，实现对铀污染土壤的修复。本发明中，微生物菌剂具有良好的铀耐受性，并能有效分泌对植物生长有益的物质，促进植物的生长，促进铀在植物中的吸收和转移。通过所选牧草与微生物复合菌的相互配合，组成稳定的生态修复系统，利用牧草及其根际环境微生物体系的吸收、转化的作用，有效清理污染土壤中的铀，实现对土壤的有效修复。实验结果表明：本发明对于铀污染土壤的修复具有较好的效果。

Description

一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及铀污染修复领域，具体为一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法。

背景技术

国内外土壤的重金属污染情况较为复杂多样，植物修复本着生态环保的原则广受关注与支持。然而，单一生物修复难以良好解决重金属污染的问题，仍存在诸多弊端，包括周期长、应用不便利、修复效率低等问题。

目前，利用化学螯合剂等材料活化土壤中重金属成效快，但该法容易污染地下水，造成环境破坏。

为此，迫切需要一种新的方法，以解决上述问题。

发明内容

植物根际促生细菌通过产生植物生长激素(IAA)、铁载体、ACC脱氨酶等多种机制，促进植物的生长，增加植物的生物量，同时还通过代谢分泌部分小分子物质增加土壤中重金属的生物有效性，确定菌株能否拥有更多与促生能力相关的生物学功能特性，是判断菌株优越性的重要指标，具多种促生功能于一身的菌株是宝贵的微生物资源。细菌的这些生物学功能对于其强化植物修复土壤重金属污染，具有重要的作用。

本发明的目的在于：针对单一生物修复难以良好解决重金属污染的问题，仍存在周期长、应用不便利、修复效率低等问题，提供一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法。本发明中，发明人首先构建微生物复合体系，筛选出微生物复合菌，并通过大量实验，与不同的植物进行复配，最终得到本申请的技术方案。本发明中，微生物菌剂具有良好的铀耐受性，并能有效分泌对植物生长有益的物质，促进植物的生长，促进铀在植物中的吸收和转移。通过所选牧草与微生物复合菌的相互配合，组成稳定的生态修复系统，利用牧草及其根际环境微生物体系的吸收、转化的作用，有效清理污染土壤中的铀，实现对土壤的有效修复。实验结果表明：本发明对于铀污染土壤的修复具有较好的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，包括如下步骤：将牧草种植于铀污染土壤中，并将微生物复合菌定殖于牧草上，通过牧草与微生物的联合作用，实现对铀污染土壤的修复；

所述铀污染土壤中，每kg铀污染土壤中铀的质量为0.1mg～200mg；

所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌3～12％、柠檬酸杆菌15～30％、苏云金芽胞杆菌15～30％，余量为培养基；

或所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌15～30％、枯草芽孢杆菌3～12％，余量为培养基。

所述牧草为多花黑麦草、单年生黑麦草、果树草中的一种或多种。

所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌10％、柠檬酸杆菌20％、苏云金芽胞杆菌20％，余量为培养基；

或所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20％、枯草芽孢杆菌10％，余量为培养基。

将菌种进行振荡培养，菌株接种到液体培养基中，28℃振荡培养对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中离心，收集菌体，并用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD₆₀₀≈1.0，将菌体按照复合微生物菌配比方式进行混合，得到复合菌微生物；再向牧草接菌，从而将微生物复合菌定殖于牧草上。

将菌种进行振荡培养，菌株(OD₆₀₀＝0.8)以10％的菌种接种量接种到液体培养基中，150rpm28℃振荡培养24h至对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中8000rpm离心15min收集菌体，并使用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD₆₀₀≈1.0(菌液浓度约为10⁸CFU/ml)，将菌体按照复合微生物菌配比方式进行混合，备用；再向牧草接菌，从而将微生物复合菌定殖于牧草上。

向铀污染土壤中播种牧草，待牧草出苗后，向土壤根部均匀注射微生物复合菌，通过牧草与微生物的联合作用，实现对铀污染土壤的修复。

待牧草生长的平均株高距地面10～20cm后，再次向土壤际根均匀注射微生物复合菌。

采用七点法分孔注射微生物复合菌。

作为优选，在高于100mg/kg浓度铀污染土壤修复时，牧草采用单年生黑麦草；所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20％、枯草芽孢杆菌10％，余量为培养基。

作为优选，在低于50mg/kg浓度铀污染土壤修复时，牧草采用多花黑麦草；所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20％、枯草芽孢杆菌10％，余量为培养基。

针对前述问题，本发明提供一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其通过筛选出特定的微生物复合菌，并将该微生物复合菌定殖于牧草上，通过牧草与微生物复合菌的联合作用，实现对铀污染土壤的修复工作。本发明中，筛选出的微生物复合菌剂能够通过分泌铁载体、IAA、ACC脱氨酶等多种机制促进牧草生长，加强牧草对胁迫环境的抗性，增加牧草的生物量，同时还能通过代谢产生小分子有机酸等物质来活化土壤中重金属，增加重金属的生物有效性，从而促进微生物强化牧草修复土壤重金属污染，提高牧草修复效率。申请人在研究过程中，采用多种微生物和植物进行试验，最终优选出本发明的多花黑麦草、单年生黑麦草、果树草三种牧草，并利用这些牧草与微生物复合菌组合在一起，组成稳定的生态修复系统用于铀污染土壤的修复和治理工作。本发明利用牧草及其根际环境微生物体系的吸收、转化的作用，有效清理污染土壤中的铀，实现对土壤的有效修复。

申请人在本发明中，给出了相应的测定数据，数据表明：本发明的微生物复合菌对铀具有较强的耐受性，能够用于重污染区；所选的微生物菌剂对牧草生长及富集具有明显的促进效果，有利于加快铀污染土壤的修复。

综上所述，对铀污染土壤的修复，不仅依赖于对植物的选择，而且与植物根部环境与微生物类群的相互作用有关，只有结合植物与根际微生物的优势，才能为铀污染土壤提供更为有效的修复技术；本发明中，申请人通过对优势牧草与微生物的联合修复土培研究，检测在不同浓度铀胁迫下植株株高、干重及富集情况，分析筛选出联合效果较好的组合，其能有效的使三种牧草总的铀富集量提高了20％以上，且地下铀富集量均超过1200mg/kg。综合考虑根据不同污染情况采用不同组合体系完成修复工作，在高于100mg/kg浓度铀污染土壤的治理中，使用单年生黑麦草与微生物组合3的植物微生物联合修复体系；在低于50mg/kg浓度铀污染土壤的治理中，使用多花黑麦草与微生物组合3的植物微生物联合修复体系。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为微生物组合的铀耐受性分析结果。

图2为微生物分泌IAA标准曲线图。

图3为微生物分泌ACC脱氨酶标准曲线图。

图4为微生物分泌铁载体能力测定结果。

图5为注射组合菌液示意图。

图6为铀胁迫下微生物组合对多花黑麦草干重的影响。

图7为铀胁迫下微生物组合对单年生黑麦草干重的影响。

图8为铀胁迫下微生物组合对果树草干重的影响。

图9为铀胁迫下微生物组合对多花黑麦草株高的影响。

图10为铀胁迫下微生物组合对单年生黑麦草株高的影响。

图11为铀胁迫下微生物组合对果树草株高的影响。

图12为微生物组合对多花黑麦草地上铀富集量的影响。

图13为微生物组合对单年生黑麦草地上铀富集量的影响。

图14为微生物组合对果树草地上铀富集量的影响。

图15为微生物组合对单年生黑麦草地下铀富集量的影响。

图16为微生物组合对多花黑麦草地下铀富集量的影响。

图17为微生物组合对果树草地下铀富集量的影响。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1

重金属生物有效性是决定植物修复的重要因素之一。研究证实，许多螯合剂与微生物能增强土壤中重金属的生物有效性，其中，微生物主要靠氧化还原作用或分泌出有机质等方式，对其产生作用。微生物能通过产生铁载体、IAA、ACC脱氨酶等多种有机物质促进植物生长、增大吸收能力、增加生物量，还可以活化土壤中的重金属，提高生物有效性。同时，确定微生物的铀耐受能力也十分重要，寻找可协同共生，且能促进植物吸收生长的微生物成为主要研究方向，将为植物-微生物联合修复铀污染土壤提供生物资源。

(一)微生物的选择

1材料与方法

1.1微生物菌种

本研究所用菌均来源于中国微生物菌种保藏中心，根据申请人之前的研究，优选采用如下5种作为参试菌种，其具体种类及来源见下表。

表1优势微生物列表

上述菌种均为均来源于中国微生物菌种保藏中心。

1.2铀耐受性微生物组合筛选正交实验设计

如表2所示，正交试验设计5因素3水平，共12个实验；设置铀浓度为50mg/L，培养基选用为LB培养基。

表2微生物组合正交实验设计

注：百分比(％)为配伍体系中菌种的接种量

根据OD₆₀₀下的吸光值检测菌液浓度，吲哚乙酸、产ACC脱氨酶、产铁载体能力等共同判定菌种组合的协同或拮抗作用，进而筛选出铀胁迫下共生效果较好的微生物组合。

1.3微生物产吲哚乙酸(IAA)能力测定

1.3.1溶液的配制

PC比色液的配制：称取12gFeCl₃溶于300ml蒸馏水中，然后再缓慢加入429.7ml98％浓硫酸，冷却后定容至1L，测定范围：0.3～20mg/L。

S2比色液的配制：称取4.5gFeCl₃溶于300ml蒸馏水中，然后再缓慢加入587.4ml98％浓硫酸，冷却后定容至1L，测定范围：5～200mg/L。

1.3.2标准曲线的绘制

采用IAA来绘制标准曲线，配制两组IAA溶液，浓度依次为2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5mg/L和25，50，75，100，125，150，175mg/L，分别取上述IAA4ml，在第一组中加入PC比色液4ml，第二组中加入S2比色液4ml，在黑暗中静置0.5h，取出立即用分光光度计测OD₅₃₀值，以加了比色液的蒸馏水调0，重复三次，获得数据，绘制标准曲线。

1.3.3微生物组合样品产IAA检测

将菌种置于King培养液(配方：蛋白胨20g，琼脂15.0g，甘油10mL，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000mLpH7.2)中振荡培养12d，使菌悬浮液和空白对照在1000rpm*10min条件下离心，取上层清液4ml，将等量比色液与之混合，暗处理0.5h，取出后即刻使用分光光度计检测OD₅₃₀值，每个样品设置3次重复，用加入了比色液的蒸馏水来调0，根据相应的标准曲线统计出IAA的浓度，依照PC比色液和S2比色液的测定区间，选取结果并确定其分泌的数量。

1.4微生物产ACC脱氨酶能力测定

采用茚三酮比色法ACC测定脱氨酶活力

1.4.1标准曲线的绘制：

取0ug/mL、50ug/mL、100ug/mL、200ug/mL、300ug/mL、400ug/mL、500ug/mL的ACC溶液各5mL于25mL的比色管中，各加入ImL的0.5％茚三酮试剂，加上塞充分摇匀。将其置于90℃下水浴20-25min，冷却至室温，用721型分光光度计测定OD₅₃₀光密度值。以标准液的光密度值和浓度做一标准曲线。

1.4.2微生物组合吸光值的测定

将筛选出的菌株接种到含有0.5g/LACC的ADF培养基中，经180r/min，28℃培养24h，获得的培养液经10000r/min，4℃离心30s，取上层清液。采用同样的反应量与反应条件进行实验，并测定OD₅₃₀吸光值。

1.4.3ACC脱氨酶含量计算

根据以上所得标准曲线对应计算出待测稀释液的浓度，再与稀释倍数相乘即得出ACC待测液的浓度，用ACC浓度的多少来检测ACC脱氨酶活性的高低。本研究中ACC脱氨酶的单位酶活定义是28℃，pH7.5时，每分钟时间消耗ACC的值。

1.5微生物产铁载体能力测定

1.5.1CAS检测液体的制备

在100ml蒸馏水中溶解0.364g十六烷基三甲基溴化铵，获得10mmol/L的溶液，100ml蒸馏水中溶解0.0164g氯化铁，获得1mmol/L溶液(可加少量稀HCI)，先用乙醇溶解0.121gCAS，后用去离子水定容至100ml，最终配置出CAS检测液。

1.5.2培养基的制备

(1)MKB液体培养基：酪蛋白氨基酸5.0g，甘油15ml,K₂HPO₄ 2.5g,MgSO₄·7H₂O2.5g,双蒸水l000ml,pH＝7.2。

(2)LB液体培养基(500ml)：5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取液，5g氯化钠，调pH至7.0。50mL分装于5个100ml锥形瓶中。

1.5.3铁载体检测流程

将优势微生物组合加入到MKB培养基中，28℃，150r/min培养48h；使用离心机3500r/min离心15min，取上层清液用于检测，使上清液与3mLCAS检测液充分混匀后静置1h，待反应完成后采用722型分光光度计来测定630nm波长处的吸光值(A)，用双蒸水与对照调零。同时，取3mLCAS检测液和3mL未接种的MKB液体培养基上层清液充分混匀，采用相同方法测定吸光值，即为参比值(Ar)。

近年来国际上通用的方法是以A与Ar的比值作为定量的指标，用来比较各种微生物分泌出铁载体的多少。A与Ar的比值越小，则说明铁载体的分泌量越多。

2结果与分析

2.1铀胁迫下微生物铀耐受性及共生效果分析

本研究为了分析5种微生物组合共生效果，通过对铀胁迫下的正交试验获得12个正交试验组用于探究微生物的共生效果，如图1(图1中标记1-12分别对应表2中微生物组合1-12)所示，发现2号、4号、7号、10号和12号(详见正交实验表)共生情况明显优于其他组，且10号在48h处达到最大，其吸光值为3.104；9号共生效果最差，吸光值最大仅为1.444；同时，在50mg/L的铀胁迫下，上述5种组合均体现出较强的铀耐受能力。相反，50mg/L铀胁迫抑制了9号等微生物组合的生长，体现出了较差的铀耐受能力，或因组合内微生物相互拮抗，难以共生，诸类原因均导致其不利于后期应用。

2.2优势微生物组合产吲哚乙酸(IAA)能力

植物根际促生细菌能在代谢过程中产生植物激素，其是促进植物生长的重要因素。吲哚乙酸(IAA)是植物体内最为普遍的生长激素，有多种生物功效，包括促进细胞伸长和细胞分化，进而促进植物生长发育，在细菌、真菌、藻类、蕨类和种子植物普遍存在。本研究以吲哚乙酸(IAA)标准液的浓度为横坐标(x)，OD₅₄₀为纵坐标(y)绘制标准曲线，得到回归方程为：y＝0.0587x-0.1257(R²＝0.9995)。图2给出了微生物分泌IAA标准曲线图。

本研究以IAA为主要研究对象，研究组合微生物的产植物激素能力，结果表明5个组合微生物均能产IAA，测定结果如下表3所示。

表3微生物组合分泌IAA能力测定

序号	吸光值(OD530)	IAA浓度/mg·L-1
			2号	0.389±0.032	8.76±0.54
4号	1.198±0.087	22.55±2.18
			7号	0.422±0.039	9.32±0.84
10号	1.566±0.079	28.82±1.74
			12号	1.872±0.094	34.04±3.82

申请人发现，4号、10号和12号组合吸光值较大，分泌IAA的能力最强，分别为22.55mg/L、28.82mg/L和34.04mg/L。周小梅(参考文献：分泌吲哚乙酸的蒌蒿内生耐镉细菌的筛选与鉴定，《生态环境学报》2014年12期)筛选镉胁迫下分泌IAA能力较好的微生物研究中证实，IAA越大，对植物生长的促进效果越好，通过对植物内源IAA产生影响，更适用于促进植物生长。

本研究中，4号、10号和12号组合为优势菌株组合，而2号、7号则相对较低分别为8.76mg/L和9.32mg/L，对植物生长的促进效果较小，不利于后期应用。

2.3优势微生物组合产ACC脱氨酶能力

植物在逆境的条件下会分泌出乙烯，这是植物对环境的一种生理应激反应，同时也是植物的一种自我保护能力。然而，过量的分泌乙稀将会导致植物生长发育受阻或死亡。研究显示，ACC是乙烯生物合成的前体物质，而植物根际促生细菌产生的ACC脱氨酶可以直接将ACC分解成a-丁酮酸和氨。因此，产ACC脱氨酶是筛选植物促生菌的关键指标。本研究通过对5个组合微生物产ACC脱氨酶能力的检测，按照上述标准曲线的绘制方法，绘制出以下ACC标准曲线图，其回归方程为y＝0.0011x+0.0271，R＝0.9958。图3给出了微生物分泌ACC脱氨酶标准曲线图。

依据上述ACC脱氨酶酶活力测定方法，测得微生物组合在OD_570nm处的吸光值，根据其标准曲线的回归方程，可以计算出2号和7号的ACC浓度检测值较大，分别为537.18ug·mL^-1和496.27ug·mL^-1。微生物组合分泌ACC脱氨酶能力测定如下表4所示。

表4微生物组合分泌ACC脱氨酶能力测定

许明双(参考文献：番茄和水稻种子可培养内生细菌的多样性分析及促生菌功能研究，《中国农业大学》2014年)对微生物提高水稻产量的研究中发现产ACC脱氨酶活性较高的微生物能更好的促进植物生长，提高产量。说明，组合2号和7号分泌ACC脱氨酶能力较差，而观察4号、10号和12号可发现，不仅具有ACC脱氨酶，而且其酶活力维持在比较高的水平。综合分析，4号、10号和12号能有效的分泌ACC脱氨酶，从而更好的控制ACC的含量，达到提高植物生长的目的。

2.4优势微生物组合产铁载体能力

在贫铁的环境中，某些根际微生物分泌一种对铁有高度螯合性的物质而获得竞争优势，该类物质就是铁载体。产生铁载体被认为是植物根际促生细菌直接和间接促进植物生长的有效途径之一，也是判断菌株促生能力强弱的指标之一。铁载体能有效的提高土壤金属活性，促进植物根际有益物质的吸收，提高植物自身的生长状况进而更好的提高铀耐受能力。

由于检测液吸光值(Ar)数值较大，其A/Ar值越小，菌株产铁载体能力越强，测定结果如图4所示。由图所见，4号、10号和12号A/Ar值相对较低，分别为1.15、1.08和1.05。研究发现，产生铁载体越多，对重金属的耐受能力也越强，能很好的适应污染环境。本研究发现，微生物能正常分泌铁载体，而耐受性越强产铁载体越多，体现出较强的铁载体分泌能力，更能满足植物和微生物对铁的需求，抑制了有害微生物的生长繁殖。

3讨论与小结

3.1铀胁迫对微生物组合共生效果的影响

目前很热门生物修复中的植物修复，虽然有很多不可替代的优势，但同时也存在着生长周期长、环境适应性差等缺点。其中，植物促生细菌强化植物修复是指，其能定殖于植物根际或植物内部，并能够通过一种或多种机制促进植物生长。研究菌株相关生物学特性，有助于筛选高效植物根际促生细菌株并阐明其作用机制。正交试验设计的12个组合图可看出，在48h处吸光值均大于2。本研究同样发现优势较大的5种组合中，均有胶质芽孢杆菌(Bacillus mucitaginosus)，证实该菌易于与其他菌种共生，存活于土壤，能成为促进植物生长的重要材料。生长状态较差的组合的不一定由铀胁迫导致，有可能存在菌种间的相互拮抗作用，导致其不能正常生长。综合来看，筛选出的2号、4号、7号、10号和12号组合是铀胁迫下共生情况较好的组合。

3.2供试菌株IAA、ACC脱氨酶、铁载体分泌情况

马文文等研究发现禾本科根际微生物资源繁杂，有效的植物根际促生细菌能够以色氨酸为前体不同程度地产生IAA或其衍生物，并且植物的根际又会分泌出色氨酸。本发明同样发现，优势微生物组合可能为植物提供一定量的IAA，促进植物根系的生长。刘健关于微生物肥料作用机理的研究得出，一定量的IAA可促进植物初生根生长。因此10号产IAA的能力较好，更适用于分泌IAA的菌株，具有更好的应用前景。

ACC是高等植物体内乙稀前体物质，ACC脱氨酶可减少乙稀的产生，增加植物的抗逆性。本申请定量测定了5种微生物组合产ACC脱氨酶的能力，4号、10号和12号都体现出了较强的ACC脱氨酶分泌能力，更能促进植物生长，显示ACC脱氨酶细菌具有较强的逆境耐受能力和逆境条件下促进植物生长的潜力。

铁载体是细菌和植物在贫铁情况下分泌一种对铁有高度螯合能力的小分子化合物，其对金属物质有很高的结合系数。铁载体与Fe的螯合物还能够直接被植物所吸收利用，促进植物生长。魏本杰在微生物强化植物修复重金属土壤的研究中针对铁载体进行了深入分析，发现铁载体在对普通金属产生螯合作用的同时还可以溶解土壤中的镉，证实本发明对铁载体含量判断的重要性。微生物分泌铁载体有助于植物生长发育，10号和12号组合的因其优秀的产铁载体能力，对土壤中重金属的活化能力更为突出，有望应用于后期应用。

3.3小结

研究柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkman andGillen)、胶质芽孢杆菌(Bacillusmucitaginosus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus Frankland)等5种菌种进行50mg/L铀胁迫下的正交组合实验，考察各组合在铀胁迫下的共生效果，测定优势组合菌IAA、ACC脱氨酶和铁载体的分泌能力。分析获得到5种共生效果较好且铀耐受能力强的微生物组合，依照植物促生指标分泌IAA、ACC脱氨酶和铁载体能力的检测筛选出优势微生物组合。综上对IAA、ACC脱氨酶和铁载体分泌物的能力的判定，发现4号(胶质芽孢杆菌10％、柠檬酸杆菌20％和苏云金芽胞杆菌20％)、10号(胶质芽孢杆菌10％、枯草芽孢杆菌20％和蜡样芽孢杆菌10％)和12号(胶质芽孢杆菌20％和枯草芽孢杆菌10％)三种物质分泌情况均高于其他组，可有效促进铀胁迫下植物的生长，有待成为联合修复的微生物应用材料。综合判定结果选用4号、10号和12号用于后期研究安排。

(二)植物-微生物联合修复体系构建

随着研究的深入与扩展，越来越多的研究人员认可，植物具有很好的修复治理效果，植物因易培养、来源丰富、具有观赏价值及可用于制备饲料等优势，而受到重视。目前，植物大多与微生物或者和其他生物组合在一起，组成稳定的生态修复系统用于江河湖海的污染修复治理。植物修复是指，利用植物及其根际环境微生物体系的吸收、转化、挥发和降解的作用，清理环境中污染物质的一项新兴的修复治理技术。

植物根际促生细菌可以通过分泌铁载体、IAA、ACC脱氨酶等多种机制促进植物生长，加强植物对胁迫环境的抗性，增加植物的生物量，同时还能通过代谢产生小分子有机酸等物质来活化土壤中重金属，增加重金属的生物有效性，从而促进微生物强化植物修复土壤重金属污染，提高植物修复效率。分析统计，约80％的土壤细菌能分泌吲哚乙酸，并与植物内源的IAA发生反应。研究发现，给油菜种子接种植物根际促生细菌putidaGR12-2(分泌低水平IAA)可致使其根长增大约25％。微生物所产生的铁载体可以作为植物生长的营养物质，直接提高植物生长及抗病能力。根际促生菌(PGPR)分泌的铁载体能够与植物根际病原菌争夺有限的铁营养，进而抑制病原菌再生，间接促进植物生长。研究证实，突光假单胞菌通过产生铁载体竞争铁离子，提高康乃馨对镰刀菌的抵抗能力。具有ACC脱氨酶活性的植物根际促生菌不仅可以促进植物生物量增加，还可以保护植物免受外界胁迫，包括盐胁迫、干旱胁迫、重金属胁迫、及植物病原体的迫害等。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1种质材料

多花黑麦草(Lolium multiflorum Lamk.)，单年生黑麦草(Lolium perenneL.)，果树草(Dactylis glomerataL.)。

1.1.2供试土壤

模拟铀污染土壤。

表5供试土壤理化性质

Table 5 Test soil physical and chemical properties

1.1.3根据前述实验结果，选用如下优势微生物组合，如下表6所示。

表6优势微生物组合列表

1.2微生物组合菌液的制备

分别对以上微生物进行振荡培养。菌株(OD₆₀₀＝0.8)以10％的菌种接种量接种到液体培养基中，150rpm28℃振荡培养24h至对数生长期，将菌液转移至无菌离心瓶中8000rpm离心15min收集菌体，并使用去离子水反复清洗，最终将离心出的菌体用无菌去离子水洗净后稀释至OD₆₀₀≈1.0(菌液浓度约为108CFU/ml)。将菌体按照组合配比方式进行混合备用。按照每处理3重复的方式，向每盆牧草接菌30mL，对照牧草不接任何菌液和培养基，仅加入与菌液等量的去离子水。

1.3铀胁迫下微生物对牧草苗期生长的影响

向模拟铀污染土壤播种牧草。整个生长期间采用自然光照，隔天浇水(每盆300mL)的方式进行。待植物生长的平均株高距地面15cm开始向土壤根际均匀注射，如图5采用七点法分孔均匀注射菌液，合计30mL，注射深度10cm。每隔1周注射一次，共注射4次。实时观测记录植物的生长状况，待牧草生长60d后进行收获，收获时首先用去离子水清洗并沥干。

1.4铀含量分析

对牧草中各部分的铀含量测定，并对牧草富集指标计算，测定牧草对铀的富集能力。

1.5数据分析处理

采用Microsoft Office Excel 2007进行植株生理生化指标的处理；采用SPSS19.0进行生理生化指标显著性分析。

2结果与分析

2.1铀胁迫下不同微生物组合对牧草生物量的影响

生物量是单盆铀富集量的重要组成指标，生物量是植株受铀胁迫程度的主要体现方式。取洗净后的整株牧草，切割成地上地下两部分，进行烘箱杀青处理置恒重，称量计算单盆总干重。依据空白组为基准值，其他组生物量变大说明微生物对植物的生长有较好的促进效果，此方式可明确体现出其受作用程度的大小。

测定结果如图6至图8所示。在3种组合菌液的处理下，多花黑麦草、单年生黑麦草和果树草生物量都有所不同。由图6至图8可见，3种牧草在不同浓度铀胁迫下获得干重各有差异，施加不同菌液对牧草干重影响也较大。综合来看，3种组合菌对植物生长都有不同程度的促进，针对多花黑麦草和单年生黑麦草，3号效果最为明显，2号最差。如图，果树草空白组的干重，随着铀胁迫浓度的升高，受抑制明显且呈下降趋势，在不同浓度胁迫下组合1使果树草生物量分别提高了68.7％、33.9％、38.4％、51.4％和114.3％，组合3效果仅次于组合1，组合2效果不佳；多花黑麦草生长状况良好，空白组在不同浓度铀胁迫下影响不大，且在50mg/kg铀胁迫下干重达到最高值12.76g，在不同浓度胁迫下组合3使多花黑麦草生物量分别提高了70.4％、16.5％、38.7％、30.7％和85.7％，组合1效果仅次于组合3，组合2效果最差；微生物组合对单年生黑麦草的促进效果最为显著，在高浓度下效果较差的组合2也很好的提高了植株生物量，在不同浓度铀胁迫下(0、20、50、100和150mg·kg^-1)组合3使单年生黑麦草生物量分别提高了75.7％、21.1％、107.3％、93.6％和97.4％，组合1效果仅次于组合3，组合2效果最差。组合3在不同浓度铀胁迫和不同种牧草中均能较好的促进植物生长。

2.2铀胁迫下不同组合微生物对牧草形态学指标的影响

在重金属等毒害物质胁迫下，植物的生长过程中会出现叶片发黄，根叶萎缩等症状。对牧草的形态学指标检测可明确观察出其受重金属迫害的程度，也可通过分析获得对牧草生长有促进作用组合微生物。

图9至图11为铀胁迫下微生物组合对牧草株高的影响。如图9至图12可见，添加微生物菌液对植物生长及发育有很大帮助，观察实验空白组发现，随着铀胁迫浓度的升高，果树草陆续出现叶黄、萎缩等问题，对比添加菌液3发现，添加菌液后牧草长势良好偶见黄叶，能明显提高牧草的抗虫抗病能力及铀耐受性；对比单年生黑麦草和多花黑麦草空白组和加菌液组合1、3牧草，发现空白组较加菌组明显瘦弱，且根系短小，部分须根发黑枯竭，加菌组在高浓度铀胁迫下依然能正常生长，根系发达遍布整个盆栽容器。由此可见，本发明所选用的菌液对植物生长及抗病能力等都有较大帮助。

3种组合微生物对植物的株高，根长等指标都有不同程度影响，不同浓度铀胁迫下，3种菌液处理对牧草株高影响如图所示，果树草施加组合2和组合3后相对空白组都有较大的变化，不同浓度铀胁迫下组合2相对空白组分别提高了36.7％、9.3％、39.2％、47.4％和46.8％，组合3提高了41.3％、43.2％、64.6％、75.8％和71.4％；单年生黑麦草施加组合1和组合3后相对空白组都有较大的变化，不同浓度铀胁迫下组合3相对空白组分别提高了36.6％、22.2％、45.5％、35.5％和27.3％，组合1提高了32.1％、25.3％、51.5％、50.7％和40.9％；多花黑麦草在150mg/kg铀浓度胁迫下施加组合1，达到超出空白组73.4％。综上，组合3所完成的促进效果较好，能有效抗病、防叶发黄的同时提高植物株高等形态学指标。

2.3铀胁迫下不同组合微生物对牧草富集能力的影响

牧草铀富集量是检测微生物组合优势效果的重要指标。将牧草的地上地下部分分别烘干碾磨，消解完毕后用ICP-MS测定其地上地下部分铀含量。对多花黑麦草、单年生黑麦草和果树草不同菌种配伍组合及铀胁迫处理后每盆地上及地下部分进行测定分析。

2.3.1微生物组合对牧草地上部分铀富集能力的影响

微生物组合对牧草地上铀富集量的影响如图12至图14所示。3种牧草施加筛选出的3种组合微生物均体现出同样的特质，随着铀胁迫浓度的升高，其地上富集量均呈现升高趋势。由图可见，20mg/kg、50mg/kg、和100mg/kg铀胁迫下多花黑麦草空白组和施加3种组合菌的体系，其地上富集无明显差异，当铀胁迫浓度达到150mg/kg时施加组合1和组合3菌剂的多花黑麦草地上富集明显高于空白组和组合2，且组合2低于空白组；多花黑麦草3种组合菌促进下地上富集能力均稳步上升，在100mg/kg和150mg/kg铀胁迫下单年生黑麦草的地上富集情况发现，组合3＞组合1＞空白组＞组合2，且差异显著；观察果树草地上富集情况可发现，150mg/kg铀胁迫下组合3是空白组的1.25倍，是组合2的1.77倍。综上可发现，高浓度铀胁迫下组合2对牧草地上富集无促进效果，且有明显的抑制作用，组合1和组合3能有效的提高牧草地上富集。

2.3.2微生物组合对牧草地下部分铀富集能力的影响

如图15至图17可见，牧草相应的地下富集量明显高于其地上富集量，差异较为显著，说明根部吸收是植物吸收重金属的主要方式。不同浓度铀胁迫下其富集情况也不同，如图单年生黑麦草的地下富集情况，发现100mg/kg和150mg/kg铀胁迫下，其数量比较关系为组合3和组合1＞空白组和组合2，且组合2低于空白组，组合1是组合2地上富集量的1.67倍和1.53倍；多花黑麦草在1号和3号组合菌的促进下，其地下富集量呈明显的升高趋势，组合2没能产生促进效果，并抑制了其富集能力，组合1促进效果最好是空白组的1.33倍，是组合2的2.08倍；观察果树草地下富集能力发现，组合2也抑制了其地下富集量，组合3效果最好是空白组的1.8倍，是组合2的2.7倍。综上可见，组合2分泌促进植物生长能力的物质较好，但并未对土壤牧草栽培有较好的促进效果，效果低于空白组，且妨碍了根部对铀的吸收。

3讨论与小结

3.1 3种微生物组合对牧草的生长发育及铀富集能力的影响

本发明研究发现，3种菌种组合对多花黑麦草、单年生黑麦草和果树草的铀富集能力的影响不同，且组合2相对其他两组差异较大。组合1和组合3微生物组合在不同浓度铀胁迫下，对牧草铀富集能力都有一定程度的提升。其中，主要以促进牧草根际的生长发育为主，间接促进了地上生物量的增大，对牧草发黄、萎缩、矮小等问题都有较好的帮助，使牧草株高、干重、根长等方面都有较好的提高，进而使其对铀的富集总量得到提升，达到更好的修复效果。3种微生物组合均可分泌有效物质提高牧草修复效率，各组合中均含有胶质芽孢杆菌，都表明该菌具有较强促生效果，含有该菌的微生物组合能有效的提高土壤有机物质活性，促进植物生长，提高生产量。组合2对其生物量和株高促进效果不明显，且高浓度下产生抑制作用，对其富集能力的抑制更为凸出，菌种中所含有的蜡样芽孢杆菌，抑制了胶质芽孢杆菌的生长，单一的枯草芽孢杆菌未能有效的促进植物生长，反而加快了根部的腐化，阻碍了吸收作用，抑制生长的同时，还使得其难以有效吸收土壤中的铀。组合1和组合3均产生了较好的促进作用，提高生物量、增大叶面积、防害除病的同时，帮助土壤中金属离子的活化，影响了铀和土壤颗粒的螯合，增大了吸收效率，更好的促进了牧草对铀的吸收；土壤中的铀对植物生长有一定的毒害作用，施加菌液处理有助于减缓铀对牧草生长的毒害，因而对其干重的影响十分明显。

3.2优势植物-微生物联合修复方案

本发明研究发现，3号微生物组合对果树草的生物量及富集量都有很大促进，组合菌内的枯草芽孢杆菌产生效果明显，这与本室阮晨对钴污染土壤的植物-微生物联合修复中选用的菌种为同一种，阮晨研究证实该菌对牧草生长及富集的促进效果明显。同时，发明人分别进行了枯草芽孢杆菌对钴和铀的耐受性试验，发现其耐受性均强于其他菌种，可存活于重污染区。综合来看，枯草芽孢杆菌是微生物组合中极为重要的菌体，有必要在组合微生物的配比中提高它所占的比例。部分学者研究发现，铀单盆富集量是体现牧草修复铀污染土壤能力的重要指标，其计算方法是单盆牧草干重与单盆平均富集量的乘积，因此干重生物量主要影响其修复效果。施加了组合1和组合3微生物，高浓度(150mg/kg)铀胁迫下有效的提高了单年生黑麦草、多花黑麦草和果树草的生物量，对比发现单年生黑麦草的空白生物量更大，菌液促进提高率也较高，组合1和组合3对其地上地下富集能力均有明显的增强效果，且组合3更强，因此，选用单年生黑麦草与组合3的植物微生物联合修复体系用于高浓度铀污染土壤的治理；研究表明，低浓度(50mg/kg)铀胁迫下多花黑麦草的生物量更大，组合3的促进效果最佳，使得生物量最大，富集量更高。因此，选用多花黑麦草与组合3的植物微生物联合修复体系用于低浓度铀污染土壤的治理。

3.3植物-微生物联合修复应用前景展望

土壤重金属污染联合修复技术的成功应用，不仅依赖于对植物的选择，植物根部环境与根际环境微生物类群的相互作用具有重要的研究意义，结合植物与根际微生物的优势有望为金属污染土壤的修复提供更为有效的植物修复技术。本发明研究的结果表明，正确配对植物和微生物，能有效的利用二者的优势，共同提高其对整个环境的校服效率。因此，不断的筛选高铀富集植物和与其搭配修复的微生物组合(促进植物生长、丰富根际微生物和活化土壤核素)尤为重要，这也将成为铀污染土壤修复的主要研究方向。本研究并未深入探讨优势微生物促进植物修复铀污染土壤的机理因素，这些研究内容仍需进一步探讨。

3.4结论

通过对优势牧草与微生物的联合修复土培研究，检测在不同浓度铀胁迫下植株株高、干重及富集情况，分析筛选出联合效果较好的组合。研究将优势牧草与优势微生物组合配对，检测牧草的生长及富集指标，发现组合1(胶质芽孢杆菌10％、柠檬酸杆菌20％、苏云金芽胞杆菌20％)和组合3(胶质芽孢杆菌20％、枯草芽孢杆菌10％)对3种牧草的生物量和富集能力都有较强的促进效果，组合3促进效果最为明显，能有效的使三种牧草总的铀富集量提高了20％以上，且地下铀富集量均超过1200mg/kg，综合考虑根据不同污染情况采用不同组合体系完成修复工作，在高于100mg/kg浓度铀污染土壤的治理中使用单年生黑麦草与微生物组合3的植物微生物联合修复体系；在低于50mg/kg浓度铀污染土壤的治理中使用多花黑麦草与微生物组合3的植物微生物联合修复体系。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (8)

1.一种牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，包括如下步骤：微生物复合体系的构建；将牧草种植于铀污染土壤中，并将微生物复合菌定殖于牧草上，通过牧草与微生物的联合作用，实现对铀污染土壤的修复；

所述铀污染土壤中，每kg污染土壤中铀的质量为0.1mg~200mg；

所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌3~12%、柠檬酸杆菌15~30%、苏云金芽胞杆菌15~30%，余量为培养基；

或所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌15~30%、枯草芽孢杆菌3~12%，余量为培养基。

2.根据权利要求1所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，所述牧草为多花黑麦草、单年生黑麦草、果树草中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌10%、柠檬酸杆菌20%、苏云金芽胞杆菌20%，余量为培养基；

或所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20%、枯草芽孢杆菌10%，余量为培养基。

4.根据权利要求1-3任一项所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，向铀污染土壤中播种牧草，待牧草出苗后，向土壤根部均匀注射微生物复合菌，通过牧草与微生物的联合作用，实现对铀污染土壤的修复。

5.根据权利要求4所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，待牧草生长的平均株高距地面10~20cm后，再次向土壤根部均匀注射微生物复合菌。

6.根据权利要求1所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，采用七点法分孔注射微生物复合菌。

7.根据权利要求1所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，在高于100mg/kg浓度铀污染土壤修复时，牧草采用单年生黑麦草；所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20%、枯草芽孢杆菌10%，余量为培养基。

8.根据权利要求1-7任一项所述牧草-微生物联合修复铀污染土壤的方法，其特征在于，在低于50mg/kg浓度铀污染土壤修复时，牧草采用多花黑麦草；所述微生物复合菌中各菌种的接种量以百分比计为：胶质芽孢杆菌20%、枯草芽孢杆菌10%，余量为培养基。