CN113477704A - 一种牧草、牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牧草、牧草‑微生物联合修复铯污染土壤的方法，属于重金属污染土壤修复领域，在铯污染土壤上种植牧草，通过牧草实现对铯污染土壤中铯的富集；所述牧草为苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种。本申请的植物均通过前期萌发实验，考察了发芽率和发芽势，保证了植物种子对Cs核素污染的耐受性。进一步，对所筛选牧草植物进行了株高测定，同时测量了牧草植物营养生长末期的干重，并对各项富集参数进行了测定和计算，通过多项参数的比对，筛选出对Cs的优势富集植物。本申请筛选出三种对铯具有高富集能力的牧草植物，并以此为基础，实现对铯污染土壤的修复。在牧草修复铯污染土壤的基础上，进行牧草‑微生物的联合修复。

Description

一种牧草、牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法

技术领域

本申请涉及重金属污染土壤修复领域，具体为一种牧草、牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法。

背景技术

Cs是一种常见的γ射线发射源的同位素。在福岛核电站发生核泄漏事故后，大量的放射性核素释放到周边的环境中。放射性核素Cs会污染周边的环境，致使当地的条件不再足以维系人们的正常社会生活，进而造成大量土地的荒废。放射性核素铯-134和铯-137的半衰期长，且具有很强的迁移能力，使得等待其自然衰减几乎不可实现，而这些核素一旦通过食物链进入人体，将造成严重的危害。

利用植物富集修复污染土壤时，需要用到对重金属具有较强吸收作用的植物，这类植物被称为“超富集植物”。超富集植物是指对核素富集吸收能力高于常规植物至少100倍的特殊植物。Baker于1989年对超积累植物的定义为：植物对Cu、Co、Ni、Pb的富集能力大于1000mg·kg^-1，或是Mn、Zn的富集能力大于10000mg·kg^-1，且要保证该植物的转运系数(TF)＞1。

由于超富集植物需要在高浓度重金属胁迫的环境下生存，且需要对重金属具有较强的吸收作用，所以超富集植物往往具备以下特点：(1)对于污染重金属或核素具有高耐受性；(2)可收获部分能够积累高水平的重金属或核素；(3)生长周期较短，有较大的生物量，有较为庞大的根系。

植物对于核素的富集能力由土壤的污染浓度、植物种类、土壤本身理化性质及田间管理等多种因素决定。而在这些因素中，以植物种类的筛选是决定植物修复技术能力大小的关键性因素之一。不同的植物种类其自身对不同核素的耐受、富集、转运能力均有较大差异，选择正确的植物进行核素污染土壤的修复，可以达到事半功倍，大幅提升治理效率的效果。

为此，本申请提供一种超富集植物修复铯污染土壤的方法，以实现相应的生物修复。

发明内容

本申请的发明目的在于，提供一种牧草、牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法。

为了实现上述目的，本申请采用如下技术方案：

一种牧草修复铯污染土壤的方法，在铯污染土壤上种植牧草，通过牧草实现对铯污染土壤中铯的富集；

所述牧草为苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种。

包括如下步骤：

(1)当铯污染土壤内的铯浓度≤50mg·kg^-1时，采用苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种对铯污染土壤修复；

(2)当铯污染土壤内的铯浓度≤140mg·kg^-1且铯浓度＞50mg·kg^-1时，采用杂交狼尾草、提摩西中的一种或两种对铯污染土壤；

(3)当铯污染土壤内的铯浓度≤270mg·kg^-1且铯浓度＞140mg·kg^-1时，用提摩西对铯污染土壤修复。

一种牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法，在铯污染土壤上种植牧草，通过牧草实现对铯污染土壤中铯的富集；

所述牧草为苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种；

在牧草的根层注射微生物组合菌剂，通过微生物菌剂组合与牧草实现对铯污染土壤的修复。

所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按0.8-1.2:2:2:2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:0.8-1.2:2组成，或耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:0.8-1.2组成。

所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:1:1:1组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:2:2:2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:1:2组成，或耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:1组成。

所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:2:2:2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按2:1:2:0组成。

在牧草生长过程中，将微生物复合菌剂接种至牧草根部，通过微生物复合菌剂与牧草联合作用，实现对铯污染土壤的修复。

包括如下步骤：

(1)将牧草种子在待修复的含铯污染土壤中进行播种，并生长至幼苗期；

(2)将微生物复合菌剂接种到植物根层；通过微生物复合菌剂与牧草的联合作用，实现对含铯污染土壤的修复。

所述牧草为苏丹草；所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:1:2组成。

本申请的植物均通过前期萌发实验，考察了发芽率和发芽势，保证了植物种子对Cs核素污染的耐受性。进一步，对所筛选牧草植物进行了株高测定，同时测量了牧草植物营养生长末期的干重，并对各项富集参数进行了测定和计算，通过多项参数的比对，筛选出对Cs的优势富集植物。本申请筛选出三种对铯具有高富集能力的牧草植物，并以此为基础，实现对铯污染土壤的修复。在牧草修复铯污染土壤的基础上，进行牧草-微生物的联合修复，以5点注射法将外源促生微生物直接接种于植物根际，提升微生物存活率的同时，增加微生物的促进效应；通过牧草-微生物组合联合作用，实现对含铯土壤的修复，增加植物-微生物组合的实际应用价值。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为暗箱培养种子摆放示意图。

图2为植物的播种图。

图3为铯胁迫对多年生黑麦草株高的影响。

图4为铯胁迫对单年生黑麦草株高的影响。

图5为铯胁迫对高丹草株高的影响。

图6为铯胁迫对杂交狼尾草株高的影响。

图7为铯胁迫对苏丹草株高的影响。

图8为铯胁迫对提摩西株高的影响。

图9为高浓度铯胁迫下牧草枯萎示例图。

图10为铯胁迫对牧草地上部干重的影响。

图11为铯胁迫对牧草地下部干重的影响。

图12为五点接种法示意图。

图13为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草地上部干重的影响。

图14为Cs胁迫下微生物组合对提摩西地上部干重的影响。

图15为Cs胁迫下微生物组合对杂交狼尾草地上部干重的影响。

图16为牧草生长图。

图17为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草地下部干重的影响。

图18为Cs胁迫下微生物组合对提摩西地下部干重的影响。

图19为Cs胁迫下微生物组合对杂交狼尾草地下部干重的影响。

图20为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草地上部铯富集量的影响。

图21为Cs胁迫下微生物组合对提摩西地上部铯富集量的影响。

图22为Cs胁迫下微生物组合对杂交狼尾草地上部铯富集量的影响。

图23为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草地下部铯富集能力的影响。

图24为Cs胁迫下微生物组合对提摩西地下部铯富集能力的影响。

图25为Cs胁迫下微生物组合对杂交狼尾草地下部铯富集能力的影响。

图26为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草铯富集总量的影响。

图27为Cs胁迫下微生物组合对提摩西铯富集总量的影响。

图28为Cs胁迫下微生物组合对杂交狼尾草铯富集总量的影响。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

实施例1

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1种质材料

种质材料选用单年生黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)、多年生黑麦草(Loliumperenne L.)、高丹草(Sorghum Hybrid Sudangrass)、苏丹草(Sorghum sudanense(Piper)Stapf.)、杂交狼尾草(Pennisetum americanum x P.purpureum)、提摩西(Phleumpratense L.)。其中，杂交狼尾草、高丹草来源于江苏正大草业，单年生黑麦草、多年生黑麦草来源于苏卉花艺，提摩西来源于进口名园种业，苏丹草来源于江西稻草人农业园。

1.1.2供试土壤

供试土壤采自某污染土源，pH＝5.8，有机质含量为21.30mg·kg^-1，土壤Cs背景值为：72.50mg·kg^-1。属于被污染土壤。

1.2核素污染土壤的制备

选用氯化铯(CsCl)为Cs原料，根Cs的含量配制成不同浓度的Cs溶液。将配制完成的Cs溶液按照实验设计浓度要求，设置Cs浓度为：0、20、50、100、200、400mg·kg^-1。利用喷壶少量多次地均匀喷洒拌入土壤中，进行搅拌，将结团捏碎，以保证土壤搅拌均匀。将制备土壤置于暗处，静置放置1个月，期间每隔7天略微加入去离子水并进行搅拌，保证拌入核素的土壤达到土壤平衡，完成核素污染土壤的制备。

1.3铯对牧草种子发芽的影响

本实验发芽实验的具体步骤为：筛选六种牧草种子，挑选种子颗粒饱满、大小相近个体在5％次氯酸钠溶剂中浸泡8min，去离子水反复清洗，后用温水浸泡12h。将滤纸用去离子水润湿后平铺于培养皿中，均匀摆放40粒植物种子，摆放方式见图1。用去离子水分别溶解事先称量好的氯化铯加入培养皿，处理浓度梯度为0mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L。每个梯度设置三个重复，置于暗室常温培养。播种后第三天记录各处理的发芽势，第五天记录各处理的发芽率。

1.4牧草的播种及生长管理

本实验采用温室光照、盆栽栽培(高＝14cm，底径＝10cm，外口径＝16.5cm，每盆装土1kg)的实验方式。挑选种子颗粒饱满、大小相近个体在5％次氯酸钠溶剂中浸泡8min，去离子水反复清洗，后用温水浸泡12h，每盆30粒种子，将种子逐粒拨入预先准备的好的花盆中，保证播种均一，用少量土壤覆盖在种子表面，控制适宜的湿度，使种子可以健康生长。播种后每天观察生长状况，保证每盆25株健康植株。实验采用温室光照处理，保证每日光照时长11h(7:00am-18:00pm)适时浇水，保持田间持水量的60％～70％。

待牧草株高持续3d不再增长后，对牧草植物进行收获，具体收获方式为：利用去离子水将土壤浸湿，使其成为泥浆状，而后从花盆底部的排水孔用外力将整个土层连带植物一起顶出，使其脱离花盆。缓慢挤压土壤，由于牧草植物根系发达，注意不要伤到根系，将土层泡入事先准备好的水盆中，在水中缓慢地剥去植物根际土壤，将植物完整取出。最后用流水清洗植株，从植物底端主根与茎干连接处作为地上部和地下部的分界处，如有气生根的则以气生根与茎干连接处为地上部和地下部分界处，将植物分为地上部和地下部分开保存、编号，于105℃下杀青2h，烘干24h备测。

1.5牧草生长指标测定

待植物生长第19d开始测量并记录植物生长的株高，待植物株高持续3d无变化后结束株高测定。选取能代表整盆植株正常生长状况的牧草植株，直尺于土壤表面持平，将所选植株小心拉直，准确读数。单盆植株干重按照杀青烘干至恒重为标准，准确读数。

1.6牧草富集指标分析

采用微波消解仪(Anton Paar，德国，Multiwave PRO)对烘干植物的地上部、地下部材料进行消解实验。消解的具体操作流程如下：将杀青干燥后的植物材料磨碎后称取样品0.3g(精确到0.001g)于容器中，加入l0mL优级纯HN0₃，5mL高氯酸(70％～72％)，在可调式电热板(预热至180℃)上预消解30min。之后将消解管按照顺序放入微波消解仪中，设定温度爬坡180℃(20min)，温度保持180℃(20min)，样品冷却55℃(20min)。待微波消解完成后，将消解管以原顺序放回石墨消解仪，进行赶酸处理，待消解管内液体剩余1mL时，加入适量离子水(2-3mL)，持续赶酸，直到无白色酸雾产生。充分消解后的消解液应为无色透明液体。如变成棕黑色，表明未消解完全，放冷后再加入混合酸5mL，继续加热，直至消解完全。将无色透明的消解液用0.22μm水系过滤器转移至50mL容量瓶中，消解管应用去离子水进行多次清洗，清洗液同样经过0.22μm水系过滤器，并于容量瓶中，最后定容，混匀待测定，同时做空白实验。完成后，进行测定。

1.7铯胁迫牧草富集指标计算方法

植株Cs核素含量(CC，mg·kg^－1)＝(地上干重×地上核素含量+地下干重×地下核素含量)/(地上干重+地下干重)；

富集系数(BCF)＝植株核素含量/实际土壤核素含量；

转移系数(TF)＝植株地上核素富集量/植株地下核素富集量；

单盆积累量(BCQ，mg·pot^－1)＝(植株干重x植株核素含量)/单盆土重。

植株核素含量是检验植株对特定核素吸收能力的重要指标，其代表了植物在重金属污染环境下其体内能够吸收保存的重金属量。富集系数是衡量植株特定核素富集能力强弱的重要参数，超富集植物的富集系数通常＞1。转运系数TF代表了植株根部向上运输核素的能力。当一种植物对特定核素的吸收和富集主要在其地上部时，该植物的转运系数会＞1，当TF的数值越大时，越表明该植物对特定核素的转运能力越强，越有作为超富集植物的潜力；当TF<1时，证明该植物对特定核素的吸收主要集中在根部，且植株将核素向地上部转运的能力较弱，TF数值越小，该植物作为超富集植物的潜力就越有待考究。

2结果与分析

2.1铯胁迫对种质材料发芽势和发芽率的影响

对6种牧草植物种子第3天时各浓度铯胁迫下的种质材料种子的发芽势和第5天时各处理的发芽率进行测定，各种质材料的发芽势和发芽率结果如表1所示。

表1铯胁迫下各种子的发芽势和发芽率

由表可知，除苏丹草和高丹草外，各铯浓度胁迫对其他4种植物的种子发芽势和发芽率均无明显影响。苏丹草的发芽势和发芽率随着铯浓度胁迫的增高而逐渐下降，表现出明显的抑制作用，在400mg/L的Cs胁迫条件下，苏丹草的发芽势及发芽率仅为72.50％和72.33％；而高丹草在20mg/L的铯浓度胁迫下表现出发芽势和发芽率均受到抑制，而其他浓度条件下发芽势和发芽率无明显变化。从高浓度Cs胁迫条件下的相对发芽率来看，除苏丹草外，其余5种牧草植物种子均能正常发芽，表现这5种牧草种子对Cs胁迫具有良好的耐受性。

2.2铯胁迫对牧草生长效应的影响

2.2.1铯胁迫对牧草株高的影响

本申请通过模拟Cs污染土壤，对牧草植物进行梯度Cs压土培实验，记录在不同浓度Cs胁迫条件下植株在营养生长期间的株高变化，并与对照进行对比分析，探究Cs浓度对植株生长株高的影响，研究结果如图3、图4、图5、图6、图7、图8所示。

由图可知，除高丹草外，其余5种牧草植物的株高均在90mg·kg^-1的Cs浓度胁迫条件下表现出明显的抑制效应，其中苏丹草的株高受到的抑制效应最强，其株高相较于CK减少了27.5％，为45.4cm。在120mg·kg^-1的Cs浓度胁迫条件下，除杂交狼尾草外，其余5种牧草植物的株高抑制效应不明显或无抑制效应，而杂交狼尾草的株高则表现出明显的抑制效应，其株高相较于CK减少了24.7％；而提摩西在该浓度条件下株高反而增高，相较于CK提升了7.4％。6种牧草植物中只有提摩西能够在170mg·kg^-1和270mg·kg^-1的Cs浓度胁迫条件下能够维持生长，其余5种植物均在高浓度Cs胁迫条件下无法正常生长，且叶片发黄焦枯，出现不同程度的枯萎和死亡，如图9所示；提摩西在170、270mg·kg^-1的Cs浓度胁迫条件下，其株高分别为48.3cm和48.0cm，相较于CK减少了4.0％和4.6％。

2.2.2铯胁迫对牧草干重的影响

本实施例将牧草分为地上部和地下部进行收获，获得6种牧草植物地上部、地下部的干重数据，并对其进行分析，探究Cs胁迫对牧草干重的影响，如图10、图11所示。

如图所示，⑴地上部干重方面：6种牧草植物中，单年生黑麦草和多年生黑麦草的地上部干重在低浓度的Cs胁迫下没有明显差异，证明单年生黑麦草和多年生黑麦草对低浓度Cs胁迫具有一定的耐受性，两种牧草植物在120mg·kg^-1的Cs条件下，其地上部干重分别为1.41g和1.28g。其余4种牧草植物在浓度Cs胁迫下依旧呈现出随Cs浓度提升，其地上部干重逐渐下降的趋势，证明4种牧草植物的正常生长发育受到了Cs胁迫的影响，但苏丹草的地上部干重相较于具有耐受性的单年生黑麦草和多年生黑麦草来说，依旧远高于该两种牧草，其地上部干重在70mg·kg^-1的Cs条件下能够达到7.66g，而在120mg·kg^-1的Cs条件下，其地上部干重也最高，为4.40g。

⑵地下部干重方面：6种牧草植物中，苏丹草的地下部干重在低浓度Cs胁迫下呈现出随Cs浓度的提升而逐渐增加的趋势，其地下部干重最高的为120mg·kg^-1的Cs条件下的苏丹草，为3.12g。证明低浓度的Cs对苏丹草根系的生长具有促进作用。而其余5种牧草植物的地下部干重在低浓度Cs胁迫条件下，呈现出先增加再减少的趋势，证明低浓度的Cs胁迫能够一定程度上促进6种牧草植物根系的生长，而随着Cs浓度的提升，而逐渐转变为抑制作用。

2.3牧草对铯的富集能力分析

2.3.1牧草对铯的富集能力分析

将所收获的植物样品通过杀青干燥处理后，利用研钵将植物样品研磨成粉状，而后称取0.3g样品进行消解处理，利用火焰原子吸收法对消解液进行定量测定，最后将所得数据进行计算整理，得到各类相关系数。各植物Cs富集相关参数如表2所示。

表2各种质材料Cs富集参数

表2中，GCC:地上植株Cs含量(mg·kg-1)；UCC:地下植株Cs含量(mg·kg-1)；CC:植株Cs含量(mg·kg-1)；BCQ:单盆积累量(mg·pot-1)；BCF:富集系数；TF:转移系数。

由表可知，在各浓度Cs胁迫条件下，单年生黑麦草和多年生黑麦草的各项数据均远低于其余4种植物。除提摩西外，其余5种植物均在170mg·kg^-1及以上Cs胁迫条件下无法正常生长，而从提摩西的富集系数可以看出，在270mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，提摩西的地上部、地下部Cs富集量均低于170mg·kg^-1Cs浓度胁迫下其本身的富集量，证明提摩西在高浓度胁迫下其对Cs的富集能力受到了明显的抑制。

地上部和地下部Cs富集量方面，在90mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，杂交狼尾草的地上部Cs富集量最高，为1039.50mg·kg^-1；而地下部富集量则是提摩西最高，为1155.00mg·kg^-1。在120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，杂交狼尾草的地上部和地下部的Cs富集量最高，分别为4964.42mg·kg^-1和3607.83mg·kg^-1。从植株的Cs富集量来看，在120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，杂交狼尾草和提摩西的富集量较大，分别为4605.35mg·kg^-1和3315.39mg·kg^-1而多年生黑麦草的富集量最低，仅为1647.94mg·kg^-1。

单盆积累量方面，在70-120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，各植物的单盆积累量均呈上升趋势。在120mg·kg^-1Cs浓度胁迫条件下，杂交狼尾草的单盆积累量最大，为15.97mg·pot^-1；其次为苏丹草和高丹草，其单盆积累量分别为15.54mg·pot^-1和12.88mg·pot^-1。而在170-270mg·kg^-1Cs浓度胁迫条件下，只有提摩西能够保持生长，其单盆积累量分别为16.51mg·pot^-1和6.66mg·pot^-1。

富集系数方面，在90-120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，杂交狼尾草的富集系数最大，分别为10.69和37.73，其次是提摩西，分别为8.25和27.16。多年生黑麦草的富集系数最低，仅为4.74和13.50。170-270mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，提摩西的富集系数分别为25.26和9.02，从富集系数可以看出，提摩西的富集能力在高浓度条件下同样表现出了抑制作用。

转运系数方面，在70-120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，除高丹草外，其余5种牧草植物的转运系数均呈逐渐上升的趋势，高丹草的转运系数呈现随浓度上升而逐渐降低的趋势，其在120mg·kg^-1时达到最低，为1.02，但高丹草的转运系数始终大于1，证明其有较强的Cs转运能力。而在90mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，杂交狼尾草和苏丹草的转运系数最大，均为1.21。而在120mg·kg^-1Cs浓度胁迫下，苏丹草的转运系数最高，达到了1.49，其次为杂交狼尾草，其转运系数为1.38。

3.讨论与小结

本实施例所用土壤属于污染土壤，其Cs的原始土壤背景值均达到了污染土壤标准，为72.50mg·kg^-1。因此，本申请通过设置梯度浓度实验，将原本设置为0、20、50、100、200、400mg·kg^-1的污染土壤，代入其背景值后，实际实验所用土壤污染浓度为Cs：70、90、120、170、270、470mg·kg^-1。

3.1牧草种子与幼苗核素耐受性的差异

本实施例所选牧草种子均经过了前期的种子萌发实验，保证了发芽势和发芽率，但在Cs的超富集植物筛选实验过程中，供试材料在高浓度的Cs胁迫下依旧产生了不同程度的枯萎和死亡。究其原因是由于种子在萌发时期其所需营养物质大多有自身的胚乳提供，而进入幼苗期开始，所需的营养物质更多是通过自生光合作用和外界土源吸收获得，而核素往往具有一定的生理毒性，且Cs与K化学性质类似，而Cs和K属于竞争关系，高浓度的Cs⁺会抢占K⁺离子通道，导致植物吸收K⁺受阻。当牧草植物缺少生长所需的必要元素且生长环境恶劣时，变回产生叶片焦黄枯萎，甚至死亡等生理反应。

本实施例中，在120mg·kg^-1的Cs浓度条件下，单年生黑麦草、多年生黑麦草和提摩西转运系数均小于1，证明该浓度条件下，3种牧草植物其对Cs的转运能力不强，以地下部富集为主。

3.2小结

本研究通过对6种牧草植物种子进行Cs胁迫萌发实验，确定6种牧草植物种子对各浓度的Cs胁迫均有一定程度的耐受性。通过梯度Cs胁迫土培，对6种牧草植物的生长效应及富集能力进行了综合考察，发现6种牧草植物对于低浓度的Cs胁迫环境下具有一定的耐受能力；而高浓度Cs条件下，除提摩西外的其余5种牧草植物在高浓度Cs条件下均不能保持正常生长，出现叶黄焦枯，于幼苗期死亡的现象。针对Cs的富集能力，提摩西、杂交狼尾草和苏丹草相较于其他植物有明显优势，其单盆积累量在120mg·kg^-1Cs胁迫环境下分别达到了12.11mg·pot^-1，15.97mg·pot^-1，15.54mg·pot^-1。因此，选用苏丹草、杂交狼尾草、提摩西作为Cs的植物-微生物联合修复备选植物。

4.微生物-牧草联合修复铯污染土壤

在前述基础上，建立植物-微生物组合，进行Cs污染土壤的植物-微生物联合修复研究。

4.1材料与方法

4.1.1牧草和微生物组合

发明人通过考察不同牧草对Cs的耐受性和富集能力，筛选出三种具有强耐受性和高富集能力的牧草：苏丹草(Sorghum sudanense(Piper)Stapf.)、提摩西(Phleumpratense L.)、杂交狼尾草(Pennisetum americanum×Pennisetum purpureum cv.)。

耐Cs的微生物组合为：A(枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌＝1:1:1:1)、B(枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌＝1:2:2:2)、D(枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌＝2:1:2:0)、H(枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌＝0:2:1:0)。

将耐Cs的三种牧草分别与筛选得到的四种微生物组合进行组合，在牧草生长过程中，将微生物菌液接种至植物根部，研究微生物组合对牧草生物量及富集能力的影响。

4.1.2材料制备

4.1.1.1铯污染土壤制备

通过计算配置含Cs浓度为20、50、100mg kg^-1的土壤。拌置方法：通过计算称取一定量的CsCl，将固体在去离子水中溶解后，与农田土壤一起均匀搅拌，静置1个月，在静置期间需要每隔十天对土壤加水进行二次混合。在静置期结束待土壤自然风干后装入花盆中，每盆装1kg土壤。

4.1.1.2微生物组合的培养

分别取枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、耐辐射奇球菌和荧光假单胞菌在TGY培养基中进行培养，待细菌OD₆₀₀达到1.0时，按照比例将菌液进行混合摇匀，分别得到A、B、D、H组合。

表3 Cs修复优势微生物组合表

4.1.2牧草播种及生长管理

选取籽粒饱满的种子在5％次氯酸钠溶剂中浸泡8min，去离子水反复清洗，后用温水浸泡24h。将泡后的种子均匀播种在花盆中，控制种子发芽所需要的湿度和温度，观察发芽情况。待种子发芽后，选择长势较好的草苗定株25株，拔掉长势差及过于密集的苗，每天用日光灯照射12h，定期给每盆牧草浇等量的水，保持牧草生长最适的条件。

4.1.3接种微生物

待牧草植株生长至幼苗期(待植物生长的平均株高3cm)时，将筛选的微生物组合用注射器注射到植物根层，采用五点接种法，分孔均匀注射菌液，注射深度5cm，每5天注射一次，每次20mL，共计注射4次，总量80mL菌液。其中，五点接种法示意图如图12所示。

4.1.4样品的收获及处理

待牧草生长至地上部不再增高为止，在抽穗前收获牧草，用手轻轻捏碎植物根部土壤，将植物连同地下部完整取出，用水洗干净根部泥土，将地上部地下部分离，分别在105℃烘箱中进行杀青处理，结束后用研钵将样品碾碎成粉，称取0.3g在微波消解仪(AntonPaar Multiwave PRO)中进行消解。消解样通过火焰原子吸收分光光度计(Perkin ElmerAA700)，测定Cs含量。

通过公式计算所测数据的各个指标，各指标的计算公式如下：

植株核素含量(Nuclide contents，NC，mg/kg)＝(地上干重×地上核素含量+地下干重×地下核素含量)/(地上干重+地下干重)；

富集量(Bioconcentration quantity，BCQ，mg/pot)＝每盆植株干重×植株核素含量；

富集系数(Bioconcentration factor，BCF)＝植株核素含量/实际土壤核素含量；

转移系数(Transport coefficients，TF)＝植株地上核素富集量/植株地下核素富集量。

4.2结果分析

4.2.1微生物组合对牧草干重的影响

将牧草收获后杀青，去除牧草中的水分，分别称量不同牧草的不同部位后获得牧草干重数据如图13、图14、图15所示。

图16给出了牧草生长图；其中，a：提摩西接种D组合后在不同浓度下的生长情况；b：狼尾草接种A组合后在不同浓度下的生长情况；c：提摩西在100mg kg-1时接种不同微生物组合后的差异(CK)。

研究发现，不同Cs浓度对三种牧草地上部的生物量影响较大，其中三种牧草在Cs浓度为20mg kg^-1时生物量最低，苏丹草和提摩西在Cs浓度为100mg kg^-1时也表现出很强的生长能力，如图16(a)所示。苏丹草在20mg kg^-1和50mg kg^-1时，生长受到了抑制，而Cs浓度达到100mg kg^-1时生物量又增加且接近0浓度对照组；提摩西在Cs浓度为50和100mg kg^-1时，生物量明显高于20mg kg^-1，并且超过了0浓度对照组，表明中高浓度的Cs对提摩西的生长造成了一定的促进作用；如图16(b)所示，狼尾草在受到三个浓度的胁迫下，其生物量都低于0对照组，表明狼尾草对于Cs的耐受性较差，导致狼尾草在受到Cs胁迫后生长情况受到抑制。

通过图16(c)所示可以明显看出添加微生物组合后，牧草生物量得到了增加。对于0浓度来说，在添加微生物组合后各实验组的生物量都得到明显提升。提摩西的CK组在20、50、100mg kg^-1时生物量均低于0浓度对照组，但是在接种四种微生物组合后，50和100mgkg^-1时的实验组生物量超过了0对照组。苏丹草根部添加四种组合后，B组合在0、50和100mgkg^-1的浓度下均比其余四组生物量高，因此得出B组合在促进苏丹草生物量的增加中具有明显的正向效果。在提摩西中，A、B、D组合在四种浓度下对提摩西生物量的提高具有较强的作用，所以这三个微生物组合为提升提摩西地上部干重的优势组合。狼尾草在20、50、100mgkg^-1下干重受到抑制，但是总体下A、D组合在四种浓度中具有较好的促进作用。

图17、图18、图19依次为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草、提摩西、杂交狼尾草地下部干重的影响。

Cs对地下部干重的影响较小，苏丹草在四种浓度下地下部干重均较为稳定，没有受到促进和抑制作用；提摩西地下部干重受到Cs的影响与地上部一致，三个浓度均抑制了地下部干重，在20mg kg^-1的时候受到的抑制最强，在50和100mg kg^-1时又得到微小的促进作用，但是总体变化不大；狼尾草地下部生物量与苏丹草和提摩西比较总体较小，在Cs的胁迫下的实验组与0浓度对照组比，表现出微小的抑制作用。

微生物组合对地下部干重的影响也很显著，苏丹草0浓度对照组中A、B、D三个组合都促进了牧草地下部生物量的增加，其中B组合效果最佳，在0、20、50mg kg^-1时对苏丹草地下部生物量的促进作用都最强，在浓度达到100mg kg^-1时，四种组合均对地下部生物量有促进作用，其中A、D、E组合表现出的促进能力最强。在提摩西中，四个微生物组合的能力表现的更加突出，在所有浓度中，微生物组合均对牧草地下部干重产生了明显的促进作用，在0、20mg kg^-1时A组合的促进效果最显著，在50、100mg kg^-1时B、D组合的效果最显著，其中D组合在100mg kg^-1时提摩西地下部干重是CK组的3倍。狼尾草中在0、20mg kg^-1时B、D组合效果较好，在50、100mg kg^-1时D、E组合的徐静效果较好。

4.2.2微生物组合对牧草富集效率的影响

图20、图21、图22分别为Cs胁迫下微生物组合对苏丹草、提摩西、杂交狼尾草地上部铯富集量的影响。

微生物组合虽然对牧草干重的增加具有明显的促进能力，但是对牧草地上部富集Cs的能力上却产生了一定的抑制作用，除了在狼尾草100mg kg^-1时四个组合的富集能力与CK大致持平，且B组合稍强于CK外，其余实验组的富集能力均受到微生物组合的抑制作用。

如图23、图24、图25所述，苏丹草中在20mg kg^-1的Cs浓度下，四个组合对牧草富集Cs的能力都未表现出促进作用。在50mg kg^-1时A、B组合对苏丹草富集能力表现出促进作用，而D、H组合则相对产生抑制作用。在100mg kg^-1时A、D组合具有促进富集能力的效果，而B、H组合又产生抑制作用。在提摩西中，四种组合未对牧草富集能力造成正向促进能力。在杂交狼尾草100mg kg^-1的Cs浓度下，接种了A组合后增强了牧草对Cs的富集能力。

4.2.3微生物组合对牧草单盆富集量的影响

单盆富集量是指牧草植株在单位质量的污染土壤中一次性所能够富集的全部Cs的质量。它是通过植株各部分的干重与其各部分的富集浓度乘积之和，是牧草对Cs污染能力最直接的体现。研究结果如图26、图27、图28所示，研究所用到的四种微生物组合在低浓度0和50mg kg^-1Cs的时候，对牧草的富集能力产生抑制效果，而在100mg kg^-1时，D组合对三种牧草的富集能力均具有促进作用。在苏丹草100mg kg^-1浓度下接种D组合后，苏丹草的富集能力得到一定的提升，对Cs的富集量可以达到1.2mg kg^-1。在提摩西10mg kg^-1的根部接种微生物组合后，D、H组合都可以提高牧草富集Cs的能力，在杂交狼尾草中，A、B、D、H四个组合均能够在100mg kg^-1时提高对Cs的富集能力。其中D组合的促进能力最强。因此D组合是促进牧草富集土壤中Cs的最优组合。

研究表明，接种微生物组合对牧草干重的促进作用较大，可以很明显的增加牧草地上部和地下部的干重，但是在20、50mg kg^-1Cs的环境中对牧草富集Cs的能力却存在抑制作用，在100mg kg^-1时不同牧草与其不同的组合结合后会产生一定的促进效果。总体来说苏丹草-D组合为去除Cs的最优组合。

表4各植物-微生物组合Cs富集参数

注：CK为对应浓度无微生物的对照；GCC为地上植株铯含量(mg kg^-1)；UCC为地下植株铯含量(mg kg^-1)；CC为植株铯含量(mg kg^-1)；BCQ为单盆积累量(mg pot^-1)；TF为转移系数；BCF为富集系数。

4.3总结

本申请中，添加了微生物组合的实验组地上部和地下部干重明显高于未添加微生物的CK组，因此表明微生物组合作用于植物根部后可以显著提高牧草的干重。

本申请中，狼尾草在相同浓度下的转移系数和富集系数分别为2.047±0.298和5.817±0.469，添加H组合后3.272±0.291和6.071±0.188，在未添加微生物组合前狼尾草的转移系数比油菜低，但添加微生物后转移系数和富集系数都获得了提高。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (5)

1.一种牧草修复铯污染土壤的方法，其特征在于，在铯污染土壤上种植牧草，通过牧草实现对铯污染土壤中铯的富集；

所述牧草为苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述牧草修复铯污染土壤的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）当铯污染土壤内的铯浓度≤50 mg•kg^-1时，采用苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种对铯污染土壤修复；

（2）当铯污染土壤内的铯浓度≤140 mg•kg^-1且铯浓度＞50 mg•kg^-1时，采用杂交狼尾草、提摩西中的一种或两种对铯污染土壤；

（3）当铯污染土壤内的铯浓度≤270 mg•kg^-1且铯浓度＞140 mg•kg^-1时，用提摩西对铯污染土壤修复。

3.一种牧草-微生物联合修复铯污染土壤的方法，其特征在于，在铯污染土壤上种植牧草，通过牧草实现对铯污染土壤中铯的富集；

所述牧草为苏丹草、杂交狼尾草、提摩西中的一种或多种；

在牧草的根层注射微生物组合菌剂，通过微生物菌剂组合与牧草实现对铯污染土壤的修复。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:0.8-1.2:0.8-1.2:0.8-1.2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按0.8-1.2:2:2:2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:0.8-1.2:2组成，或耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:0.8-1.2组成。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述微生物复合菌剂由枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:1:1:1组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌：荧光假单胞菌按1:2:2:2组成，或枯草芽孢杆菌：耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:1:2组成，或耐辐射奇球菌：蜡样芽孢杆菌按2:1组成。

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