CN110721997A

CN110721997A - 一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法

Info

Publication number: CN110721997A
Application number: CN201911196944.XA
Authority: CN
Inventors: 陈晓明; 韩梦薇; 戚鑫; 王丹; 商冉; 勾家磊; 卓弛夫; 敬路淮; 罗学刚
Original assignee: Southwest University of Science and Technology
Current assignee: Institute of chemical defense, Chinese Academy of Military Sciences; Southwest University of Science and Technology
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明公开了一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法，目的在于解决现有的重金属土壤修复方法主要以修复单种重金属污染的土壤为主，对于受重金属镉、铀同时污染的土壤，尚缺乏有效修复措施的问题。本发明微生物修复铀镉复合污染土壤的方法，包括如下步骤：将复合菌种用于铀镉复合污染土壤的修复中，所述复合菌种采用枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌复合而成。本发明通过将三种菌株复配，得到特定比例的微生物复合物，其能大幅提升对土壤中金属铀、金属镉的去除水平，具有较好的去除效果。本申请操作简单，对金属铀、金属镉的去除效果好，去除率高，具有极好的土壤修复效果。

Description

一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法

技术领域

本发明涉及土壤修复领域，尤其是铀镉复合污染土壤领域，具体为一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法。

背景技术

土壤是生态系统的重要组成部分，也是生物赖以生存的物质基础。然而，重金属对土壤的污染，会导致粮食的大量减产，造成严重的经济损失。其中，重金属镉具有高毒性、高迁移性和污染的隐蔽性，存在较大的危害。而铀作为一种放射性核素，同时兼有化学污染毒性和放射性，其可通过采矿作业、泄漏等方式释放到土壤、沉积物或地下水中，造成土壤和地下水的污染。

重金属污染物主要来源于矿山的开采、冶炼、电镀以及制革行业的蓬勃发展，含镉农药化肥的大量使用。重金属对生态环境造成污染，此外可通过食物链途径，进入人体进而对人体健康产生严重危害作用。目前，对重金属污染的质量主要有三大类，分别是物理，化学及生物方法。研究表明，微生物可以通过和重金属离子的络合作用、胞外沉淀、胞内积累等方式，达到降低重金属生物可利用态浓度的效果，被广泛应用于研究重金属污染的土壤修复。

针对土壤重金属污染问题，人们进行了大量的研究。例如，中国专利申请CN110283596A公开了一种原位修复土壤重金属镉的钝化剂及修复方法；中国专利申请CN110283023A公开了一种用于修复土壤镉污染的多效能玉米秸秆生物炭复合肥料及其制备方法；中国专利申请CN107138520A公开了一种利用硫酸盐混合菌还原修复铀污染土壤的处理方法；中国专利申请CN201810953966.5公开了一种铀污染土壤的高效植物提取修复方法；中国专利申请CN201410168041.1公开了一种全方位联合技术修复铀污染土壤的装置和方法；中国专利申请CN201110335747.9公开了一种利用柠檬酸促进蚕豆修复治理铀污染土壤的方法。

然而，目前的重金属土壤修复方法，主要还是以修复单种重金属污染的土壤为主，对于受重金属镉、铀同时污染的土壤，尚缺乏有效的修复措施。

为此，本申请以铀、镉复合污染的土壤为对象，提供一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对现有的重金属土壤修复方法主要以修复单种重金属污染的土壤为主，对于受重金属镉、铀同时污染的土壤，尚缺乏有效修复措施的问题，提供一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法。本发明通过将三种菌株复配，得到特定比例的微生物复合物，其能大幅提升对土壤中金属铀、金属镉的去除水平，具有较好的去除效果。本申请操作简单，对金属铀、金属镉的去除效果好，去除率高，具有极好的土壤修复效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法，将复合菌种用于铀镉复合污染土壤的修复中，所述复合菌种采用枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌复合而成。

所述复合菌种中，枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌的比例为15-30:15-20:10，或10-20:30:30。

所述复合菌种中，枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌的比例为30:20:10，或10:30:30，或30:30:20。

进一步，所述复合菌种中，枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌的比例为30:30:20。

包括如下步骤：

(1)按菌种悬液投加比例，配置复合菌种；

(2)向待处理的铀镉复合污染土壤中添加步骤1制备的复合菌种，充分混匀，并调节土壤持水量，保证土壤内复合菌种的生长，即可。

所述步骤2中，以待处理铀镉复合污染土壤的质量计，复合菌种的添加量为铀镉复合污染土壤质量的0.1～8％。进一步，复合菌种的添加量为铀镉复合污染土壤质量的2.0～4.5％。作为优选，复合菌种的添加量为铀镉复合污染土壤质量的2.5～3.0％。

所述步骤2中，复合菌种的生长时间为5～200d。

所述步骤2中，复合菌种的生长时间为60～90d。

所述步骤1中，将配置的复合菌种与生物炭混合，恒温摇床培养10～50h后抽滤，真空冷冻干燥得到吸附微生物固定剂；并将制备的吸附微生物固定剂代替复合菌种，用于步骤2中。

所述步骤1中，恒温摇床培养温度为10～35℃，摇床转速为80～150r·min^-1。进一步，所述步骤1中，恒温摇床培养温度为30℃，摇床转速为120r·min^-1，培养时间为22～26h。

所述生物炭采用包括如下步骤的方法制备而成：以农业废弃物为原料，将原料烘干粉碎后，在300～380℃下缺氧炭化1～3.5h后，冷却至室温，取出炭化物，磨碎，完成生物炭的制备；

所述农业废弃物为玉米秸秆、药渣、牛粪、酒糟、甘蔗皮中的一种或多种。进一步，所述农业废物物为玉米秸秆或药渣。

将原料烘干粉碎后，置于马弗炉内缺氧炭化；缺氧炭化温度为340～360℃，缺氧炭化时间为1.5～2.5h。

针对前述问题，本申请提供一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法。发明人通过长期实践，将枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌按特定比例进行复配，得到对铀镉复合污染土壤具有较好修复效果的复合菌剂。

试验结果表明，本发明对U的去除率能达到83.58％，对Cd的去除率能达到66.06％，具有较好的去除效果。

附图说明

本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：

图1为实施例1中细菌组合对U和Cd的去除效率图。

图2为实施例1对土壤可提取态铀、镉的影响。

图3为实施例1中M处理组对芹菜、番茄生物量的影响。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1

分别取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkmanand Gillen)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)悬浮液。将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkman and Gillen)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)按30％：30％：10％的比例配置成复合菌剂。

向待处理的铀镉复合污染土壤中添加配置的复合菌剂(复合菌剂的质量为待处理的铀镉复合污染土壤质量的3％)，充分混匀，定期浇水保持土壤湿润，即可。

为验证本申请的可行性，实验室验证如下。

1.试验材料

1.1供试菌种

供试菌株来源于西南科技大学实验室保存的三株菌株，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkman and Gillen)和蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。

1.2供试土壤

供试土壤的铀、镉含量及理化性质如下表1所示。

表1土壤的铀、镉含量及理化性质

pH	OM(g·kg<sup>-1</sup>)	CEC(cmol·kg<sup>-1</sup>)	Cd(mg·kg<sup>-1</sup>)	U(mg·kg<sup>-1</sup>)
					7.3	7.9	12.6	3.1	24.1

2.细菌组合的筛选

2.1细菌组合正交试验

选取前述筛选的菌株蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和柠檬酸杆菌。细菌在LuriaBertani(LB)培养基(胰蛋白胨5.0g，酵母抽提物10.0g，NaCl 10.0g，水1L，pH 7.2)中在30℃、120rpm条件下震荡培养24h。细菌细胞在4℃下以8000rpm的速度离心15min收集细菌细胞，再用无菌的0.03M MgSO₄溶液洗涤三次以去除剩余的培养基。除去上清液后，用0.85％无菌NaCl溶液制备细菌悬浮液，其生物量浓度约为2×10⁸CFU·mL^-1。设计细菌组合的正交试验，三种菌悬液投加比例分别为10％、20％和30％。表2显示了正交试验的处理方法。

表2三种菌株的正交实验

2.2吸附实验

在含有50ml供试金属溶液(初始U和Cd浓度均为30mg·L^-1)的250ml锥形瓶中进行吸附实验，比较细菌组合对U和Cd的去除效果。吸附剂为细菌组合菌悬液(其生物量浓度为2×10⁸CFU·mL^-1，2ml)，在吸附实验前加入溶液中。吸附实验在振荡培养箱中进行，温度为30℃，转速为120rpm，时间为24h。吸附后，悬浮液以4000rpm离心8min，分析上清液中残留的U和Cd浓度。设置不含细菌组合的对照组在相同条件下进行实验，通过吸附实验筛选出最佳的细菌组合。

3.结果分析

图1给出了实施例1中细菌组合对U和Cd的去除效率。图1中，不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

如图1所示，对于U的去除，M9的去除率最高(83.58％)，其次是M6(79.66％)。其他细菌组合的去除率为60.18％-74.34％，显著低于M6(p<0.05)。对于Cd的去除，M7和M9的去除率最高(分别为66.06％和65.61％)。其他细菌组合的去除率为44.67％-59.65％，显著低于M9处理(p<0.05)。总的来说，M9对U、Cd都具有较高的去除率，因此，M9(30％枯草芽孢杆菌+30％蜡样芽孢杆菌+20％柠檬酸杆菌)为最佳的细菌组合。

进一步，发明人以前述M9的细菌组合为基础，将本发明用于修复土壤的蔬菜实例验证，具体如下。

4.1供试土壤

土壤取自西南科技大学校园实验田，挑拣出植物残体及石子后，阴凉处风干并磨碎过1mm筛。将一定量的CdCl₂与UO₂(CH₃COO)₂·H₂O溶解于去离子水溶液中，期间不断搅拌使之充分混匀，置于20℃培养箱继续老化一个月，待用。最终，土壤中重金属浓度、有机质含量(OM)及阳离子交换量(CEC)见表3。

表3土壤的铀、镉含量及理化性质

pH	OM(g·kg<sup>-1</sup>)	CEC(cmol·kg<sup>-1</sup>)	Cd(mg·kg<sup>-1</sup>)	U(mg·kg<sup>-1</sup>)
					7.1	13.9	12.6	2.5	28.9

每盆2.5kg供试土壤样品，设置2个处理，未添加钝化剂的土壤作为对照(记为CK)，另外1个处理中加入M9的细菌组合(记为M)。添加量为3％(以干重计)，充分混匀，同时每个处理设3个重复。置于温室中，温度控制在25±1℃，定期浇水保持土壤湿度，培养75d。

4.2钝化后土壤的盆栽试验

选取叶菜类的芹菜(Apium graveolens)、茄果类的番茄(Lycopersiconesculentum)进行盆栽实验。用乙醇和30％的H₂O₂(1:1)混合液对蔬菜种子表面消毒20min，并用大量的无菌水洗涤。再播种育苗，待种子发芽2周后选择发育一致的幼苗，每盆种植3株，蔬菜暴露在自然光下，土壤定期灌溉。蔬菜成熟后收获，分别收获根和可食部分，去离子水洗净后干燥，用ICP-MS测定铀、镉含量(通常情况下，芹菜的可食部分为其地上部分，番茄的可食部分为其果实)。

4.3土壤酶活测定及铀、镉可提取态测定

添加本发明对土壤进行处理75d后，测定土壤酶活和可提取态铀、镉含量。

4.3.1土壤FDA水解酶与脱氢酶测定

FDA水解酶以无色的荧光素二乙酸为基质，采用比色法来测定其活性，结果以1h内1g土壤中荧光素的毫克数来表示。脱氢酶采用TTC法测定，结果以24h后1g土壤中TPF的毫克数来表示。每种土样的酶活测定均需要设置无基质对照，整个实验需做无土对照。

4.3.2土壤可提取态重金属测定

配置DTPA浸提液：称取1.967g DTPA溶于15.6mL三乙醇胺和少量水中；再将1.47gCaCl₂·2H₂O溶于水，一并转入1000mL容量瓶中，加水至约950mL，用6mol·L^-1HCl调节pH至7.30，最后用水定容。

浸提步骤：称取25g风干并过20目筛的土样，放入150mL硬质玻璃三角瓶中，加入50mL DTPA浸提剂，于室温下往复振荡，3000r·min^-1离心60min，再用ICP-MS测定上清液中铀、镉的含量。

5结果与分析

5.1本申请对土壤可提取态铀、镉含量的影响

将M9复合菌株以土重的3％(均以干重计)，施加入供试土壤后，于第75d采集样品，测定土壤中可提取态铀、镉含量，以未加菌株处理作为对照。处理土壤的钝化效果如图2所示。相比于对照组，本申请处理土壤中可提取态的铀、镉含量均显著降低。

5.2钝化后土壤的理化性质及酶活变化

本申请还考察75d后各处理土壤理化性质及酶活变化，如表4所示。结果显示，M处理组中土壤脱氢酶活性显著高于对照组，相对于对照组，其活性增加幅度达14.2％。

表4钝化75d后各处理组土壤理化性质的变化

5.3钝化处理后蔬菜的生长状况

株高是植物形态学指标之一，其变化可视为植物受土壤中重金属胁迫程度的直接反应，也是检验钝化剂对重金属的钝化效果的重要指标。试验结果表明，与对照组相比，M处理组能显著提高株高。

生物量检验植物生长状况的重要指标，也是植株受重金属胁迫程度的主要体现方式。图3显示了M处理组对芹菜、番茄生物量的影响。钝化处理对植物的生物量都有一定的影响，与对照相比，M处理对芹菜、番茄的生物量有显著提高(P<0.05)，相比于对照组其生物量分别增加了45.5％、25.8％。这些结果与实验结束时观察到的植物的健康状况一致。在钝化剂处理之后，芹菜、番茄显示出正常的发育，没有任何毒性症状。

5.4钝化处理后芹菜、番茄中的铀、镉含量

我们通过盆栽试验，模拟了M处理组修复后的芹菜、番茄对铀、镉的吸收情况，检验钝化剂的修复效果。

与对照组相比，M处理组中蔬菜的地上和根部的铀、镉含量都显著降低(P<0.05)。M处理组中，芹菜可食部分铀含量降低了22.3％，根部铀含量降低了25.4％；番茄可食部分的镉含量降低了37.3％，根部的镉含量降低了42.6％。

综上，为了验证本申请的效果，本申请对铀镉复合污染土壤进行修复，并以芹菜、番茄为实例，通过检测芹菜、番茄中重金属的富集量，检验了本申请的修复效果。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims

1.一种微生物修复铀镉复合污染土壤的方法，其特征在于，将复合菌种用于铀镉复合污染土壤的修复中，所述复合菌种采用枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌复合而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合菌种中，枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌的比例为15-30:15-20:10，或10-20:30:30。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述复合菌种中，枯草芽孢杆菌、柠檬酸杆菌与蜡样芽孢杆菌的比例为30:20:10，或10:30:30，或30:30:20。

4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）按菌种悬液投加比例，配置复合菌种；

（2）向待处理的铀镉复合污染土壤中添加步骤1制备的复合菌种，充分混匀，并调节土壤持水量，保证土壤内复合菌种的生长，即可。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，以待处理铀镉复合污染土壤的质量计，复合菌种的添加量为铀镉复合污染土壤质量的0.1~8%。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述步骤2中，复合菌种的生长时间为5~200d。

7.根据权利要求4~6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，将配置的复合菌种与生物炭混合，恒温摇床培养10~50h后抽滤，真空冷冻干燥得到吸附微生物固定剂；并将制备的吸附微生物固定剂代替复合菌种，用于步骤2中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1中，恒温摇床培养温度为10~35℃，摇床转速为80~150 r·min^-1。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物炭采用包括如下步骤的方法制备而成：以农业废弃物为原料，将原料烘干粉碎后，在300~380℃下缺氧炭化1~3.5h后，冷却至室温，取出炭化物，磨碎，完成生物炭的制备；

所述农业废弃物为玉米秸秆、药渣、牛粪、酒糟、甘蔗皮中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将原料烘干粉碎后，置于马弗炉内缺氧炭化；缺氧炭化温度为340~360℃，缺氧炭化时间为1.5~2.5h。