CN103350105A - 一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法，首先在镉污染土壤中种植镉富集植物，然后在镉富集植物根际土壤接种耐镉细菌，常规培养，浇水、保湿，利用镉富集植物对镉的吸收作用和耐镉细菌的强化作用联合富集土壤中镉，重复上述过程可达到修复镉污染土壤的目的。本发明土壤修复方法效果好、费用低，易于管理与操作，不会产生二次污染，具有广泛的应用前景。

Description

一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法及其应用

技术领域

本发明涉及环境污染治理技术领域，具体涉及利用镉富集植物青葙子富集土壤中重金属镉，并通过根际接种耐镉细菌强化青葙子的镉富集能力，适用于土壤重金属镉污染的快速、安全修复。

背景技术

随着工业和经济的迅速发展，我国许多地区的土壤都不同程度地受到重金属污染，而且污染面积和污染程度有不断扩大趋势，据我国农业部的调查，我国遭受重金属污染的土地面积占污水灌区总面积的64.8%。污染环境的镉主要来源于金属矿山、有色金属冶炼、电镀、合金制造以及玻璃、陶瓷、油漆和颜料等企业单位所排放的废水、废气和废渣之中。镉是一种生物毒性非常强的重金属，它对水生生物、微生物、农作物都有毒害作用，镉对农业最大的威胁是产生“镉米”、“镉菜”，使人得骨痛病。另外，镉会损伤肾小管，出现糖尿病，还引起血压升高，出现心血管病，甚至致癌、致畸。

目前，对于重金属污染土壤的修复主要有物理修复、化学修复及生物修复3种途径。传统的物理技术主要有离子交换法、吸附法等，这些方法对小面积污染土壤具有较好的效果，但容易造成二次污染，破坏土壤的结构和肥力，而且成本较高；化学修复技术有化学沉淀法、电化学还原法、氧化还原法等，这些技术虽然简单易行、见效快，但并没有从根本上去除土壤中重金属，只是改变了其存在的形态，容易再次活化，而且化学药剂对生态环境具有一定的破坏作用。

生物修复是利用微生物或植物的生命代谢活动，对土壤中的重金属进行富集或提取。生物修复技术主要包括植物修复和微生物修复。植物修复是指用植物吸收土壤中的重金属，最终达到清除土壤中重金属的一类技术总称，植物修复法具有成本低、绿色净化、不破坏土壤生态环境、无需进行二次处理等优点，是未来修复技术的主要发展方向。用来进行修复的植物可以包括高等植物界的一切植物，如野生的草、威以及栽培的树木、草皮和作物等。其中，有一类植物的重金属吸收量明显超过其他普通植物，即超富集植物。青葙子（Celosiaargentea L.）是一种对重金属对镉具有一定富集能力的植物，自然条件下其植物体内的镉含量可以达到50mg/kg以上，其生长迅速、种子易于萌发并具有一定的观赏性，是一种良好的土壤重金属修复植物资源。

然而，植物修复也具有一定的缺陷，例如：重金属富集植物通常生物量低，生长比较慢；对金属有选择性，不适合多种重金属复合污染的治理；植物对重金属的吸收能力往往受到土壤环境和气候条件的限制；此外污染物可能通过落叶重新回到土壤中。这些都限制了植物修复技术在重金属污染土壤治理方面的应用。为了，研究人员考虑采用多种方式来弥补其不足之处。

近几年，采用重金属抗性微生物来提升植物对重金属的吸收能力逐渐成为国内外研究的热点，微生物强化植物对重金属的吸收，其原理主要基于以下两个方面：一是促进植物营养吸收，增强植物抗逆性，借助增加生物量的手段提高修复能力。如菌根真菌可以溶解转运土壤中的无机矿物元素；根瘤菌进行生物固氮等促进植物营养吸收；根部多种微生物的存在所形成的稳定根部微环境，增强了植物抗逆性等，这些都直接或间接地增加了植物的生物量，提高了植物修复能力。二是增加植物根部重金属浓度，促进重金属的吸收或固定。微生物不仅通过其自身的组成成分如菌根外菌丝、几丁质、色素类物质，EPS等吸附重金属，而且通过其分泌的各种有机酸或特殊物质来活化重金属，增加其在植物根部浓度。通过某些植物体内存在的对特定重金属具有转运作用的蛋白，将富集在植物根都的重金属转运到植物体内；或使土壤中重金属吸附于根际，降低其流动性，从而减少其进入食物链的可能，并且在移除植物体时降低土壤中重金属的浓度，借此达到植物吸收和固定的目的。因此，采用根际接种耐镉微生物的方式，促进青葙子对镉的吸收能力，强化其土壤修复效果是一种可行的方式，具有极大的开发潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法，通过在镉污染土壤中种植富集植物青葙子，并在其根际接种耐镉细菌，通过耐镉细菌对青葙子促生和对镉的活化作用增强青葙子的镉吸收能力，实现土壤镉污染的高效、快速、安全修复。

为实现上述发明目的，本发明公开了一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法，在镉污染土壤中种植镉富集植物，并在镉富集植物根际土壤接种耐镉细菌，利用镉富集植物对镉的吸收作用和耐镉细菌的强化作用联合富集土壤中镉。

所述镉富集植物是青葙子。

将青葙子种植到隔污染土壤中是将4～6叶期的青葙子幼苗种植到镉污染土壤中。

所述青葙子在镉污染土壤中培养的环境温度为15℃～35℃，种植期为45天～2个月，定期浇水，保持镉污染土壤含水量为最大持水量的70%～85%。

为了促进青葙子对土壤中镉的吸收效果，分别在青葙子种植5天后和20d后接种耐镉细菌，所述耐镉细菌克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2，该细菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013248。DE2具有分泌ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）-脱氨酶和IAA（吲哚乙酸）的能力，可耐受浓度为200mg/L的镉污染。

所述接种耐镉细菌的接种方式为在所述植物根际土壤灌根接种，细菌细菌定殖后，青葙子根际土壤中耐镉细菌的菌群密度达到1×10⁸CFU/g以上。

所述接种耐镉细菌的接种方式为在所述植物根际土壤灌根接种，将所述细菌制备成菌液，每千克土壤接种浓度为5×10⁷CFU/mL～1×10⁸CFU/mL的菌液15mL～20mL，接种1～3次，优选为每千克土壤接种浓度1×10⁸CFU/mL的菌液20mL，接种2次。

为了促进青葙子生长和微生物的定殖，本发明中还可以对青葙子施用肥料，所用肥料为绿邦园艺资材有限公司生产的植物通用液，每盆浇施10mL，在土壤平衡时施用。

本发明还公开了上述植物-微生物联合富集土壤中镉的方法在土壤修复中的应用。

所述应用方法为：当镉富集植物生长成熟后，将该植物从污染土壤上移除，连续种植青葙子并重复上述操作，直至土壤中的镉含量达到环境安全标准。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用植物-微生物联合富集污染土壤中的镉，所采用植物为镉富集植物青葙子，具有良好的富集隔的能力，而且用于接种的微生物分离自污染区植物叶片，与植物的作用更为紧密；接种方式采用灌根接种，有利于细菌在植物根际定殖，对植物的生长和根系提取重金属起到良好的促进作用。本发明的土壤修复应用方法其修复效果好、费用低、易于管理与操作、不产生二次污染，重复操作可修复镉污染土壤，具有广泛的应用前景。

保藏信息

本发明提供的耐镉细菌克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013248，保藏日期为2013年6月5日。

具体实施方式

以下将通过耐镉细菌DE2的分离试验和在镉污染土壤中种植青葙子的盆栽试验为例，对本发明进行进一步详细的说明。下述实施例中的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂市场购买得到，以下的“%”如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1：耐镉细菌的筛选、鉴定及生物学特性分析

从深圳市大宝山尾矿区（污染区）采集到一种植物叶子，去离子水冲洗干净后用70%的酒精浸泡20s，再用2.5%的次氯酸钠浸泡10min，用无菌水反复冲洗，以最后一次冲洗的无菌水涂布于固体LB培养基（蛋白陈10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000mL）平板上，若培养后无微生物生长，表明消毒彻底。在无菌操作台上，取适量上述消毒彻底的植物组织至无菌的研钵内，加入1mL0.9%的氯化钠溶液，充分研磨，然后将其以10倍梯度系列稀10～10⁶倍，涂布于固体LB培养基上，培养48h，挑取不同形态的的细菌分离物进行纯化和扩大培养。

对分离到的各内生菌株，采用逐步提高培养基中镉浓度的方式进行驯化培养，发现一株细菌可在浓度为200mg/L镉浓度的培养基中良好生长。对其进行产ACC-脱氨酶和吲哚乙酸能力进行测定，发现其具有良好的生物学性状，产ACC-脱氨酶能力可达到0.0582μmolα-酮酸/mg pro.h，产吲哚乙酸能力可达到153.877mg/L，将其命名为DE2。

结合DE2的生长形态、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，将其鉴定为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.），保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013248。

实施例2青葙子对土壤中镉的富集能力

盆栽试验所用土壤采自深圳市南山区当地蘑菇种植园，去除异物后室内风干、磨碎、混匀，过4mm筛。对青葙子种子在首先在湿润滤纸上萌发，然后转移至育苗基质中培育至4～6叶期，备用。

试验采用直径约15cm的塑料盆，每盆装土约2kg，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置镉含量为10mg/kg、30mg/kg和60mg/kg的污染土壤，分别种植相同数量的4～6叶期植青葙子，同时采用不添加镉的土壤作为对照，每日浇水保持土壤含水量为最大持水量的70%～85%。

青葙子移栽45d后，将植物沿着土壤表面剪下，分成地下和地上两部分，用自来水和去离子水冲洗干净、风干。地下部分用5mmol/L Ca（NO₃）₂溶液浸泡15min以交换去掉表面吸附的重金属离子，再用去离子水冲洗2～3次。将其置于105℃下杀青30min，60℃烘干48h后粉碎装入样品袋。同时收集上述不同镉含量的土壤，自然条件下风干待检。将植物样品及土壤样品送往深圳市帕斯环境检测技术有限公司检测，检测方法为微波酸分解电感耦合等离子发射光谱法（ICP-AES），样品消解方法及质量控制参照《危险废物鉴别标准浸出毒性鉴别》附录S（国家标准GB5085.3-2007）。

所有检验处理均设置3个重复，数据采用SPSS18.0分析差异显著性。

试验结果：

（1）镉污染对青葙子生物量的影响

45d后，将青葙子取出，分为地上及地下两部分，生物量测定结果见表1。

表1不同浓度镉污染青葙子的生物量

在中低浓度的镉污染范围内（10mg/kg、30mg/kg），青葙子地上、地下部分的鲜质量、干质量均未与对照表现出明显的差异，低浓度的镉污染（10mg/kg）反而对青葙子地上部分的生长起到了一定的促进作用。60mg/kg的镉污染虽然对青葙子的生长具有一定的抑制作用，但是差异不显著。据此可以看出，青葙子在生长后期可抵御较强浓度的镉污染，是一种良好的重金属镉耐受植物，具备应用于土壤镉污染修复的潜力。

（2）青葙子的镉富集量测定

将烘干后的样品粉碎后装入样品袋，同时取不同镉含量的土壤，自然条件下风干。待检。用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-AES）检测植株体内及土壤中镉含量，结果见表2。

表2青葙子的镉富集情况

处理

地下部镉

地上部镉

地下部镉总

地上部镉总

转移系数

地上部

mg/kg	含量mg/kg	含量mg/kg	量μg	量μg	A/R	AC
							0	2.74	4.06	0.68	6.98	1.49	2.87
10	24.17	25.47	5.81	48.81	1.07	1.32
							30	34.20	34.13	8.37	58.14	1.04	0.66
60	54.00	44.38	11.23	74.81	0.92	0.45

注：A/R为地上部镉含量与其地下部镉含量的比值；AC为富集系数，下同。

从表2可以看出，青葙子的镉含量随着土壤中镉浓度的升高而增加；转移系数和富集系数变化趋势较为相似，低、中浓度镉污染好于高浓度镉污染。高浓度镉污染条件下，其地上部分镉含量达到了44.38mg/kg，具备一定的富集能力；除60mg/kg镉浓度外，其余处理青葙子的镉转移系数均大于1，具备了一定的转运能力。此外，青葙子具有种子易于萌发、生长周期短、观赏性较好等优势，可以考虑通过添加如EDTA等化学药剂或是微生物菌剂等方式，提高青葙子的镉富集能力，使其在环境治理方面发挥更大的作用。

实施例3青葙子-耐镉细菌联合富集土壤中镉

首先将实施例1中用于接种的克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2活化，菌株活化采用固体LB培养基，30℃培养24h，挑取菌落接入豆芽汁培养基，30℃、150r/min振荡培养48h制备发酵液，用空白豆芽汁培养基将菌液稀释至浓度为1×10⁸CFU/mL，备用。

试验采用直径约15cm的塑料盆，每盆装土约2kg，重金属镉以溶液形式加入盆中混合均匀，配置成100mg/kg的镉污染土壤。调节盆中土壤含水量为最大持水量的70%～85%左右，自然平衡1周后向盆中移栽长势基本一致的4-6叶期的青葙子幼苗，每盆2颗。缓苗5d后用无菌注射器向青葙子根际土壤注入30mL菌液，同时设置一个对照接入等体积的空白培养基。20d后以同样的方法重复接种1次，细菌在青葙子根际定殖并稳定后，其菌群密度可达到1×10⁸CFU/g以上。

温室常规管理，观察记录植株生长情况，45d后收获青葙子并进行生物量的测定。样品的处理及检测方法与实施例2相同。

试验结果：

（1）株高测定结果

45d后对青葙子进行株高测定，在100mg/kg的镉污染土壤中，对照株高仅为25.7cm，接菌种处理的青葙子株高为35.4cm，比对照高出37.74%。可见接种耐镉细菌DE2能够有效缓解镉对青葙子的毒害作用，促进了植株的生长。

（2）生物量测定结果

收获时，将青葙子分为地上部分和地下部分，分别测量两部分的鲜质量和干质量，结果见表3。

表3青葙子生物量/g

在100mg/kg浓度的镉污染条件下，接种DE2对青葙子的生长发育能够起到一定的促进作用，其中地下和地上部分的鲜质量分别比对照高出47.83%和23.10%；地下和地上部分的干质量分别比对照高出53.85%和25.46%。说明接种克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2能有效降低镉对青葙子的毒害作用，同时促进了青葙子的生长发育，生物量明显增加。

（3）接种耐镉细菌对青葙子镉富集能力的影响

表4各处理青葙子的镉富集情况

表4可见，接种耐镉细菌对青葙子的镉富集能力具有一定的提升。接种细菌的青葙子地下、地上部分的镉含量分别比对照高出39.60%和68.44%；地下、地上部分的镉富集总量分别比对照提升114.84%和111.35%，地上部富集系数（AC）比对照提高68.85%，效果显著。接菌后青葙子的镉富集能力达到了超富集植物的标准（地上部分镉含量≥100mg/kg），转移系数（A/R）提高了约21.36%，同样达到了超富集植物的标准（A/R≥1）。由此可见，接种克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）DE2，不仅能有效提高青葙子对镉的富集能力，同时能够促进镉从根部向地上部分转移。

上述实验结果表明，本发明所采用的植物-微生物联合富集土壤中镉具有良好的效果，利用青葙子对镉的富集能力可提取土壤中的镉，辅以耐镉细菌的强化作用可有效提升青葙子的镉吸收量，使之达到镉超富集植物的标准并应用于土壤修复中。本发明中所采用的克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2镉耐受能力强，并具有良好的生物学性状，能够分泌ACC-脱氨酶和吲哚乙酸，具有良好的促生和提高植物抗逆性的潜能；所述细菌分离自污染区植物叶片，与植物的联系更为紧密；采用灌根的接种方式可增加细菌在青葙子根际的密度，并提高耐镉细菌在土壤中的定殖能力，是一种行之有效的接种方式。同时青葙子具有种子易于萌发、生长迅速、观赏性较好等特点，重复本发明的过程，青葙子-微生物联合作用不断吸收土壤中的镉，不仅能够修复镉污染土壤，又能美化环境，是一种绿色、安全的镉污染土壤治理方法。

综上所述，尽管本发明的具体实施方式对本发明进行了详细描述，但本领域一般技术人员应该明白的是，上述实施例仅仅是对本发明的优选实施例的描述，而非对本发明保护范围的限制，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种植物-微生物联合富集土壤中重金属镉的方法，其特征在于：在镉污染土壤中种植镉富集植物，并在镉富集植物根际土壤接种耐镉细菌，利用镉富集植物对镉的吸收作用和耐镉细菌的强化作用联合富集土壤中镉。

2.根据权利要求1所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：所述镉富集植物是青葙子。

3.根据权利要求2所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：将青葙子种植到隔污染土壤中是将4～6叶期的青葙子幼苗种植到镉污染土壤中。

4.根据权利要求3所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：所述青葙子在镉污染土壤中培养的环境温度为15℃～35℃，定期浇水，保持镉污染土壤含水量为最大持水量的70%～85%。

5.根据权利要求1所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：接种于镉富集植物根际土壤的的耐镉细菌为克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）DE2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2013248。

6.根据权利要求5所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：所述接种耐镉细菌的接种方式为在所述植物根际土壤灌根接种，细菌定殖后，青葙子根际土壤中耐镉细菌的菌群密度达到1×10⁸CFU/g以上。

7.根据权利要求5所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：所述接种耐镉细菌的接种方式为在所述植物根际土壤灌根接种，将所述细菌制备成菌液，每千克土壤接种浓度为5×10⁷CFU/mL～1×10⁸CFU/mL的菌液15mL～20mL，接种1～3次。

8.根据权利要求1所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法，其特征在于：在镉富集植物种植5天后和20天后接种耐镉细菌。

9.权利要求1所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法在土壤修复中的应用。

10.根据权利要求9所述的植物-微生物联合富集土壤中镉的方法在土壤修复中的应用，其特征在于：当镉富集植物生长成熟后，将该植物从污染土壤上移除，连续种植青葙子并重复上述操作，直至土壤中的镉含量达到环境安全标准。