CN104001712A - 碱茅与微生物组联合修复石油污染土壤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，步骤如下：将石油降解菌剂与土壤以重量比按1:5比例混合均匀，撒入碱茅种子，浇水待植物发芽，按照植物正常生长要求管理；所述用于种植碱茅的土壤为总石油烃质量分数为10000+5000mg/kg的污染土壤。本方法是在石油污染的盐碱土壤中加入菌剂并混匀，然后播种碱茅种子，定期浇水，使得植物与微生物协同降解土壤中石油污染物质。碱茅除具有促进石油烃降解的作用外，还具有绿化的作用，加入微生物菌剂使得降解率和降解速度都得到提高，且微生物降解后得到的有机质可以作为植物肥料，植物与微生物互利共生，降解时间持续较长，使得石油烃类污染物质具有较好的去除效果。

Description

碱茅与微生物组联合修复石油污染土壤的方法

技术领域

本发明属于环境污染修复技术领域，涉及一种碱茅与微生物组联合修复石油污染土壤的方法。 

背景技术

石油是现代社会主要的能源之一，素有“工业血液”之称。现在产油的国家和地区已有150多个，发现的油气田4万多个。其中我国找到的有400多个，年产石油近2亿吨，是世界十大产油国之一。然而，石油在开采、冶炼和运输过程中会因为突发事故、泄露或操作不当，造成周围土壤大量污染。石油进入到土壤以后，会吸附在土壤颗粒表面，堵塞土壤空隙，降低土壤透水性，改变土壤有机质组成、结构和理化性质，从而阻碍植物生长；并且可能会透过土壤缝隙而污染到地下水，威胁人类健康。 

鉴于石油污染对土壤造成的严重影响，世界各国很早就制定了土壤修复计划，进行各种修复方法研究。主要包括：物理法、化学法和生物法修复。传统的物理化学方法由于费用高，易产生二次污染，不适合大规模应用。生物修复包括植物修复和微生物修复，相对于物理化学修复，生物修复操作简单，费用低，不易造成二次污染，且能够改善土壤质量，因此得到人们的广泛重视。 

我国许多油田都处于滨海盐碱地带及生态环境恶劣地区，这对生物修复效果产生很大负面影响。选取耐盐碱植物-微生物联合修复方法，可以有效改善修复过程中盐碱的负面影响。微生物可以将有机大分子物质分解为小分子供植物吸收，植物根际分泌物可以刺激微生物生长繁殖，植物腐败后的腐殖质可以改良土壤，增加土壤养分含量。因此，开发耐盐碱植物-微生物联合修复技术对我国盐碱区石油污染土壤修复具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，微生物降解后得到的有机质可以作为植物肥料，植物根系分泌物或酶类物质可为微生物提供培养基质，植物与微生物互利共生，降解时间持续较长，使得石油烃类污染物质具有较好的去除效果。 

本发明实现目的的技术方案是： 

一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，步骤如下： 

将石油降解菌剂与土壤以重量比按1:5比例混合均匀，撒入碱茅种子，浇水 待植物发芽，按照植物正常生长要求管理；所述用于种植碱茅的土壤为总石油烃质量分数为10000+5000mg/kg的污染土壤。 

所述石油降解菌剂的制备方法为：将两菌种分别活化培养，将活化后的菌种按照1～5%的比例接种到发酵罐中扩大培养，把麦麸在灭菌箱中高压蒸汽灭菌，冷却后，将所得发酵液与麦麸按1～1.5g/mL混合均匀，风干，制成降解菌剂。 

所使用的菌种为：使用的菌种之一保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8646，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri；另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，混合比例为1：1，保藏日期2013年12月27日。 

而且，所述土壤水分保持在60～70%。 

而且，所述活化培养基组成：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH为7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。 

而且，所述发酵培养基组成：水解糖2.5%，玉米浆2.5%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.04%，尿素0.4%，pH为6.8～7.0。 

而且，所述碱茅种子的播种量为1.5～2.0kg/亩，上部覆土1.0～2.0cm。 

本发明的有益效果和优点是： 

1、本方法是在石油污染的盐碱土壤中加入菌剂并混匀，然后播种碱茅种子，定期浇水，使得植物与微生物协同降解土壤中石油污染物质。碱茅是一种耐盐碱植物，加入微生物菌剂使得降解率和降解速度都得到提高，且微生物降解后得到的有机质可以作为植物肥料，植物根系分泌物或酶类物质可为微生物提供培养基质，植物与微生物互利共生，降解时间持续较长，使得石油烃类污染物质具有较好的去除效果。 

2、本发明选取碱茅作为修复植物，其特点为喜湿润，抗寒力强，耐-30℃低温，并能顺利越冬；耐旱，干旱时叶片卷成筒状，减少了水分蒸发，对土壤要求不严；喜光不耐荫，特别抗盐碱，在盐分1.85%～4.24%，pH为8.6～8.8条件下仍能生存，使用的碱茅除具有促进石油烃降解的作用外，还具有绿化的作用。 

3、本申请通过试验证实在石油烃质量分数为10000mg/kg的土壤中，碱茅生物量基本没有受到抑制，利用发达的根系及根系微生物联合作用可以有效地降解污染土壤中总石油烃，通过连续种植该植物，可以实现连续降解石油污染土壤的总石油烃，直到达到环境安全标准，具有工程量小，无二次污染且同时可以美化环境。 

附图说明

图1为不同石油烃浓度对碱茅株高影响效果图； 

图2为不同处理组对石油烃的降解效果图； 

图3为不同处理组土壤的DGGE条带图。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，具体步骤如下： 

将石油降解菌剂与石油污染土壤按一定比例混合均匀，然后在其上种植碱茅，碱茅生长过程中，与石油降解菌联合作用，降解土壤中总石油烃，通过对碱茅的修剪亦可以去除部分石油烃，从而达到修复石油污染土壤的目的。 

具体操作如下：将菌剂与土壤以重量比按1:5比例混合均匀（菌剂浓度约为106～109CFU/g），撒入碱茅种子，播种量为1.5～2.0kg/亩，上部覆土1.0～2.0cm，浇水使土壤水分保持在65%左右，待植物发芽，按照植物正常生长要求管理。 

石油降解菌剂的制备方法为：将两菌种分别保存在斜面培养基中的菌种转接到100mL牛肉膏蛋白胨培养基中活化培养，将活化后的菌种按照1%的比例接种到发酵罐中扩大培养，把麦麸在灭菌箱中高压蒸汽灭菌，冷却后，将所得发酵液与麦麸按V（mL）：W（g）为1:1混匀，自然风干，装袋封口，制成生物固体菌剂。 

活化培养基组成：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH为7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。 

发酵培养基组成：水解糖2.5%，玉米浆2.5%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.04%，尿素0.4%，pH为6.8～7.0。 

所述用于种植碱茅的土壤为总石油烃质量分数为10000+5000mg/kg的污染土壤。 

所述的利用草坪草碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，所使用的菌种为：本发明使用的菌种之一保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8646，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri，另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum。混合比例为1：1。 

实施例1 

实验地点设在天津科技大学河口、海岸带环境与生态学研究室内，盆栽试验土壤为石油污染土壤与清洁土壤配置后的土壤，即在中海油环保技术服务分公司 储油池附近采集的石油污染土壤（0～20cm）与天津科技大学泰达校区花池内采集的自然无污染土壤（0～20cm）。 

植物对石油烃耐受性试验：共设五种土壤对照，分别为CK（清洁土壤）、石油烃污染土壤土壤A（5000mg/kg）、土壤B（10000mg/kg）、土壤C（20000mg/kg）土壤D（30000mg/kg）。 

通过重量配比成总石油烃质量分数为5000mg/kg、10000mg/kg、20000mg/kg和30000mg/kg的污染土壤。每个培养皿中添加200g土壤样品，碱茅种子经过水培膨胀出芽后点播于培养皿中（每个培养皿中种植20粒），覆土1.0～2.0cm后喷洒自来水使土壤充分湿润，定期浇水，使土壤水分保持在65%左右，定期观察植物发芽情况，30天后测量植物株高。 

降解试验：选取石油烃质量分数为10000mg/kg的土壤为受试土壤。每种石油烃污染土壤分别进行三种处理试验，为只添加细菌、只种植碱茅和碱茅-细菌联合处理并设置空白对照。每个处理重复3次。将微生物固体菌剂与受试土壤以1:5的比例混合均匀，每盆（12cm×12cm）装入1.0kg土壤。碱茅种子经过水培膨胀出芽后点播于实验花盆中（每盆中种植40粒），覆土1.0～2.0cm后喷洒自来水使土壤充分湿润，定期浇水，使土壤水分保持在65%左右，120天后测定土壤中总石油烃含量和石油烃各组分变化及用DGGE技术测定土壤微生物群落变化。 

具体试验结果如下： 

（1）不同处理浓度下碱茅对石油烃污染物的耐受性 

参见表1和图1可知，在不同污染处理下，碱茅的发芽情况各不相同。当石油烃污染质量分数小于10000mg/kg时，碱茅对污染物显示出了较强的耐受性，植物发芽率对照清洁土壤没有明显差异，且石油烃污染物质对植物的株高抑制作用也不明显，生长25天后石油污染对植物株高抑制率分别为6.87%和10.69%。当石油烃污染质量分数大于10000mg/kg时，石油烃对植物生长的抑制作用逐渐明显，相对空白组它们发芽的抑制率分别为23.5%和28.84%；植物株高抑制率分别为36.64%和47.33%。 

表1不同处理浓度下碱茅对石油烃污染物的耐受性 

	空白	5000mg/kg	10000mg/kg	20000mg/kg	30000mg/kg
						发芽率（%）	85.3	75.7	80.3	65.3	60.7
植株高度（cm）	13.1	12.2	11.7	8.3	6.9

（2）不同处理组对总石油烃的降解率 

从图2中可以看出，自然条件下，污染土壤中石油烃污染物质有一定降解，但是各处理实验组中石油烃降解率均显著高于空白对照组，添加细菌、种植碱茅 和碱茅-细菌联合组降解率分别达到自然条件下的1.76倍、1.38倍和2.28倍，降解效果顺序为碱茅-细菌联合组>细菌>碱茅。无论是在自然条件下还是试验处理情况下，烷烃降解率明显高于芳香烃和沥青质及极性物质的降解率，可知挥发、淋滤和光解亦会降解部分石油烃，经过种植植物或添加细菌均可以促进石油烃组分降解。相比之下，沥青质及极性物质降解率很小，说明这些非烃化合物组分较难降解。 

（3）试验土壤中细菌群落分布 

图3中，1为空白对照组，2为碱茅-细菌联合组，3为细菌组，4为碱茅组。从图中可以看出，处理组土壤中DGGE条带较未处理样品比较丰富，亮度鲜明，S1、S2为所有试验组共同存在的一般条带，S3、S4、S5只有在个别样品中出现条带，说明种植碱茅或添加细菌可以增加土壤中细菌数量，且丰富度增加，均匀度降低，优势种群出现。 

Claims (5)

1.一种碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，其特征在于：步骤如下：

将石油降解菌剂与土壤以重量比按1:5比例混合均匀，撒入碱茅种子，浇水待植物发芽，按照植物正常生长要求管理；所述用于种植碱茅的土壤为总石油烃质量分数为10000+5000mg/kg的污染土壤；

所述石油降解菌剂的制备方法为：将两菌种分别活化培养，将活化后的菌种按照1～5%的比例接种到发酵罐中扩大培养，把麦麸在灭菌箱中高压蒸汽灭菌，冷却后，将所得发酵液与麦麸按1～1.5g/mL混合均匀，风干，制成降解菌剂；

所使用的菌种为：使用的菌种之一保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8646，施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri；另外一种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum，混合比例为1：1。

2.根据权利要求1所述的碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，其特征在于：所述土壤水分保持在60～70%。

3.根据权利要求1所述的碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，其特征在于：所述活化培养基组成：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH为7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，其特征在于：所述发酵培养基组成：水解糖2.5%，玉米浆2.5%，磷酸氢二钾0.15%，硫酸镁0.04%，尿素0.4%，pH为6.8～7.0。

5.根据权利要求1所述的碱茅与微生物联合修复石油污染土壤的方法，其特征在于：所述碱茅种子的播种量为1.5～2.0kg/亩，上部覆土1.0～2.0cm。