CN1347391A - 用利用烷烃的细菌对石油污染物的生物除污 - Google Patents

用利用烷烃的细菌对石油污染物的生物除污 Download PDF

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Abstract

利用烷烃的细菌被用来降解包含石油化合物的污染物。可应用就地方法或外部方法从液体、气体和固体源减少或消除石油污染物。在一个优选的实施方案中,用利用烷烃的细菌在氧的存在下接触石油污染物以通过共代谢或直接代谢降解石油污染物而减少各种环境中的石油浓度。合适的利用烷烃的细菌包括:假单胞菌属、贪噬菌属、诺卡氏菌属、金黄杆菌属、丛毛单胞菌属、食酸菌属、红球菌属、金杆菌属、微球菌属、气单胞菌属、寡养单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、希瓦氏菌属、叶杆菌属、棍状杆菌属、产碱菌属、戈登氏菌属、棒杆菌属和噬纤维菌属。

Description

用利用烷烃的细菌对石油污染物的生物除污
                    本发明的领域
本发明涉及污染物的降解，更具体地说，涉及应用利用烷烃的微生物对基于石油的污染物的生物除污。
                      背景知识
汽油和石油污染的土壤和地下水是应用常规技术[例如土壤蒸汽提取(SVE)]用空气喷射(AS)增强来除污的。如果进行相当大部分的除污努力保持适当的条件，汽油和石油(例如液压油、马达油和燃料油)在地下环境中是高度可降解的。例如，如果在释放区存在足够浓度的氧气，可加速汽油和石油化合物的需氧降解。
常规技术(例如SVE)通过在土壤(它恒定地用新鲜空气补充)中产生真空而提供所需的氧供应，或者应用压缩机通过空气喷射将空气脉冲输送到地下。一些除污专家甚至使用化学品(例如过氧化氢和缓释氧化合物)来氧化溢出的汽油和燃料油而加速清洁。如果存在适当的氧供应，很好地适应场所条件的本土细菌能长时间代谢污染物。
很多石油溢出物(例如汽油和燃料油)扩散到土壤中而产生吸附相的污染。这股流体继续向下迁移直至它到达地下水而漂浮在水面上。然后纯石油产品在地下水中作为分离相聚集，而石油混合物的其它可溶性化合物则产生溶解相污染。长时间后，本土石油降解微生物代谢碳源。石油混合物的挥发性组分通常首先被降解。更高链石油组分(长链脂肪烃和多环芳烃)更长时期地保留在地下，常见以废油或汽油溢出物的风蚀组分的形式。
业已关于很多细菌族和很多种细菌阐述了需氧细菌对苯环的降解。然而，除污专家还没有将石油衍生的化合物注入基于石油的释放场所，因为已经存在细菌代谢的碳源，所以按常规不认为第二批基于石油的化合物可加速场所清洁和恢复原状。
尽管作出了通常的除污努力，但仍需要有效降解石油污染物的方法。鉴于上述情况并且为了弥补现有技术的其它不足而开发了本发明。
                   本发明概述
按本发明，应用利用烷烃的生物来降解石油污染物。可通过共代谢或通过直接代谢而进行降解。本发明的利用烷烃的生物可被用来对含于空气、土壤和地下水废物流中的石油污染物进行就地(in situ)或外部(ex-situ)生物除污。此外，还可应用耐盐和耐酸的利用烷烃的细菌来再生被石油污染影响的盐水和低pH地下水体系。优选通过加氧酶催化的反应来增强石油化合物的代谢。
本发明一方面提供了一种降解石油污染物的改良方法。
本发明另一方面提供了一种用利用烷烃的细菌通过共代谢过程降解石油污染物的方法。
本发明另一方面提供了一种用能直接代谢石油污染物的利用烷烃的细菌降解石油污染物的方法。
本发明另一方面提供了一种降解石油污染物的方法，该方法通过用利用烷烃的细菌在至少一种烷烃和氧的存在下处理所述污染物达足够长的时间而使利用烷烃的细菌降解石油污染物。
本发明另一方面提供了一种净化水的方法。该方法包括如下步骤：提供包含石油污染物的污染水，用利用烷烃的细菌在至少一种烷烃和氧的存在下处理石油污染物达足以使利用烷烃的细菌降解石油污染物的处理时间，从而产生含有比受污染的水更低浓度石油污染物的净化水。
本发明另一方面提供了一种处理被石油污染物污染的场所的方法。该方法包括如下步骤：对受污染的场所提供烷烃基质，再对受污染的场所提供含氧的气体。
从下列描述将更明白本发明的这些和其它方面。
              对优选实施方案的详细描述
本发明涉及降解石油污染物的方法。本文应用的术语“石油污染物”包括含于原油或精制石油中的化合物。这样的石油衍生化合物通常包含脂肪烃(例如，C5～C36)和芳烃(例如，C9～C22)的组合。具体的石油污染物包括原油，精制油，燃料油(例如，2号、4号和6号燃料油)，柴油，汽油，液压油和煤油。苯、甲苯、乙苯和二甲苯(BTEX)是汽油中的最挥发性组分并且可能存在于石油污染物中。三甲苯和例如下列的其它PAHs也是燃料油和重质石油化合物的常见组分：萘、蒽、二氢苊、苊、苯并(a)蒽、苯并(a)芘、苯并(b)荧蒽、苯并(g，h，i)苝、苯并(k)荧蒽和芘。可用总的石油烃(TPH)来量化含于污染场所(例如土壤和地下水中)的石油污染物的量。此外，也可用各类脂族化合物和芳族化合物来量化石油污染物。
这样的石油污染物还可能伴有其它污染物，例如氯化脂族化合物、氯化芳族化合物和非氯化芳族化合物。具体的烃污染物包括：二氯甲烷、1，1-二氯乙烷、氯仿、1，2-二氯丙烷、二溴氯甲烷、1，1，2-三氯乙烷、2-氯乙基乙烯基醚、四氯乙烯(PCE)、氯苯、1，2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、溴二氯甲烷、反-1，3-二氯丙烯、顺-1，3-二氯丙烯、溴仿、氯代甲烷、溴代甲烷、乙烯基氯、氯乙烷、1，1-二氯乙烯、反-1，2-二氯乙烯、三氯乙烯(TCE)、二氯苯、顺-1，2-二氯乙烯、二溴甲烷、1，4-二氯丁烷、1，2，3-三氯丙烷、溴氯甲烷、2，2-二氯丙烷、1，2-二溴乙烷、1，3-二氯丙烷、溴苯、氯甲苯、三氯苯、反-1，4-二氯-2-丁烯和丁基苯。
按本发明，将烷烃用来刺激有效地降解石油污染物的、利用烷烃的细菌的生长。合适的烷烃包括：甲烷、乙烷、丙烷、丁烷及其混合物。例如，天然气可被用作烷烃来源。丁烷是用于本发明的特别优选的烷烃。丁烷可呈丁烷基质的形式提供。丁烷基质包括液体和/或气体，其中，存在刺激利用丁烷的细菌大量生长的足量丁烷。丁烷优选是丁烷基质的最占优势的化合物(基于重量百分数)。丁烷通常占丁烷基质的至少约10wt％。丁烷基质的其它成分可包括任何合适的化合物，包括惰性气体和/或其它烷烃(例如甲烷、乙烷和丙烷)。优选地，丁烷基质包含至少约50wt％的丁烷，更优选至少约90wt％的丁烷。在一个具体实施方案中，丁烷基质包含至少约99wt％的正丁烷。虽然本文主要描述了丁烷基质的使用，但是应懂得，本发明还可应用其它烷烃和利用烷烃的细菌。
可以任何合适的形式供给氧，包括空气、纯氧以及氧与惰性气体(例如氦、氩、氮、一氧化碳等)的掺合物。
可以就地或外部进行本发明的生物除污方法而从各种环境(包括水性体系)除去污染物。适合处理的水性体系包括：饮用水、地下水、工业废水等。
按本发明的一个实施方案，利用丁烷的细菌在降解石油污染物方面有效。利用丁烷的细菌可用于通过共代谢和/或直接代谢的方法需氧降解石油。
丁烷是四个碳的分子和长链脂肪烃的成分。用丁烷气体刺激导致大的处理区。例如，如果将丁烷气体以高浓度注入石油释放区，生物刺激作用迅速增大目标区内每克土壤或每毫升地下水中的石油降解微生物数。本方法对风蚀最严重的石油释放场所(此处，最挥发性的组分早已被降解了，因而有效石油释放区尺寸已缩小了)特别有效。如果在处理区内停止或中断了丁烷注射而继续供应氧，那么高密度的丁烷利用者将被迫代谢土壤中残余的石油组分，因为丁烷食物源已被拆去了。这通过增强天然减弱作用而加速石油清洁，而且是对汽油和燃料油溢出物的有效处理。
本发明利用丁烷的细菌优选产生加氧酶而且能代谢丁烷。有效的酶包括胞外酶、胞内酶和联胞酶。利用丁烷的细菌通常产生丁烷一氧化物酶和/或丁烷双加氧酶，而在一些实施方案中还可能产生脱卤素酶(dehologenase enzymes)，它直接代谢石油化合物。
本发明利用丁烷的细菌可包括革兰氏阴性的和革兰氏阳性的需氧杆菌和球菌，兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，非光合的、非产孢的(non-fruiting)滑行细菌和不规则的无芽孢革兰氏阳性杆菌。
就包括革兰氏阴性需氧杆菌和球菌的假单胞菌科(Pseudomonadaceae)来说，下列属的种可能是合适的：假单胞菌属(Pseudomonas)；贪噬菌属(Variovorax)；金黄杆菌属((Chryseobacterium)；丛毛单胞菌属(Comamonas)；食酸菌属(Accidovorax)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)；黄单胞菌属(Xanthomonas)；弗拉特氏菌属(Frateuria)；动胶菌属(Zoogloea)；产碱菌属(Alcaligenes)；黄杆菌属(Flavobacterium)；德克斯氏菌属(Derxia)；俊片菌属(Lampropedia)；布鲁氏菌属(Bucella)；黄色杆菌属(Xanthobacter)；栖热菌属(Thermus)；热微菌属(Thermomicrobium)；盐单胞菌属(Halomonas)；交替单胞菌属(Alteromonas)；蛇形菌属((Serpens)；紫色杆菌属(Janthinobacterium)；博德特氏菌属(Bordetella)；副球菌属((Paracoccus)；拜叶林氏克菌属(Beijerinckia)；以及弗朗西丝氏菌属(Francisella)。
就包括革兰氏阳性真细菌类(Eubacteria)和放线菌(Actinomycetes)的放线菌诺卡氏菌(Nocardioform Actinomycetes)科来说，下列属可能是合适的：诺卡氏菌属(Nocardia)；红球菌属(Rhodococcus)；戈登氏菌属(Gordona)；类诺卡氏菌属(Nocardioides)；糖多孢菌属(Saccharopolyspora)；小多孢菌属(Micropolyspora)；原小单胞菌属(Promicromonospora)；间孢囊菌属(Intrasporangium)；假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)；以及厄氏菌属(Oerskovia)。
就包括革兰氏阳性球菌的菌球科(Micrococcaceae)来说，下列属可能是合适的：微球菌属(Mcrococcus)；口腔球菌属(Stomatococcus)；动性球菌属(Planococcus)；葡萄球菌属(Staphylococcus)；气球菌属(Aerococcus)；消化球菌属(Peptococcus)；消化链球菌属(Peptostreptococcus)；粪球菌属(Coprococcus)；孪生球菌属(Gemella)；片球菌属(Pediococcus)；明串珠菌属(Leuconostoc)；瘤胃球菌属((Ruminococcus)；八叠球菌属(Sarcina)；以及链球菌属(Streptococcus)。
就包括兼性厌氧革兰氏阴性杆菌的弧菌科(Vibrionaceae)来说，下列属可能是合适的：气单胞菌属(Aeromonas)；发光杆菌属(Photobacterium)；弧菌属(Vibrio)；邻单胞菌属(Plesiomonas)；发酵单胞菌属(Zymomonas)；色杆菌属(Chromobacterium)；肉杆菌属(Cardiobacterium)；鞘杆菌属(Calymmatobacterium)；链杆菌属(Streptobacillus)；艾肯氏菌属(Eikenella)；以及加德纳氏菌属(Gardnerella)。
就包括革兰氏阴性需氧杆菌和球菌的根瘤菌科(Rhizobiaceae)来说，下列属可能是合适的：叶杆菌属(Phyllobacterium)；根瘤菌属(Rhizobium)；慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)；以及土壤杆菌属(Agrobacterium)。
就包括非光合的、滑行细菌、非产孢的噬纤维菌科(Cytophagaceae)来说，下列属可能是合适的：噬纤维菌属(Cytophaga)；屈挠杆菌属(Flexibacter)；腐败螺旋菌属(Saprospira)；柔发菌属(Flexithrix)；滑柱菌属(Herpetosiphon)；二氧化碳噬纤维菌属(Capnocytophaga)；以及生孢噬纤维菌属(Sporocytophaga)。
就包括不规则无芽孢的革兰氏阳性杆菌的棒状杆菌(Corynebacterium)科来说，下列属可能是合适的：金杆菌属(Aureobac terium)；壤霉菌属(Agromyces)；蛛菌属(Arachnia)；罗氏菌属(Rothia)；醋酸杆菌属(Acetobacterium)；放线菌属(Actinomyces)；节杆菌属(Arthrobactera)；隐秘杆菌属(Arcanobacterium)；毛螺菌属(Lachnospira)；丙酸杆菌属(Propionibacterium)；真杆菌属(Eubacterium)；丁酸弧菌属(Butyrivibria)；短杆菌属(Brevibacterium)；双歧杆菌属(Bifidobacterium)；微杆菌属(Microbacterium)；乳酪杆菌属(Caseobacter)；以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)。
应用了下列分离技术来获得各种利用甲烷、利用丙烷和利用丁烷的细菌的纯培养物和混合培养物。应用了富集操作为给定的生长基质增加细菌种群。每周转移从经受富集的各种场所收集的土壤样品达一年。下文描述了用于富集的方法和原料。
用不锈钢手用螺旋钻在一到二英尺的深度收集土壤样品。将土壤样品储存在专用玻璃容器内，用无菌去离子水/蒸馏水浸湿而运送到实验室。变更取样场地时用三份Alconox皂/蒸馏水漂洗液清洗手用螺旋钻。用作接种体的土壤样品是从表1中归纳的场所采集的。表1
   样品号/基质     样品场所
    1/土壤 填筑池
    2/土壤 #2燃料油渗入的土壤
    3/土壤 填筑池
    4/土壤 汽油和废油渗入的土壤
    5/土壤 浅淡水塘
    6/土壤 盐土沼泽
    7/土壤 工业污水流出口
    8/土壤 #2燃料油渗入的土壤
用液体培养基每周转移培养物达一年而增大利用甲烷、利用丙烷和利用丁烷的细菌的相对数量。所述液体培养基是从下列化学品制备的无机盐培养基(MSM)：
MgSO4-7H2O            1.0g；
CaCl2                  0.2g；
NH4Cl                  0.5g；
FeCl3-6H2O            4.0mg；
痕量元素溶液            0.5ml；以及
蒸馏水                  900ml。
痕量元素溶液(它为细菌生长提供微量营养物)是从下列组分制备的：
ZnCl2                 5.0mg；
MnCl2-4H2O           3.0mg；
H3BO4                30.0mg；
NiCl2-6H2O           2.0mg；
(NH4)6Mo7O24-4H2O 2.25mg；以及
蒸馏水               1000ml
在高压灭菌(121℃，20min)之前，用20.0ml包含3.6gNa2HPO4和1.4g KH2PO4于100ml蒸馏水中的磷酸盐缓冲液将MSM的pH调节到6.8。对MSM和缓冲液高压灭菌后，当培养基温度达到60℃时，往MSM中添加另一份2.0ml缓冲液。添加溶于100ml蒸馏水的4.0mg酪蛋白氨基酸和4.0mg酵母(Difco)而完成MSM混合物的混合。在添加到MSM之前，通过0.2微米滤器(Gelman)的真空过滤将所述营养液过滤灭菌。
在第一次富集转移之前，对来自表1中归纳的八个取样地点的接种体进行一系列预处理。前两次预处理是对用作接种体的原始土壤原料进行的。对于每周转移过程中作为MSM的替换液进行后两次处理。预处理包括下列步骤：(1)30％乙醇饱和液淋洗，接着用无菌磷酸盐缓冲液淋洗(乙醇)；(2)60℃水浴15分钟(加热)；(3)未处理(不处理)；(4)含10％氯化钠水溶液(10％NaCl)的MSM；以及(5)pH为2.0(pH2)的MSM。应用第(4)和(5)个处理试图确定能利用烃作为生长基质的极限嗜盐菌和嗜酸菌。
对每个样品系列的第一次富集转移是在含20ml MSM和1.0g接种体的72ml血清瓶(Wheaton)中进行的。随后用无菌塑料注射器(B&D)进行培养物转移(5.0ml)。用红橡皮塞盖住瓶子并用铝卷边密封(Wheaton)。将每个样品都进行无菌操作，并将全部玻璃器皿、原料和供料都通过高压灭菌消毒。表2归纳了富集转移方案和每个血清瓶的液面上空间内被置换的甲烷或丙烷的浓度，应用专用气密注射器(Hamilton)进行所述置换，用Fisher Scientific惰性取样阀(开/关操纵杆)来控制每次转移之间从针尖损耗的气体。表2
    样品号     预处理     食物源   样品标记
    1     乙醇     甲烷     1EM
    1     热     甲烷     1HM
    1     未处理     甲烷     1NM
    1     10％  NaCl     甲烷     1SM
    1     pH2.0     甲烷     1AM
    1     乙醇     丙烷     1EP
    1     热     丙烷     1HP
    1     未处理     丙烷     1NP
    1     10％  NaCl     丙烷     1SP
    1     pH2.0     丙烷     1AP
可从下列反应式推导甲烷、丙烷和丁烷的矿化所需氧的量。
          2∶1
       5∶1
     6.5∶1
表2归纳了关于1号样品制备的整组富集转移物。第一个样品系列不包括丁烷处理。其余七个样品是按相同方式制备的，此外，还包含丁烷处理系列，如表3～9中所示。每个样品系列都保持一个对比样(只含无菌MSM的血清瓶)。
本文描述的全部烃气体都是研究级的(Scott Specialty Gases)。以27％(vol/vol)的浓度添加甲烷，以10％的浓度添加丙烷和以6％的浓度添加丁烷。头六个月富集转移后，浓度降到13％(甲烷)和9％(丙烷)。丁烷的浓度保持相同(在6％)。表3
    样品号     预处理     食物源   样品标记
    2     乙醇     甲烷     2EM
    2     热     甲烷     2HM
    2     未处理     甲烷     2NM
    2     10％  NaCl     甲烷     2SM
    2     pH2.0     甲烷     2AM
    2     乙醇     丙烷     2EP
    2     热     丙烷     2HP
    2     未处理     丙烷     2NP
    2     10％  NaCl     丙烷     2SP
    2     pH2.0     丙烷     2AP
    2     乙醇     丁烷     2EB
    2     热     丁烷     2HB
    2     未处理     丁烷     2NB
    2     10％  NaCl     丁烷     2SB
    2     pH2.0     丁烷     2AB
表4
   样品号     预处理     食物源   样品标记
    3     乙醇     甲烷     3EM
    3     热     甲烷     3HM
    3     未处理     甲烷     3NM
    3     10％  NaCl     甲烷     3SM
    3     pH2.0     甲烷     3AM
    3     乙醇     丙烷     3EP
    3     热     丙烷     3HP
    3     未处理     丙烷     3NP
    3     10％  NaCl     丙烷     3SP
    3     pH2.0     丙烷     3AP
    3     乙醇     丁烷     3EB
    3     热     丁烷     3HB
    3     未处理     丁烷     3NB
    3     10％  NaCl     丁烷     3SB
    3     pH2.0     丁烷     3AB
表5
  样品号     预处理     食物源   样品标记
    4     乙醇     甲烷     4EM
    4     热     甲烷     4HM
    4     未处理     甲烷     4NM
    4     10％  NaCl     甲烷     4SM
    4     pH2.0     甲烷     4AM
    4     乙醇     丙烷     4EP
    4     热     丙烷     4HP
    4     未处理     丙烷     4NP
    4     10％  NaCl     丙烷     4SP
    4     pH2.0     丙烷     4AP
    4     乙醇     丁烷     4EB
    4     热     丁烷     4HB
    4     未处理     丁烷     4NB
    4     10％  NaCl     丁烷     4SB
    4     pH2.0     丁烷     4AB
表6
   样品号     预处理    食物源   样品标记
    5     乙醇     甲烷     5EM
    5     热     甲烷     5HM
    5     未处理     甲烷     5NM
    5     10％  NaCl     甲烷     5SM
    5     pH2.0     甲烷     5AM
    5     乙醇     丙烷     5EP
    5     热     丙烷     5HP
    5     未处理     丙烷     5NP
    5     10％  NaCl     丙烷     5SP
    5     pH2.0     丙烷     5AP
    5     乙醇     丁烷     5EB
    5     热     丁烷     5HB
    5     未处理     丁烷     5NB
    5     10％  NaCl     丁烷     5SB
    5     pH2.0     丁烷     5AB
表7
   样品号     预处理     食物源 样品标记
    6     乙醇     甲烷     6EM
    6     热     甲烷     6HM
    6     未处理     甲烷     6NM
    6     10％  NaCl     甲烷     6SM
    6     pH2.0     甲烷     6AM
    6     乙醇     丙烷     6EP
    6     热     丙烷     6HP
    6     未处理     丙烷     6NP
    6     10％  NaCl     丙烷     6SP
    6     pH2.0     丙烷     6AP
    6     乙醇     丁烷     6EB
    6     热     丁烷     6HB
    6     未处理     丁烷     6NB
    6     10％  NaCl     丁烷     6SB
    6     pH2.0     丁烷     6AB
表8
   样品号     预处理     食物源   样品标记
    7     乙醇     甲烷     7EM
    7     热     甲烷     7HM
    7     未处理     甲烷     7NM
    7     10％  NaCl     甲烷     7SM
    7     pH2.0     甲烷     7AM
    7     乙醇     丙烷     7EP
    7     热     丙烷     7HP
    7     未处理     丙烷     7NP
    7     10％  NaCl     丙烷     7SP
    7     pH2.0     丙烷     7AP
    7     乙醇     丁烷     7EB
    7     热     丁烷     7HB
    7     未处理     丁烷     7NB
    7     10％  NaCl     丁烷     7SB
    7     pH2.0     丁烷     7AB
表9
    样品号     预处理     食物源 样品标记
    8     乙醇     甲烷     8EM
    8     热     甲烷     8HM
    8     未处理     甲烷     8NM
    8     10％  NaCl     甲烷     8SM
    8     pH2.0     甲烷     8AM
    8     乙醇     丙烷     8EP
    8     热     丙烷     8HP
    8     未处理     丙烷     8NP
    8     10％  NaCl     丙烷     8SP
    8     pH2.0     丙烷     8AP
    8     乙醇     丁烷     8EB
    8     热     丁烷     8HB
    8     未处理     丁烷     8NB
    8     10％  NaCl     丁烷     8SB
    8     pH2.0     丁烷     8AB
前两周富集转移后，所有的液体悬浮物(10％ NaCl处理、2.0pH处理和对比样除外)都显示了浊度的显著增大。
进行富集转移25周后，对全部隔离群搜集形态描述和直接细胞数。应用Olympus BH-2相差显微镜搜集隔离群的形态描述。此外，应用Bright Line血细胞计数器(Fisher Scientific)通过直接计数法数细胞密度。表10归纳了所述描述和细胞密度计数结果。保持灭菌的MSM血清瓶作为对比。表10
样品标记     形态学  计数结果(细胞数/ml)
    1EM     球菌      2.5E8
    1HM     球菌/杆菌      1.8E8
    1NM     杆菌      1.3E8
    1SM     球菌      5.8E6
    1AM     球菌      3.8E6
    1EP     杆菌      4.0E6
    1HP     球菌      1.3E7
    1NP     杆菌      9.8E6
    1SP     双球菌      4.0E6
    1AP     杆菌(可变的)      1.5E6
    2EM     球菌/杆菌      1.2E8
    2HM     球菌/杆菌      7.3E7
    2NM     链球菌/杆菌      1.1E8
    2SM     逗号形的      6.6E7
    2AM     逗号形的      8.3E6
    2EP     杆菌      1.2E8
    2HP     杆菌/逗号形的      1.8E8
    2NP     杆菌(可变的)      1.1E8
    2SP     球菌      7.0E6
    2AP     球菌      3.3E6
    2EB     球菌/杆菌      2.1E8
    2HB     杆菌(可变的)      2.5E8
    2NB     球菌/逗号形的      1.9E8
    2SB     杆菌      2.5E6
    2AB     球菌      3.0E6
    3EM     球菌/杆菌      1.4E8
    3HM     球菌      1.2E8
    3NM     球菌      5.8E7
    3SM     球菌     7.5E5
    3AM     球菌     7.5E5
    3EP     杆菌     7.8E7
    3HP     杆菌     3.0E7
    3NP     杆菌     7.1E7
    3SP     球菌     1.0E6
    3AP     杆菌     2.5E5
    3EB     杆菌(可变的)     1.5E8
    3HB     球菌/杆菌     3.1E7
    3NB     球菌     3.1E8
    3SB     球菌(不规则的)     1.7E7
    3AB     球菌/杆菌     2.5E5
    4EM     球菌(可变的)     1.6E8
    4HM     双球菌     3.1E8
    4NM     球菌     1.6E8
    4SM     球菌     1.3E6
    4AM     杆菌     2.5E5
    4EP     杆菌(可变的)     1.0E8
    4HP     杆菌(可变的)     2.2E8
    4NP     球菌     1.3E8
    4SP     球菌     1.5E6
    4AP     球菌/杆菌     6.5E6
    4EB     杆菌     3.6E8
    4HB     杆菌(可变的)     4.8E8
    4NB     杆菌     2.6E8
    4SB     逗号形的     1.3E6
    4AB     球菌     1.0E6
    5EM     球菌(可变的)     1.3E8
    5HM     球菌     1.4E8
    5NM     球菌     2.4E8
    5SM     无细胞     0.0
    5AM     无细胞     0.0
    5EP     球菌(可变的)     5.1E7
    5HP     杆菌     3.2E7
    5NP     链球菌     2.1E8
    5SP     球菌(可变的)     2.8E6
    SAP     杆菌     5.0E5
    5EB     杆菌     3.1E8
    5HB     球菌     3.2E7
    5NB     球菌     1.6E8
    5SB     杆菌     1.0E6
    5AB     球菌     2.5E6
    6EM     杆菌(可变的)     1.7E8
    6HM     球菌     2.6E8
    6NM     球菌/螺旋体     1.3E8
    6SM     球菌(可变的)     1.3E6
    6AM     球菌(可变的)     2.0E6
    6EP     杆菌     2.8E7
    6HP     杆菌     1.3E8
    6NP     杆菌/螺旋体     2.0E8
    6SP     球菌(可变的)     3.5E6
    6AP     球菌(可变的)     5.0E5
    6EB     球菌     3.5E7
    6HB     杆菌     1.3E8
    6NB     杆菌     4.8E7
    6SB     球菌     2.3E6
    6AB     球菌     3.3E6
    7EM     链球菌     1.3E8
    7HM 葡萄球菌(staphylococci)     3.2E7
    7NM     球菌/杆菌     3.1E8
    7SM     球菌(可变的)     3.0E6
    7AM     球菌(可变的)     4.0E6
    7EP     杆菌     1.4E8
    7HP     杆菌     4.1E8
    7NP     杆菌     3.5E8
    7SP     球菌(可变的)     1.2E7
    7AP     球菌(可变的)     1.5E6
    7EB     杆菌(可变的)     1.6E8
    7HB     杆菌(可变的)     3.9E8
    7NB     杆菌     4.2E8
    7SB     球菌(可变的)     4.3E6
    7AB     球菌(可变的)     2.8E6
    8EM     球菌     5.6E7
    8HM     球菌     6.1E7
    8NM     球菌     5.7E7
    8SM     球菌(可变的)     5.3E6
    8AM     杆菌     2.3E6
    8EP     杆菌     1.4E8
    8HP     球菌     3.8E8
    8NP     球菌     2.9E8
    8SP     方形的     6.5E6
    8AP     球菌(可变的)     3.8E6
    8EB     杆菌     1.3E8
    8HB     杆菌/链球菌     9.8E7
    8NB     杆菌(可变的)     1.2E8
    8SB     杆菌(可变的)     2.0E6
    8AB     球菌(可变的)     2.8E6
  对比-1     无细胞     0.0
  对比-2     无细胞     0.0
  对比-3     无细胞     0.0
于1996年8月22日将样品标记菌株3NB和6NB在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD分别在ATCC标识号55808和55809下保藏。
按本发明处理后，石油污染物含量大为减小了。例如，在污染的地下水和土壤中，石油污染物含量优选被减小到低于表11中列出的水平。表11
    成分     地下水(ppm)     土壤(ppm)
    TPH      0.2     200
脂族化合物C5～C8      0.4     100
脂族化合物C9～C12      4     1,000
脂族化合物C9～C18      4     1,000
脂族化合物C19～C36      5     2,500
芳族化合物C9～C10      0.2     100
芳族化合物C11～C22      0.2     200
作为供微生物消费的食物源，丁烷在很多应用中由于它的溶度因子而可能是比甲烷或丙烷更优良的基质。甲烷和丙烷的特征是稍微溶于水，而丁烷的特征则是很易溶于水。在17℃下，100ml水中分别可溶解3.5ml甲烷和6.5丙烷。相比之下，100ml水中可溶解15ml丁烷。更高的溶解度增大了微生物对供代谢的生长基质的接触，而且可能产生证实是一级动力学的反应速率。
各种利用丙烷和利用丁烷的细菌特征如下。微生物鉴定基于相似性指数。微生物鉴定体系(MIS)中的相似性指数是这样的数值，即，它表达未知样品的脂肪酸成分与用来产生作为其匹配物列出的文库条目的菌株的平均脂肪酸甲酯成分相比是如何地接近。数据库检索提供最佳匹配物和相关的相似性指数。未知样品的脂肪酸组成与文库条目平均值的准确匹配导致1.000的相似性指数。相似性指数将随着每种脂肪酸与平均百分数的不同而减小。相似性为0.500或更高的菌株以及第一次选择和第二次选择之间分离为0.100的菌株是良好的匹配物(良好的或优异的)。0.300～0.500之间的相似性指数可能是良好的匹配物，但是也指示非模式菌株(OK)。低于0.300的值启示该菌种不在数据库中，但列出的那些提供最接近的相关菌种(不良的或差的)。
至于脂肪酸分析后仍然未鉴定的菌株，就应用Biolog系统，其中，通过将未知分离物的基质利用特性与Biolog数据库比较来鉴定微生物。
在两个独立的实验室选择下列分离物来鉴定：丙烷利用者2EP，3EP，4HP，6HP，6NP和8NP；而丁烷利用者2EB，2HB，3EB，3NB，4EB，4HB，4NB，5EB，6HB，6NB和7NB。
大多数丙烷利用者和丁烷利用者的特征是两个实验室比较-成对分离物2EP-2EB、3EP-3EB、4HP-4HB、6HP-6HB和6NP-6NB的不同属/种，于是表明丁烷利用者是一类明显与丙烷降解者不同的微生物。由于利用甲烷的细菌必然是甲烷氧化者，所以来自甲烷实验生态系统的分离物未接受实验分析。将来自实验生态系统的大部分分离物混合。在两个实验室之间，59属/种被鉴定为“良好的或优异的”准确，14为“OK”准确(非模式菌株)，以及22为“不太”准确(不属于数据库的仍然未知的种)。表12归纳了经鉴定能降解石油化合物的丁烷利用者。表12
样品标记     属     种
    2HB* 假单胞菌属     恶臭很单胞菌(pudida)
    2EB 假单胞菌属     红苍白假单胞菌(rubrisubalbicans)
    3EB 假单胞菌属     红苍白假单胞菌
    5EB 假单胞菌属     铜绿假单胞菌(aeruginosa)
    6NB 假单胞菌属     铜绿假单胞菌
    2EB 贪噬菌属     争论贪噬菌(paradoxus)
    2HB 贪噬菌属     争论贪噬菌
    3EB 贪噬菌属     争论贪噬菌
    3NB 贪噬菌属     争论贪噬菌
    4HB     贪噬菌属     争论贪噬菌
    4NB     贪噬菌属     争论贪噬菌
    5EB*     贪噬菌属     争论贪噬菌
    6HB     贪噬菌属     争论贪噬菌
    2EB     贪噬菌属     争论贪噬菌**
    6NB     贪噬菌属     争论贪噬菌***
    7NB    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌(asteroides)
    2HB    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌***
    3EB    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌***
    4HB*    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌***
    4NB    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌***
    7NB    诺卡氏菌属     星状诺卡氏菌***
    5EB*    诺卡氏菌属     巴西诺卡氏菌(brasiliensis)
    2EB    诺卡氏菌属     局限诺卡氏菌(restricta)
    2HB    诺卡氏菌属     小球诺卡氏菌(globerula)
    2HB    金黄杆菌属     产吲哚金黄杆菌(indologened)
    4HB    金黄杆菌属     产吲哚金黄杆菌
    7NB    金黄杆菌属     产吲哚金黄杆菌
    5EB    金黄杆菌属     脑膜脓毒性金黄杆菌(meningosepticum)
    2EB   丛毛单胞菌属     食酸丛毛单胞菌(acidovorans)
    3NB   丛毛单胞菌属     食酸丛毛单胞菌
    6HB   丛毛单胞菌属     食酸丛毛单胞菌
    6NB   丛毛单胞菌属     食酸丛毛单胞菌
    4EB     食酸菌属     德氏食酸菌(delafieldii)
    4NB     食酸菌属     德氏食酸菌
    6NB     食酸菌属     德氏食酸菌
    4NB     红球菌属     紫红红球菌(rhodochrous)
    7NB     红球菌属     紫红红球菌
    2EB     红球菌属     红串红球菌(erythropolis)
    3EB     红球菌属     红串红球菌
    6HB     红球菌属     红串红球菌
    4EB*     红球菌属     藤黄红球菌(fascians)
    5EB*     红球菌属     藤黄红球菌
    4NB     金杆菌属     巴氏金杆菌(barkeri)
    4HB     金杆菌属     酯香金杆菌(steroaromaticum)
    4NB     金杆菌属     酯香金杆菌
    6HB     金杆菌属     天牛金杆菌(saperdae)
    5EB     微球菌属     变异微球菌(varians)
    7NB     微球菌属     变异微球菌
    7NB     微球菌属     克氏微球菌(kirstinae)
    6HB     气单胞菌属     豚鼠气单胞菌(caviae)
    6NB     气单胞菌属     豚鼠气单胞菌
    2EB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌(maltophilia)
    3EB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌
    4EB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌
    5EB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌
    6HB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌
    6NB    寡养单胞菌属     嗜麦芽糖寡养单胞菌
    4EB    鞘氨醇杆菌属     嗜温鞘氨醇杆菌(thalpophilum)
    4NB*    鞘氨醇杆菌属     食神鞘氨醇杆菌(spiritivorum)
    4NB    希瓦氏菌属(Shewanella)     腐败希瓦氏菌B(putrefaciens B)
    3NB*     叶杆菌属     紫金牛叶杆菌(myrsinacearum)
    6HB     棍状杆菌属     密执安棍状杆菌(michiganense)
    6HB     棍状杆菌属     密执安棍状杆菌****
    6NB     产碱菌属     木糖氧化产碱菌(xylosoxydans)
    7HB*    戈登氏菌属     土生戈登氏菌(terra)
    7NB     棒杆菌属     水生棒杆菌B(aquaticum B)
    7NB    噬纤维菌属     约氏噬纤维菌(johnsonae)
*＝指示与脂肪酸数据库差匹配的低相似性指数。在这些情况下，列出的聚生体中的菌种与测试基质利用的数据库匹配并且仍未鉴定。(*)最恰当地描述了未知的属/种。**＝GC亚类A亚种***＝GC亚类B亚种****＝棋盘状亚种(tessellarius subspecies)
可用于本发明的就地生物除污方法包括将非本土的利用丁烷的微生物注入表面或表面下和/或应用本土的利用丁烷的微生物。可通过添加营养物和生长基质(可能限于详尽研究的生态系统内)刺激本土的微生物繁殖。对于有氧代谢，氧通常在有限的浓度内。可通过在任何地下环境(其中，已引入了含氯烃)中添加丁烷、氧和任选的补充营养物来增强利用丁烷的细菌的生长，从而产生有效的处理区。可通过灌注井或扩散井或一些其它类别的输送系统将氧、营养物(例如无机和有机含氮化合物和含磷化合物)和丁烷气体输入地下。也可将利用丁烷的生物的非本土株注入地下环境。至于利用石油的细菌，可能不必引入脂肪烃碳源。可以就地在含盐环境或低pH环境中应用本发明的利用丁烷的生物。
一个可用于降解石油污染物的就地生物除污的优选的系统和方法被描述于1999年3月24日申请的、题为“应用利用丁烷的细菌就地生物除污的系统和方法”美国专利申请(将它并入本文作参考)。
此外，本发明利用丁烷的生物可在外部生物反应器中提供，如描述于美国专利申请系列No.08/767,750中的能处理空气、土壤或地下水(淡水、盐水或低pH)废水流的生物反应器。所述外部生物反应器可被用于间歇式操作和/或连续流动操作中。
至于空气或气体处理，利用丁烷的细菌可在生物反应器中在耐湍动气流的任何合适类别的包装材料或基质上生长。可用真空鼓风机从地下或其它环境抽取含有氯化挥发性有机化合物的气流并在生物反应器中处理。在该实施方案中，处理作用包括，使氯化废气流以与常规活性炭系统中大体相同的方式通过生物反应器，不同的是，污染物不仅仅被转移，而是被消灭。
可按本发明用利用丁烷的生物在外部生物反应器中将石油污染的土壤生物除污。该装置可通过混合或流化搅拌土壤，于是促进石油的挥发(它可被作为上述废气流那样处理)。另一类土壤反应器可在生物反应器中降解石油污染物，所述生物反应器能通过引入非本土的利用丁烷的细菌或刺激本土的利用丁烷的细菌而处理土壤浆状基质。可将氧、营养物(包括备选的有限碳源和氮源，例如酪蛋白氨基酸和酵母)和丁烷引入这类生物反应器中。表面活性剂的应用可加速从土壤基质除去石油污染物，于是减少处理时间和提高生物反应器的性能。
按本发明的一个实施方案，可应用一个外部生物反应器再生被石油污染物污染的地面水或地下水(通过应用利用丁烷的细菌)。受污染的水可包括淡水、盐水、低pH水等。外部生物反应器可包含一个或多个室，每个室装有一种基质(例如接种了特异性菌株或利用丁烷的细菌的聚生体的生物膜织物或包装材料)。每个生物反应器室优选盛有氧、营养物和丁烷气体输送体系。应用利用丁烷的生物(证实了应用石油化合物作为直接食物源的能力)的生物反应器系统可能不需要引入丁烷。然而，在共代谢系统中，优选包括定时器而调节丁烷的引入，于是减小饱和酶位点(它将导致更低的污染物破坏速率)的可能性。
除了间歇式操作，还可通过连续流动技术操作生物反应器。可通过控制操作参数(例如用培养基增大生物膜表面积，改良丁烷和氧输送系统以及调节最适合细菌生长的条件)而大大提高石油脱除效率。适用于上文列出的生物反应器中生物膜的各种其它支持介质(即，非金属筛网、丸、珠等)可在处理阶段之前为生物膜的形成提供更大的表面积。其它类别的支持介质也可优化细菌生长和生物反应器中表面积与体积的比，从而改良生物降解条件，并且有效地减少在生物反应器内所需的滞留时间。通过利用有效的氧和生长基质输送系统(例如喷洒)可实现更高的性能。这可通过减小喷洒过程中的泡尺寸(它将增大生物反应器内微生物对化合物的利用率)来达到。在某些情况下，可能需要通过预调节pH、温度和其它相关的物理化学参数而减小至生物反应器的极为受压的流入液物流的负效果。
虽然为了阐释而在上文描述了本发明的具体实施方案，但对本领域技术人员来说，显然可对本发明的细节作很多改变而不偏离附后权利要求书限定的本发明。

Claims (43)

1.一种降解石油污染物的方法，该方法包括，用利用烷烃的细菌在至少一种烷烃和氧的存在下处理石油污染物达足以使利用烷烃的细菌降解石油污染物的处理时间。
2.权利要求1的方法，其中，所述至少一种烷烃包括丁烷。
3.权利要求2的方法，其中，丁烷是作为包含作为基质最占优势的化合物的丁烷的丁烷基质提供的。
4.权利要求2的方法，其中，丁烷是作为包含至少约10wt％丁烷的丁烷基质提供的。
5.权利要求2的方法，其中，丁烷是作为包含至少约50wt％丁烷的丁烷基质提供的。
6.权利要求2的方法，其中，丁烷是作为包含至少约90wt％丁烷的丁烷基质提供的。
7.权利要求2的方法，其中，丁烷是作为包含至少约99wt％正丁烷的丁烷基质提供的。
8.权利要求1的方法，其中，以大致恒定的速率提供所述烷烃。
9.权利要求1的方法，其中，在大致整个处理时间内提供所述烷烃。
10.权利要求1的方法，它进一步包括，在一部分处理时间内对利用烷烃的细菌提供所述至少一种烷烃。
11.权利要求1的方法，其中，以脉冲形式提供所述烷烃。
12.权利要求1的方法，其中，在大致整个处理时间内对利用烷烃的细菌提供氧。
13.权利要求1的方法，其中，以空气的形式提供氧。
14.权利要求1的方法，其中，以大致恒定的速率提供氧。
15.权利要求1的方法，其中，所述利用烷烃的细菌包括至少一种选自下组的细菌：假单胞菌属、贪噬菌属、诺卡氏菌属、金黄杆菌属、丛毛单胞菌属、食酸菌属、红球菌属、金杆菌属、微球菌属、气单胞菌属、寡养单胞菌属、鞘氨醇杆菌属、希瓦氏菌属、叶杆菌属、棍状杆菌属、产碱菌属、戈登氏菌属、科里氏杆菌属和噬纤维菌属。
16.权利要求1的方法，其中，所述利用烷烃的细菌包括至少一种选自下组的细菌：恶臭假单胞菌、红苍白假单胞菌、铜绿假单胞菌、争论贪噬菌、星状诺卡氏菌、巴西诺卡氏菌、局限诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、产吲哚金黄杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、食酸丛毛单胞菌、德氏食酸菌、紫红红球菌、红串红球菌、藤黄红球菌、巴氏金杆菌、酯香金杆菌、天牛金杆菌、变异微球菌、克氏微球菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、嗜温鞘氨醇杆菌、食神鞘氨醇杆菌、腐败希瓦氏菌B、紫金牛叶杆菌、密执安棍状杆菌、木糖氧化产碱菌、土生戈登氏菌、水生棒杆菌B和约氏噬纤维菌。
17.权利要求1的方法，其中，所述利用烷烃的细菌包括至少一种选自下组的细菌：红苍白假单胞菌、铜绿假单胞菌、争论贪噬菌、星状诺卡氏菌、局限诺卡氏菌、产吲哚金黄杆菌、食酸丛毛单胞菌、德氏食酸菌、紫红红球菌、红串红球菌、酯香金杆菌、天牛金杆菌、变异微球菌、克氏微球菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、嗜温鞘氨醇杆菌、密执安棍状杆菌、木糖氧化产碱菌、水生棒杆菌B和约氏噬纤维菌。
18.权利要求1的方法，其中，所述石油污染物存在于土壤中。
19.权利要求18的方法，其中，用利用烷烃的细菌处理后，土壤中的石油污染物浓度小于约200ppm总石油烃。
20.权利要求1的方法，其中，所述石油污染物存在于液体中。
21.权利要求20的方法，其中，所述液体包括水。
22.权利要求21的方法，其中，用利用烷烃的细菌处理后，水中的石油污染物浓度小于约0.2ppm总石油烃。
23.权利要求21的方法，其中，基本上全部石油被利用烷烃的细菌降解。
24.权利要求1的方法，其中，在受污染的场所就地处理石油污染物。
25.权利要求24的方法，其中，所述受污染的场所包括地下水。
26.权利要求1的方法，其中，在生物反应器中外部处理石油污染物。
27.一种净化水的方法，它包括：
提供包含石油污染物的受污染的水；以及
用利用烷烃的细菌在至少一种烷烃和氧的存在下处理石油污染物达足以使利用烷烃的细菌降解石油污染物的处理时间而生产具有比受污染的水更低浓度的石油污染物的净化水。
28.权利要求27的方法，其中，所述至少一种烷烃包括丁烷。
29.权利要求28的方法，其中，丁烷是作为包含作为基质最占优势的化合物的丁烷的丁烷基质提供的。
30.权利要求28的方法，其中，丁烷是作为包含至少约10wt％丁烷的丁烷基质提供的。
31.权利要求28的方法，其中，丁烷是作为包含至少约50wt％丁烷的丁烷基质提供的。
32.权利要求28的方法，其中，丁烷是作为包含至少约90wt％丁烷的丁烷基质提供的。
33.权利要求28的方法，其中，丁烷是作为包含至少约99wt％正丁烷的丁烷基质提供的。
34.权利要求27的方法，其中，所述净化水包含小于约0.2份/百万份总石油烃。
35.权利要求27的方法，其中，所述受污染的水包括地下水。
36.权利要求27的方法，其中，在受污染的场所就地处理所述受污染的水。
37.权利要求27的方法，其中，在生物反应器中外部处理所述受污染的水。
38.一种处理被石油污染物污染的场所的方法，它包括：
对受污染的场所提供烷烃基质；以及
对受污染的场所提供含氧的气体。
39.权利要求38的方法，其中，所述烷烃基质基本上由丁烷基质构成。
40.权利要求39的方法，其中，所述丁烷基质包含至少约10wt％的丁烷。
41.权利要求39的方法，其中，所述丁烷基质包含至少约50wt％的丁烷。
42.权利要求39的方法，其中，所述丁烷基质包含至少约90wt％的丁烷。
43.权利要求39的方法，其中，所述丁烷基质包含至少约99wt％的正丁烷。
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