CN106676042A - 混合微生物制剂及其制造方法 - Google Patents

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CN106676042A
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张国良
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安徽壹诺环境工程有限公司
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • BPERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09CRECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09C1/00Reclamation of contaminated soil
    • B09C1/10Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes

Abstract

本发明涉及用于以生物学方式复原被复合污染物质的油类污染的土壤的混合微生物制剂及其制造方法,即利用以1:1:2:2:1:1:1的比率混合醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的1种菌株来制造而成的混合微生物制剂以生物学方式复原油类污染土壤。

Description

混合微生物制剂及其制造方法

[0001]

技术领域

[0002] 本发明的技术领域涉及一种混合微生物制剂及其制造方法,尤其涉及一种用于以生物学方式复原被复合污染物质的油类污染的土壤的混合微生物制剂及其制造方法。

[0003]

背景技术

[0004]由于油类污染土壤并非被一种油类污染,而是以复合性的方式被多种油类污染,因此,只有一同组合使用具有可以对各个油类拥有高效率且具有可以进行选择性的分解的能力的微生物制剂,才可以有效地进行净化。

[0005] 在到目前为止所知晓的微生物制剂中,很多种微生物制剂虽然具有油类分解能力,但要么根据各微生物制剂的特性来分解能力弱,要么根据油类的种类来呈现出选择性的分解能力,而且在高浓度的油类污染区域中,发生因污染物质而使增值变弱等诸多问题。并且,由于被多种油类以复合性的方式污染,或者根据土壤的种类、形状及含水率而存在很难几乎完全净化多种土壤层的问题。

[0006] 韩国授权专利第10-1198103号(2012年10月31日授权)公开了具有油类分解能力的新的微生物及其制造方法,其特征在于,由具有油类分解能力的假单胞细菌(Pseudomonas sp.)MJ32KCTClI678BP和假单胞细菌(Pseudomonas sp.)MJ33 KCTCl 1679BP指定的多个新的菌株、使多个新的菌株固定于特定载体的微生物制剂及利用它们来以复合性的方式复原被油类污染的土壤。根据所公开的技术,由于对多种难分解性物质具有分解能力,并对高浓度油类污染具有高的抵抗力,还拥有生分解能力,因此,在单独或与具有油类分解能力的多种菌株一同在有效的载体中实现固定化来使用于油类污染土壤的生物学复原的情况下,与以往的污染土壤复原方法相比,既有效又经济,并能够以环保的方式净化污染环境。

[0007] 韩国公开专利第10-2008-0007861号(2008年OI月23日公开)公开了具有油类分解能力的新的微生物及油类污染土壤的生物学复原方法。根据所公开的技术,新的微生物被指定为红球菌EN3KCTC19082 (Rhodococcus baikoneurensis EN3KCTC19082)、约氏不动杆菌EN67KCTC12360 (Acinetobacter johnsonii EN67 KCTC12360)及溶血不动杆菌EN96KCTC12361 (Acinetobacter haemolyticus EN96 KCTC12361),并且,除了新的微生物之外,可以使用从油类污染土壤分离的具有油类分解能力的诺卡氏菌属、大头茶属、红球菌属、不动杆菌属的多种微生物,而且,可以通过添加作为生表面活性剂的一种的2-烷基-3-羟基酸及其衍生物来增加这些菌株的油类分解活性度,由此,与现有的污染土壤复原方法相比,既有效、又经济,并且能够以环保方式净化污染环境。

[0008]上述现有的微生物制剂及其制造方法在利用微生物制剂对被复合污染物质的油类污染的土壤进行复原的过程中,在将对生态环境产生的影响最小化方面存在局限性,尤其,具有在对被具有广范围的分子量和多种分子结构且包含直链型碳化氢或脂肪族、芳香族碳化氢的复合污染物质的油类污染的土壤实施生物学复原方面存在局限性的问题。

[0009] 现有的微生物制剂及其制造方法由于同样未能考虑地下处理之类的原位(in-s i tu)处理工序、土壤耕作之类的离位(ex-si tu)处理工序等不同工序的特性,因而具有很难进行实现最优化的油类污染土壤的复原的问题。并且,在对油类污染土壤进行地下处理的情况下,需要具有广泛的油类分解性,并需要优秀的土壤渗透性,但通过现有的微生物制剂及其制造方法很难在长时间内获得效果,并且,在此还具有很难有效地处理广范围的污染区域的问题。

[0010] 现有技术文献专利文献

韩国授权专利第10-1198103号韩国公开专利第10-2008-0007861号

发明内容

[0011] 本发明目的在于解决上述缺点,即提供以生物学方式复原被复合污染物质的油类污染的土壤的混合微生物制剂及其制造方法。

[0012]

解决上述问题的方法在于提供混合微生物制剂,根据本发明的一特征,其特征在于,以1: 1:2: 2:1:1:1的比率混合醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株来制造而成。

[0013] 解决上述问题的方法在于提供混合微生物制剂,根据本发明的另一特征,其特征在于,其以1:1:3:3:3:1:1的比率混合醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株来制造而成。

[0014] 解决上述问题的方法在于提供混合微生物制剂的制造方法,根据本发明的又一特征,其包括:在污染土壤中稀释醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株作为微生物,并调节水分来进行添加的步骤;使智能型混凝试验搅拌机完全封闭,并测定上述生化需氧量微生物的芳香族碳化氢分解率的步骤;测定土壤内残留油类碳化氢(TPH)的量来计算出土壤内油类碳化氢的分解率的步骤;实施细菌粘附烃测试,来测定上述微生物的亲水性的步骤;利用甲磺酸甲酯来执行上述微生物的细胞壁组成变化的步骤;执行电动电势测定来确认上述微生物的土壤内移动性的步骤;确认即使在使改变原菌株和细胞壁的多个微生物传代培养100代或200代后,细胞壁的特性是否得到维持的步骤;以及以1:1:2:2:1:1:1的比率混合上述微生物,并实现剂型化的步骤。

[0015] 解决上述问题的方法在于提供混合微生物制剂的制造方法,根据本发明的还有一特征,包括:在污染土壤中稀释醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株作为微生物,并调节水分来进行添加的步骤;使生化需氧量智能型混凝试验搅拌机完全封闭,并测定上述微生物的芳香族碳化氢分解率的步骤;测定土壤内油类碳化氢残留的量来计算出土壤内的油类碳化氢分解率的步骤;实施细菌粘附烃测试来测定上述微生物的亲水性的步骤;利用甲磺酸甲酯来执行上述微生物的细胞壁组成变化的步骤;执行电动电势测定来确认上述微生物的土壤内移动性的步骤;确认即使在使改变原菌株和细胞壁的多个微生物传代培养100代或200代后,细胞壁的特性是否得到维持的步骤;以及以1:1:3:3:3:1:1的比率混合上述微生物,并实现剂型化的步骤。

[0016] 本发明效果在于,提供以生物学方式复原被复合污染物质的油类污染的土壤的混合微生物制剂及其制造方法,从而在利用微生物制剂对被复合污染物质的油类污染的土壤进行复原的过程中,有利于将对生态环境产生的影响最小化,尤其,可以对被具有广范围的分子量和多种分子结构且包含直链型碳化氢或脂肪族、芳香族碳化氢的复合污染物质的油类进行综合分解。

[0017] 根据本发明,与地下处理之类的原位(in-situ)处理工序、土壤耕作之类的离位(ex-situ)处理工序等不同工序的特性相匹配地提供具有差别化的油类分解功效的混合物生物制剂,从而具有对油类污染土壤实现最优化,并可以实现综合性复原的效果。

[0018] 根据本发明,提供在具有广泛的油类分解能力,并需要优秀的土壤渗透性的油类污染土壤进行地下处理的情况下,也长时间有效的油类污染土壤复原用微生物制剂,从而不仅可以综合性地具有油类分解能力,而且可以喷洒于广泛的污染区域或向地下注入,可以在广泛的污染区域有效地适用原位处理工序,尤其,在复原由海洋油类泄漏事故引起的附近区域的土地或工业园区区域等广泛的油类污染区域的土壤方面非常有效。

[0019]

附图说明

[0020]图1为对本发明实施例的混合微生物制剂的制造方法进行说明的图;

图2为表示利用本发明实施例的生化需氧量智能型混凝试验搅拌机的分解率测试结果的图;

图3为表示本发明实施例的油类碳化氢的分解率测定结果的图;

图4为表示用于本发明实施例的微生物的土壤渗透性实验的微型柱的图;

图5为表示实施本发明实施例的细菌粘附烃测试的结果的图;

图6为表示利用本发明实施例的甲磺酸甲酯来执行微生物的细胞壁组成变化的结果的图;

图7及图8为表示本发明实施例的变异菌株的特征即使在进行100代及200代后也得到维持的试验结果的图;

图9至图11为表示本发明实施例的原菌株和细胞壁的特性发生变化的微生物的油类碳化氢的分解率的图。

[0021] 附图标记的说明 SlOl:添加水分的步骤

S102:测定芳香族碳化氢分解率的步骤S103:测定TPH分解率的步骤

S104:测定亲水性的步骤

S105:执行细胞壁的组成成分变化的步骤

s1e:确认移动性的步骤

S107:确认是否维持细胞壁特性的步骤

S108:微生物的剂型化

具体实施方式

[0022] 以下,参照附图对本发明的实施例进行详细的说明,以使本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易地实施。但与本发明相关的说明仅为用于进行结构性说明乃至功能性姓名的实施例,因此,本发明的保护范围不应被解释为局限于本文所述的实施例。即,实施例可以进行多种变更,并可以具有多种形态,因此,本发明的保护范围应被理解为可以实现技术思想的等同技术方案。并且,本发明所揭示的目的或效果并非为特定实施例包括这些目的或效果或仅包括这种效果的含义,因而本发明的保护范围不应被理解为因此而受到限制。

[0023] 以下,参照附图对本发明实施例的混合微生物制剂及其制造方法进行详细说明。[〇〇24] 本发明实施例的混合微生物制剂采集存在于油类污染土壤的多个微生物,并筛选油类分解能力优秀的微生物菌株,筛选醋酸|丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)DM、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) DM、生癌肠杆菌(Enterobactercaucerogenus) DM、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri) 0X1、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等共计6种菌株作为微生物菌株,并且,师选红球菌属(Rodococcus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、大头茶属(Gordonia sp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)0Lu_l、荚膜黄杆菌(Novosphingobium capsulatum) 0Lu_2、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)0Lu_3、黄单胞菌属(Xanthomonas sp•) 0Lu-4中的至少一种菌株作为微生物菌株,对所筛选的总计7种相应的微生物菌株进行培养,并以预设的比率(例如,1:1:2:2:1:1:1、1:1:3:3:3:1:1等)进行混合来制造。

[0〇25]针对上述微生物,使用稀释涂抹法,并利用灭菌后的蒸馏水按规定的比率进行稀释后,在固体培养基中进行涂抹,并在30°C的条件下进行16小时的培养之后,测定微生物个体数,之后,为了在微生物制剂中恒定维持微生物的个体数而使用相同的方法。

[0〇26] 第一实验例:具油类分解能力实现最优化的微生物组成比的混合微生物制剂的制造第一,对利用生化需氧量(BOD,b1chemical oxygen demand)智能型混凝试验搅拌机(jar tester)的分解率的测定进行说明如下。

[0027]图1为对本发明实施例的混合微生物制剂的制造方法进行说明的图。

[0〇28] 参照图丨,准确地测定了利用柴油(Diesel)以10000ppm(mg/kg)的条件使干燥的土壤受到污染的160的土壤。在稀释上述的微生物,并将水分调节为20%来进行添加后(步骤S101),使用镊子在平板(tablets)橡胶袋子放入NaOH (Sodium hydroxide),使得生化需氧量智能型混凝试验搅拌机(OxiTOP)完全封闭,并放入于20°C的培养基来实施零位校正,从而测定了上述微生物的芳香族碳化氢分解率(步骤S102)。

[0029]图2为表示利用本发明实施例的生化需氧量智能型混凝试验搅拌机的分解率测试结果的图。

[0030] 使使用于微生物制剂的微生物混合比率变得不同来测定的结果如图2所示。此时,微生物作为醋酸钙不动杆菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌肠杆菌DM、施氏假单胞菌0X1、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属OLu-

1、荚膜黄杆菌0Lu-2、不动杆菌属0Lu-3、黄单胞菌属OLu-4中的I种菌株,7种微生物的混合比率为1:1:2:2:1:1:1,在分解芳香族碳化氢的微生物的相对比率得到完善的情况下,呈现出最佳的分解效果。

[0031] 第二,对油类碳化氢分解率的测定的说明如下。

[0032] 在执行上述的步骤S102后,利用标准工序试验法来测定残留于土壤内的总油类碳化氢的量,并计算出土壤内油类碳化氢的分解率(步骤S103)。

[0033]利用二氯甲烷从土壤内抽取油类碳化氢后,使用GC (MS)来进行测定。

[0034]图3为表示本发明实施例的油类碳化氢的分解率测定结果的图。

[0035] 为了使基于上述微生物的混合比率的变化的油类碳化氢的分解率实现最优化,在经过10日后,对多种微生物的组成比进行了分解率的测定。一边恒定维持总个体数,一边改变醋酸钙不动杆菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌肠杆菌DM、施氏假单胞菌0X1、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属OLu-1、荚膜黄杆菌0Lu-2、不动杆菌属0Lu-3、黄单胞菌属OLu-4中的I种菌株的混合比率,并观察了分解率。若按相应的微生物制剂的顺序分别标为A、B、C、D、E、F、G,并观察油类碳化氢的分解率测定结果,则如图3所示。在此,像生癌肠杆菌DM、施氏假单胞菌0X1、红串红球菌一样对芳香族碳化氢拥有分解能力的微生物的相对比率高的1:1:3:3:3:1:1组合组被判断为油类碳化氢的分解率高。因此,判断今后为了复原被油类污染的土壤而应当考虑污染物质的种类,并适当地调节混合微生物制剂中的微生物的相对比例。

[0036] 第二实施例:土壤渗透性优秀的油类分解菌株混合制剂的制造第一,对渗透性实验的说明如下。

[0037]图4为表示用于本发明实施例的微生物的土壤渗透性实验的微型柱的图。

[0038] 上述,利用40〜70mesh的土壤体重新筛选所干燥的土壤,而为了对上述的微生物进行土壤渗透性实验,使用小容量(例如,3mL)的塑料注射器作为图4所示的微型柱,并在剥开过滤纸(Whatman N0.4)后,利用40〜70mesh的土壤体注入所筛选的1.5g的土壤。此时,在均匀地填充注入于各微型柱的土壤后,恒定维持体积。

[0039] 为了去除土壤内的自生细菌的影响,在121°C的条件下进行20分钟的湿润灭菌后,在干燥箱(60°C)中放入一天以上,来去除湿气,从而维持均匀条件的湿度。对从油类污染土壤中筛选并被判断为油类分解性优秀的醋酸钙不动杆菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌肠杆菌DM进行比较实验。

[0040] 上述微生物为了维持适当的活性而在LB (Luria Bertani)培养基中培养一整夜(overnight)(例如,16小时〜18小时)后,重新在新的LB培养基中以0D600 0.05〜0.1的状态进行重新接种,并重新培养至0D600 0.6〜0.8 (exponential phase)。使培养至指数为止的微生物进行离心分离(VS-15 CFN,8000rpm,10 min),来去除上清液,并对微生物进行筛选分离。

[0041]上述,利用灭菌后的蒸馏水来对进行筛选分离的微生物进行3次清洗,来去除营养源及离子成分后,在灭菌后的蒸馏水中重新实施悬浮,从而制造了被调节为0D600 0.2的水准的悬浮液。在微型柱中适用与微型柱内的1.5g的土壤的外体积一样的条件的1.8mL的微生物悬浮液,并进行了比较实验。

[0042] 为了使微生物悬浮液和土壤充分接触,在常温、无菌状态下放置30分钟,并在微型柱插入灭菌后的注射针,来防止微生物悬浮液直接排出。在经过30分钟后,使悬浮液进行重力排水,并在利用灭菌后的蒸馏水适当地稀释经过微型柱的余液后,在LB琼脂(agar)培养基中涂抹稀释液,并在30 °C培养基中培养了 16小时〜18小时。

[0043]测定在平板培养基上进行培养后生成的菌落数,来计算出菌落形成单位(CFU,Colony Forming Unit)值,而就渗透性而言,求得向微型柱投入的微生物的个体数的渗透微型无的个体数的百分率比,来筛选出土壤内渗透性优秀的菌株。

[0044]第二,对细菌粘附经(BATH ,bacterial adherence to Hydrocarbon)测试进行说明如下。

[0045]上述微生物的土壤内移动性受细胞壁的特性的影响,细菌和霉菌等根据生长条件(溶解氧的浓度、pH生长培养基中营养源的种类)来改变微生物细胞壁的特性,由此,对细胞壁的亲水性和疏水性产生影响。

[0046] 根据其表面的特性,疏水性的物质部与亲水性的物质相结合而与疏水性的物质相结合,普通的油类物质(即,碳化氢等)的液滴具有疏水性。在使无疏水性溶剂和无法掌握其表面的特性的微生物悬浮液相混合后,实现停滞,并到达平行之后,测定在作为亲水性的培养基和作为疏水性的溶剂中展开的微生物量的比,从而可以掌握微生物细胞壁的特性。

[0047] 在进行混合的期间内,使得位于水层的微生物中的细胞壁的特性为疏水性的微生物向疏水性溶剂层移动,使得存在于亲水性的水层的微生物的量减少。因此,若测定停滞后的水层的光学密度(0D,Optical Density),则在疏水性微生物的情况下,光学密度的减少幅度增加。利用这种方法观察了被判断为油类分解性优秀的醋酸钙不动杆菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌肠杆菌DM等菌株的细胞壁的特性。作为疏水性溶剂,使用了对二甲苯(P-xylene) (Junsei,日本(Japan))。

[0048] 针对各菌株,利用与渗透性实验方法相同的方法制造出活性得到维持的微生物,并利用蒸馈水调节所制造的悬浮液成为0D400 0.5的水准,并在管(tube)中放入4ml的悬浮液来停滞30分钟后,重新测定了准确的0D400值。

[0049] 在管中放入Iml的对二甲苯,并利用振荡器(IKA,日本(Japan))来准确混合I分钟后,在室温条件下放置30分钟,使得碳化氢层和水层(微生物悬浮液)相分离后,测定0D400值f,从而计算出相对于初始光学密度值i的最终光学密度值f之比。在此,光学密度值f的比值越接近1,微生物细胞壁的组成成分越成为亲水性,光学密度值f的比值月小,越呈现出具有疏水性的细胞壁的组成成分的微生物。

[0050]图5为表示实施本发明实施例的细菌粘附烃测试的结果的图。在此,图5的(a)部分表示相比于醋酸钙不动杆菌的悬浮液的水性相的吸水减少率,图5的(b)部分表示相比于生癌肠杆菌的悬浮液的水性相的吸收减少率。

[0051]油类分解性优秀的醋酸钙不动杆菌DM、肺炎克雷伯氏菌DM、生癌肠杆菌DM等的菌株呈现出不同的细胞壁的特性。

[0052] 在执行上述的步骤S103后,为了检测微生物的土壤内移动性而实施细菌粘附烃测试,从而可以测定微生物的亲水性(步骤S104)。此时,作为细菌粘附烃测试的结果,如图5所示,醋酸钙不动杆菌的细胞壁的特性在比较菌株中疏水性最高,生癌肠杆菌的表面的亲水性最高。可知这种细胞壁的亲水性、疏水性的变化对微生物的土壤内移动性产生很大影响。[〇〇53] 在细胞表面尤其为疏水性的醋酸钙不动杆菌的土壤内的渗透性最差,细胞壁为亲水性的生癌肠杆菌的土壤内的渗透性最优秀。

[〇〇54] 微生物的土壤内移动性与油类分解性一样,同样为重要的变数。在注入细胞壁的疏水性强的油类分解微生物的培养液的情况下,相比于注入亲水性的油类分解微生物的情况,因土壤内移动性低而无法向污染区域投入。即,判断出适用细胞壁的亲水性高的微生物在进行生物学复原方面更为有效。

[〇〇55] 第三实验例:油类分解菌株的土壤改善方法第一,基于微生物细胞壁的化学变化的渗透性调节的说明如下。

[〇〇56] 在执行上述的步骤S104后,作为用于增进被判断为油类分解性佳,且被使用于土壤渗透性的微生物的醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌等的渗透性的方法,利用甲横酸甲酯(methyl methanesulfonate;MMS,Sigma)来执行了上述微生物的细胞壁组成变化(步骤S105)。而且,使各微生物在M9最小培养基中培养一整夜(例如,16小时〜18小时)后,从新在最小培养基中以0D600 0.05〜0.1的状态重新接种,并培养至0D600 0.6〜0.8(exponential phase)。使培养至指数为止的微生物进行离心分离(8000rpm,lOmin),来去除上清液,并收集微生物,在使用磷酸盐缓冲液(0.1M PPB,pH 7)对所收集的微生物进行3次清洗,并重新在M9中实施悬浮。

[〇〇57]以使微生物悬浮液的浓度成为OD550 2的方式进行稀释,来制造了悬浮液,并在灭菌后的3个呙心分离用微型管(microcentrifuge tube)中分别注入了 1.25ml的相应的微生物悬浮液。其中,在2个管中分别放入6.25iil、12.5yl的甲磺酸甲酯,并利用振荡器来在30秒钟内进行适当的振荡。

[〇〇58] 在3(TC的条件下,使适当浓度的微生物悬浮液和MMS(Sigma)完全混合而成的悬浮液培养一小时后,进行离心分离,之后去除上清液,并利用25ml的M9最小培养基进行清洗。之后,重新进行离心分离后,利用10ml的M9最小培养基进行清洗,并使所聚集的微生物在10ml的M9最小培养基中实施悬浮。

[〇〇59] 在30°C的条件下,使微生物悬浮液培养一小时,并利用磷酸盐缓冲盐水(PBS,phosphate buffer saline)使其中的一部分以适当的浓度稀释,并涂抹于LB板(plate)。在使剩余的培养液在M 9最小培养基中培养16小时〜18小时后,重新在M 9最小培养基中以0D600 0.05〜0.1状态实施重新接种,并在培养至0D600 0.6〜0.8(exponential phase)为止后,使用PPB清洗3次,并利用微型柱来进行了数次反复渗透实验。

[〇〇6〇] 为了认为地改变油类分解微生物的细胞壁的特性,来使土壤内移动性增进,使用甲磺酸甲酯来以化学性的方式改变微生物的细胞壁的组成成分。改变甲磺酸甲酯的投入浓度来调节了变化程度。可知当为了增进微生物的土壤渗透性而使发生变化的2.5ml的微生物悬浮液渗透3g的土壤时,与未发生变化的原来的菌株相比,渗透性得到提高。

[〇〇61]图6为表示利用本发明实施例的甲磺酸甲酯来执行微生物的细胞壁组成变化的结果的图。

[0062] 如图6所示,在醋酸钙不动杆菌(AC)的情况下,被6.25μ1的甲磺酸甲酯处理的微生物的渗透性在醋酸钙不动杆菌为0%时提高为14.7 ±2.9%。在肺炎克雷伯氏菌(KP)的情况下,可知当原菌株的土壤渗透性为0%时利用6.25μ1的MMS来得到处理的菌株(M_l)、利用12.5μ1的丽S来得到处理的菌株(Μ_2)的渗透性分别相对提高3±0.25%、99± 13.82%。并且,在细胞壁的亲水性佳的原来的生癌肠杆菌(EC)的情况下,可知当利用原菌株的土壤渗透性为约I ±0.27%时利用6.25μ1的丽S来得到处理的菌株(M_l)、利用12.5μ1的丽S来得到处理的菌株(Μ_2)的渗透性分别为3.3± 1.13%、2.2 ±0.95%,土壤渗透性得到提高,从而与其他菌株相比,土壤移动性的增进相对不是很大。

[0063]上述的特性如图6所示,即使在对原菌株和发生变化的菌株进行100代以上的传代培养之后,也呈现出几乎相同的形态。在醋酸钙不动杆菌的情况下,在100代之后发生变异的微生物(AC 100 generat1n)的渗透性在原株的渗透性为0%时,增加为36±13.9%,在肺炎克雷伯氏菌(KP 10generat1n)的情况下,当原株的土壤渗透性为0%时变异为6.25μ1、12.5μ1的变异株分别呈现出12.6 ± 4.3%、87.1 ± 31.6%的渗透性,在生癌肠杆菌(EC 100generat1n)的情况下,当原株的土壤渗透性为约0.04 ± 0.04%时变异为6.25μ1、12.5μ1的变异株分别呈现出3.8 ± 0.08%、3.7 ± 0.6%的渗透性,因此,可知当考虑误差时,100代后的微生物的渗透性与出示变异菌株相比,土壤内移动性相对略有提高或几乎呈现出相似的水准。

[0064] 第二,对电动电势(Zeta potential)测定的说明如下。

[0065] 在执行上述的步骤S105后,可以执行电动电势测定来确认上述微生物的土壤内移动性(步骤S106)。此时,在M9培养基中培养一整夜(例如,16小时〜18小时)的各菌株后,重新在M9最小培养基中以0D600 0.05〜0.1的状态进行重新接种,并培养至0D600 0.6〜0.8(exponential phase)。在培养至指数以上后,进行离心分离(8000rpm,1min),并去除上清液,回收微生物。

[0066] 使用磷酸盐缓冲液(0.1M PPB,pH 7)进行3次清洗,并以使微生物悬浮液的浓度成为大致2.5 X 108cells/ml (0D600N 2)的方式实施悬浮。在常温条件下对悬浮液进行3〜5分钟的超声波降解(sonicat1n) (BRANS0NIC,Ultrasonic cleanser),并将此在灭菌后的微型管中分别分株lml。使用ELS-8000 (Otsuka,日本(Japan))作为测定仪,并为了获得电动电势测定的准确性而在每次进行微生物的测定时,在清洗干净测定仪内的多个细胞后,反复测定2次。

[0067]作为与渗透性相比较来掌握细胞壁变化的特性的方法,利用了电动电势。若电动电势的绝对值变小,则微生物的细胞壁呈现出亲水性。

[0068]图7及图8为表示本发明实施例的变异菌株的特征即使在进行100代及200代后也得到维持的试验结果的图。

[0069]如图7及图8所示,呈现出作为微生物的醋酸钙不动杆菌(AC)、肺炎克雷伯氏菌(KP)及生癌肠杆菌(EC)和以相应的微生物的细胞壁呈现出亲水性的方式发生变异的变异菌株的特征即使在100代及200代后也得到维持的试验结果,在此,可以对菌株和变异菌株的电动电势值进行比较。

[0070] 在醋酸钙不动杆菌(AC)的情况下,电动电势绝对值的增加幅度小,且在误差范围内发生变化。相反,在肺炎克雷伯氏菌(KP)或生癌肠杆菌(EC)的情况下,可知变异菌株的电动电势绝对值明显减少。可知引导化学变异,使得细胞壁的特性变化为亲水性。

[0071] 在生癌肠杆菌(EC)的情况下,与相对不同的两个菌株(肺炎克雷伯氏菌(KP)及生癌肠杆菌(EC))相比,菌株的渗透性高,这是因为生癌肠杆菌(EC)的细胞壁的特性为原来的亲水性。由于这种特性,可知生癌肠杆菌(EC)即使引诱变异,细胞壁的特性变化也不大。即,以化学性的方式发生变化的多个菌株的土壤内渗透性可以增进,而即使在100代、200代后,引诱化学变化来使细胞壁的特性变化为亲水性的微生物的特征依旧得到维持。

[0072] 第三,对土壤移动性增进微生物的油类分解性(TPH)的说明如下。

[0073] 一边为了增进土壤渗透性而变化微生物的细胞壁,一边为了掌握是否对微生物的油类分解性产生影响,以与上述的方法相同的方式测定了微生物的油类分解性。

[0074]图9至图11为表示本发明实施例的原菌株和细胞壁的特性发生变化的微生物的油类碳化氢的分解率的图。在此,图9示出作为原菌株的醋酸钙不动杆菌(AC)和细胞壁的特性发生变化的微生物(AC M2)(即,利用12.5μ1的丽S来使醋酸钙不动杆菌(AC)发生变换的菌株)的油类碳化氢的分解率,图10示出作为原菌株的肺炎克雷伯氏菌(KP)和细胞壁的特性发生变化的微生物(KP M2 (即,利用6.25μ1的MMS来使肺炎克雷伯氏菌(KP)发生变换的菌株)、ΚΡ M2 (S卩,利用12.5μ1的MMS来使肺炎克雷伯氏菌(KP)发生变换的菌株))的油类碳化氢的分解率,图11示出作为原菌株的生癌肠杆菌(EC)和细胞壁的特性发生变化的微生物(EC Ml (S卩,利用6.25μ1的MMS来使生癌肠杆菌(EC)发生变换的菌株)、EC M2 (S卩,利用12.5μI的MMS来使生癌肠杆菌(EC)发生变换的菌株))的油类碳化氢的分解率。

[0075] 在执行上述的步骤S106后,可以确认使原菌株和细胞壁发生变化的多个微生物在进行100代或200代的传代培养(generat1n)后,细胞壁的特性是否得到维持(步骤S107)。在此,在整体上,与原菌株相比,呈现出±10%左右的分解性,而对于使原菌株和细胞壁发生变化的多个微生物进行100代或200代的传代培养的多个微生物而言,传代培养期间变得越长,油类分解性越减少,这被判断为使用LB培养基的持续的传代培养而呈现出引诱(inducing)微生物内油类分解性途径的代谢所参与的酶的效果。

[0076] 在执行上述步骤S107后,能够以预设的比率(例如,1: 1: 2:2:1:1:1、1: 1:3:3:3:1:1等)混合上述的微生物来实施剂型化(步骤S108)。

[0077]具有上述构成的混合微生物制剂及其制造方法,利用微生物制剂对被复合污染物质的油类污染的土壤进行复原的过程中,有利于将对生态环境产生的影响最小化,尤其,可以对被具有广范围的分子量和多种分子结构且包含直链型碳化氢或脂肪族、芳香族碳化氢的复合污染物质的油类进行综合分解。

[0078] 本发明提供,与地下处理之类的原位(in-situ)处理工序、土壤耕作之类的离位(ex-situ)处理工序等不同工序的特性相匹配地,具有差别化的油类分解功效的混合物生物制剂,从而具有对油类污染土壤实现最优化,并可以实现综合性复原的效果。且本发明提供,在具有广泛的油类分解能力,并需要优秀的土壤渗透性的油类污染土壤进行地下处理的情况下,也长时间有效的油类污染土壤复原用微生物制剂,从而不仅可以综合性地具有油类分解能力,而且可以喷洒于广泛的污染区域或向地下注入,可以在广泛的污染区域有效地适用原位处理工序,尤其,在复原由海洋油类泄漏事故引起的附近区域的土地或工业园区区域等广泛的油类污染区域的土壤方面非常有效。

[0079]以上虽然对本发明的实施例进行了详细说明,但本发明的保护范围不限于此,利用发明要求保护范围所定义的本发明的基本概念的普通技术人员的多种变形及改良形态也同样属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.混合微生物制剂,其特征在于,以1:1: 2: 2:1:1:1的比率混合醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株来制造而成。
2.混合微生物制剂,其特征在于,以1:1: 3: 3:3:1:1的比率混合醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株来制造而成。
3.混合微生物制剂的制造方法,其特征在于,包括: 在污染土壤中稀释醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株作为微生物,并调节水分来进行添加的步骤; 使智能型混凝试验搅拌机完全封闭,并测定上述生化需氧量微生物的芳香族碳化氢分解率的步骤; 测定土壤内残留油类碳化氢的量来计算出土壤内油类碳化氢的分解率的步骤; 实施细菌粘附烃测试,来测定上述微生物的亲水性的步骤; 利用甲磺酸甲酯来执行上述微生物的细胞壁组成变化的步骤; 执行电动电势测定来确认上述微生物的土壤内移动性的步骤; 确认即使在使改变原菌株和细胞壁的多个微生物传代培养100代或200代后,细胞壁的特性是否得到维持的步骤; 以及以1:1:2:2:1:1:1的比率混合上述微生物,并实现剂型化的步骤。
4.混合微生物制剂的制造方法,特征在于包括: 在污染土壤中稀释醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、生癌肠杆菌、施氏假单胞菌、红串红球菌、恶臭假单胞菌等6种菌株以及红球菌属、不动杆菌属、大头茶属、鞘氨醇杆菌属、荚膜黄杆菌、不动杆菌属、黄单胞菌属中的I种菌株作为微生物,并调节水分来进行添加的步骤; 使生化需氧量智能型混凝试验搅拌机完全封闭,并测定上述微生物的芳香族碳化氢分解率的步骤; 测定土壤内油类碳化氢残留的量来计算出土壤内的油类碳化氢分解率的步骤; 实施细菌粘附烃测试来测定上述微生物的亲水性的步骤; 利用甲磺酸甲酯来执行上述微生物的细胞壁组成变化的步骤; 执行电动电势测定来确认上述微生物的土壤内移动性的步骤; 确认即使在使改变原菌株和细胞壁的多个微生物传代培养100代或200代后,细胞壁的特性是否得到维持的步骤; 以及以1:1:3:3:3:1:1的比率混合上述微生物,并实现剂型化的步骤。
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