CN114317378B - 一株烷烃降解功能菌xp4-7及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株烷烃降解功能菌XP4‑7及其应用。该菌株为副球菌(Paracoccus sp.)XP4‑7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.22994，保藏日期为2021年07月30日。实验证明菌株XP4‑7对烷烃具有优良的降解能力，对石油和柴油中总烷烃的降解率分别为48％和62％，可广泛用于烷烃降解及石油污染的修复，如石油污染的海洋水体修复等。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株烷烃降解功能菌XP4-7及其应用。
背景技术
目前，海洋污染日趋加剧，石油作为全球性海洋污染物，已成为海洋污染的主要类型，对海洋生态环境造成了极大破坏；世界各国所需石油70％需经海路运输，大型油轮失事以后，石油部分或全部流入海洋，从而造成严重的海洋石油污染，直接或间接影响着人类的生存和可持续发展；人类逐渐认识到海洋资源是本世纪实现可持续发展的主要资源。
治理海洋石油污染的关键在于如何有效处理溢油污染，常用的海洋石油污染治理方法有物理处理法、化学处理法和生物修复法。与化学、物理处理法相比，生物修复对人和环境造成的影响最小，成本最低，因此，生物修复法以成本低、无二次污染的优势成为当下治理海洋石油污染最有前途的治理手段。海洋中存在大量能够降解石油烃的微生物资源。而且，与其他生态环境相比较，海洋中降解烷烃微生物种类有很大不同。据目前报道，能够降解石油烃的海洋微生物有200多种，分属于70个属，其中细菌40个属，包括弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)和气单胞菌属(Aeromonas)等。
近年来，石油烃降解菌主要分离自沿海和陆地等污染区域，对于开放海域石油烃降解微生物的研究相对较少。海底冷泉区天然气水合物分解后产生的一些流体组分在海底表面溢出，由于溢出的流体富含甲烷、硫化氢、二氧化碳和石油烃等组分，给一些微生物(细菌和古菌)提供丰富的养分。烷烃是石油的重要组成成分，因此，开发深海冷泉区来源高效降解烷烃的菌株，对于海洋石油污染修复具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株具有烷烃降解功能的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7。
本发明的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7，已于2021年07月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为：CGMCC No.22994。所述副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7来源于南海海马冷泉区海底沉积物，以石油和柴油为唯一碳源进行多次人工富集培养、分离纯化后获得。该菌株为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7，在MA培养基上28℃生长3天，菌落呈圆形，胡萝卜色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中间凸起，直径1～2mm，最适合生长条件为：pH 7～9。
本发明的第二个目的是提供所述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7在降解石油和/或柴油污染物中的应用。进一步的，所述的石油和/或柴油污染物为烷烃。
实验证明，副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7可高效降解烷烃类化合物。在人工海水培养基(MMC)中分别加入石油或柴油为唯一碳源，接种该菌株后在28℃条件下培养20天，对石油和柴油中总烷烃的降解率分别为48％和62％。
本发明的第三个目的是提供所述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7在制备降解烷烃的微生物菌剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种降解烷烃的微生物菌剂，该菌剂含有上述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7作为主要活性成分。
本发明的第五个目的是提供上述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7和上述的微生物菌剂在烷烃污染环境的生物修复中的应用。进一步的，所述的烷烃污染环境包括烷烃污染水体和/或土壤。
进一步，所述的烷烃包括C10-C35烷烃。
本发明的第六个目的是提供一种降解烷烃的方法，该方法是将上述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7或上述的微生物菌剂接种至含烷烃的体系中进行培养，以实现烷烃的降解。
本发明具备的有益效果：
本发明提供了一种具有烷烃降解功能的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7，该菌株XP4-7对烷烃具有优良的降解能力，对石油和柴油中总烷烃的降解率分别为48％和62％，可广泛用于烷烃降解及石油污染的修复，如石油污染的海洋水体修复等。
本发明的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101；其保藏编号为：CGMCC No.22994。
附图说明
图1为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7在MA培养基上的菌落形态。
图2为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7的16S rRNA系统进化发育树。
图3为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7对石油中烷烃的降解率。
图4为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7对柴油中烷烃的降解率。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1、副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株的筛选鉴定
配制人工海水培养基(MMC)：称取氯化钠24g，七水合硫酸镁7g，硝酸铵1g，氯化钾0.7g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢钠3g，溶于1000mL超纯水，调pH 7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，灭菌后补加适量微量元素混合液和七水合硫酸镁溶液；微量元素混合液：称取氯化钙2g，六水合氯化铁50mg，硫酸铜0.5mg，四水合氯化镁0.5mg，七水合硫酸锌10mg，溶于1000mL超纯水，微量元素混合液经0.22μm滤膜过滤除菌；七水合硫酸镁溶液：称取35g七水合硫酸镁，定容至100mL超纯水中，121℃灭菌20min。
油降解菌群富集培养：在人工海水养基中加入终浓度为1g/L石油和柴油混合物(1:1质量比)配制成富集培养基。将采集于南海海马冷泉海底沉积物样品1～2g加入到富集培养基中，于28℃、150rpm恒温摇床中避光培养7天；移取5mL第一次富集培养液接种至新鲜的人工海水培养基中，在相同的条件下进行第二次富集培养；如此，重复转接共进行3次富集培养。
细菌的分离和纯化：取第三次富集培养后的培养液进行10倍梯度稀释，在MA平板上涂布，置于28℃恒温培养箱中培养3～7天左右，待长出菌落后，在超净台内从平板上挑取形态迥异的单菌落，在MA平板上多次划线纯化，获得分离纯化的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7。
细菌的鉴定：提取副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株DNA，利用27F/1492R通用引物即27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增16SrRNA基因片段并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。对16S rRNA基因序列在EzBiocloud网站上进行比对，发现其与Paracoccus sp.DSL-16菌株相似性最高，相似度为97.70％。利用系统发育分析软件MEGA7.0构建进化树，所述的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7的16S rRNA的系统进化发育树见图2。结果表明，本发明的菌株XP4-7属于Paracoccus属，将其命名为副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7，该菌于2021年07月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101；保藏编号：CGMCC No.22994。
实施例2、副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株形态特征
将单菌落划线接种于MA平板培养基上，28℃条件下培养3天。副球菌(Paracoccussp.)XP4-7菌落在MA平板上菌落呈圆形，胡萝卜色不透明，表面光滑湿润，边缘规则，无晕环，中间凸起，直径1～2mm。参见图1。
实施例3、副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株降解烷烃能力的测定
配制人工海水培养基(MMC)，在121℃高温灭菌20min，分装于40mL玻璃瓶中，每瓶10mL，分别加入终浓度为10g/L的石油和柴油，在28℃，150rpm、无光条件下培养20天，通过气质联用色谱仪(GC-MS)对培养物前和培养后残余的烷烃进行测定。结果显示，副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株对石油和柴油中总烷烃的降解率分别为48％和62％，对石油中正十烷烃～正三十五烷烃降解率分别为0.9％，0.9％，16.0％，75.0％，70.8％，82.1％，85.1％，83.4％，93.8％，92.2％，79.9％，63.3％，82.8％，85.3％，78.2％，71.6％，77.3％，80.0％，84.9％，80.4％，72.7％，74.9％，73.6％，73.8％，53.3％，43.2％，对柴油中正十一烷烃～正三十五烷烃降解率分别为0.2％，13.0％，45.9％，66.6％，80.2％，83.1％，74.1％，85.3％，80.8％，82.3％，83.9％，86.1％，83.2％，79.1％，72.4％，75.8％，71.1％，64.0％，76.4％，72.7％，73.4％，4.5％，10.7％，2.2％，16.2％。参见图3和图4。上述结果表明，本发明保藏的副球菌(Paracoccus sp.)XP4-7菌株对烷烃具有优良的降解能力，可广泛用于烷烃降解及石油污染的修复，如石油污染的海洋水体修复等。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株烷烃降解功能菌XP4-7及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1320
<212> DNA
<213> 副球菌XP4-7(Paracoccus sp.XP4-7)
<400> 1
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taatggccta ccaagccgac gatccatagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg 240
actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttag acaatggggg 300
caaccctgat ctagccatgc cgcgtgagtg atgaaggcct tagggttgta aagctctttc 360
agctgggaag ataatgacgg taccagcaga agaagccccg gctaactccg tgccagcagc 420
cgcggtaata cggagggggc tagcgttgtt cggaattact gggcgtaaag cgcacgtagg 480
cggactggaa agttgggggt kraatcccgg ggctcaaccc cggaactgcc ttcaaaacta 540
tcagtctgga gttcgagaga ggtgagtgga attccgagtg tagaggtgaa attcgtagat 600
attcggagga acaccagtgg cgaaggcggc tcactggctc gatactgacg ctgaggtgcg 660
aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgaatg 720
ccagtcgtcg ggttgcatgc aattcggtga cacacctaac ggattaagca ttccgcctgg 780
ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 840
gcatgtggtt taattcgaag caacgcgcag aaccttacca acccttgaca tggcaggacc 900
gctggagaga ttcagctttc tcgtaagaga cctgcacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 960
agctcgtgtc gtgagatgtt cggttaagtc cggcaacgag cgcaacccac gtccctagtt 1020
gccagtattc agttgggcac tctatggaaa ctgccggtga taagccggag gaaggtgtgg 1080
atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg 1140
acagtgggtt aatccccaaa agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca 1200
tgaagttgga atcgctagta atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1260
ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag ttgggtctac ccgacggccg tgcgctaacc 1320
Claims (7)
1.副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7，其保藏编号为：CGMCC No. 22994。
2.权利要求1所述的副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7在降解烷烃中的应用，所述的烷烃为C12-C35烷烃。
3.权利要求1所述的副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7在制备降解烷烃的微生物菌剂中的应用，所述的烷烃为C12-C35烷烃。
4.一种降解烷烃的微生物菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7作为主要活性成分。
5.权利要求1所述的副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7和权利要求4所述的微生物菌剂在烷烃污染环境的生物修复中的应用，所述的烷烃为C12-C35烷烃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的烷烃污染环境包括烷烃污染水体和/或土壤。
7.一种降解烷烃的方法，其特征在于，将权利要求1所述的副球菌（Paracoccus sp.）XP4-7或权利要求4所述的微生物菌剂接种至含烷烃的体系中进行培养，以实现烷烃的降解，所述的烷烃为C12-C35烷烃。
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| EP2607479A1 (en) * | 2011-12-22 | 2013-06-26 | Evonik Industries AG | Biotechnological production of alcohols and derivatives thereof |
| JP2014023489A (ja) * | 2012-07-27 | 2014-02-06 | Sumitomo Heavy Ind Ltd | パラコッカス属細菌 |
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