CN113773998B - 一种PCBs复合降解菌剂及其应用 - Google Patents

一种PCBs复合降解菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种PCBs复合降解菌剂，该复合降解菌剂以寡养单胞菌为核心，配以嗜麦芽窄食单胞菌，通过复配两种菌以协同提高PCBs的降解率，24小时对四氯联苯的降解率可达到97.33％，用于高效修复PCBs污染水体和土壤；且本发明丰富了PCBs降解菌的资源库，为PCBs污染的治理提供了一种生物修复方案。

Description

一种PCBs复合降解菌剂及其应用
技术领域
本发明属于环境污染修复技术领域，更具体地，涉及一种PCBs复合降解菌剂及其应用。
背景技术
多氯联苯PCBs是最具有代表性的持久性有机污染物之一，一旦泄漏到环境中，难以彻底清除，可通过食物链富集进入鱼和其他动物及人体内，引起“三致”毒性。传统的PCBs污染修复方法主要是利用物理和化学方法修复已被多氯联苯污染的土壤。化学方法常用的是高温焚烧法和化学法，但高温焚烧法条件苛刻，易造成二次污染，且成本高、设备复杂；化学法工艺复杂、处理效率低；物理方法主要包括填埋封存法、热处理法、超声波法、溶解洗脱和表面活性刹洗脱法、物理吸附法等，其中填埋封存法运用较为普遍，但是安全隐患依然存在，不能从根本上解决污染问题。
近年来生物修复因其低成本、低能耗、对环境负面影响较小等优点已经成为主流。微生物修复法可以弥补物理、化学修复技术的不足，利用多氯联苯降解菌以多氯联苯为碳源及能源的特性，达到消除污染、恢复生态平衡的目的是一种绿色经济、富有前景的PCBs修复技术，如专利CN201410041265.6提供了一种多氯联苯降解菌的筛选方法及一株多氯联苯降解菌、专利CN201910419157.0提供了Ralstonia pickettii M1菌株及其在降解菲和联苯中的应用。但单一菌种降解多氯联苯PCBs的方法也存在一定的局限，如对底物降解有要求，降解效率低、周期长等。
因此，为满足多环境介质中PCBs风险的消减和污染修复的迫切需求，复配多种菌以协同提高PCBs污染点的生物强化修复效率是目前的趋势。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种PCBs复合降解菌剂，通过复配两种菌实现协同提高PCBs降解率，以高效修复PCBs污染的水体和土壤的目的。
本发明的首要目的是提供一株寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌株。
本发明的第二个目的是提供一种包含寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6的PCBs复合降解菌剂。
本发明的第三个目的是提供一种包含上述PCBs复合降解菌剂的生物降解剂。
本发明的第四个目的是提供上述PCBs复合降解菌剂在修复PCBs污染水体和/或土壤方面的应用。
本发明的第五个目的是提供一种修复PCBs污染水体的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明从湛江红树林沉积物中分离得到寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8，以本土微生物为基础制备的复合降解菌剂，不会破坏生物平衡，不会与自然土壤微生物区系的菌群产生拮抗作用，在受污染的生物群落中存活率高，保证了高生物降解潜力。
本发明提供的寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6在较低的环境温度(10～15℃)下仍可保持较高的活性，其在15℃下对四氯联苯的降解率相对最适温度条件(30℃)仅下降12.27％；且该菌具有广泛的适应性，可在pH为5～10的条件下仍保持较高的活性，具有多环境应用的潜在优势。
因此，本发明首先提供一株寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌株。
所述Stenotrophomonas sp F-6于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61931。
本发明意外发现，将寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8复配用以降解多氯联苯(PCBs)，其降解效果得到显著性地提升，且在低温环境(15℃)中仍具有较高降解性，表明两种菌的联用可协同增强对PCBs的降解效果，高效修复PCBs污染水体和土壤，具有优异的修复PCBs污染环境的能力。
因此，本发明还提供一种PCBs复合降解菌剂，所述复合降解菌剂包含寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌液、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液；
所述Stenotrophomonas maltophilia Z-8于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61930。
所述Stenotrophomonas sp F-6的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述Stenotrophomonas maltophilia Z-8的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明上述PCBs复合降解菌剂是以寡养单胞菌为核心，配以嗜麦芽窄食单胞菌，协同加快PCBs污染物的降解，在24小时内对四氯联苯的降解率达到97.33％；寡养单胞菌配以嗜麦芽窄食单胞菌组成的菌群结构更加稳定，适应性能更强，能更好适应各类PCBs的污染环境，从而大大提高生物降解率，可用于高效修复PCBs污染水体和土壤。
优选地，所述寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌液中活菌数为8.62×108～9.47×108cfu/mL；所述嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液中活菌数为3.97×108～5.12×108cfu/mL；所述Stenotrophomonas sp F-6菌液和Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液的体积比为5～7：1。
在本发明最优选的实施例中，所述寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌液中活菌数为9.27×108cfu/mL；所述嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液中活菌数为4.17×108cfu/mL；所述寡养单胞菌菌液和嗜麦芽窄食单胞菌菌液的体积比为6：1。
本发明还提供上述复合降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌液的制备
从-80℃冰箱取出保存的菌液200μL，于锥形瓶中加入10ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养16h，使菌液复性生长；取复性后菌液100μL加入20ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养12～16h。
(2)嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液的制备
从-80℃冰箱取出保存的菌液200μL，于锥形瓶中加入10ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养16h，使菌液复性生长；取复性后菌液100μL加入20ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养12～16h。
(3)将寡养单胞菌菌液和嗜麦芽窄食单胞菌菌液混合即得到所述复合降解菌剂。
本发明还提供一种生物降解剂，包含上述复合降解菌剂。
此外，上述复合降解菌剂在修复PCBs污染水体和/或土壤方面的应用也应在本发明的保护范围内。
优选地，所述PCBs包括三氯联苯、四氯联苯。
最后，本发明还提供一种修复PCBs污染水体的方法，是将上述复合降解菌剂投加到PCBs污染水体中修复16～24小时，最优选为24小时。
进一步地，所述PCBs污染水体中PCBs的浓度为18～20mg/L，最优选为20mg/L；所述复合降解菌剂与PCBs污染水的体积比为1～3：100，最优选为1：100。
本发明具有以下有益效果：
本发明供的PCBs降解菌剂，通过复配两种菌可协同提高PCBs降解率，24小时对四氯联苯的降解率可达到97.33％，适用于PCBs污染水体和土壤的高效生物修复。
本发明丰富了PCBs降解菌的资源库，为治理PCBs污染提供了一种新型、高效的生物防治方案，在降解PCBs或制备PCBs降解菌剂用于生态修复多氯联苯污染方面具有实际应用价值。
附图说明
图1为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6革兰氏染色图；
图2为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌落图；
图3为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6在半固体培养基中培养照片；
图4为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6的系统发育树；
图5为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6的同源性分析结果；
图6为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8革兰氏染色图；
图7为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌落图；
图8为嗜麦芽窄食单胞菌在半固体培养基中培养照片；
图9为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8的系统发育树；
图10为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8的同源性分析结果；
图11为两株菌在不同温度、不同pH下的生长曲线图；
图12为复合降解菌剂3、寡养单胞菌菌液、嗜麦芽窄食单胞菌菌液各自降解四氯联苯后的气象图谱。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1菌株的鉴定和保藏
本实验所用寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8是取湛江红树林沉积物，分离后得到。
一、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌株的鉴定和保藏
1、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌株的形态观察及生理生化实验
(1)实验方法
在LB板上进行三区域划线法观察菌株生长特点；革兰氏染色法进行菌株染色；使用非发酵细菌生化编码鉴定管070150，鉴定菌株生化特性；使用半固体培养基，观察菌株的运动性。
(2)结果
1)对寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6进行革兰氏染色，染色后其镜检图(1000X)见图1所示，确定其为革兰氏阴性细菌。
2)对寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6在LB琼脂培养基上培养，可以观察到其菌落呈现白色，圆形，见图2所示。
3)对寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6在半固体培养基中培养，见图3所示，可观察到此菌株在半固体培养基上可沿斜面生长，具有运动性。
4)使用非发酵细菌生化编码鉴定管070150，鉴定菌株生化特性
表1
Figure BDA0003295750450000051
Figure BDA0003295750450000061
结果如表1所示，表明Stenotrophomonas sp F-6可利用葡萄糖作为碳源生长；具有的脱羧酶有：鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶；具有细胞色素C、明胶酶，可分解/利用西蒙氏柠檬酸盐、七叶苷；可产生β-半乳糖苷；具有还原硝酸盐的能力。
2、菌株的16SrDNA分子生物学鉴定
(1)鉴定方法
采用TIANam细菌DNA试剂盒提取菌株基因组DNA。利用特异性引物：
Forward:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
Reverse:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
从基因组DNA中扩增出16S rDNA片段。PCR：加入Ex-taq聚合酶混合。94℃预变性5min；94℃30S，54℃30S，72℃2min，32个循环，72℃8min。PCR产物连接上载体pMD18-T(TaKaRa，大连，中国)后转换感受态细胞DH5α。测得序列定并在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih)BLAST进行比对。利用MEGA6软件构建系统发育树。
(2)鉴定结果
Stenotrophomonas sp F-6的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，系统发育树如图4所示，其同源性分析结果见图5，Stenotrophomonas sp F-6与Stenotrophomonassp.I_37-G5PA9B和Stenotrophomonas sp.PMIK-2菌株同源性分别高达99.4％和98.2％，同属寡养单胞菌属。因此本发明筛选获得的降解菌鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)。
SEQ ID NO:1：
ACGGCAGCACAGGAGAGCTTGCTCTCTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAATGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACATTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACC
因此综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列，可以得出该菌株为寡养单胞菌，将该菌株命名为寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6。
3、菌株保藏
该寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61931，保藏地址为：广州市先烈中路100号。
二、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌株的鉴定和保藏
1、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌株的形态观察及生理生化实验
(1)实验方法
在LB板上进行三区域划线法观察菌株生长特点；革兰氏染色法进行菌株染色；使用非发酵细菌生化编码鉴定管070150，鉴定菌株生化特性；使用半固体培养基，观察菌株运动性。
(2)结果
1)对嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8进行革兰氏染色，染色结果见图6，确定其为革兰氏阴性细菌，呈杆状。
2)Stenotrophomonas maltophilia Z-8在LB琼脂培养基上其菌落呈现白色，圆形，见图7所示。
3)使用非发酵细菌生化编码鉴定管070150，鉴定菌株生化特性
表2
Figure BDA0003295750450000081
Figure BDA0003295750450000091
从表2的结果可以看到，该菌可利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖；具有的脱羧酶有：鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶；具有尿素分解酶、细胞色素C(氧化酶)，可分解/利用西蒙氏柠檬酸盐、七叶苷；可产生β-半乳糖苷；具有分解葡萄糖产醇的能力。
4)半固体培养基观察，见图8，观察发现此菌株具有运动性。
2、菌株的16SrDNA分子生物学鉴定
(1)鉴定方法
采用TIANam细菌DNA试剂盒提取菌株基因组DNA。利用特异性引物：
Forward:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
Reverse:5'-TACCTTGTTACGACT-3'。
从基因组DNA中扩增出16S rDNA片段。PCR：加入Ex-taq聚合酶混合。94℃预变性5min；94℃30S，54℃30S，72℃2min，32个循环，72℃8min。PCR产物连接上载体pMD18-T(TaKaRa，大连，中国)后转换感受态细胞DH5α。测得序列定并在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih)BLAST进行比对。利用MEGA6软件构建系统发育树。
(2)鉴定结果
Stenotrophomonas maltophilia Z-8的16s rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其系统发育树见图9所示，其同源性分析结果见图10，结果表明Stenotrophomonasmaltophilia Z-8与Stenotrophomonas maltophilia JCM 20151菌株同源性高达99.9％，同属嗜麦芽窄食单胞菌。
SEQ ID NO:2：
ACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATACATCGGAATCTACTCTGTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCGATTGAATGAGCCGATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAGAAATCCAGCTGGCTAATACCCGGTTGGGATGACGGTACCCAAAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCA
因此，综合菌体形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列及同源性分析结果，可以得出该菌株为嗜麦芽窄食单胞菌。因此，将该菌株命名为嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8。
3、菌株保藏
该嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61930，保藏地址为：广州市先烈中路100号。
实施例2寡养单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌在不同pH下的生长曲线
1、实验方法
将寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6和嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia Z-8分别置于pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，温度为30℃；以及温度为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，pH为7的LB培养液中培养36h，每隔12h测一次菌液的OD600，绘制生长曲线。
2、实验结果
两株菌在不同温度、不同pH下生长12h、24h、36h的OD600值如图11所示，图11中F代表寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌株，Z代表嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia Z-8菌株，从图11可以看出，两株菌在酸性环境中会分泌碱性物质调节自身生存环境pH，可在pH为5～10下仍保持较高的活性，且能适应的温度变化范大，具有很好的环境适应性，具备多环境应用的潜在优势。
实施例3多氯联苯降解实验
1、实验方法
(1)寡养单胞菌Stenotrophomonas sp F-6菌液的制备
从-80℃冰箱取出保存的菌液200μL，于锥形瓶中加入10ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养16h，使菌液复性生长。取复性后菌液100μL加入20ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养12h，测得寡养单胞菌Stenotrophomonas spF-6菌液中活菌数为9.27×108cfu/mL。
(2)嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液的制备
从-80℃冰箱取出保存的菌液200μL，于锥形瓶中加入10ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养16h，使菌液复性生长。取复性后菌液100μL加入20ml LB肉汤培养基，于恒温摇床上30℃，180rap/min，培养12h，测得嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonas maltophilia Z-8菌液中活菌数为4.17×108cfu/mL。
(3)将寡养单胞菌菌液和嗜麦芽窄食单胞菌菌液按照表3的体积份配比制备不同的复合降解菌剂。
表3
体积份 寡养单胞菌菌液 嗜麦芽窄食单胞菌菌液
复合降解菌剂1 4 1
复合降解菌剂2 5 1
复合降解菌剂3 6 1
复合降解菌剂4 7 1
复合降解菌剂5 8 1
(4)降解性能测定
1)取(3)中制备的各组复合降解菌剂1mL，分别加入到100mL含四氯联苯浓度为20mg/L的降解体系中(1％肉汤培养基，99％MM30液体培养基)，分别置于30℃和15℃中静置24小时。以单独的寡养单胞菌菌液和嗜麦芽窄食单胞菌菌液各1mL作为对比。
其中，MM30液体培养基的组成见表4所示。
表4
Figure BDA0003295750450000131
其中，微量金属盐溶液(g/100mL)：EDTA 0.5，CaCO3 1，FeSO4·H2O 0.5，MgSO4·7H2O 10，MnSO4·H2O10，Mixture44 10mL。
Mixture44溶液(mg/100mL)：Na2B4O7·10H2O 17.7，CuSO4·5H2O 39.2，CaCl2·6H2O20.1，ZnSO4·7H2O 10.95，EDTA 250，加入100-150μL浓H2SO4，以防止产生沉淀。
2)降解率的计算公式为：
Figure BDA0003295750450000132
其中，X为降解率并以百分比表示，C0为起始浓度，Ct为反应时间24小时的残留浓度。
2、实验结果
各菌液的降解率结果如表5所示。
表5
Figure BDA0003295750450000133
Figure BDA0003295750450000141
其中，复合降解菌剂3、寡养单胞菌菌液、嗜麦芽窄食单胞菌菌液在30℃时，各自降解四氯联苯后的气象图谱结果见图12。
由上表5可知，本发明提供的寡养单胞菌在较低的环境温度(15℃)下仍保持较高的活性，降解率相对最适温度(30℃)条件下的仅下降12.27％，具有在不同环境温度下应用的潜在优势。
在PCBs染水体的修复中，单独的寡养单胞菌和嗜麦芽窄食单胞菌本身具有一定的降解PCBs的能力，而将其制成复合菌剂，两种菌在30℃下协同降解PCBs，大大提高了PCBs降解率，对四氯联苯的降解率达到97.33％，且在低温环境(15℃)中仍具有较高降解性，具备在多环境下修复PCBs污染的应用潜力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种PCBs复合降解菌剂及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1368
<212> DNA
<213> 寡养单胞菌 F-6(Stenotrophomonas sp F-6)
<400> 1
acggcagcac aggagagctt gctctctggg tggcgagtgg cggacgggtg aggaatacat 60
cggaatctac tttttcgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac cgcatacgac 120
ctacgggtga aagcagggga tcttcggacc ttgcgcgatt gaatgagccg atgtcggatt 180
agctagttgg cggggtaaag gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc tgagaggatg 240
atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc cataccgcgt gggtgaagaa ggccttcggg 360
ttgtaaagcc cttttgttgg gaaagaaatc cagctggcta atacccggtt gggatgacgg 420
tacccaaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc 480
aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg tggtcgttta agtccgttgt 540
gaaagccctg ggctcaacct gggaactgca gtggatactg ggcgactaga atgtggtaga 600
gggtagcgga attcctggtg tagcagtgaa atgcgtagag atcaggagga acatccatgg 660
cgaaggcagc tacctggacc aacattgaca ctgaggcacg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgcgaa ctggatgttg ggtgcaattt 780
ggcacgcagt atcgaagcta acgcgttaag ttcgccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 840
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg tttaattcga 900
tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgtcgaga actttccaga gatggattgg 960
tgccttcggg aactcgaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg 1080
gaactctaag gagaccgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140
atggccctta cggccagggc tacacacgta ctacaatggt agggacagag ggctgcaagc 1200
cggcgacggt aagccaatcc cagaaaccct atctcagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1260
actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc 1320
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt gttgcacc 1368
<210> 2
<211> 1366
<212> DNA
<213> 嗜麦芽窄食单胞菌 Z-8(Stenotrophomonas maltophilia Z-8)
<400> 2
acggcagcac agaggagctt gctccttggg tggcgagtgg cggacgggtg aggaatacat 60
cggaatctac tctgtcgtgg gggataacgt agggaaactt acgctaatac cgcatacgac 120
ctacgggtga aagcagggga tcttcggacc ttgcgcgatt gaatgagccg atgtcggatt 180
agctagttgg cggggtaaag gcccaccaag gcgacgatcc gtagctggtc tgagaggatg 240
atcagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc cataccgcgt gggtgaagaa ggccttcggg 360
ttgtaaagcc cttttgttgg gaaagaaatc cagctggcta atacccggtt gggatgacgg 420
tacccaaaga ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc 480
aagcgttact cggaattact gggcgtaaag cgtgcgtagg tggtcgttta agtccgttgt 540
gaaagccctg ggctcaacct gggaactgca gtggatactg ggcgactaga gtgtggtaga 600
gggtagcgga attcctggtg tagcagtgaa atgcgtagag atcaggagga acatccatgg 660
cgaaggcagc tacctggacc aacactgaca ctgaggcacg aaagcgtggg gagcaaacag 720
gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgcgaa ctggatgttg ggtgcaattt 780
ggcacgcagt atcgaagcta acgcgttaag ttcgccgcct ggggagtacg gtcgcaagac 840
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagtatgtgg tttaattcga 900
tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgtcgaga actttccaga gatggattgg 960
tgccttcggg aactcgaaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020
ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtccttag ttgccagcac gtaatggtgg 1080
gaactctaag gagaccgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140
atggccctta cggccagggc tacacacgta ctacaatggt agggacagag ggctgcaagc 1200
cggcgacggt aagccaatcc cagaaaccct atctcagtcc ggattggagt ctgcaactcg 1260
actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc 1320
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttt gttgca 1366

Claims (9)

1. 一株寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp）F-6菌株，其特征在于，所述寡养单胞菌F-6菌株于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61931。
2.一种PCBs复合降解菌剂，其特征在于，所述复合降解菌剂由寡养单胞菌F-6菌液和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）Z-8菌液组成；
所述寡养单胞菌F-6菌液含有权利要求1所述寡养单胞菌F-6菌株；
所述嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌液中，嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌株于2021年9月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61930。
3. 根据权利要求2所述复合降解菌剂，其特征在于，所述寡养单胞菌F-6菌株的16srDNA的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌株的16srDNA的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
4.根据权利要求2或3所述复合降解菌剂，其特征在于，所述寡养单胞菌F-6菌液中活菌数为8.62×108～9.47×108cfu/mL；所述嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌液中活菌数为3.97×108～5.12×108cfu/mL；所述寡养单胞菌F-6菌液和嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌液的体积比为5～7：1。
5.根据权利要求4所述复合降解菌剂，其特征在于，所述寡养单胞菌F-6菌液中活菌数为9.27×108cfu/mL；所述嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌液中活菌数为4.17×108cfu/mL；所述寡养单胞菌F-6菌液和嗜麦芽窄食单胞菌Z-8菌液的体积比为6：1。
6.一种生物降解剂，其特征在于，包含权利要求2～5任一所述复合降解菌剂。
7.权利要求2～5任一所述复合降解菌剂在修复PCBs污染水体和/或土壤方面的应用，其特征在于，所述PCBs为四氯联苯。
8.一种修复PCBs污染水体的方法，其特征在于，是将权利要求2～5任一所述复合降解菌剂投加到PCBs污染水体中修复16～24小时；所述PCBs为四氯联苯。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述PCBs污染水体中PCBs的浓度为18～20mg/L；所述复合降解菌剂与PCBs污染水的体积比为1～3：100。
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