JP2014183742A - ポリ塩化ビフェニル類無害化複合組成物ならびにその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ポリ塩化ビフェニル類に汚染した廃棄物として大量(大容量)に存在する比較的低濃度のＰＣＢｓを効率的に分解処理又は無害化処理するための微生物を複合化させた組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】コマモナス属に属し、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの主菌株と、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択され、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの補菌株とをそれぞれ培養し、前記各培養液から回収した少なくとも２種類の菌体を混合する。
【選択図】図２

Description

本発明は、ポリ塩化ビフェニル類（以下、「ＰＣＢｓ」と称する場合がある。）を分解する特性の異なる複数の微生物を配合することで複合化させ、より効率的にポリ塩化ビフェニル類を分解する組成物及びその製造方法等に関する。より詳細には、コマモナス属に属する微生物に、シュードモナス属やロドコッカス属、アクロモバクター属、ステノトロフォモナス属に属する微生物を加えて複合化させた組成物及びその製造方法、並びに当該組成物を用いることで、ポリ塩化ビフェニル類を効率よく分解する方法等に関する。

ポリ塩化ビフェニル類は、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称をいう。置換塩素の数及び位置によって多くの異性体が存在するが、理論上２０９種類に別れることが知られている。ＰＣＢｓは金属に対して安定で、絶縁性や不燃性、高脂溶性、可塑性等に優れるため、電気製品や熱媒体、絶縁油、可塑剤、塗料及びノンカーボン紙の溶剤など、非常に多岐にわたる製品分野に使用されてきた。しかしながら、生体に対する毒性が高く、臓器や脂肪組織に蓄積しやすく、発癌性があり、それに伴い皮膚障害や内臓障害、ホルモン異常なども引き起こすことから、現在ではその使用が国内のみならず国際的にも禁止されている。ＰＣＢｓは化学的にも安定で、長期間にわたって自然分解することなく残留するため、人体への影響のみならず地球上に存在する様々な生命体にも深刻な影響をもたらすことが大きな問題となっている。

国内でこれまでに輸入・製造販売されたＰＣＢｓは、およそ５５,０００トンと推定される（例えば、非特許文献１）。その使用が禁止された上、使用者に対する保管が義務付けられた後、平成２８年までに無害化する計画が立てられたが、無害化コストが高く、その作業員への暴露被害も認められたことから、計画通りに進んでいないという現状である。また、これまでＰＣＢｓを使用していないとされていた電気機器から、ＰＣＢｓ濃度がこれまでと異なり、電気機器中の絶縁油１キログラム当たり数十ミリグラム程度という微量のＰＣＢｓが検出されるものが大量に存在することが判明した。これらの背景から、平成２４年１２月１２日付けでポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法施行令の一部が改正され、ＰＣＢｓを分解処理する期限が、新たに平成３９年３月３１日と定められた。この微量ＰＣＢｓ汚染油についても、使用あるいは保管に関する正確な数量は把握できていない。一方、最近では、有機顔料に非意図的にＰＣＢｓが副生するという問題が起き、これを製造した者は全て回収しなければならない通達が出た。これらの社会的背景から、今後も継続したＰＣＢｓの分解あるいは無害化の対策が求められていることは明らかである。ＰＣＢｓの分解方法としては、従来からの焼却法に加えて、脱塩素化分解法、水熱酸化分解法、水素供与物質による還元熱化学分解法、紫外線照射法等による光分解法等が知られている。これらのうち、紫外線分解法は、ＰＣＢｓを極性有機溶媒中に溶かして紫外線を照射することにより脱塩素化し、残留するＰＣＢｓを生物処理又は触媒処理等によって無害化するものであり、常温、常圧処理できるため安全性が高く、毒性を有するＰＣＢｓを生命体である微生物が異化することで、その分解物の安全性が高いと想定され、化学処理等に較べて利点がある。

例えば、特許文献１に記載された方法は、最初にＰＣＢｓを紫外線に曝して脱塩素処理を行い、次に大型発酵プラントの微生物で分解に至るものである。しかしながら、この処理法は６０から８０％（ｗ／ｖ）にもなる高濃度なＰＣＢｓで汚染した油を一度に大量処理する点に問題があり、紫外線照射工程に続く微生物処理工程で大量の培地を加えてＰＣＢｓ濃度を調整しなければならず、微生物の培養や増殖とＰＣＢｓ分解とを同時に行わなければならないという困難性があった。

これまでにＰＣＢｓを分解する菌として報告されている微生物は、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）ＫＫＳ１０２株（例えば、特許文献２及び３参照）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）ＴＫ１０２株（非特許文献２）及びロドコッカス・オパカス（Rodococcus opacus）ＴＳＰ２０３株（非特許文献３）などがある。これらの微生物は、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）をはじめとする一連のビフェニル分解に関与する酵素群を発現する。また、これらＰＣＢｓ分解菌を複合発酵法により複合微生物の循環サイクルを起こさせ、難分解性のＰＣＢ・ダイオキシンに対する分解菌、分解酵素を現生、発現させ分解消失処理方法も提案されている（例えば、特許文献４参照）。
しかしながら、これらのＰＣＢｓ分解菌を別々に培養し、個々のポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性を詳細に検討することにより、ＰＣＢｓ分解に最適な組み合わせの複数の微生物を配合した複合微生物製剤は知られていない。

特開２００１−４６５４７号公報 特許第２７０６７１８号公報 特許第２９６７９５０号公報 特開２００４−００９０４６号公報

「２０世紀負の遺産ＰＣＢ」、中日新聞サンデー版、中日新聞社、平成２４年１１月１８日発行 Shimura M. et al, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 81, No. 6, pp.573-576, 1996. Mukerjee-Dhar G., Shimura M., and Kimbara K. Enzyme and Microbial Technology. Vol.23 p34-41 1998. K. Kimbara et.al. Agric. Biol. Chem., 52 (11), 2885-2891, 1988

ＰＣＢｓは、理論上２０９種類に及ぶ多くの異性体が存在する化合物の総称をいい、本発明者らを含め、これまでに多くの研究者らにより単離されたＰＣＢｓ分解菌単独では、一度に多種類のポリ塩化ビフェニル異性体を分解することが困難であることが判った。
そこで本発明は、微生物分類学上で特定される、少なくとも二種以上の微生物を配合、複合化させて用いることで、単独のＰＣＢｓ分解菌ではなし得なかった多種類のＰＣＢｓ異性体群全体の分解率をさらに向上させることを目的とする。

本発明者らは、米沢市内及びその近郊で採取した土壌や試料を用い、ビフェニルを唯一の炭素源とした合成培地でビフェニル分解菌をスクリーニングした結果、コマモナス属をはじめとして、アクロモバクター属、シュードモナス属、ロドコッカス属、ステノトロフォモナス属等の微生物１００株以上を単離した。これら微生物の全てにわたり個々のポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性を調べた結果、微生物の属別に共通の異性体を分解するもの、又はある特定の異性体のみを特徴的に分解するもの等、その特性が明らかとなった。すなわち、ポリ塩化ビフェニル異性体種に対する分解特性の異なる微生物種をそれぞれ複合化させ、人工的に配合した組成物とすることによって、単独の微生物種ではなし得なかった高い分解能力を獲得した新規な組成物を創出できることを見出し、本発明を完成させた。

本発明で用いられる微生物種は、コマモナス属やシュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、ステノトロフォモナス属であり、各々の微生物が、ビフェニルジオキシゲナーゼを含む一連のビフェニル分解酵素群によりビフェニルを資化して（ビフェニルを細胞内で代謝して栄養源として利用する）ポリ塩化ビフェニル類を分解する活性能を有する。但し、一部のステノトロフォモナス属及びアクロモバクター属に、それぞれ属する微生物株においては、機序は判らないが、それぞれ単独ではビフェニルやポリ塩化ビフェニル類の分解活性を示さないが、共生することでビフェニルやポリ塩化ビフェニル類の分解活性を示すものもある。したがって、本発明の１つの側面において、これらの特定の属に属する微生物から選択され、かつビフェニルジオキシゲナーゼ活性を有する少なくとも２種類、あるいはそれ以上のＰＣＢｓ分解菌株をそれぞれ培養し、各培養液から回収した少なくとも２種類、あるいはそれ以上の菌体を混合することを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル分解用組成物の製造方法が提供される。

本発明の１つの実施形態では、主菌株としてコマモナス属に属するＰＣＢｓ分解菌が選択される。また、これと複合化させる補菌株としては、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択される少なくとも１種類、あるいはそれ以上のＰＣＢｓ分解菌である。これら各微生物を、ビフェニルを炭素源として含む培地で通気攪拌培養する工程と、前記各培養液から回収した少なくとも２種類、あるいはそれ以上の菌体を混合する工程とを含む。

複合化する微生物種として好ましいのは、前記のコマモナス属ではコマモナス・テストステロニに属するＹＵ１４−１１１株、ＹＡＺ１株、及びＹＡＺ２株等が含まれ、これらのうち１又は２以上の菌株を混合して用いても良い。シュードモナス属ではシュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株、アクロモバクター属ではアクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株、ロドコッカス属ではロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株、ステノトロフォモナス属ではステノトロフォモナスｓｐ．及びアクロモバクター属ではアクロモバクターｓｐ．が共生するステノトロフォモナスｓｐ．／アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ２１共生株であることが望ましい。複合化とはこれら微生物を配合した組成物を指す。

異なる側面において、本発明は、前記製造方法によって得られる組成物とＰＣＢｓとを接触させることを特徴とするＰＣＢｓの分解あるいは無害化の方法を提供する。前記組成物は、上記の微生物を培養して得た菌体を予め配合した後に凍結した組成物で、さらに使用時に溶融解したものであるか、あるいは当該複数種の菌体と賦形剤とを含む乾燥組成物であることが好ましい。この場合の乾燥物は、凍結乾燥法あるいはドライスプレー法等で乾燥させることができる。１つの実施形態において、ＰＣＢｓを含む油性成分と、上記製造方法により得られたポリ塩化ビフェニル分解用組成物及び、場合により界面活性剤を含む水性媒体とを混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンに通気、撹拌する工程と、を含むことを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル類の分解方法が提供される。

本発明の製造方法により得られる組成物は、湿菌体の状態又は乾燥菌体の状態でも高いＰＣＢｓ分解活性を示すことから、微生物を複合した組成物として使用することができ、従来法に比べて、より効率的にＰＣＢｓを分解することができる。また、好ましい実施形態としては、乾燥菌体の状態で保存できるので、湿菌体の状態における腐敗や変敗を防止し、輸送性や貯蔵性が高まる。実際のＰＣＢｓ分解作業時における添加が容易であることから、作業性が向上し、再現性良くＰＣＢｓを分解することを可能にする。

本発明に係わる、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株、アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株、ロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株、ステノトロフォモナスｓｐ．／アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ２１株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＢｐｈＡ１遺伝子断片を増幅した結果である。 本発明に係るコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株に対して、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株又はアクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株又はステノトロフォモナスｓｐ．/アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ２１共生株を、任意に配合した組成物によるＰＣＢｓ分解率を示したグラフである。

本出願人らは、米沢市内及びその近郊で採取した土壌や浄水場の活性汚泥から採取した試料を用い、ビフェニルを炭素源とした合成培地でビフェニル分解菌をスクリーニングした結果、新規な微生物であるコマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株（以下、「ＹＵ１４−１１１株」と称する場合がある。）を単離し、すでに特許出願を行っている（特願２０１２−０４６２７０）。この新規微生物を用いてＰＣＢｓを分解する方法は、従来の方法に較べてかなりの有効性を示し、その分解率はカネクロールＫＣ−３００で８１.７％±１.３６まで達するものの、依然として未分解のＰＣＢｓが残存する。そこで、さらなる検討の結果、少なくとも二種以上の分類学上特定の属に属する微生物を配合、複合化させた組成物を用いる事で、ＰＣＢｓの分解率を更に向上させる事を見出したものである。本発明のＰＣＢ分解用組成物は、コマモナス属に属し、かつビフェニルジオキシゲナーゼ活性を示す少なくとも１つの微生物を主菌株とし、これにシュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択され、かつビフェニルジオキシゲナーゼ活性を示す少なくとも１つの補菌株とを含み、これらをあらかじめ別々に培養することを特徴とする。このとき、通気や攪拌で酸素を十分に供給しながらビフェニルを代謝誘導物質として用いることによってビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするＰＣＢｓの分解に関わる一連の代謝酵素群の発現を誘導し、ＰＣＢｓ分解活性の高い組成物を製造することができる。

[ビフェニル資化微生物のスクリーニング方法]
本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物の製造に使用しうる微生物の種類としては、ゲノム上にビフェニル分解（以下、ＰＣＢ分解ともいう）酵素群の遺伝子を有し、生育速度の速い微生物であればよく、このような微生物は通常ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことにより見出される。天然にビフェニル分解酵素を産生する微生物としては、シュードモナス属、コマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属等に属する多くの細菌があるが、ビフェニル資化性菌のスクリーニング段階でビフェニル分解活性の一つの指標となる黄橙色を示すメタ開裂物質（例えば、２-ｈｙｄｒｏｘｙ-６-ｏｘｏ-６-ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａ-２，４-ｄｉｅｎｏｔｅ）を速やかに生産し、且つ生育速度が速い微生物を選択することで、ＰＣＢ分解活性に優れる微生物の取得が期待できる。

あるいは、得られた微生物からビフェニル分解酵素遺伝子をクローン化し、これらに部位特異的突然変異誘発法等によって変異を導入することで、さらにＰＣＢ分解活性の向上した遺伝子群を作製することができる。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明の方法に使用しうるＰＣＢｓ分解菌は、このような方法により、当業者であれば容易に入手しうると考えられる。

本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物の製造に使用しうる一つの微生物は、本出願人により、コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株（ロット番号ＹＵ１４−１１−０３）として、２０１２年１月２７日付けで、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２１５として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。なお、コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株以外に単離されたビフェニル資化微生物９６株についても、１６ＳｒＤＮＡ解析を行って属種の同定を行った後、以下の表１に示したような種類の微生物であることが明らかとなり、これらは、通し番号を付与して保管用のマスターセルバンクにて保存している。また、これらの菌株が、ビフェニルジオキシゲナーゼを有することは、例えば、ビフェニルジオキシゲナーゼのゲノム情報にあたるＢｐｈＡ１遺伝子の保存性の高い領域と相補的な配列のプライマーを用いてＢｐｈＡ１遺伝子断片をＰＣＲによって増幅することで検出することができる。

［ポリ塩化ビフェニル分解活性を有する微生物の培養方法］
以下に、培養方法及びＰＣＢｓ分解方法への使用について詳細に説明する。最初に、高いＰＣＢｓ分解活性を有する微生物の培養法について述べる。培地は、非特許文献４を参考に、ｐＨが６．８〜７．０までとなるように調整した合成培地が良く、さらにビフェニルを炭素源として０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行うことが、微生物を適切に生育する上で望ましい。手順は、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、前に述べたビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地を２〜３ｍｌまで入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ菌体量としてＯＤ_６６０＝０．１〜０．８までとなるように、−８０℃以下で凍結保存した微生物株を、できるだけ速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．４〜０．８まで培養し、次に培地量で５倍以上の容積のフラスコなどに入れた、同じくビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７〜３０ｍｌに、その全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．４〜０．８まで培養し、さらに培地量の５倍以上の容積のフラスコなどにビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７０〜３００ｍｌに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．４〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型で良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。微生物の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるが、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるよう、継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的により高塩素化されたＰＣＢｓの分解活性を獲得した微生物が得られる。培養中の培養液のｐＨは、微生物の最終収量に影響を与えるため、その範囲は７．０〜９．０までとするのが望ましく、ｐＨの調整には、必要に応じて、アンモニウム塩を０．０２％〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように断続的に加えるのが良く、硫酸アンモニウムでも良い。また硫酸アンモニウムの添加は、培養中に窒素源も消費する場合において望ましい。最終の培養液のＯＤ_６６０＝２．５〜３．０までで、湿重量が１５〜２０ｇまでの高活性なＰＣＢｓ分解微生物が得られる。

次に、ＰＣＢｓ分解活性を有する微生物を速やかに高い回収率で得られる培養法について述べる。培地はＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈを改変したイースト・エキストラクト２．４％とトリプトン１．２％を主成分とし、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ７０ｍＭを、６対４の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にｐＨ６．８〜７．０で調整したものが望ましい。前に述べたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ改変培地へビフェニルを追加炭素源として０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、予めジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行う事が望ましく、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）までのビフェニルを含む合成培地２〜３ｍｌまでを入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ、ＯＤ_６６０＝０．１〜０．９までとなるように−８０℃以下で凍結保存した微生物株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．６〜０．８まで培養し、次に培地に対し５倍程度の容積のフラスコなどに入れた同じく０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）のビフェニルを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ改変培地２７〜３０ｍｌまでにその全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．６〜０．９まで培養し、さらに培地に対し５倍程度の容積のフラスコなどに入れた同じく０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）までのビフェニルを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ改変培地３００ｍｌに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ_６６０＝０．６〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備しその翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。微生物の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるか、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは予めジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的に、ＯＤ_６６０＝１４〜２０までで、湿重量が１００〜１５０ｇまでのＰＣＢｓ分解微生物が得られる。

［ポリ塩化ビフェニル分解用組成物の調製方法］
このようにして得られたＰＣＢｓ分解用微生物を含む培養物は、そのまま粉体にするか、水や界面活性剤などを含む分散媒で洗浄して、菌体を回収することができる。培養後の培養液をそのまま利用することもできるし、減圧濃縮することもできる。また、遠心分離による集菌や密度勾配遠心法、二相分離法などを行い、高濃度にＰＣＢｓ分解用微生物を分離回収することができる。各種分散媒でＰＣＢｓ分解微生物を分散した懸濁液を用いてもよい。

液剤組成物を製造する際に、上記培養物に、必要に応じて、保存性や安定性の向上を目的とした物質を追加することもできる。例えば、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、緩衝剤などを添加することができる。

粉体組成物であれば、上記培養物から得られる微生物菌体を乾燥させる必要がある。菌体の乾燥方法としては、自然乾燥や凍結乾燥、スプレードライなどで生菌のまま粉末化することができる。この際、スキムミルク等の保護剤を用いることが望ましい。また、製剤化のために増量剤などの任意の物質を添加することができる。例えば、賦形剤としては、例えば、乳糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、白糖等の糖類、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン等のデンプン類、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、沈降炭酸カルシウム等の無機塩類の他、脱脂米糠、大豆粉、おから、ピーナッツの皮、フスマ、もみがら粉、炭酸カルシウム、糖、澱粉、ビール酵母、小麦粉等、飼料安全法で認可されている任意の賦形剤があげられる。これらの賦形剤は１種のみならず２種以上併用してもよい。

本発明の好ましい実施形態において、微生物菌体は、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム塩を用いるのが良い。また、菌体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えて、糖アルコールはアルファ、ベータあるいはデルタ型のマンニトールでも良く、最終的に−２０〜−８０℃までに調温された冷凍庫等で保存でき、乾燥粉体化させた場合は、１５〜２５℃の常温で保存できるＰＣＢｓ分解乾燥菌体が得られる。

前述したそれぞれの方法で得られた菌体は、ＰＣＢｓを効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させた組成物であることが望ましく、但し、菌体を乾燥させる前の湿菌体の状態でＰＣＢｓを効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させ、この複合体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えて、ＰＣＢｓ分解複合組成物としてもよい。
本発明のポリ塩化ビフェニル分解用組成物は少なくとも２種類、あるいはそれ以上の菌体を含み、その主菌株はコマモナス属に属し、ビフェニルジオキシゲナーゼ活性を示すＰＣＢｓ分解菌を用いることが好ましい。コマモナス属に属するＰＣＢｓ分解菌は、グラム陰性細菌であるため、グラム陽性菌に較べて多くの刺激性の高い有機化合物や薬剤に対する耐性が高い。これは細胞壁の構成において、グラム陰性菌ではグラム陽性菌と共通のペプチドグリカン層の外側にさらに外膜が存在してその耐性を維持しているためである。また、コマモナス属は細菌細胞を積極的に分裂する発酵型細菌であるため、大量培養によって多量の細菌を得易いという性質を有している。すなわち、ＰＣＢｓにも強い耐性の細菌を多量に用いて（多量のＰＣＢｓ分解酵素）、広く多くのＰＣＢｓ異性体を分解し、残ったＰＣＢｓ異性体を別の少量の細菌で分解させる方法に適している。

この主菌株によるＰＣＢｓ分解作用を強化するために添加する補菌株としては、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択される少なくとも１種、あるいはそれ以上のＰＣＢｓ分解菌を用いることができる。これらの補菌株は、２，３-ビフェニルジオキシゲナーゼ（２，３-ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）が共通に選択する基質特異性を示し、ＰＣＢｓ異性体に対しては更に狭い範囲の基質特異性を示す。具体的には、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニルを選択的に分解する細菌が好ましい。

主菌株と補菌株との配合比率は、培養液の濁度、例えば、６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ_６６０）を指標として換算した菌体量で、１０：０．５〜９．９が好ましい。すなわち、補菌株の配合菌体量が主菌株の配合菌体量を上回らないことである。理由としては、ＰＣＢｓ分解反応時における必須である酸素分子を補菌株が無駄に消費しないようにするためと考えられる。従って効率の良いＰＣＢｓ分解率を得る配合法としては、反応溶液中の酸素分圧と細菌量（総量あるいは配合比）の調節が重要であり、より好ましい主菌株と補菌株との配合比率は、培養液の濁度を指標として換算した菌体量で、１０：１〜６、さらに好ましくは、１０：１〜３、最も好ましくは１０：１〜１．５程度である。

［ポリ塩化ビフェニルの分解反応］
本発明のＰＣＢｓの分解方法は、上記微生物を培養して得られた菌体を含む組成物とＰＣＢｓとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた組成物を、比較的低濃度のＰＣＢｓ汚染油と接触させたときに高いＰＣＢｓ分解活性を発揮することができる。

本発明で対象となるＰＣＢｓとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１〜１０個である。平均置換塩素原子数は、一般に２〜６個である。本発明では、これらのＰＣＢｓから選択された少なくとも一種を用いることができ、それぞれ単独で又は二種以上を任意に組み合わせたものも用いることができる。一般に、ＰＣＢｓは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる配合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上２０９種類の異性体が存在し、市販品には、およそ７０から１００、あるいはこれらを越える数の異性体が配合存在している。

本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるＰＣＢｓとしては、特徴的には、３，４，４’，５−テトラクロロビフェニルや３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３，３’，４，４’−ペンタクロロビフェニル、２，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２’，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニルに加えて、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。

ＰＣＢｓは、通常ＰＣＢ単体の配合物として市販されており、これがコンデンサーやトランスに使用されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）が製造販売したカネクロールＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）やＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロルべンゼン＝６０／４０（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール１２５４（５４％Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等も挙げられる。

本発明に係るＰＣＢｓの分解反応は、ＰＣＢｓを含む油性成分と、上記ＰＣＢ分解用組成物及び場合により界面活性剤を含む水性媒体と、を混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンを通気、攪拌する工程と、を含む。分解すべきＰＣＢｓは、エマルジョン全量に対し０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度含むことができ、当該エマルジョン中に、本発明の組成物を０．２〜２０重量％、好ましくは２〜１２重量％程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トライトンＸ−１００等の界面活性剤０．００５％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、あらかじめＰＣＢｓを含む油の粘性を下げる処理（例えば、アルコール化等）を行っても良い。反応条件は、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃に調温し、ｐＨは６〜９とし、攪拌した状態で約１２〜７２時間処理することが好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が小型化できることにより、微量ＰＣＢｓを保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる。

以下に、本発明の製造方法を含む微生物複合組成物の詳細について、実施例等を挙げて説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるものでない。

[実施例１]ビフェニル資化微生物のスクリーニング
本出願人より出願された特願２０１２−０４６２７０に示した方法と同様に、スクリーニングに使用した合成培地（Ｗ培地）は、非特許文献４の記載を参考として、以下のような組成とした。

指示ｐＨが６．３〜８．５の培地を準備し、これに炭素源として、終濃度０．１％となるようにビフェニルを加えた。山形県米沢市内及びその近郊の土壌から採取した小さじひとかき程度のサンプルを培地に添加し、３０℃、１２０ｒｐｍで約１週間〜１ヶ月間、振盪培養を行った。濁度が上昇した培養液の一部を新しい培地に植え継ぎ、同条件で振盪培養を行う作業を数回繰り返した。

ビフェニル資化微生物群の生育が見られた集積培養の中から微生物を単離した。すなわち、集積培養したビフェニル資化菌群の培養液２０μＬを合成培地プレートに塗布し、逆さにしたプレートの蓋上にビフェニル粉末を置くことで揮発させながらビフェニルを供給し、３０℃にて一晩以上培養した。生育した様々な形態のコロニーを、それぞれ新しい合成培地プレートに再度画線展開し、同じくビフェニルを揮発させて供給しつつ培養することで、各コロニーが単一種のコロニーとなるまでこれらを繰り返した。生育したシングルコロニーは、０．１％ビフェニルを含む液体の合成培地に植菌してビフェニル資化性を確認すると共に、蓋上にビフェニル粉末を置いた合成培地マスタープレートに再植菌してコロニーの形状を観察した。最後に、マスタープレートからシングルコロニーとして再単離した微生物のビフェニル資化性を確認するとともに、１６ＳｒＤＮＡ配列解析により菌種の同定を行った。このようにして単離した菌株をＹＡＺ○株（○は任意のアラビア数字で番号付けされた数番を示す。）と命名し、グリセロールストックを作製して、-８０℃に調温された冷凍庫で保存した。

［実施例２］ＹＡＺ２、ＹＡＺ２１、ＹＡＺ５１、ＹＡＺ５２及びＹＡＺ５４株のビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子の検出
既知のＰＣＢｓ分解細菌である、Burkholderia xenovorans LB400株、Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707株、Acidovorax sp. KKS102株、Rhodococcus jostii RHA1株、Rhodococcus erythropolis、および Bacillus sp. JF8株のＢｐｈＡ１（ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼαサブユニット）のアミノ酸配列の比較から、保存性の高い領域を数カ所選び（Ａｓｎ−Ｇｌｎ／Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ／Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ（配列番号１）、Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ／Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（配列番号２）など）、縮重プライマーを作製した。コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株、アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株、ロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株、ステノトロフォモナスｓｐ．／アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ２１共生株の各菌株を、ＯＤ６６０＝０．６〜１．０まで培養した培養液０．１〜１．２ｍｌから遠心集菌した菌体を、適当量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁し、８０〜１００℃で１５〜２０分間加熱後、遠心した上清を各菌株のゲノムを含む熱抽出物として使用した。これを鋳型とし作製した縮重プライマーを用いて、９４℃、３分→［９４℃、３０秒→５８〜６０℃、３０秒→７２℃、１分（３５サイクル）］→７２℃、２分、の反応条件でＰＣＲを行った。また、ＢｐｈＡ１遺伝子を持たないネガティブコントロールとして、大腸菌Ｋ−１２株のゲノムを含む熱抽出物を用いて同様の反応を行った。その結果、予測される約９００ｂｐのＢｐｈＡ１断片増幅産物が大腸菌を除く全ての菌株に検出され、これらの菌株がＢｐｈＡ１遺伝子を有することが確認できた（図１）。

［実施例３］微生物の複合化によるポリ塩化ビフェニル類の分解
コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株に対し、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株あるいはアクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株を加えて複合化させた微生物組成物を予め必要量を量り取り、これを２０ｍＭリン酸緩衝液へ投入して組成物溶液とした。組成物溶液の最終濃度は、濁度（ＯＤ_６６０）を測定することで決定できるし、あるいは適切な濃度になるよう２０ｍＭリン酸緩衝液で微調整した。さらに組成物溶液に、濃度が５ｐｐｍとなるように商用ポリ塩化ビフェニル類であるカネクロールＫＣ-３００等の溶液へ加えて、温度３０℃、２５時間で転倒攪拌して通気させ、ＰＣＢｓを分解させた。

分解率（％）の小数点第２位以下は四捨五入した。

上記の表３において、微生物の複合組成物は、微生物単独の場合と較べて、著明な分解率の向上を示した。一方、同表３にて、機序は定かでないが、とりわけてコマモナス・テストステロニＹＡＺ２対アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株の配合割合が、１．１対１から２対１の割合の場合に、高い分解効果を示した。この結果は、単に、微生物を複合させることで、微生物が産生するポリ塩化ビフェニル類の異化酵素の加増によるものでなく、微生物がその種依存的な特徴で生産するポリ塩化ビフェニル類の異化酵素の基質（この場合は、ポリ塩化ビフェニル類を指す。）に対する特異性によるものと考える画期的なものである。

［実施例４］微生物の複合化によるポリ塩化ビフェニル類分解の抑制作用
実施例３と同様の方法により、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株の菌体に対し、等量のロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株の菌体を配合した複合組成物で、カネクロールＫＣ-３００等の商用ポリ塩化ビフェニル類の分解活性を調べた結果を以下の表４に示す。

分解率（％）の小数点第２位以下は四捨五入した。

上記の表４において、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株の菌体に対し、等量のロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株の菌体を配合した複合組成物は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株単独におけるポリ塩化ビフェニル類の分解率を顕著に下げた。すなわち、微生物種あるいはその量を調節することで、ポリ塩化ビフェニル類の分解活性を制御できることを示した。

［実施例５］微生物の複合化によるポリ塩化ビフェニル異性体の分解特性
実施例３及び４と同様の方法により、カネクロールＫＣ-３００等の商用ポリ塩化ビフェニルを用いて、本発明で例に挙げた菌株のポリ塩化ビフェニル異性体の分解特性を調べた結果を以下の表５に示す。

上記の表５において、分解率の表示は、カネクロールＫＣ-３００中のポリ塩化ビフェニル異性体の存在比に対する分解率である。本実施例において、ポリ塩化ビフェニル類とした濃度は５ｐｐｍであり、反応条件は温度３０℃、２５時間とした。その結果、とりわけて表中の下線で示す通り、本実施例中における、カネクロールＫＣ-３００中の２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニル及び２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニルの分解率は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株単独の場合よりも、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株あるいはアクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株を予め配合し、複合させた場合の方が、著明に分解率を向上させることが明らかになった。すなわち微生物種の違いにより、ポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性が異なることを示した。

［実施例６］微生物複合組成物の配合変化とポリ塩化ビフェニル類の分解との相関
実施例３、４及び５と同様の方法により、カネクロールＫＣ-３００等の商用ポリ塩化ビフェニルを用いて、本発明で例に挙げた菌株の配合比を変化させた組成物を調整し、ポリ塩化ビフェニル類の分解率の変化を調べた結果について図２に示す。

図２は、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株の菌体濃度をＯＤ_６６０＝８と固定して、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株あるいはアクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株の菌体濃度をＯＤ_６６０＝１から７まで変化させ複合化した組成物を予め調製し、濃度５ｐｐｍとしたポリ塩化ビフェニル類と反応させた結果、アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株をＯＤ_６６０＝１となるようにコマモナス・テストステロニＹＡＺ２株へ配合、複合組成物とした場合が、最も顕著な分解率の向上を示した。

本発明は、単独のＰＣＢｓ分解菌によるＰＣＢ分解効果をさらに向上させたものであり、産業上の利用価値は著しい。例を挙げると、ポリ塩化ビフェニル類を内包し、汚染したコンデンサーやトランスの無害化を目的とする洗浄の場合、本発明の組成物を添加した洗浄用溶剤をコンデンサーへ注入し、その中を洗浄することにより、内包するポリ塩化ビフェニル類を分解あるいは無害化することができると考える。また、ポリ塩化ビフェニル類を内包するコンデンサーやトランスの洗浄に供した洗浄溶剤へ本発明の組成物を添加して、同様に、分解あるいは無害化することもできると考える。この様にして、日本国内あるいは海外に点在するポリ塩化ビフェニル類で汚染した機器を含む、汚染物あるいはその廃棄物の分解あるいは無害化に有効なことは明白である。

Claims (9)

1. コマモナス属に属し、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの主菌株と、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択され、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの補菌株とを、それぞれビフェニルを炭素源として含む培地で通気攪拌培養する工程と、前記各培養液から回収した少なくとも２種類の菌体を混合する工程とを含むことを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル分解用組成物の製造方法。
2. 前記少なくとも２種類の菌体混合物に賦形剤を添加し、乾燥する工程をさらに含む請求項１に記載の製造方法。
3. 前記主菌株と捕菌株との混合比率が、培養液の濁度を指標として換算した菌体量で、主菌株１０に対して、補菌株０．５〜９．９の割合である請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記主菌株が、コマモナス・テストステロニに属し、前記補菌株が、アクロモバクター属に属する１又は２以上のポリ塩化ビフェニル分解菌であり、主菌株と捕菌株との混合比率が、培養液の濁度を指標として換算した菌体量で、主菌株１０に対して、補菌株１〜６の割合である請求項１〜３いずれか一項に記載の製造方法。
5. 前記主菌株が、コマモナス・テストステロニに属する、ＹＵ１４−１１１株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１２１５）、ＹＡＺ１株、及び／又はＹＡＺ２株を含む請求項１〜４いずれか一項に記載の製造方法。
6. 前記補菌株が、シュードモナスｓｐ．ＹＡＺ５１株、アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ５２株、ロドコッカスｓｐ．ＹＡＺ５４株、及び／又はステノトロフォモナスｓｐ．／アクロモバクターｓｐ．ＹＡＺ２１共生株を含む請求項１〜３及び５のいずれか一項に記載の製造方法。
7. 請求項１〜６いずれか記載の方法により製造されたポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
8. コマモナス属に属し、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの主菌株と、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択され、かつビフェニルジオキシゲナーゼを有する少なくとも１つの補菌株とを、培養液の濁度を指標として換算した菌体量で、前記主菌株１０に対して、前記補菌株０．５〜９．９の割合で含むことを特徴とするポリ塩化ビフェニル分解用組成物。
9. ポリ塩化ビフェニル類を含む油性成分と、請求項７又は８に記載の組成物及び場合により界面活性剤を含む水性媒体とを混合してエマルジョン化する工程と、
   前記エマルジョンに通気、攪拌する工程と、を含むことを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル類の分解方法。