JP2014023489A

JP2014023489A - パラコッカス属細菌

Info

Publication number: JP2014023489A
Application number: JP2012167496A
Authority: JP
Inventors: Hideki Inaba; 英樹稲葉; Yohei Hashimoto; 庸平橋本; Nobuhiko Nomura; 暢彦野村; Masanori Toyofuku; 雅典豊福
Original assignee: Sumitomo Heavy Industries Ltd; University of Tsukuba NUC
Current assignee: Sumitomo Heavy Industries Ltd; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2012-07-27
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-02-06

Abstract

【課題】シグナル物質を大量に生産するシグナル物質生産菌を提供する。
【解決手段】パラコッカス属細菌ＡＳ６株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６３）、パラコッカス属細菌ＡＳ１３株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６４）、又はＮ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンを分泌するこれらの変異株である、パラコッカス属細菌。
【選択図】図１

Description

本発明は、パラコッカス属細菌に関する。

微生物は細胞間情報伝達物質（以下、「シグナル物質」という。）を介して情報伝達を行い、微生物の密度に依存して病原性物質の分泌やバイオフィルムの生産を制御していることが知られている。このような情報伝達機構のことをクオラムセンシングという（例えば、非特許文献１を参照）。

ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１５，４９５−５０２．

本発明では、シグナル物質の産業利用を考え、シグナル物質を大量に生産するシグナル物質生産菌を提供することを目的とする。

本発明は、パラコッカス属細菌ＡＳ６株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６３）、パラコッカス属細菌ＡＳ１３株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６４）、又はＮ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン（以下、場合により「Ｃ１６−ホモセリンラクトン（Ｃ１６−ＨＳＬ）」という。）を分泌するこれらの変異株である、パラコッカス属細菌を提供する。

上記本発明のパラコッカス属細菌は、シグナル物質の一種であるＣ１６−ＨＳＬを大量に分泌することができる。また、Ｃ１６−ＨＳＬをベシクルの形態で分泌することができる。Ｃ１６−ＨＳＬは疎水性の物質であるため、化学合成したＣ１６−ＨＳＬを水に溶解するためには、有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。これに対し、本発明のパラコッカス属細菌が生産したＣ１６−ＨＳＬは、ベシクルの形態で分泌されており、親水性の状態であることから、そのまま水系に添加して用いることができる。

本発明により、シグナル物質を大量に生産するシグナル物質生産菌を提供することができる。

ＡＳ６株の簡易分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。ＡＳ１３株の簡易分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。

本発明のパラコッカス属細菌は、Ｃ１６−ＨＳＬを主にベシクルの形態で分泌する。ベシクルとは、脂質二重膜で形成された小胞（メンブランベシクル）である。本発明のパラコッカス属細菌が生産するＣ１６−ＨＳＬはベシクル中に封入された状態で分泌される。このため、Ｃ１６−ＨＳＬが疎水性の物質であるにもかかわらず、容易に水系に添加して拡散させることができるため、微生物に効率的にＣ１６−ＨＳＬを送達することができる。

本発明のパラコッカス属細菌を培地中で培養すると、培地中にＣ１６−ＨＳＬがベシクルの形態で分泌される。そこで、一実施形態において、この培養物をシグナル物質として使用することができる。必要に応じて、上記の培養物からベシクルの形態のＣ１６−ＨＳＬ、あるいは純粋なＣ１６−ＨＳＬを精製して使用してもよい。対象とする微生物の培養環境中にシグナル物質を添加することにより、その微生物を活性化することができ、その微生物が行う目的の反応を促進することができる。Ｃ１６−ＨＳＬの添加量は適宜設定することができる。

別の実施形態において、シグナル物質の添加が必要な微生物の培養環境中で、本発明のパラコッカス属細菌そのものを培養してもよい。この場合において、パラコッカス属細菌は、その培養環境中でベシクルの形態のＣ１６−ＨＳＬを生産し、その培養環境中の微生物を活性化することができ、その微生物が行う目的の反応を促進することができる。

パラコッカス属細菌の変異体は、例えば、紫外線照射や、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンやメタンスルホン酸エチルなどの変異原性物質を培地中に添加する等の方法により、パラコッカス属細菌に突然変異を誘導し、突然変異株をクローニングし、得られた突然変異株の中からＣ１６−ＨＳＬの生産株を選別することにより取得することができる。Ｃ１６−ＨＳＬの生産株の選別には、後述するＶＩＲ０７株等のレポーター株を使用した方法等が使用できる。これにより、Ｃ１６−ＨＳＬを更に大量に生産する等の特徴を備える変異体を取得することができる。

以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明する。

（ホモセリンラクトン高生産菌のスクリーニング）
培地中にホモセリンラクトンが存在すると紫色の色素であるビオラセイン（ｖｉｏｌａｃｅｉｎ）を生産するレポーター株を利用して、活性汚泥からホモセリンラクトン高生産菌をスクリーニングした。

より具体的には、アシル基の炭素数が４〜８のＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ４〜Ｃ８−ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍ）ＣＶ０２６株及びアシル基の炭素数が１０〜１６のＮ−アシル−Ｌ−ホモセリンラクトン（Ｃ１０〜Ｃ１６−ＨＳＬ）に応答するクロモバクテリウム・ビオラセウムＶＩＲ０７株を使用した。ここで、ＣＶ０２６株が応答するホモセリンラクトンとしては、Ｎ−ブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシブタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘプタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−オクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシオクタノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。また、ＶＩＲ０７株が応答するホモセリンラクトンとしては、Ｎ−デカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシウンデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシドデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−トリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシトリデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−テトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシテトラデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシペンタデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−オキソヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン、Ｎ−３−ヒドロキシヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトン等が挙げられる。

活性汚泥を希釈して寒天培地に塗布し、単離株を得た。寒天培地上の近接する位置に、活性汚泥から得られた単離株及びレポーター株を塗布した。数日培養後、レポーター株が紫色の色素（ビオラセイン）を分泌したものについて、単離株をホモセリンラクトン生産菌と判断した。結果を表１に示す。表中、「＋」の数が多い程ビオラセインの生産量が多かったことを示す。この方法により、ホモセリンラクトン高生産菌である、ＡＳ６株及びＡＳ１３株を得た。ＡＳ６株は、２０１２年５月１８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６３として寄託した。ＡＳ１３株は、２０１２年５月１８日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６４として寄託した。

（ＡＳ６株及びＡＳ１３株が生産しているシグナル物質の解析）
ＡＳ６株及びＡＳ１３株をＬＢ培地で培養し、培養液を６，０００×ｇ、１５分間遠心分離した。続いて、遠心上清をポアサイズ０．２μｍの酢酸セルロースフィルターで濾過した後、１５０，００００×ｇ、３時間、４℃で超遠心した。上清を捨てた後、ペレットをＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ−０．８５（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ）で洗浄した。次に、ＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液中にＯｐｔｉｐｒｅｐ（商品名、アクシスシールド社）を４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０（ｖ／ｖ）％混合したものを、濃度が高いものが下に来るように遠心管内に重層してグラジエント層を作成し、一番上に４０（ｖ／ｖ）％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ−ＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ溶液に溶解したペレットを添加した。続いて、このグラジエントを１００，００００×ｇ、３時間超遠心した。超遠心分離後、それぞれの層を回収し、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．１９７６．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８−２５４．）によりタンパク質濃度を、スチュワート法（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．１９８０．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，１０−１４．）によりリン脂質濃度を分析した。タンパク質の濃度及びリン脂質の濃度が高い層をベシクルが抽出された層とした。

（ベシクルの確認）
上記のベシクルが抽出された層のサンプルを、ネガティブ染色を用いた透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により観察した。その結果、ベシクルが存在することが確認された。

（シグナル物質の同定）
質量分析により、上記のベシクルが抽出された層のサンプルを解析し、シグナル物質の標準品との比較により、物質の同定及び濃度測定を行った。その結果、ＡＳ６及びＡＳ１３株は、培養液中に１．０μＭ程度のＣ１６−ＨＳＬを分泌しており、また、その中の少なくとも半分量がベシクルに内包された状態で存在することが明らかとなった。Ｃ１６−ＨＳＬのような疎水性の物質は、細胞膜に留まりやすいと考えられている。このため、ＡＳ６及びＡＳ１３株は、ベシクルにＣ１６−ＨＳＬを内包して細胞外に排出することにより大量のＣ１６−ＨＳＬを分泌していると考えられた。

以上の結果から、発明者らは、ＡＳ６株及びＡＳ１３株が生産するＣ１６−ＨＳＬが、ベシクルの形態で分泌されることを発見した。疎水性のシグナル物質を化学合成した場合、水に溶解するために有機溶媒等を用いる必要があるなど、操作性が悪い場合がある。これに対し、ＡＳ６株及びＡＳ１３株が生産したＣ１６−ＨＳＬは、ベシクルの形態で分泌されているため親水性であり、そのまま水系に添加して用いることができることが明らかとなった。

（ＡＳ６株の同定）
１６ＳｒＤＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子）の塩基配列解析、形態観察及び生理・生化学試験により、ＡＳ６株の帰属分類群を推定した。

（１６ＳｒＤＮＡの塩基配列解析）
ＡＳ６株を寒天培地上で３０℃、２４時間培養し、ＤＮＡを抽出した。例えば、「中川恭好、川崎浩子、遺伝子解析法１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列決定法、日本放線菌学会編、『放線菌の分類と同定』、Ｐ．８８−１１７、日本学会事務センター（２００１）」に記載された、一般的な方法に基づいて、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、データベースとの相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。簡易分子系統解析は、アポロンＤＢ−ＢＡデータベースＶｅｒ．７．０（商品名、テクノスルガ・ラボ社、２０１１年３月版、検索日２０１２年５月２日）に基づいて作成した。

図１に簡易分子系統解析の結果を示す。図１において、左下の線はスケールバーを表し、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を表す。また、株名の末尾のＴはその種の基準株であることを示す。相同性検索の結果、ＡＳ６株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、パラコッカス属のｒＤＮＡの塩基配列に対して高い相同性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ＡＳ６株は、パラコッカス属の種で形成されるクラスター内に含まれ、パラコッカス・ベルスタス（Ｐ．ｖｅｒｓｕｔｕｓ）及びパラコッカス・ベンガレンシス（Ｐ．ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）に近縁であることが示された。しかしながら、ＡＳ６株がパラコッカス・ベルスタス又はパラコッカス・ベンガレンシスに帰属する可能性及びこれらとは異なる種である可能性が考えられ、種名の同定には至らなかった。

（形態観察及び生理・生化学試験）
光学顕微鏡による形態観察、及び、例えば「ＢＡＲＲＯＷ及びＦＥＬＴＨＡＭ、ＣｏｗａｎａｎｄＳｔｅｅｌ’ｓＭａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＩｄｅｎｔｉｏｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｅｄｉｃａｌＢａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ」に記載された、一般的な方法に基づいて、カタラーゼ反応、アオキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス発生、ブドウ糖の酸化／発酵について試験を行った。また、ＡＰＩ２０ＮＥキット（商品名、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）を用いて、硝酸塩還元、インドール産生、ブドウ糖酸性化、アルギニンジヒドロラーゼ、ウレアーゼ、エスクリン加水分解、ゼラチン加水分解、β−ガラクトシダーゼ及びチロクロームオキシダーゼについての生化学試験、並びに、ブドウ糖、Ｌ−アラビノース、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マルトース、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸、アジピン酸、ｄｌ−リンゴ酸、クエン酸ナトリウム、酢酸フェニルについての資化性試験を行った。さらに、嫌気条件下での生育の有無及び２０℃での生育の有無についての試験、並びに、グリセロール、サッカロース、Ｄ−フルクトース、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム及び乳酸ナトリウムについての資化性試験を行った。

結果を表２〜４に示す。ＡＳ６株は、運動性を有しないグラム陰性桿菌であり、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は共に陽性を示した。ＡＰＩ２０ＮＥキットを用いた試験の結果、ＡＳ６株は硝酸塩を還元せず、グルコース、Ｌ−アラビノース及びＤ−マンノース等を資化し、ｎ−カプリン酸及びクエン酸ナトリウムを資化しなかった。これらの性状はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスの性状と類似していたが完全には一致しなかった。特に、Ｄ−マンノースを資化する点ではパラコッカス・ベンガレンシスの性状と異なり、ラクトースを資化する点ではパラコッカス・ベルスタスの性状と異なり、硝酸塩を還元しない点はパラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスのいずれとも異なっていた。

以上の結果から、ＡＳ６株は、パラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスに近縁なパラコッカス属細菌であると推定された。

（ＡＳ１３株の同定）
ＡＳ６株と同様の方法により、ＡＳ１３株の帰属分類群を推定した。

（１６ＳｒＤＮＡの塩基配列解析）
ＡＳ１３株について、ＡＳ６株と同様の方法により、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を決定し、データベースとの相同性検索及び簡易分子系統解析を行った。簡易分子系統解析は、アポロンＤＢ−ＢＡデータベースＶｅｒ．６．０（商品名、テクノスルガ・ラボ社、２０１０年３月版、検索日２０１１年２月１４日）に基づいて作成した。

図２に簡易分子系統解析の結果を示す。図２において、左下の線はスケールバーを表し、系統枝の分岐に位置する数字はブートストラップ値を表す。また、株名の末尾のＴはその種の基準株であることを示す。相同性検索の結果、ＡＳ１３株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列は、パラコッカス属のｒＤＮＡの塩基配列に対して高い相同性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ＡＳ１３株は、パラコッカス・ベルスタス及びパラコッカス・ベンガレンシスとクラスターを形成し、このうちパラコッカス・ベルスタスと同一の分子系統学的位置を示した。しかしながら、ＡＳ１３株がパラコッカス・ベルスタスに帰属する可能性及びこれとは異なる種である可能性が考えられ、種名の同定には至らなかった。

（形態観察及び生理・生化学試験）
ＡＳ６株と同様にして、光学顕微鏡による形態観察、カタラーゼ反応、アオキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス発生、及び、ブドウ糖の酸化／発酵について試験を行った。また、ＡＰＩ２０ＮＥキット（商品名、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）を用いた生化学試験及び資化性試験を行った。さらに、メタノール、エタノール、グリセロール、フルクトース、ガラクトース及びラクトースについての資化性試験を行った。結果を表５〜７に示す。その結果、ＡＳ１３株は、運動性を有しないグラム陰性桿菌であり、ＬＢ寒天培地上でのコロニーの色は黄色を呈し、グルコースを酸化せず、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は共に陽性を示した。これらの性状は、１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果において帰属が示唆されたパラコッカス属の性状と一致した。ＡＰＩ２０ＮＥキットを用いた試験の結果、ＡＳ１３株は硝酸塩を還元せず、ゼラチンを加水分解せず、グルコース、Ｌ−アラビノース及びＤ−マンノース等を資化せず、Ｄ−マンニトール、マルトース及びグルコン酸カリウム等を資化した。また、ＡＳ１３株は、メタノール、エタノール及びグリセロール等を資化し、ラクトースを資化しなかった。これらの性状はパラコッカス・ベルスタスの性状と類似していたが完全には一致しなかった。特に、運動性を有さず、硝酸塩を還元せず、グルコース及びＬ−アラビノースを資化せず、メタノールを資化する点はパラコッカス・ベルスタスの性状と異なっていた。

以上の結果から、ＡＳ１３株は、パラコッカス・ベルスタスに近縁なパラコッカス属細菌であると推定された。

Claims

パラコッカス属細菌ＡＳ６株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６３）、パラコッカス属細菌ＡＳ１３株（受託番号ＮＩＴＥＰ−１３６４）、又はＮ−ヘキサデカノイル−Ｌ−ホモセリンラクトンを分泌するこれらの変異株である、パラコッカス属細菌。