WO2019225475A1 - 目的物質の生産方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、誘導剤を使用することなく、菌体増殖期と物質生産期とを効率的に切り替えることにより、微生物による目的物質の収量を増加させることができる発酵プロセスを提供する。より具体的には、本発明は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および当該オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を共培養して目的物質を生産することを含む、目的物質の生産方法；ならびにこのような第１微生物および第２微生物を含む共培養系などを提供する。

Description

目的物質の生産方法

　本発明は、目的物質の生産方法などに関する。

　現在、異種遺伝子（例、植物由来遺伝子）の導入により構築された人工的な合成代謝経路を有する微生物を利用することにより、微生物において代謝物質からの目的物質の生産系が開発されている。例えば、目的物質としてイソプレノイドが生産される場合、アセチルＣｏＡ（解糖系末端代謝物質）を起点とする生合成経路であるメバロン酸経路に対応する異種遺伝子を導入した微生物を利用して、アセチルＣｏＡからのイソプレノイドの生産系が開発されている（例、特許文献１～４）。アセチルＣｏＡは生合成経路（例、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、アミノ酸合成系・脂質合成系）における中間代謝物質の１つであり、菌体増殖に必須な代謝物である。微生物の増殖、および微生物による目的物質の生産が競合関係にある場合、微生物による目的物質の生産のための発酵プロセスでは、目的物質の収量を増加させるため、菌体増殖期と物質生産期とを如何に切り替えるかについて検討されている。

　ところで、菌体増殖期と物質生産期とを切り替えるため、クオラムセンシング（ＱＳ）を利用することにより、菌体増殖に重要な代謝経路を、誘導剤（ＩＰＴＧ）を用いて培養中の任意のタイミングで遮断し、物質生産に切り替える人工遺伝子回路（トグルスイッチ）が報告されている（非特許文献１、２）。ＱＳとは、オートインデューサー（例、Ｎ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＡＨＬ））に基づき菌体の密度を感知し遺伝子の発現制御を行う機構であり、発光バクテリアであるＶｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉの遺伝子が最もよく研究されている。上記先行技術でも、Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉのＬｕｘシステム（ＡＨＬ：Ｎ－３－オキソヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン；ＡＨＬ合成遺伝子：ｌｕｘＩ；ＡＨＬレセプター遺伝子：ｌｕｘＲ）を用いて、菌体密度を感知して発現制御を行うトグルスイッチがＥ．ｃｏｌｉにおいて構築されている。しかし、ＬｕｘシステムをＥ．ｃｏｌｉにおいて構築しただけでは、非常に低い菌体密度であっても遺伝子の発現制御がなされてしまうことが知られている。したがって、上記先行技術では、ｌｕｘプロモーター（Ｐ_ｌｕｘ）プロモーターの両端に対して、ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）が標的とするオペレーター配列（ｌａｃＯ配列）を導入したＰ_ｌｕｘｌａｃＯプロモーターを構築することにより、ＡＨＬ－ＬｕｘＲ複合体（オートインデューサーおよびそのレセプターの複合体）によるプロモーターへの結合をＬａｃＩリプレッサーによる立体障害により制限している。誘導剤（ＩＰＴＧ）は、ＬａｃＩリプレッサーに結合することにより、ＬａｃＩのＬａｃＯ配列への結合を阻害することができる。これにより、添加されるべき誘導剤（ＩＰＴＧ）の濃度に応じてＰ_ｌｕｘｌａｃＯプロモーター活性（ＬａｃＩリプレッサーによる立体障害の軽減によるＡＨＬ－ＬｕｘＲ複合体によるプロモーターへの結合の向上）およびＡＨＬ合成速度を制御できるため、ＱＳにより目的遺伝子（ｇｌｔＡ遺伝子）の発現を誘導することができる。

国際公開第２０１３／１７９７２２号 国際公開第２０１５／０６０５２９号 国際公開第２０１５／０８０２７３号 国際公開第２０１６／０８４９６３号

Ｓｏｍａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２３（２０１４）　１７５－１８４ Ｓｏｍａ　Ｙ，　Ｈａｎａｉ　Ｔ，　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３０（２０１５）　７－１５

　上記先行技術によれば、菌体増殖期と物質生産期とを切り替えるための手段として誘導剤（ＩＰＴＧ）の使用が必須である。しかし、このような誘導剤は高価であり、また、誘導剤の投入時期の調節も要し煩雑であるため、上記先行技術のシステムは、商業規模の物質生産には不向きである。

　したがって、本発明の目的は、誘導剤を使用することなく、菌体増殖期と物質生産期とを効率的に切り替えることにより、微生物による目的物質の収量を増加させることができる発酵プロセスを開発することである。

　本発明者らは、鋭意検討した結果、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を共培養することにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を共培養して目的物質を生産することを含む、目的物質の生産方法。
〔２〕前記第１微生物が、以下を含む、〔１〕の方法：
（１）目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーターを含む第１発現単位；ならびに
（２）オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第２発現単位。
〔３〕前記第２微生物が、オートインデューサーの合成酵素をコードする遺伝子、および当該遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第３発現単位を含む、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記第１発現単位および前記第２発現単位の一方もしくは双方が前記第１微生物に対して異種であるか、または前記第３発現単位が前記第２微生物に対して異種である、〔２〕または〔３〕の方法。
〔５〕オートインデューサーがＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）である、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記オートインデューサー依存性プロモーターがｌｕｘプロモーター（Ｐｌｕｘ）であり、
　前記転写因子をコードする遺伝子が、ＡＨＬレセプターをコードする遺伝子（ＬｕｘＲ）であり、
　前記合成酵素をコードする遺伝子が、ＡＨＬ合成酵素をコードする遺伝子（ＬｕｘＩ）である、〔５〕の方法。
〔７〕前記第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）が５０％未満である、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）が１０％以下である、〔７〕の方法。
〔９〕前記第１微生物および／または第２微生物が、以下（ａ）および（ｂ）を含む遺伝子発現制御系を含む、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法：
（ａ）微生物の増殖に必要とされる内因性物質の変換に関与する酵素をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたリプレッサー抑制性プロモーター；ならびに
（ｂ）リプレッサーをコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーター。
〔１０〕内因性物質がアセチルＣｏＡである、〔９〕の方法。
〔１１〕目的物質が、メバロン酸またはイソプレノイドである、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕目的物質がアミノ酸である、〔１〕～〔８〕のいずれかの方法。
〔１３〕目的物質がポリペプチドである、〔１〕～〔８〕および〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕前記第１微生物および前記第２微生物が同種の微生物である、〔１〕～〔１３〕のいずれかの方法。
〔１５〕前記第１微生物および／または前記第２微生物がグラム陰性細菌である、〔１〕～〔１４〕のいずれかの方法。
〔１６〕前記第１微生物および／または前記第２微生物が、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌である、〔１〕～〔１５〕のいずれかの方法。
〔１７〕エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、〔１６〕の方法。
〔１８〕前記第１微生物および／または前記第２微生物が、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）細菌である、〔１〕～〔１５〕のいずれかの方法。
〔１９〕パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）細菌がパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）である、〔１８〕の方法。
〔２０〕クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を含む共培養系。
〔２１〕クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーを産生する能力を有しない微生物。
〔２２〕クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有しない微生物。

　第１微生物および第２微生物を用いる本発明の方法は、誘導剤を使用することなく、菌体増殖期と物質生産期とを効率的に切り替えることにより、培地中の炭素源から目的物質を効率的に生産することができる。本発明の方法は、微生物の増殖に必要とされる内因性物質（菌体増殖と物質生産との間で競合する物質）を目的物質の合成のために利用することにより、目的物質の生産の開始後に、微生物の増殖を相対的に抑制することができる。また、本発明によれば、本発明の方法に有用である共培養系および微生物が提供される。

図１は、実施例４で用いたＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ）およびＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ）におけるｇｌｔＡ遺伝子（メバロン酸生合成と共通中間物質であるアセチルＣｏＡを基質とするＴＣＡ回路の初発反応を行う、菌体増殖に必要な酵素をコードする遺伝子）の発現調節機構の概要を示す図である。菌体増殖後にｇｌｔＡ遺伝子の発現を抑制することにより、菌体増殖が抑制される一方で、目的物質の生産のためにアセチルＣｏＡを効率よく供給することができる。菌体増殖後のｇｌｔＡ遺伝子の発現の抑制は、ｇｌｔＡ遺伝子の発現を改変型ＰＬプロモーター（ＰＬｔｅｔＯ１；ＰＬプロモーターを抑制するためのリプレッサー（ｔｅｔＲ）が結合する領域をＰＬプロモーター内に導入した改変型プロモーター）で制御し、そしてリプレッサー（ｔｅｔＲ）の発現を野生型Ｐｌｕｘプロモーターで制御することにより行うことができる。（Ａ）菌体生育時の概要を示す。菌体生育時には、細胞密度が低く、オートインデューサー（ｌｕｘＩ）の濃度が不十分であり、Ｐｌｕｘを活性化するのに十分な量の転写調節複合体〔オートインデューサー（ｌｕｘＩ）およびそのレセプター（ｌｕｘＲ）の複合体〕が供給されない。その結果、リプレッサー（ｔｅｔＲ）の発現が抑制され、ひいては当該リプレッサーによるｇｌｔＡ遺伝子の発現抑制を実現できないため、菌体増殖に必要であるｇｌｔＡ遺伝子が発現する。また、Ｐｌｕｘを活性化するのに十分な量の転写調節複合体が供給されないため、目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子（ｍｖａＡ、ｈｍｃＭ、およびｔｈｉＬ）の発現も抑制される。（Ｂ）目的物質の生産時の概要を示す。細胞密度が高くなると、オートインデューサー（ｌｕｘＩ）の濃度が十分になり、Ｐｌｕｘを活性化するのに十分な量の転写調節複合体が供給される。その結果、リプレッサー（ｔｅｔＲ）の発現が促進され、ひいては当該リプレッサーによるｇｌｔＡ遺伝子の発現抑制を実現できるため、菌体増殖に必要であるｇｌｔＡ遺伝子の発現が抑制される。また、Ｐｌｕｘを活性化するのに十分な量の転写調節複合体が供給されるため、目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子（ｍｖａＡ、ｈｍｃＭ、およびｔｈｉＬ）の発現も促進される。 図２は、Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株とＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株の共培養によるメバロン酸（ＭＶＡ）の蓄積量（ｇ／Ｌ）を示す図である。植菌時のＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株の割合を％で示す。Ｎ＝３の平均値とエラーバーは標準偏差値で示す。ＬｕｘＩＲ：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株（第２微生物）；ＬｕｘＲ：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株（第１微生物）。

　本発明は、目的物質の生産方法を提供する。本発明の方法は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を共培養して目的物質を生産することを含む。

　クオラムセンシングは、自分と同種の微生物の密度を感知して、それに応じて所定の物質の産生を制御する機構である。クオラムセンシングは、微生物がある程度以上の微生物密度（菌体量）に増殖するまで特定の物質生産を抑える一方、十分な微生物密度に到達したときには所定の物質の産生を行うことから、微生物の生存戦略と密接に関連していると考えられている。

　クオラムセンシングを担うオートインデューサーは、クオルモンとも呼ばれており、転写制御因子と結合して転写活性化作用を示すことにより目的タンパク質の合成を促進することができる。このようなオートインデューサーは、それを産生した微生物自体で作用するのみならず、菌体外に分泌されて他の微生物にも取り込まれることにより、取り込まれた微生物でも作用することができる。微生物密度が低い（菌体量が少ない）場合、微生物内で産生されたオートインデューサーは微生物外に分泌され拡散され、微生物内のオートインデューサー濃度は低くなることから、転写活性化作用の程度も低くなり目的タンパク質の合成を殆ど促進することができない。一方、微生物密度が高い（菌体量が多い）場合、微生物内のオートインデューサー濃度は高くなることから、転写活性化作用の程度も高くなり目的タンパク質の合成を強く促進することができる。

　クオラムセンシングを担うオートインデューサーとしては、多くのグラム陰性細菌で産生されているＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）を使用することができる。ＡＨＬにおけるアシルは、微生物の種類によっても異なるが、炭素原子数４～１６であることが多い。異なる炭素原子数のアシルを有するＡＨＬが、微生物の種類に応じて利用されている。より具体的には、ＡＨＬとしては、例えば、Ｎ－ブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシブタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘプタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－オクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシオクタノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシノナノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－デカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシウンデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシドデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－トリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシトリデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－テトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシテトラデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシペンタデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－ヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－オキソヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトン、Ｎ－３－ヒドロキシヘキサデカノイル－Ｌ－ホモセリンラクトンが挙げられる。また、クオラムセンシングを担うオートインデューサーとしては、ＡＨＬ以外にも、４，５－ジヒドロキシ－２，３－ペンタンジオン（ＡＩ２：オートインデューサー２）；ＨＨＱ（２－アルキル－４－キノロン）、ＰＱＳ（２－アルキル－３－ヒドロキシ－４－キノロン）等のキノロン・キノリン類；インドール類；ペプチド；環状ジペプチド等の因子を使用することができる。好ましくは、オートインデューサーは、ＡＨＬである。

　オートインデューサーは、それと結合して転写活性化作用を示す転写因子（オートインデューサーのレセプター）に結合することで、その作用を発揮することができる。ＡＨＬと結合して転写活性化作用を示す転写因子としては、例えば、ＡＨＬレセプター（ＡＨＬレセプター遺伝子であるＬｕｘＲによりコードされるタンパク質）を使用することができる。上述したような異なる炭素原子数のアシルを有するＡＨＬに対するレセプターが、微生物の種類に応じて利用されている。より具体的には、ＡＨＬレセプターとしては、例えば、ｌｕｘＲ、ＴｒａＲ，ＲａｉＲ、ＣｉｎＲ、ＲｈｉＲ、ＢｉｓＲ、ＴｒｉＲ、Ｙ４ｑＨ、ＣｅｒＲ、ＣｅｐＲ，ＳｏｌＲ、ＡｈｙＲ、ＡｓａＲ、ＥａｇＲ、ＥｘｐＲ、ＣａｒＲ、ＥｃｂＲ、ＳｄｉＡ，ＳｗｒＲ、ＳｍａＲ、ＹｅｎＲ、ＬａｓＲ、ＲｈｌＲ、ＰｓｙＲ、ＡｂｌＲ、ＶａｎＲ，ＢｊａＲ、ＰｈｚＲ、ＯｒｙＲ、ＥａｎＲ、ＸａｇＲ、ＡｖｉＲ、ＴｏｆＲが挙げられる。また、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに対するレセプターとしては、ＡＨＬレセプター以外にも、ＡＩ－２レセプターとしてＬｓｒＢ、ＰｂｓＢ、ＲｂｓＢ、およびＬｕｘＰ；キノロン・キノリン類のレセプターとしてＰｑｓＲ；ペプチドＡＩＰ－ＩのレセプターとしてＡｇｒＣおよびＡｇｒＡ；インドール類のレセプターとしてｂａｅＳＲおよびｃｐｘＡＲ等のレセプターを使用することができる。好ましくは、オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子は、ＡＨＬレセプター（ＡＨＬレセプター遺伝子であるＬｕｘＲによりコードされるタンパク質）である。

　オートインデューサーは、微生物においてオートインデューサーの合成酵素により産生される。オートインデューサーの合成酵素としては、例えば、ＡＨＬの合成酵素（例、ＬｕｘＩ、ＴｒａＩ、ＲａｉＩ、ＣｉｎＩ、ＲｈｉＩ、ＣｅｒＩ、ＣｅｐＩ、ＣｖｉＩ、ＳｏｌＩ、ＡｈｙＩ、ＡｓａＩ、ＥａｇＩ、ＥｘｐＩ、ＥｃｂＩ、ＥｓａＩ、ＳｗｒＩ、ＳｍａＩ、ＹｅｎＩ、ＬａｓＩ、ＳａｌＩ、ＲｈｌＩ、ＰｈｚＩ、ＰｓｙＩ、ＡｈｌＩ、ＶａｎＩ、ＢｊａＩ、ＰｈｚＩ、ＥａｎＩ、ＴｏｆＩ）、ＡＨＬの合成酵素以外のオートインデューサーの合成酵素（例、ＬｕｘＳ、ＣｑｓＡ、ＬｕｘＭ　ＡＨＬ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）が挙げられる。好ましくは、オートインデューサーの合成酵素は、ＡＨＬの合成酵素である。

　オートインデューサー、およびそれと結合して転写活性化作用を示す転写因子はそれぞれ、クオラムセンシングの機構を有する微生物由来のものを使用することができるが、好ましくは、クオラムセンシングの機構を有する微生物として種々のグラム陰性菌が報告されていることを考慮すると、グラム陰性菌由来のオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子を用いることができる。オートインデューサーおよびそれと結合する転写因子が由来するグラム陰性菌としては、例えば、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌〔例、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ）、ビブリオ・アングイラルム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）〕、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）細菌〔例、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）〕、エンテロバクテリア属（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）細菌〔例、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）〕、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）細菌〔例、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・ステワルチイ（Ｐａｎｔｏｅａ　ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、エルウィニア属（Ｅｒｖｉｎｉａ）細菌〔例、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルウィニア・キリサントベミ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｈｒｙｓａｎｔｂｅｍｉ）〕、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌〔例、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）〕、サルモネラ属細菌〔例、サルモネラ・チプビムリアム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｂｉｍｕｒｉｕｍ）〕、エルシニア属細菌〔例、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）〕、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細菌〔例、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・アレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブブイ・タバキ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ｐｖ.ｔａｂａｃｉ）、シュードモナス・シリンガエ・ピーブイ・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ｐｖ.ｓｙｒｉｎｇａｅ）〕、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌〔例、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｔｉｓ）〕、リゾビウム属（Ｒｂｉｚｏｂｉｕｍ）細菌〔例、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグミノサラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、リゾビウム・エスピー・ＮＧＲ２３４（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐ．ＮＧＲ２３４）、リゾビウム・スファエロイデス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）〕、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）細菌〔例、アエロモナス・ハイドロピビラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｂｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）〕が挙げられる。オートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の組合せは、これらが相互作用して転写活性化作用を示すことができる限り特に限定されないが、同種の微生物由来のオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の組合せを使用することが好ましい。より好ましくは、オートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子は、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ）等のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌のものである。

　クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物としては、上述したようなオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する微生物を使用することができる。好ましくは、第１微生物は、目的物質の生合成に関与するタンパク質およびオートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子の双方を発現し、かつ目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の複合体を介して促進される微生物である。目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の複合体を介して促進される微生物としては、例えば、（ａ）オートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の複合体により活性化され得るオートインデューサー依存性プロモーターの制御下に配置されている、目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子を含む微生物（目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサー依存性プロモーターにより直接的に制御される微生物）、ならびに（ｂ）目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子が、上述したようなオートインデューサー依存性プロモーターではない誘導性プロモーターの制御下に配置されており、かつ、当該誘導性プロモーターを直接的または間接的に制御する能力を有する所定の転写因子（例、アクチベーター）をコードする１以上の遺伝子が、上述したようなオートインデューサー依存性プロモーターの制御下に配置されている微生物（目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサー依存性プロモーターにより間接的に制御される微生物）が挙げられる。遺伝子のプロモーターへの配置は、単一遺伝子が単一プロモーターの制御下に配置されるモノシストロニック様式、または複数遺伝子が単一プロモーターの制御下に配置されるポリシストロニック様式のいずれかであってもよい。微生物の発現システムの簡便な構築等の観点からは、目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の複合体を介して促進される（ａ）の微生物が好ましい。

　目的物質は、微生物において生合成が可能である任意の物質であり、商業的に価値のある物質（例、医薬、食品、化粧品または試薬等の製品における成分）が好ましい。目的物質の生合成に関与するタンパク質は、目的物質の種類に応じて異なる。本発明では、微生物において生合成が可能である任意の目的物質を生産することができるため、このような目的物質の種類に応じて、目的物質の生合成に関与するタンパク質の種類を適宜選択することができる。

　一実施形態では、目的物質は、メバロン酸、またはイソプレノイドであってもよい。したがって、目的物質の生合成に関与するタンパク質として、メバロン酸、またはイソプレノイドの生合成に関与するタンパク質（好ましくは酵素）を使用することができる。

　メバロン酸の生合成に関与するタンパク質としては、例えば、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡレダクターゼ（例、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３４）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．４．１．３．５）、アセチルＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（チオラーゼ）（例、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）が挙げられる。

　イソプレノイド化合物は、分子式（Ｃ５Ｈ８）ｎを有する１以上のイソプレン単位からなる。イソプレノイド化合物は、テルペンまたはテルペノイドとも呼ばれる。テルペンとテルペノイドとの相違は、テルペンが炭化水素であるのに対し、テルペノイドはさらなる官能基を含む点にある。テルペンは、分子中のイソプレン単位数により分類される〔例えば、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セステルテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、セスカルテルペン（Ｃ３５）、テトラテルペン（Ｃ４０）、ポリテルペン、ノルイソプレノイド〕。モノテルペンとしては、例えば、ピネン、ネロール、シトラール、カンファー、メントール、リモネン、およびリナロールが挙げられる。セスキテルペンとしては、例えば、ネロリドール、およびファルネソールが挙げられる。ジテルペンとしては、例えば、フィトール、およびビタミンＡ１が挙げられる。スクアレンはトリテルペンの例である。また、カロテノイド〔例、カロテン（例、プロビタミンＡ１）、キサントフィル〕は、テトラテルペンとして知られている。テルペンまたはテルペノイドの詳細は、種々の刊行物に記載されている（例、Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　２，６７４～６８１（２００６）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　５，２８３～２９１（２００９）；Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　３，９３７～９４７（２００５）；Ａｄｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｅｎｇ　Ｂｉｏｔｅｃｈｍｏｌ（ＤＯＩ：１０．１００７／１０＿２０１４＿２８８）。不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されており、これらもイソプレノイド化合物に含まれる。

　イソプレノイドは、多くの生物（例、微生物、植物、動物）が有するメバロン酸（ＭＶＡ）経路〔例、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，　Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｍｉｚｉｏｒｋｏ　ＨＭ，Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．５０５，１３１－１４３（２０１１）を参照〕および／またはメチルエリスリトール－４－リン酸（ＭＥＰ）経路〔例、Ｋｕｚｕｙａｍａ　ＴおよびＳｅｔｏ　Ｈ，Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．８８，４１－５２（２０１２）；Ｇｒaｗｅｒｔ　Ｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｍｏｌ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ．６８，３７９７－３８１４（２０１１）を参照〕を介して、イソプレン単位の前駆体であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）および／またはジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）から生合成される。したがって、イソプレノイドの生合成に関与するタンパク質としては、（１）種々のイソプレノイドの生合成に共通する前駆物質であるＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生合成に関与する酵素、または（２）個々のイソプレノイドの生合成に特異的に関与する酵素（ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰよりも下流の生合成経路に関与する酵素）が挙げられる。
　ＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの生合成に関与する酵素としては、例えば、ＭＶＡ経路に関与する酵素、ＭＥＰ経路に関与する酵素、ならびにＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ間の変換能を有する酵素が挙げられる。
　ＭＶＡ経路に関与する酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．７．１．３６）、ホスホメバロン酸キナーゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．７．４．２）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（例、Ｅ．Ｃ．４．１．１．３３）、アセチル－ＣｏＡ－Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．３．３．１０）、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（例、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３４、およびＥ．Ｃ．１．１．１．８８）、アセチル－ＣｏＡ－アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡリダクターゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９／１．１．１．３４）が挙げられる。
　ＭＥＰ経路に関与する酵素としては、例えば、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸シンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．２．１．７）、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース－５－リン酸リダクトイソメラーゼ（例、Ｅ．Ｃ．１．１．１．２６７）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールシンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．７．７．６０）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトールキナーゼ（例、Ｅ．Ｃ．２．７．１．１４８）、２－Ｃ－メチル―Ｄ－エリスリトール－２，４－シクロニリン酸シンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．４．６．１．１２）、１－ヒドロキシ－２－メチル－２－（Ｅ）－ブテニル－４－ニリン酸シンターゼ（例、Ｅ．Ｃ．１．１７．７．１）、４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸レダクターゼ（例、Ｅ．Ｃ．１．１７．１．２）が挙げられる。
　ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ間の変換能を有する酵素としては、例えば、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（例、Ｅ．Ｃ．５．３．３．２）が挙げられる。
　個々のイソプレノイドの生合成に特異的に関与する酵素としては、例えば、リモネンシンターゼ（目的物質がリモネンの場合）、リナロールシンターゼ（目的物質がリナロールの場合）、リナロールシンターゼ、チトクロームｐ４５０モノオキシゲナーゼ、およびトランスカルベオールデヒドロゲナーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素（目的物質がカルボンの場合）、バレンセンシンターゼからなる群より選ばれる１以上の酵素（目的物質がバレンセンの場合）、バレンセンシンターゼ、チトクロームＰ４５０、およびアルコールオキシダーゼからなる群より選ばれる１以上の酵素（目的物質がヌートカトンの場合）が挙げられる。

　別の実施形態では、目的物質は、ポリペプチドであってもよい。したがって、目的物質の生合成に関与するタンパク質として、ポリペプチドの生合成に関与するタンパク質を使用することができる。このようなポリペプチドは、医薬、食品、化粧品または試薬等の製品における成分として用いることができる。あるいは、このようなポリペプチドは、微生物において別の目的物質（例、上述したようなメバロン酸、またはイソプレノイド）の生産が意図される場合に、当該別の目的物質の生合成に関与するタンパク質であってもよい。より具体的には、目的物質であるポリペプチドとしては、例えば、セルラーゼ、アルブミン、ラミニン、ＥＰＯが挙げられる。

　本発明では、微生物の増殖に必要とされる内因性物質を、目的物質の合成のために利用することができる。目的物質の合成のために利用することができる微生物の増殖に必要とされる内因性物質は、上述した目的物質の種類に応じて異なるが、効率的に本発明の方法を行う観点から、微生物が培養培地中の成分（例、培地中の炭素源）から十分に生合成することができる内因性物質が好ましい。より好ましくは、菌体増殖期と物質生産期との切り替えを強化する観点から、微生物の増殖に必要とされる内因性物質として、菌体増殖と物質生産との間で競合する物質を利用することが好ましい。微生物の増殖に必要とされる内因性物質を目的物質の合成のために利用することで、微生物の増殖を相対的に抑制することができる。さらにより好ましくは、菌体増殖期と物質生産期との切り替えのさらなる強化の観点から、微生物の増殖に必要とされる内因性物質としては、培養培地中に含まれない、または不十分な量でしか含まれない内因性物質を使用することができる（例、内因性物質の枯渇培地の使用）。

　微生物の増殖に必要とされる内因性物質としては、例えば、微生物の構造の構成要素の供給および細胞分裂に必要である内因性物質が挙げられる。このような内因性物質としては、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、アミノ酸生合成系、または脂質生合成系に関与する内因性物質が好ましい。
　トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に関与する内因性物質としては、例えば、ＴＣＡ回路に流入する物質であるアセチル－ＣｏＡ、ならびにＴＣＡ回路を構成するクエン酸、アコニット酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、α－ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、およびオキサロ酢酸が挙げられる。
　アミノ酸生合成系に関与する内因性物質としては、例えば、（ａ）ヒスチジンの前駆体であるリボース－５－リン酸、（ｂ）セリン、システインおよびグリシンの前駆体である３－ホスホグリセリン酸、（ｃ）トリプトファン、フェニルアラニンおよびチロシンの前駆体であるホスホエノールピルビン酸、（ｄ）アラニン、ロイシンおよびバリンの前駆体であるピルビン酸、（ｅ）アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、スレオニン、メチオニンおよびイソロイシンの前駆体であるオキサロ酢酸、ならびに（ｆ）プロリン、グルタミン酸、グルタミンおよびアルギニンの前駆体であるα－ケトグルタル酸が挙げられる。
　脂質生合成系に関与する内因性物質としては、例えば、アセチル－ＣｏＡ、マロニル－ＣｏＡ、アセチル－ＡＣＰ、マロニル－ＡＣＰ、３－オキソアシル－ＡＣＰ、３－ヒドロキシアシル－ＡＣＰ、エノイル－ＡＣＰ、アシル－ＡＣＰ（例、ブチリル－ＡＣＰ）、および３－オキソアシル－ＡＣＰ、脂肪酸アシル－ＡＣＰが挙げられる。
　微生物の増殖に必要とされる内因性物質としては、上述した２以上の生合成系に共通して関与する内因性物質が好ましく、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に関与する内因性物質がより好ましく、アセチル－ＣｏＡおよびピルビン酸（アセチルＣｏＡの前駆体であり、また、アミノ酸生合成系にも関与する内因性物質）がさらにより好ましい。特に好ましくは、本発明では微生物の増殖に必要とされる内因性物質としてアセチル－ＣｏＡを利用することができる。

　特定の実施形態では、第１微生物は、以下を含んでいてもよい：
（１）目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーターを含む第１発現単位；ならびに
（２）オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子をコードする遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第２発現単位。

　本発明において、上述した第１発現単位および第２発現単位、ならびに後述する第３発現単位における用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定の遺伝子（ポリヌクレオチド）およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該遺伝子の転写、ひいては当該遺伝子によりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントを適宜含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位はまた、宿主細胞に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ））であっても、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、非固有）であってもよい。ここで、表現「発現単位が異種である」とは、タンパク質として発現されるべき所定の遺伝子およびそれに作動可能に連結されたプロモーターのいずれか一方または双方が微生物（宿主細胞）に対して異種であることをいう。発現単位はまた、タンパク質として発現されるべき１つの遺伝子、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、モノシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）、またはタンパク質として発現されるべき複数の遺伝子（例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上の遺伝子）、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）であってもよい。発現単位は、微生物（宿主細胞）においてゲノム領域（例、上記タンパク質をコードする遺伝子が固有に存在する天然ローカスである天然ゲノム領域、もしくは当該天然ローカスではない非天然ゲノム領域）、または非ゲノム領域（例、細胞質内）に含まれることができる。発現単位は、１または２以上（例、１、２、３、４、または５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、および人工染色体が挙げられる。発現単位を構成するプロモーターは、遺伝子に作動可能に連結されることにより、遺伝子によりコードされるタンパク質を微生物で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、微生物に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種である。

　第１発現単位における、目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子としては、上述したタンパク質をコードする１以上の遺伝子を使用することができる。

　第１発現単位におけるオートインデューサー依存性プロモーターは、上述したオートインデューサーおよびそれに結合する能力を有する転写因子の複合体が結合して転写促進作用を示すプロモーターである。このようなプロモーターは、オートインデューサーおよびそれに結合する能力を有する転写因子の種類に応じて適宜選択することができる。オートインデューサー依存性プロモーターとしては、例えば、ｌｕｘプロモーター（Ｐｌｕｘ）、ｌａｓ－ｒｈｌ　ｂｏｘを持つプロモーター、ｔｒａ　ｂｏｘを持つプロモーター、Ｅｓａ　ｂｏｘを持つプロモーターが挙げられる。好ましくは、オートインデューサー依存性プロモーターは、Ｐｌｕｘである。このようなプロモーターはまた、オートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子と同種の微生物のものを使用することができる。好ましくは、オートインデューサー依存性プロモーターは、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ）等のビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌のものである。

　第２発現単位における、オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子をコードする遺伝子としては、上述した転写因子をコードする遺伝子を使用することができる。

　第２発現単位におけるプロモーターとしては、例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーターが挙げられる。好ましくは、微生物（宿主細胞）で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。微生物で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、微生物で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。

　好ましくは、第１微生物は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有し、かつ、当該オートインデューサーを産生する能力を有しない微生物であってもよい。このような第１微生物は、オートインデューサーを産生する能力を有しない（例、オートインデューサーの合成酵素を発現しない）ことから、第２微生物の不在下では目的物質を生産することができないが、第２微生物との共培養により目的物質を生産することができる。このような第１微生物を用いることで、第１微生物および第２微生物の混合（共培養の開始条件）により、菌体増殖期から物質生産期への切り替えの時期を厳密に制御することができる。したがって、このような第１微生物は、菌体増殖期から物質生産期への切り替えの厳密な制御による、効率的な目的物質の生産に有用である。オートインデューサーを産生する能力を有しない第１微生物としては、以下の発現単位（１’）を含まない微生物を使用することが好ましい：
（１’）オートインデューサーの合成酵素をコードする遺伝子、および当該遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位。

　クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物としては、上述したようなオートインデューサーを産生する能力を有する微生物を使用することができる。好ましくは、第２微生物は、オートインデューサーの合成酵素を発現する微生物である。

　特定の実施形態では、第２微生物は、以下を含んでいてもよい：
（３）オートインデューサーの合成酵素をコードする遺伝子、および当該遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第３発現単位。

　第３発現単位における、オートインデューサーの合成酵素をコードする遺伝子としては、上述したオートインデューサーの合成酵素をコードするものを使用することができる。

　第３発現単位におけるプロモーターとしては、例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーターが挙げられる。好ましくは、微生物（宿主細胞）で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。微生物で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、微生物で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。

　特定の実施形態では、第２微生物は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有し、かつ、当該オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有しない微生物であってもよい。オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有しない微生物は、目的物質の生合成に関与するタンパク質、および／またはオートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子を産生する能力を有しない微生物であってもよい。このような第２微生物は、作製が簡便であるという利点を有する。このような第２微生物はまた、共培養されるべき第１微生物において目的物質の生産を回避できるのみならず、第２微生物自体においても第１微生物の不在下で目的物質の生産を回避することにより、共培養系全体において菌体増殖期から物質生産期への切り替えの時期を厳密に制御できることから、共培養系全体における効率的な目的物質の生産に有用であるというさらなる利点を有する。このような第２微生物としては、以下の発現単位（２’）ならびに／あるいは（３’）を含まない微生物を使用することが好ましい：
（２’）目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーターを含む発現単位；ならびに／あるいは
（３’）オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子をコードする遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位。

　別の特定の実施形態では、第２微生物は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有し、かつ、当該オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する微生物であってもよい。オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する微生物は、上述した第１微生物と同様に、目的物質の生合成に関与するタンパク質およびオートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子の双方を発現し、かつ目的物質の生合成に関与するタンパク質の発現がオートインデューサーおよびそれと結合する能力を有する転写因子の複合体を介して促進される微生物であってもよい。したがって、このような第２微生物は、クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有しつつ、上述した発現単位（２’）ならびに／あるいは（３’）を含む微生物であってもよい。

　第１微生物および／または第２微生物は、微生物の増殖に必要とされる内因性物質の利用を、微生物の増殖後において制限することにより、菌体増殖期と物質生産期とを効率的に切り替え、ひいては培地中の炭素源から目的物質を効率的に生産するために、以下（ａ）および（ｂ）を含む遺伝子発現制御系を含んでいてもよい（例、図１を参照）：
（ａ）微生物の増殖に必要とされる内因性物質の変換に関与する酵素をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたリプレッサー抑制性プロモーター；ならびに
（ｂ）リプレッサーをコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーター。

　（ａ）において、微生物の増殖に必要とされる内因性物質の変換に関与する酵素としては、微生物の増殖に必要とされる当該内因性物質の消費に対して不利に作用する酵素が挙げられる。このような酵素としては、例えば、トリカルボン酸（ＴＣＡ）回路、アミノ酸生合成系、または脂質生合成系に関与する酵素が挙げられるが、ＴＣＡ回路に関与する酵素が好ましい。ＴＣＡ回路に関与する酵素としては、例えば、アセチルＣｏＡを基質とするＴＣＡ回路の初発反応を行う、アセチルＣｏＡをクエン酸に変換する酵素（例、クエン酸シンターゼ／ｇｌｔＡ遺伝子）、クエン酸をイソクエン酸に変換する酵素（例、アコニターゼ／ａｃｎＢ遺伝子）、イソクエン酸を２－オキソグルタル酸に変換する酵素（例、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ／ｉｃｄ遺伝子）、２－オキソグルタル酸をスクシニルＣｏＡに変換する酵素（例、２－オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ／ｓｕｃＡ／Ｂ／ｌｐｄ遺伝子）、スクシニルＣｏＡをコハク酸に変換する酵素（例、スクシニルＣｏＡシンテターゼ／ｓｕｃＣ遺伝子）、コハク酸をフマル酸に変換する酵素（例、コハク酸デヒドロゲナーゼ／ａｄｈＣ遺伝子）、フマル酸をリンゴ酸に変換する酵素（例、フマル酸ヒドラターゼ／ｆｕｍＣ遺伝子）、およびリンゴ酸をオキサロ酢酸に変換する酵素（例、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ／ｍｄｈ／ｍｑｏ遺伝子）が挙げられる。より好ましくは、微生物の増殖に必要とされる内因性物質の変換に関与する酵素は、アセチルＣｏＡをクエン酸に変換する酵素（例、クエン酸シンターゼ／ｇｌｔＡ遺伝子）である。

　（ａ）におけるリプレッサー抑制性プロモーターは、リプレッサーが結合すると、転写が抑制されるプロモーターである。リプレッサー抑制性プロモーターとしては、例えば、Ｌａｃプロモーター（ｌａｃオペロン）、Ｔｒｐプロモーター、およびＴｅｔプロモーターが挙げられる。

　（ｂ）におけるリプレッサーは、リプレッサー抑制性プロモーターが結合すると、その転写活性を低減できる因子である。このようなリプレッサーとしては、例えば、ＴｅｔＲ、ｌａｃＩ、およびｔｒｐＲとトリプトファンの組合せが挙げられる。

　（ｂ）におけるオートインデューサー依存性プロモーターは、上述したものと同様である。

　上述した第１微生物および第２微生物としては、任意の微生物（宿主細胞）を用いることができる。このような微生物としては、例えば、グラム陽性菌およびグラム陰性菌が挙げられる。グラム陽性菌としては、例えば、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌〔例、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）〕、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌〔例、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）〕が挙げられる。グラム陰性菌としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する微生物を使用することができる。また、グラム陰性菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌〔例、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）〕、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌〔例、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）〕を用いることもできる。第１微生物および第２微生物としては、グラム陰性菌が好ましい。第１微生物および第２微生物は、同種または異種のいずれの微生物であってもよいが、同種の微生物であることが好ましい。

　第１微生物および第２微生物として用いられる宿主細胞は、内因性遺伝子が改変されていてもよい。例えば、このような宿主細胞は、内因性クオラムセンシング遺伝子が欠失するようにゲノムが改変されていてもよい。内因性クオラムセンシング遺伝子としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉについてはＳｄｉＡ遺伝子、パントエア・アナナティスについてはｅａｎＩＲ遺伝子およびｒｈｌＩＲが報告されているので、このような遺伝子が欠失するように宿主細胞のゲノムを改変することができる。他の微生物を宿主細胞として用いる場合も、内因性クオラムセンシング遺伝子を適宜欠失させることができる。

　上述した第１微生物および第２微生物は、当該分野において公知である任意の方法により作製することができる。例えば、上述したような形質転換微生物は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。

　発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。

　発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。

　発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用されている発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。

　本発明の方法では、上述したような第１微生物および第２微生物を共培養することにより、目的物質を生産することができる。共培養における第１微生物および第２微生物の混合比率は、適宜調節することができるが、特定の混合比率で行われてもよい。興味深いことに、共培養において第２微生物の菌体量が第１微生物の菌体量よりも少ない場合、目的物質の対グルコース消費収率が増加することが確認されている（実施例４、表４）。したがって、本発明の方法では、共培養において第２微生物の菌体量が第１微生物の菌体量よりも少なくなるように、第１微生物含有液および第２微生物含有液が混合されることが好ましい。

　共培養における第１微生物および第２微生物の混合比率は、第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）として評価することができる。第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）は、好ましくは５０％未満であり、より好ましくは３０％以下であり、さらにより好ましくは１０％以下であり、特に好ましくは１％以下、０．１％以下または０．０１％以下であってもよい。本発明では、このような第２微生物の菌体量の割合（％）がこのように小さい値であっても、共培養の優れた効果が確認されている。したがって、本発明の方法は、第１微生物を培養して大量に増殖させた培養培地中に、別途少量培養された第２微生物を投入することにより、第１微生物および第２微生物の共培養が行われてもよい。このような第２微生物の菌体量の割合（％）はまた、目的物質の生産が可能である限り特に限定されないが、０．００００１％以上、０．０００５％以上、０．００１％以上、または０．００５％以上であってもよい。

　第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）は、第１微生物含有液および第２微生物含有液（例、微生物の培養液）のＯＤ値（例、波長６００～６６０ｎｍの吸光度）を考慮して、これらの含有液を適宜混合することにより評価することができる。例えば、第１微生物含有液および第２微生物含有液（例、微生物の培養液）のＯＤ値を所定の値（例、２．０）にそろえた後、これらをＡ：Ｂの液量比率で混合することにより、上記割合（％）を１００（％）×Ｂ／（Ａ＋Ｂ）の値に設定することができる。共培養に際しては、このような割合の第１微生物および第２微生物の混合液に対して、培養培地をさらに添加して、共培養開始時の微生物濃度を所定の範囲に適宜調節することもできる。共培養開始時の微生物濃度の範囲としては、例えば、ＯＤ値（例、波長６００～６６０ｎｍの吸光度）を基準にすると、例えば０．１～２．０の範囲の値、好ましくは０．２～１．８の範囲の値、より好ましくは０．３～１．６の範囲の値であってもよい。

　本発明の方法では、上述したような第１微生物および第２微生物の混合物を培養培地において培養することができる。共培養のための培養培地としては、当該分野において微生物の培養のために使用されるものを用いることができる。培養培地は、炭素源、窒素源、有機微量栄養源等の成分を含むことが好ましい。炭素源としては、例えば、単糖類（例、グルコース）、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等の無機イオンが少量添加されていてもよい。共培養のための培養培地はまた、上述した微生物の増殖に必要とされる内因性物質（例、アセチルＣｏＡ）を含まないか、または不十分な量でしか含まない培地であってもよい。

　共培養のための培養条件としては、特に限定されず、標準的な微生物の培養条件を用いることができる。培養温度としては、２０～４２℃が好ましく、３０～４０℃がより好ましい（例、３７℃）。ガス組成としては、ＣＯ_２濃度が約６％～約８４％であることが好ましく、ｐＨが、約５～９であることが好ましい。また、共培養される第１微生物および第２微生物の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。培養方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。このような培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が挙げられる。

　生産された目的物質の回収（例、単離、精製）は、適宜行うことができる。このような回収方法としては、例えば、クロマトグラフィー（例、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）、有機溶媒による抽出、遠心分離、透析、ならびに溶解度の差異を利用する方法（例、塩析）が挙げられる。

　本発明はまた、クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および当該オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を含む共培養系を提供する。本発明の共培養系は、上述したような培養培地を含んでいてもよい。本発明の共培養系は、例えば、本発明の方法の実施に有用である。

　本発明はさらに、（１）クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーを産生する能力を有しない微生物、ならびに（２）クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有しない微生物を提供する。本発明の微生物は、例えば、本発明の共培養系の構築、および本発明の方法の簡便な実施に有用である。

　以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクオラムセンシングを用いたメバロン酸生産（単独培養）
１－１）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５によるクオラムセンシングシステムを用いたメバロン酸生産菌の構築
　クオラムセンシングとは、グラム陰性細菌でＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（略ＡＨＬ）をオートインデューサーとして菌体の密度を感知し、遺伝子の発現制御を行う機構のことで、発光バクテリアＶｉｂｒｉｏ　Ｆｉｓｈｅｒｉの遺伝子が最もよく研究されている。Ｅ．ｃｏｌｉ内で、このＶｉｂｒｉｏ　ＦｉｓｈｅｒｉのＬｕｘシステム（ＡＨＬ合成遺伝子ＬｕｘＩとＡＨＬレセプター遺伝子であるＬｕｘＲ）を用いて、菌体密度を感知してメバロン酸の発現制御を行う株を、以下の手順により作製した。

１－２）Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｌａｃｔｉｓ由来メバロン酸経路上流遺伝子の染色体導入株の作製
　Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｌａｃｔｉｓ由来のメバロン酸経路の上流遺伝子をコードする塩基配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ＮＣ＿００２６６２．１、ｍｖａＡ　ＧＩ：１１１５２３０、ｈｍｃＭ　ＧＩ：１１１５２３２、ｔｈｉＬ　ＧＩ：１１５２３１）は公知である。この情報よりＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ｈｍｃＭ）、チオラーゼ（ｔｈｉＬ：翻訳開始コドンをＧＴＧからＭＴＧに変更）の順に、配列番号１のＲＢＳ配列を間に挟んで直線状に並べたオペロン構造となるように化学合成を行い、常法によりｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）とｔｒｐターミネーターを持つ発現プラスミドを、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社）を用いて構築した。このプラスミドをｐＳＴＶ－Ｐｔａｃ＿ＡＭＬ（配列番号２）と命名した。

　次に、ＭＧ１６５５の染色体上のｌｄｈＡ（ｂ１３８０）部位に導入するための遺伝子断片を以下の方法でＰＣＲ法を用いて調製した。

　最初に２つの断片を作製した。１つは薬剤遺伝子用断片で、ＰＣＲ用鋳型としてλａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲを有するゲノム断片を使用した。これは、カナマイシン耐性薬剤マーカー（Ｋｍ）、及びλファージのアタッチメントサイトであるλａｔｔＬ及びλａｔｔＲが含まれる。これらのヌクレオチド配列を配列番号３に示す。配列番号４と配列番号５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、薬剤遺伝子用断片としてΔｌｄｈＡ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲを得た。

　次に、メバロン酸経路上流遺伝子用断片のＰＣＲ鋳型として、先に述べたｐＳＴＶ－Ｐｔａｃ＿ＡＭＬ（配列情報２）を使用し、配列番号６と配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｌｕｘプロモーター（Ｐｌｕｘ）を持つメバロン酸上流遺伝子断片Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬを得た。最後に作製した２つの断片を鋳型に配列番号４と配列番号７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｌｄｈＡ遺伝子の上流５０ｂｐ、下流５０ｂｐが付加した染色体導入用遺伝子断片ΔｌｄｈＡ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬを増幅した。全てのＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼとして、タカラバイオ社より販売されているＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼを利用し、９８℃、２分、（９８℃、１０秒、５５℃、１５秒、７２℃、１分／ｋｂ）×４０サイクルの条件で反応を行った。また、遺伝子断片の精製はＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＧＦＰ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いた。

　ＭＧ１６５５の染色体上に遺伝子断片ΔｌｄｈＡ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬを導入する方法は、λ－ｒｅｄ法により実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５に温度感受性の複製能を有するプラスミドｐＫＤ４６を含むＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５（以下ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６と表記する）を、エレクトロポレーションのために用いた。プラスミドｐＫＤ４６［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１２，ｐ６６４０－６６４５］は、アラビノース誘導性ＰａｒａＢプロモーターに制御されるλＲｅｄシステムの遺伝子（λ、β、ｅｘｏ遺伝子）を含むλファージの合計２１５４塩基のＤＮＡフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号　Ｊ０２４５９，第３１０８８番目～３３２４１番目）を含む。

　ＭＧ１６５５／ｐＫＤ４６株をカルベシニリン１００ｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地で３０℃終夜培養した。その後、培養液１ｍＬを終濃度１ｍＭのアラビノースと１００ｍｇ／Ｌのカルベシニリンを含むＬＢ液体培地１００ｍＬに植菌して、３４℃３時間振とう培養をおこなった菌体を常法に従いコンピテントセルを作製し、先に調製した断片をエレクトロポーレーション法でコンピテントセルに導入した。ＳＯＣ培地で３４℃２時間培養後、カナマイシン含有寒天培地に塗布し、１６時間培養を行った。

　エレクトロポレーション法は、ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ　ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、電場強度１８ｋＶ／ｃｍ、コンデンサー容量２５μＦ、抵抗値２００Ωの条件で行った。得られた耐性コロニーは、配列番号８と配列番号９に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｌｄｈＡ（ｂ１３８０）部位にメバロン酸上流遺伝子が導入されていることを確認した。この株（ＭＧ１６５５　ΔｌｄｈＡ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬ）をＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株と命名した。

　次にＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株からａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミドｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓ（ＷＯ２００５／０１０１７５）を使用した。ｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓはλファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。ｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓが細胞に導入されると、同プラスミドと染色体上のａｔｔＬ、又はａｔｔＲとの間で組み換えが起こり、ａｔｔＬとａｔｔＲの間の遺伝子を切り出し、染色体上にはａｔｔＬ、又はａｔｔＲ配列のみ残る。
　ＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓにて形質転換し、３０℃培養でアンピシリン耐性を獲得したコロニーを取得した。次にｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓ除去のためＬＢ寒天培地上に植菌し、３７℃で一晩培養して得たコロニーのアンピシリン耐性及びカナマイシン耐性を試験し、ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲとｐＭＷ－ｉｎｔｘｉｓ－ｔｓが脱落しているカナマイシン遺伝子除去株を得た。この株をＭＧ－ＡＭＬ－Ｆｒｅｅ株と命名した。

１－３）Ｖｉｂｒｉｏ　Ｆｉｓｈｅｒｉ由来ＬｕｘＩ及びＬｕｘＲ遺伝子の染色体導入株の作製
　発光バクテリアＶｉｂｒｉｏ　Ｆｉｓｈｅｒｉ由来ｌｕｘＩ及びｌｕｘＲ遺伝子をコードする塩基配列（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ＮＣ＿０１１１８６、ｌｕｘＩ　ＧＩ：６８０８０３３、ＬｕｘＲ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ１７０１０４）は公知である。この配列を用いて構築されたプラスミドｐＴＡ１１０９（Ｔ．ｈａｎａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２０１５；３０：７－１５，配列番号１０）をＰＣＲ鋳型として用い、ＭＧ１６５５の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位に導入するための遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｌｕｘＩ－Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ（配列番号１１）を以下の方法で構築した。

　最初に３つの断片（ａ、ｂ、ｃ）を作製した。ａ断片はカナマイシン耐性遺伝子用断片（λａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲ）で、配列番号１２と配列番号１３に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて１－２と同様にＰＣＲ反応を行い、断片を得た。ｂ断片は、ｌｕｘプロモーター（Ｐｌｕｘ）によるｌｕｘＩ遺伝子発現用断片で、ｐＴＡ１１０９プラスミドを鋳型に、配列番号１４と配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、断片を得た。ｃ断片は、ｔａｃプロモーター（Ｐｔａｃ）によるｌｕｘＲ遺伝子発現用断片で、ｐＴＡ１１０９プラスミドを鋳型に、配列番号１６と配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、断片を得た。最後にａ、ｂ、ｃの断片を鋳型に、配列番号１２と配列番号１５に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｉｎｓＨ４遺伝子の上流５０ｂｐ、下流５０ｂｐが付加した染色体導入用遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｌｕｘＩ－Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ（配列番号１１）を増幅した。この断片を１－２と同様に調製し、ｐＫＤ４６を導入したＭＧ－ＡＭＬ－Ｆｒｅｅ株の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にλ－ｒｅｄ法で導入した。得られたカナマイシン耐性コロニーは、配列番号２１と配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にｌｕｘＩとｌｕｘＲ両遺伝子が導入されていることを確認した。この株（ＭＧ１６５５　ΔｌｄｈＡ：：Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｌｕｘＩ－Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ）をＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株と命名した。

１－４）クオラムセンシングシステムによるメバロン酸生産菌ＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株の培養結果
　クオラムセンシングシステムによるメバロン酸生産菌ＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株の培養評価を実施した。カナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）入りＬＢ寒天培地上で３４℃１６時間培養したＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株、及び対照用株として培養したＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株を、各々菌体１白金耳をＭＳ－Ｍｅｔ培地（グルコース４０ｇ、酵母エキス２ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物１ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、硫酸鉄・７水和物１０ｍｇ、硫酸マンガン・５水和物１０ｍｇ、ＤＬ－Ｍｅｔ１ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調製後、炭酸カルシウムを５０ｇ加えた培地）４ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃で２４時間振とう培養する。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のメバロン酸の蓄積量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）により定量した。結果を表１に示す。

　表１から明らかなように、Ｐｌｕｘで発現制御されるメバロン酸経路上流遺伝子は、単独（ＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株）では発現しないのでメバロン酸は生産されないが、ｌｕｘＩ及びＬｕｘＲ両遺伝子を導入したＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株は、クオラムセンシングシステムによりメバロン酸経路上流遺伝子が発現し、６．４ｇ／Ｌのメバロン酸蓄積量を示した。メバロン酸経路はアセチルＣｏＡを出発物質としているが、アセチルＣｏＡは菌体増殖に必要な物質を生産するＴＣＡ回路と共通な中間物質であるため、菌体増殖とメバロン酸生産は競合する。よって、メバロン酸を生産しないＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株のＯＤ値よりもメバロン酸を生産したＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株のＯＤ値が減少した。
　以上より、Ｐｌｕｘを利用することにより、メバロン酸を効率よく生産できることが確認された。

実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるクオラムセンシングを用いたメバロン酸生産を制御するための共培養法の開発
　クオラムセンシングシステムは菌体密度依存的に発現量が強化されるシステムである。一方、微生物を用いた物質生産において、菌体密度が低い時に高い能力の物質生産を行うと、菌体生育を阻害することがあり、結果として全体の物質生産量が低下することがある。野生型ｌｕｘプロモーターを用いてＥ．ｃｏｌｉ内でクオラムセンシングシステムを再構築すると、菌体密度が低い時から物質生産をすることが報告されている（Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，　Ｅ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００８（７４）４３７－３３５）。この問題を回避するため、クオラムセンシングシステムのオートインデューサーＡＨＬの発現量を任意に変更し、且つ発現時期を変更可能なシステムの改良を行った。

　即ち、ＡＨＬ合成遺伝子ＬｕｘＩのみを発現させる株と、メバロン酸経路上流遺伝子とＡＡＨＬレセプター遺伝子を発現させた株を構築し、この２株を共培養法でメバロン酸生産量向上を行った。

２－１）ＡＨＬ合成遺伝子ＬｕｘＩ発現株（ＭＧ－ＬｕｘＩ株）の構築
　ＬｕｘＩ遺伝子はｔａｃプロモーターで恒常発現させて、ＭＧ１６５５の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位に導入するための遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＩ（配列番号２３）を調製するために、１－３で得たａ断片を鋳型に配列番号１２と配列番号１８に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、カナマイシン耐性遺伝子断片を得た。次に、１－３で得たｂ断片を型に配列番号１９と配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＬｕｘＩ遺伝子断片を得た。最後にカナマイシン耐性遺伝子断片とＬｕｘＩ遺伝子断片を鋳型に配列番号１２と配列番号２０に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｉｎｓＨ４遺伝子の上流５０ｂｐ、下流５０ｂｐが付加した染色体導入用遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＩを増幅した。この断片を１－２と同様に調製し、ｐＫＤ４６を導入したＭＧ１６５５株の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にλ－ｒｅｄ法で導入した。得られたカナマイシン耐性コロニーは、配列番号２１と配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＩ断片が導入されていることを確認した。この株（ＭＧ１６５５　ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＩ）をＭＧ－ＩｕｘＩ株と命名した。

２－２）メバロン酸経路上流遺伝子とＡＨＬレセプター遺伝子発現株（ＭＧ－ＡＭＬｌｕｘＲ株）の構築
　ＬｕｘＲ遺伝子はｔａｃプロモーターで恒常発現させて、ＭＧ－ＡＭＬ－Ｆｒｅｅ株の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位に導入するための遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ（配列番号２４）を調製するために、１－３で得たｃ断片を型に配列番号１６と配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ＬｕｘＲ遺伝子断片を得た。次に２－１で得たカナマイシン耐性遺伝子断片とＬｕｘＲ遺伝子断片を鋳型に配列番号１２と配列番号１７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｉｎｓＨ４遺伝子の上流５０ｂｐ、下流５０ｂｐが付加した染色体導入用遺伝子断片ΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲを増幅した。この断片を１－２と同様に調製し、ｐＫＤ４６を導入したＭＧ－ＡＭＬ－Ｆｒｅｅ株の染色体上のｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にλ－ｒｅｄ法で導入した。得られたカナマイシン耐性コロニーは、配列番号２１と配列番号２２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ｉｎｓＨ４（ｂ１３３１）部位にΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ断片が導入されていることを確認した。この株（ＭＧ１６５５ΔｌｄｈＡ：：Ｐｌｕｘ＿ＡＭＬΔｉｎｓＨ４：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ）をＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＲ株と命名した。

２－３）ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株とＭＧ－ＬｕｘＩ株を用いた共培養結果
　ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株（第１微生物）とＭＧ－ＬｕｘＩ株（第２微生物）の共培養評価を実施した。カナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）入りＬＢ寒天培地上で３４℃１６時間培養したＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株とＭＧ－ＬｕｘＩ株及び対照用株としてＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株を、各々寒天培地上から菌体をかきとり、ＯＤ６６０＝２．０となるように上記２株の菌体液をそれぞれ調製した。次に、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ菌体液とＭＧ－ＬｕｘＩ菌体液を単独（１００％）及び表２の割合で混ぜた菌体液を調製した。最後に、ＭＳ－Ｍｅｔ培地３ｍｌが入った太型試験管に、調製した菌体液を各１ｍｌずつ添加して最終ＯＤ６６０値が０．５の菌体培養液を、３０℃で２４時間振とう培養する。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のメバロン酸の蓄積量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）により定量した。結果を表２に示す。

　表２から明らかのように、ｌｕｘＩ単独発現（ＭＧ－ｌｕｘＩ株１００％）及びメバロン酸経路上流遺伝子とｌｕｘＲ遺伝子を発現するＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株単独発現（１００％）では、メバロン酸の蓄積は見られなかったが、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株とＭＧ－ｌｕｘＩ株の共培養では、ＭＧ－ｌｕｘＩ株の割合が２０％以下でＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株単独発現（１００％）よりメバロン酸の蓄積量は向上し、ＭＧ－ｌｕｘＩ株の割合が５％で、最大で８．６ｇ／Ｌの蓄積量を示し、収率は２１．５％とＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株単独培養より共培養の方が高かった。

　したがって、目的物質の産生のためには、第１微生物および第２微生物の共培養が共発現微生物の培養よりも優れることが確認された。

実施例３：ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株とＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株の共培養結果
　次に、ＡＨＬ供与株としてＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株（第２微生物）を使用し、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株（第１微生物）との共培養を実施した。共培養の割合は事前に検討し、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＲ株９９．５％、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株０．５％で２－３と同様に培養を行った。培養はＮ＝２で行い、平均値の結果を表３に示す。

　表３から明らかのように、共培養法では、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株と単独発現（１００％）より、ＡＨＬ供与株としてＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株を僅か０．５％添加するだけでメバロン酸の蓄積量は８．９ｇ／Ｌ、収率は２２．１％と、ＭＧ－ＡＭＬ－ｌｕｘＩＲ株単独培養より共培養の方が高かった。

実施例４：Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｓｉｓにおけるクオラムセンシングを用いたメバロン酸生産
　Ｅ．ｃｏｌｉ以外の微生物でクオラムセンシングを用いた共培養が物質生産に有用であることを示すために、Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｓｉｓのＳＣ１７（０）株（例、ＥＰ２３３６３４７（Ａ１））でクオラムセンシングを用いた共培養法によるメバロン酸生産を実施した。

４－１）ＳＣ１７（０）Ｐｌｕｘ＿ＭＡＬ株の構築
　染色体導入用ベクターｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲ　ベクター（Ｍｉｎａｅｖａ　ＮＩ　ｅｔ　ａｌ．，ＢＭＣ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）の制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイトに、常法に従いメバロン酸経路上流遺伝子がＰ．ａｎａｎａｔｉｓのｐｈｏＣプロモーター制御下に導入されたプラスミド、ｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ－Ｋｍ（ｐＡＨ１６２－λａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲ―ＰｐｈｏＣ＿ｈｍｃＭ＿ｍｖａＡ＿ｔｈｉＬ）を、ＰＩＲ２株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｃ１１１１１０）を用いて構築した（配列番号２５）。なお、ＭＡＬは、上述のＡＭＬとは異なり、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ（ｈｍｃＭ）、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ｍｖａＡ）、チオラーゼ（ｔｈｉＬ）の順に直線状に並べたオペロン構造となっている。

　次に、上記ｐＡＨ１６２－ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ－Ｋｍプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．，２０１１；３１８（１）：５５－６０）にしたがってＳＣ１７（０）ΔＡｍｐＨ：：ａｔｔＢ_{ｐｈｉ８０}のａｔｔＢ_{ｐｈｉ８０}部位に導入した。得られたカナマイシン耐性コロニーは、配列番号２６と配列番号２７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ＡｍｐＨ（ＰＡＪ＿２０７１）部位にａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ断片が導入されていることを確認した。

　次に、ＳＣ１７（０）ΔＡｍｐＨ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬのコンピテントセルを常法に従い作成後、ＲＳＦ－Ｐａｒａ－ＩＸプラスミドを導入した。このプラスミドは、λファージのインテグラーゼ（Ｉｎｔ）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ（Ｘｉｓ）をコードする遺伝子を搭載し、アラビノース誘導でＩｎｔ及びＸｉｓを発現するプラスミドである（Ｙ．　Ｔａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．，ＡＥＭ，２０１５；８１（３）：９２９－９３７）。また、アラビノース誘導でカナマイシン耐性遺伝子が除去した株をＳＣ１７（０）ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ株と命名した。

　次にＳＣ１７（０）ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ株のｐｈｏＣプロモーターをｌｕｘプロモーターにλＲｅｄ法で置換するために、ＲＳＦｒｅｄＴＥＲ（ＷＯ２００８／０９０７７０Ａ１）をＳＣ１７（０）ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ株に導入したＳＣ１７（０）ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ／ＲＳＦｒｅｄＴＥＲ株を得た。プロモーター置換用断片は、ＭＧ－ＡＭＬ－Ｋｍ株から抽出したゲノムを鋳型に、ＰｐｈｏＣ導入部位より２６０ｂｐ上流領域８０ｂｐを持つ配列番号２８と、ｈｍｃＭ遺伝子のＮ末側領域の６１ｂｐをもつ配列番号２９に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、ΔＡｍｐＨ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｈｍｃＭ＿Ｎ断片（配列番号３０）を得た。λＲｅｄ用のコンピテントセルは、ＳＣ１７（０）ＰｐｈｏＣ＿ＭＡＬ／ＲＳＦｒｅｄＴＥＲ株をＬＢ液体培地にて終夜培養した。その後、培養液１ｍＬを終濃度１ｍＭのＩＰＴＧと５０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地１００ｍＬに植菌して、３４℃３時間振とう培養をおこなった菌体を常法に従いコンピテントセルを作製し、先に調製した断片をエレクトロポーレーション法でコンピテントセルに導入した。ＳＯＣ培地で３４℃２時間培養後、カナマイシン含有寒天培地に塗布し、１６時間培養を行った。出現したコロニーを配列番号２８と配列番号２９に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを行い、Ｌｕｘプロモーターに置換されたことを確認した。この株よりカナマイシン耐性遺伝子を除去した株をＳＣ１７（０）Ｐｌｕｘ＿ＭＡＬ株と命名した。

４－２）ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株の構築
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｇｃｄ遺伝子は、グルコースデヒドロゲナーゼをコードしており、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓは好気性増殖中にグルコン酸を蓄積することが知られている（Ａｎｄｒｅｅｖａ　ＩＧら，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．２０１１　Ｍａｙ；３１８（１）：５５－６０）ので、２－ケトグルコン酸生成経路が遮断されていることが好ましい。クオラムセンシングシステムに必要なｌｕｘＩ及びｌｕｘＲ遺伝子発現用断片をｇｃｄ（ＰＡＪ＿３４７３）部位に導入し、同時にｇｃｄ遺伝子を欠損させて２－ケトグルコン酸生成経路が遮断を行った。

　ｌｕｘＩＲ遺伝子導入用断片の調製はＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＩＲ株のゲノムを鋳型に、ｌｕｘＲ遺伝子導入用断片の調製はＭＧ－ＡＭＬ－ＩｕｘＲ株のゲノムを鋳型に、各々配列番号３１と配列番号３２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｇｃｄ遺伝子上流領域５０ｂｐ及び下流領域５０ｂｐを含むΔｇｃｄ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｌｕｘＩ－Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ断片（配列番号３５）及びΔｇｃｄ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ断片（配列番号３６）を得た。次にＳＣ１７（０）Ｐｌｕｘ＿ＭＡＬ株にＲＳＦｒｅｄＴＥＲを導入し、４－１と同様にλＲｅｄ法でｇｃｄ遺伝子の部位にΔｇｃｄ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｌｕｘ＿ｌｕｘＩ－Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ断片、或いはΔｇｃｄ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ―Ｐｔａｃ＿ｌｕｘＲ断片を導入し、カナマイシン耐性株を得た。得られた株は、配列番号３３と配列番号３４に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、ｇｃｄ部位に目的断片が導入されたことを確認した。次に、４－１と同様な方法でカナマイシン耐性遺伝子を除去した株を構築し、ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株と命名した。

４－３）ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲ株の構築
　ｇｌｔＡ遺伝子（ＰＡＪ＿０４９０）はメバロン酸生合成と共通中間物質であるアセチルＣｏＡを基質とするＴＣＡ回路の初発反応を行う酵素で、菌体増殖に必要な酵素である。よって、菌体増殖とメバロン酸生産は競合関係にある。このｇｌｔＡ遺伝子の発現を菌体増殖後に抑制し、アセチルＣｏＡを物質生産に効率よく供給するために抑制型転写因子ｔｅｔＲ遺伝子を用いたシステムが報告されている（Ｔ．ｈａｎａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２０１５；３０：７－１５、および特開２０１５－１５４７６８号公報）。このシステムを、野生型ｌｕｘプロモーターを用いてＰ．ａｎａｎａｔｉｓで再構築するために以下の方法でΔｇｌｔＡ：：Ｐｌｕｘ＿ｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ断片を作製し、ゲノムへ導入を試みた。

　最初に、λａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲを有するゲノム断片を鋳型に配列番号３７と配列番号３８に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｇｌｔＡ遺伝子上流領域５０ｂｐを含むΔｇｌｔＡ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ－Ｐｌｕｘ断片（ａ断片）を、プラスミドｐＴＡ１１４５（Ｔ．ｈａｎａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　２０１５；３０：７－１５）を鋳型に配列番号３９と配列番号４０に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓのｇｌｔＡ遺伝子Ｎ末領域５０ｂｐを含むｔｅｔＲ遺伝子とＰＬプロモーターを含むｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ断片（ｂ断片）を得た。次に、ａ断片とｂ断片を鋳型に配列番号３７と配列番号４０に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ΔｇｌｔＡ：：Ｐｌｕｘ＿ｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ断片を得た。しかしこの断片を用いたλＲｅｄ法による染色体導入株が取れなかったので、ｇｌｔＡ遺伝子の上流及びＮ末側の領域の相同組み換え領域を各々１３０ｂｐに長くした断片を再調製するために、ΔｇｌｔＡ：：Ｐｌｕｘ＿ｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ断片を鋳型に配列番号４１と配列番号４２に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ΔｇｌｔＡ：：Ｐｌｕｘ＿ｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ－ｌｏｎｇ断片（配列番号４５）を得た。

　次にＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株に各々ＲＳＦｒｅｄＴＥＲを導入し、４－１と同様にλＲｅｄ法でｇｌｔＡ遺伝子の部位にΔｇｌｔＡ：：Ｐｌｕｘ＿ｔｅｔＲ－ＰＬ＿ｇｌｔＡ－Ｎ－ｌｏｎｇ断片を導入し、カナマイシン耐性株を得た。得られた株は、配列番号４３と配列番号４４に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、ｇｌｔＡ部位に目的断片が導入されたことを確認した。次に、４－１と同様な方法でカナマイシン耐性遺伝子を除去した株を構築し、ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲ株と命名した。

４－４）ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ）及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ）の構築
　Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓには内因性クオラムセンシング遺伝子としてｅａｎＩＲ（ＰＡＪ＿１２８７，１２８８）が報告されている（Ｍｏｒｏｈｏｓｈｉ　Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　２００７　１８９（２２）　８３３３－８３３８）。この内因性のｅａｎＩＲ遺伝子を欠損させるために、以下の方法で構築した。

　最初に、λａｔｔＬ－Ｋｍ－λａｔｔＲを有するゲノム断片を鋳型に、配列番号４６と配列番号４７に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｅａｎＩＲ遺伝子上流領域５０ｂｐ及び下流領域５０ｂｐを含むΔｅａｎＩＲ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ（配列番号５０）断片をｅａｎＩＲ遺伝子破壊用の薬剤遺伝子用断片として得た。次にＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲ株及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲ株の各々に、ＲＳＦｒｅｄＴＥＲを導入し、４－１と同様にλＲｅｄ法でｅａｎＩＲ（ＰＡＪ＿１２８７，１２８８）の部位にΔｅａｎＩＲ：：ａｔｔＬ－Ｋｍ－ａｔｔＲ断片を導入し、カナマイシン耐性株を得た。得られた株は、配列番号４８と配列番号４９に示すヌクレオチド配列からなるプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行い、ｅａｎＩＲ部位にカナマイシン耐性遺伝子が導入されたことを確認した。これらの株をＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ）及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ）と命名した。

４－５）ＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＩＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ）及びＳＣ１７（０）－ＭＡＬ－ｔｅｔＲ＿ｇｌｔＡ－ｌｕｘＲΔｅａｎＩＲ株（略称：Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ）を用いた共培養法によるメバロン酸生産
　Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株（第２微生物）とＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株（第１微生物）の共培養評価を実施した。カナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）入りＬＢ寒天培地上で３４℃１６時間培養したＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株及びＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株を、各々寒天培地上から菌体をかきとり、ＯＤ６６０＝２．０となるように菌体液を調製した。次に、Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ菌体液とＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ菌体液を単独（１００％）及び表４の割合で混ぜた菌体液を調製した。最後に、ＭＳ－Ｍｅｔ培地３ｍｌが入った太型試験管に、調製した菌体液を各１ｍｌずつ添加して最終ＯＤ６６０値が０．５の菌体培養液を、３０℃で２４時間振とう培養する。遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のメバロン酸の蓄積量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）により定量した。培養はＮ＝３で行い、その平均値の結果を表４に示す。また、メバロン酸の蓄積量を図１に示す。

　Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株単独培養に対し、Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株とＰ－ＭＡＬ－ｌｕｘＲ株の共培養はメバロン酸の蓄積量が向上し、Ｐ－ＭＡＬ－ｌｕｘＩＲ株を僅か０．０１％添加でメバロン酸蓄積量１２．１ｇ／Ｌ、対グルコース消費収率は３０．３％と高いことを確認した。

　本発明の方法は、例えば、目的物質の効率的な生産に有用である。
　本発明の共培養系は、例えば、本発明の方法の実施に有用である。
　本発明の微生物は、例えば、本発明の共培養系の構築、および本発明の方法の簡便な実施に有用である。

Claims (22)

1. 　クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を共培養して目的物質を生産することを含む、目的物質の生産方法。
2. 　前記第１微生物が、以下を含む、請求項１記載の方法：
   （１）目的物質の生合成に関与するタンパク質をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーターを含む第１発現単位；ならびに
   （２）オートインデューサーと結合して転写活性化作用を示す転写因子をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第２発現単位。
3. 　前記第２微生物が、オートインデューサーの合成酵素をコードする遺伝子、および当該遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む第３発現単位を含む、請求項１または２記載の方法。
4. 　前記第１発現単位および前記第２発現単位の一方もしくは双方が前記第１微生物に対して異種であるか、または前記第３発現単位が前記第２微生物に対して異種である、請求項２または３記載の方法。
5. 　オートインデューサーがＮ－アシル－Ｌ－ホモセリンラクトン（ＡＨＬ）である、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
6. 　前記オートインデューサー依存性プロモーターがｌｕｘプロモーター（Ｐｌｕｘ）であり、
   　前記転写因子をコードする遺伝子が、ＡＨＬレセプターをコードする遺伝子（ＬｕｘＲ）であり、
   　前記合成酵素をコードする遺伝子が、ＡＨＬ合成酵素をコードする遺伝子（ＬｕｘＩ）である、請求項５記載の方法。
7. 　前記第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）が５０％未満である、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
8. 　前記第１微生物および前記第２微生物の総菌体量に対する前記第２微生物の菌体量の割合（％）が１０％以下である、請求項７記載の方法。
9. 　前記第１微生物および／または第２微生物が、以下（ａ）および（ｂ）を含む遺伝子発現制御系を含む、請求項１～８のいずれか一項記載の方法：
   （ａ）微生物の増殖に必要とされる内因性物質の変換に関与する酵素をコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたリプレッサー抑制性プロモーター；ならびに
   （ｂ）リプレッサーをコードする１以上の遺伝子、および当該１以上の遺伝子に作動可能に連結されたオートインデューサー依存性プロモーター。
10. 　内因性物質がアセチルＣｏＡである、請求項９記載の方法。
11. 　目的物質が、メバロン酸またはイソプレノイドである、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
12. 　目的物質がアミノ酸である、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
13. 　目的物質がポリペプチドである、請求項１～８および１２のいずれか一項記載の方法。
14. 　前記第１微生物および前記第２微生物が同種の微生物である、請求項１～１３のいずれか一項記載の方法。
15. 　前記第１微生物および／または前記第２微生物がグラム陰性細菌である、請求項１～１４のいずれか一項記載の方法。
16. 　前記第１微生物および／または前記第２微生物が、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌である、請求項１～１５のいずれか一項記載の方法。
17. 　エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求項１６記載の方法。
18. 　前記第１微生物および／または前記第２微生物が、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）細菌である、請求項１～１５のいずれか一項記載の方法。
19. 　パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）細菌がパントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ　ａｎａｎａｔｉｓ）である、請求項１８記載の方法。
20. 　クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有する第１微生物、および前記オートインデューサーを産生する能力を有する第２微生物を含む共培養系。
21. 　クオラムセンシングを担うオートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーを産生する能力を有しない微生物。
22. 　クオラムセンシングを担うオートインデューサーを産生する能力を有し、かつ、前記オートインデューサーに依存して培地中の炭素源から目的物質を産生する能力を有しない微生物。

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