JP6271494B2 - 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 - Google Patents
3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6271494B2 JP6271494B2 JP2015241185A JP2015241185A JP6271494B2 JP 6271494 B2 JP6271494 B2 JP 6271494B2 JP 2015241185 A JP2015241185 A JP 2015241185A JP 2015241185 A JP2015241185 A JP 2015241185A JP 6271494 B2 JP6271494 B2 JP 6271494B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- microorganism
- enzyme
- pathway
- item
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 164
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 19
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropionic acid Chemical compound OCCC(O)=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 875
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 373
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 291
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 275
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 275
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 148
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 141
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 124
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 120
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 120
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 111
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 94
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 84
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 83
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 74
- 108010008386 malonyl-Coa reductase Proteins 0.000 claims description 68
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 67
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 67
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 claims description 53
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 claims description 53
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 101710198510 Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase [NADH] Proteins 0.000 claims description 46
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 28
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 claims description 27
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 claims description 27
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 claims description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 27
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 claims description 25
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 claims description 25
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 24
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 claims description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 20
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 20
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 19
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 18
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 16
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 12
- 108060002020 cyanase Proteins 0.000 claims description 11
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 10
- 108010019608 3-Oxoacyl-(Acyl-Carrier-Protein) Synthase Proteins 0.000 claims description 8
- 102100037149 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N Carbon-14 Chemical compound [14C] OKTJSMMVPCPJKN-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 claims description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N Carbon-12 Chemical compound [12C] OKTJSMMVPCPJKN-IGMARMGPSA-N 0.000 claims description 7
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 7
- 108010008221 formate C-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 6
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 6
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 6
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000000157 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010055468 3-oxoacyl-(acyl-carrier-protein) reductase Proteins 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 5
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 3
- 101150000475 pntAB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101710142619 3-hydroxyacyl-[acyl-carrier-protein] dehydratase FabZ Proteins 0.000 claims description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 101150033131 sthA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150070497 accC gene Proteins 0.000 claims 2
- 101150008263 accD gene Proteins 0.000 claims 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 claims 2
- RVGLEPQPVDUSOJ-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-3-hydroxypropanoate Chemical compound COC(=O)CCO RVGLEPQPVDUSOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 claims 1
- 101100012355 Bacillus anthracis fabH1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100378010 Bacillus subtilis (strain 168) accC1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100322122 Bacillus subtilis (strain 168) accC2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100012357 Bacillus subtilis (strain 168) fabHA gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100135734 Haloferax mediterranei (strain ATCC 33500 / DSM 1411 / JCM 8866 / NBRC 14739 / NCIMB 2177 / R-4) pccB gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000000818 NADP Transhydrogenases Human genes 0.000 claims 1
- 108010001609 NADP Transhydrogenases Proteins 0.000 claims 1
- 101150046124 accA gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150013885 accB gene Proteins 0.000 claims 1
- ISFBDLBZPVCEKD-ONNFQVAWSA-N chembl123303 Chemical compound N\C(S)=N\N=C\C1=NC=CC=C1O ISFBDLBZPVCEKD-ONNFQVAWSA-N 0.000 claims 1
- UKDLORMZNPQILV-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-hydroxypropanoate Chemical compound CCOC(=O)CCO UKDLORMZNPQILV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims 1
- 101150015067 fabB gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150026389 fabF gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150090981 fabG gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150035981 fabH gene Proteins 0.000 claims 1
- 101150068528 mabA gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 278
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 266
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 264
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 264
- 239000000047 product Substances 0.000 description 149
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 111
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 90
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 84
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 78
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 68
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 60
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 39
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 37
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 34
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 34
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 29
- 108010039731 Fatty Acid Synthases Proteins 0.000 description 28
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 28
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 27
- 102100022089 Acyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase Human genes 0.000 description 26
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 26
- 241000894007 species Species 0.000 description 25
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 24
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 22
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 description 20
- 108700033863 EC 2.3.1.85 Proteins 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 20
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 18
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 17
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 17
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 17
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 16
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 15
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 15
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 15
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 14
- OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 3-oxopropanoate Chemical compound [O-]C(=O)CC=O OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 13
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 13
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 12
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- -1 thienodiazaboline Chemical compound 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 11
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 11
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 9
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 9
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 9
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 9
- 101150100150 fabI gene Proteins 0.000 description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 9
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 8
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 8
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-L chorismate(2-) Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C([O-])=O)=C[C@H]1OC(=C)C([O-])=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-L 0.000 description 8
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 101150056881 mcr gene Proteins 0.000 description 8
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 8
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 3-hydroxypropionate Chemical compound OCCC([O-])=O ALRHLSYJTWAHJZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 6
- 102000009114 Fatty acid desaturases Human genes 0.000 description 6
- 108010087894 Fatty acid desaturases Proteins 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WPNJAUFVNXKLIM-UHFFFAOYSA-N Moxonidine Chemical compound COC1=NC(C)=NC(Cl)=C1NC1=NCCN1 WPNJAUFVNXKLIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N caerulein A Natural products CC=CCC=CCCC(=O)C1OC1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N cerulenin Chemical compound C\C=C\C\C=C\CCC(=O)[C@H]1O[C@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-NQQPLRFYSA-N 0.000 description 6
- 229950005984 cerulenin Drugs 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 6
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 6
- GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 13C-Cerulenin Natural products CC=CCC=CCCC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(N)=O GVEZIHKRYBHEFX-MNOVXSKESA-N 0.000 description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 5
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 5
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 5
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 101150006320 trpR gene Proteins 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N (+)-propylene glycol Chemical compound C[C@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 1,3-propanediol Substances OCCCO YPFDHNVEDLHUCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940035437 1,3-propanediol Drugs 0.000 description 4
- SYQNUQSGEWNWKV-XUIVZRPNSA-N 4-hydroxy-3,5-dimethyl-5-(2-methyl-buta-1,3-dienyl)-5h-thiophen-2-one Chemical compound C=CC(/C)=C/[C@@]1(C)SC(=O)C(C)=C1O SYQNUQSGEWNWKV-XUIVZRPNSA-N 0.000 description 4
- SYQNUQSGEWNWKV-UHFFFAOYSA-N 5R-Thiolactomycin Natural products C=CC(C)=CC1(C)SC(=O)C(C)=C1O SYQNUQSGEWNWKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 description 4
- 101100259583 Bacillus subtilis (strain 168) tyrS2 gene Proteins 0.000 description 4
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010071536 Citrate (Si)-synthase Proteins 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 4
- 101100236334 Escherichia coli (strain K12) lysR gene Proteins 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 4
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000498271 Necator Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 4
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 4
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 4
- XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N Triclosan Chemical compound OC1=CC(Cl)=CC=C1OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl XEFQLINVKFYRCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 101150078069 cynT gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 101150040895 metJ gene Proteins 0.000 description 4
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 4
- 101150114630 mtcA2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 101150118209 nrdR gene Proteins 0.000 description 4
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 4
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 4
- 229920000166 polytrimethylene carbonate Polymers 0.000 description 4
- 101150106935 purR gene Proteins 0.000 description 4
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 4
- 229960003500 triclosan Drugs 0.000 description 4
- 101150044161 tyrR gene Proteins 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 3
- 108010030844 2-methylcitrate synthase Proteins 0.000 description 3
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 3
- 102100032252 Antizyme inhibitor 2 Human genes 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 3
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 3
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000192731 Chloroflexus aurantiacus Species 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 3
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 description 3
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000798222 Homo sapiens Antizyme inhibitor 2 Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 3
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 3
- 108040007096 enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 3
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BUFLLCUFNHESEH-UUOKFMHZSA-N guanosine 3',5'-bis(diphosphate) Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@H]1O BUFLLCUFNHESEH-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- KCPMACXZAITQAX-UUOKFMHZSA-N guanosine 3'-diphosphate 5'-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@H]1O KCPMACXZAITQAX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 101150108412 kgd gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108010083856 methylglyoxal synthase Proteins 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 101150043391 mmsB gene Proteins 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OJJHFKVRJCQKLN-YFKPBYRVSA-N (4s)-4-acetamido-5-oxo-5-phosphonooxypentanoic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@H](NC(=O)C)C(=O)OP(O)(O)=O OJJHFKVRJCQKLN-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N (6R)-5,10-methylenetetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1C1)N)N1C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QYNUQALWYRSVHF-OLZOCXBDSA-N 0.000 description 2
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 2
- AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxypropionaldehyde Chemical compound OCCC=O AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108030001569 3-hydroxypropionate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 101800001241 Acetylglutamate kinase Proteins 0.000 description 2
- 108030006759 Acetylornithine deacetylases Proteins 0.000 description 2
- 241001103870 Adia Species 0.000 description 2
- 101000889837 Aeropyrum pernix (strain ATCC 700893 / DSM 11879 / JCM 9820 / NBRC 100138 / K1) Protein CysO Proteins 0.000 description 2
- 101710191958 Amino-acid acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009042 Argininosuccinate Lyase Human genes 0.000 description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 101000742087 Bacillus subtilis (strain 168) ATP-dependent threonine adenylase Proteins 0.000 description 2
- 101001074429 Bacillus subtilis (strain 168) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog PksD Proteins 0.000 description 2
- 101000936617 Bacillus velezensis (strain DSM 23117 / BGSC 10A6 / FZB42) Polyketide biosynthesis acyltransferase homolog BaeD Proteins 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010000898 Chorismate mutase Proteins 0.000 description 2
- 102000006732 Citrate synthase Human genes 0.000 description 2
- 101100163308 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) argR1 gene Proteins 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 102100037579 D-3-phosphoglycerate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 101100434436 Escherichia coli (strain K12) adiA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 2
- 108010020869 Homocysteine S-Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108060004316 L-cysteine desulfidase Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 2
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 2
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical group [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000178960 Paenibacillus macerans Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010038555 Phosphoglycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 description 2
- 102000028649 Ribonucleoside-diphosphate reductase Human genes 0.000 description 2
- 108010038105 Ribonucleoside-diphosphate reductase Proteins 0.000 description 2
- 108030004891 Ribose-phosphate diphosphokinases Proteins 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000774739 Thermus thermophilus Aspartokinase Proteins 0.000 description 2
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 101710159621 Very-long-chain (3R)-3-hydroxyacyl-CoA dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 101150089004 argR gene Proteins 0.000 description 2
- 101150018055 aroH gene Proteins 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010055956 beta-ketoacyl-acyl carrier protein synthase I Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N butane-1,4-diol Chemical compound OCCCCO WERYXYBDKMZEQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N carbamoyl phosphate Chemical compound NC(=O)OP(O)(O)=O FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003889 chemical engineering Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 101150021225 cynS gene Proteins 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 125000004050 enoyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 150000002190 fatty acyls Chemical group 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 2
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 2
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 2
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 2
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 2
- 238000010977 unit operation Methods 0.000 description 2
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 2
- LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N vanadium atom Chemical compound [V] LEONUFNNVUYDNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 101150090985 ydfG gene Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-N 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C(O)C(C(=O)O)=CC(O)=C21 VOJUXHHACRXLTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYTINLGPKDJURZ-HSJNEKGZSA-N 1,4-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA Chemical compound C1=CC=CC2=C(O)C(C(=O)SCCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)OP(O)(O)=O)C)=CC(O)=C21 PYTINLGPKDJURZ-HSJNEKGZSA-N 0.000 description 1
- ICFIZJQGJAJRSU-UHFFFAOYSA-N 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-<3,7,11,15,19,23,27,31-octamethyl-dotriacontaoctaen-(2,6,10,14,18,22,26,30)-yl>benzochinon Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ICFIZJQGJAJRSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 2-methyl-3-[(2e,6e,10e,14e)-3,7,11,15,19-pentamethylicosa-2,6,10,14,18-pentaenyl]naphthalene-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 HYPYXGZDOYTYDR-HAJWAVTHSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010040136 20-alpha-Hydroxysteroid Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093803 3-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III Proteins 0.000 description 1
- DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 5'-xanthylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- YQIFAMYNGGOTFB-XINAWCOVSA-N 7,8-dihydroneopterin Chemical compound N1CC([C@H](O)[C@H](O)CO)=NC2=C1N=C(N)NC2=O YQIFAMYNGGOTFB-XINAWCOVSA-N 0.000 description 1
- PLSQMGZYOGSOCE-XINAWCOVSA-N 7,8-dihydroneopterin 3'-phosphate Chemical compound N1CC([C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O)=NC2=C1N=C(N)NC2=O PLSQMGZYOGSOCE-XINAWCOVSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 1
- 102000006488 Acyl-Carrier Protein S-Malonyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010058912 Acyl-Carrier Protein S-Malonyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010070753 Adenosylmethionine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000005758 Adenosylmethionine decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000609240 Ambelania acida Species 0.000 description 1
- 101000614816 Arabidopsis thaliana 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase II, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 101000856746 Bos taurus Cytochrome c oxidase subunit 7A1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100175237 Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (strain DSM 15242 / JCM 11007 / NBRC 100824 / MB4) gcvPB gene Proteins 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037021 Citrate synthase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 101100435903 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) aroG gene Proteins 0.000 description 1
- 241000960359 Cupriavidus basilensis Species 0.000 description 1
- 241001640455 Cupriavidus campinensis Species 0.000 description 1
- 241000382839 Cupriavidus oxalaticus Species 0.000 description 1
- 241001635226 Cupriavidus pauculus Species 0.000 description 1
- 241001470441 Cupriavidus respiraculi Species 0.000 description 1
- 241000366859 Cupriavidus taiwanensis Species 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 101100121464 Dictyostelium discoideum gcvH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175157 Dictyostelium discoideum gcvH2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100175166 Dictyostelium discoideum gcvH3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100014303 Dictyostelium discoideum gcvH4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100014305 Dictyostelium discoideum gcvH5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073112 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000009093 Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 108010061075 Enterobactin Proteins 0.000 description 1
- SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N Enterobactin Natural products OC1=CC=CC(C(=O)NC2C(OCC(C(=O)OCC(C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100165944 Escherichia coli (strain K12) can gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000018711 Facilitative Glucose Transport Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058732 Fatty Acid Elongases Proteins 0.000 description 1
- 102000036181 Fatty Acid Elongases Human genes 0.000 description 1
- 102000015303 Fatty Acid Synthases Human genes 0.000 description 1
- 229940123469 Fatty acid synthase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 description 1
- 108091052347 Glucose transporter family Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000178948 Lactococcus sp. Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000121201 Oligotropha Species 0.000 description 1
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000179039 Paenibacillus Species 0.000 description 1
- 241001520808 Panicum virgatum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101100462488 Phlebiopsis gigantea p2ox gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010048516 S-sulfocysteine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000235060 Scheffersomyces stipitis Species 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108010051753 Spermidine Synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100030413 Spermidine synthase Human genes 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000205101 Sulfolobus Species 0.000 description 1
- 101100002724 Thermus thermophilus aroH gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 description 1
- GNKPWIYRLONLSO-UUOKFMHZSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@H]1O GNKPWIYRLONLSO-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010011384 acyl-CoA dehydrogenase (NADP+) Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N adenylosuccinic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=C2N=C1 OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QZBYOYPROVGOGE-UHFFFAOYSA-N aminopropylcadaverine Chemical compound NCCCCCNCCCN QZBYOYPROVGOGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150019536 aroF gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076125 aroG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000010905 bagasse Substances 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000001721 carboxyacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 150000001867 cobalamins Chemical class 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 101150029709 cysM gene Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N enterobactin Chemical compound OC1=CC=CC(C(=O)N[C@@H]2C(OC[C@@H](C(=O)OC[C@@H](C(=O)OC2)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)NC(=O)C=2C(=C(O)C=CC=2)O)=O)=C1O SERBHKJMVBATSJ-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 150000002185 fatty acyl-CoAs Chemical class 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 description 1
- 101150064198 gapN gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010921 garden waste Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 101150110684 gcvH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150011909 gcvP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150022706 gcvT gene Proteins 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010014977 glycine cleavage system Proteins 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 235000019534 high fructose corn syrup Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 101150095957 ilvA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 239000012978 lignocellulosic material Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 241000264288 mixed libraries Species 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 239000010813 municipal solid waste Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 235000018343 nutrient deficiency Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- KYOBSHFOBAOFBF-XVFCMESISA-N orotidine 5'-phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1C(O)=O KYOBSHFOBAOFBF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 229940055726 pantothenic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000010893 paper waste Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N phosphoryl Chemical group [P]=O LFGREXWGYUGZLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000010908 plant waste Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000001884 polyglutamylation Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 230000031390 regulation of fatty acid biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002910 solid waste Substances 0.000 description 1
- 101150022778 speF gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 101150031436 sucD gene Proteins 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N succinic semialdehyde Chemical compound OC(=O)CCC=O UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- ICFIZJQGJAJRSU-SGHXUWJISA-N ubiquinone-8 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ICFIZJQGJAJRSU-SGHXUWJISA-N 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000002912 waste gas Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
- A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
- A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
- A61L15/24—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
- C12M47/12—Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/04—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with a disulfide as acceptor (1.2.4)
- C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
Description
本願は、2009年9月27日に出願された米国仮特許出願第61/246,141号、2010年1月27日に出願された米国仮特許出願第61/298,844号、および2010年4月6日に出願された米国仮特許出願第61/321,480号の利益を主張する。各出願の全体の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、化学物質3−ヒドロキシプロピオン酸(3−HP)および3−HPから作製される生成物を含み得る化学生成物の生成のためにマロニル−CoAの利用が増加している、細菌株などの代謝改変された微生物に関する。代謝改変された微生物は、3−HPに対する耐性の増加を示すように適合され得る。また、例えば3−HP寛容原性複合体として同定される複合体の1つ以上の遺伝子改変を含む微生物の場合のように、1つ以上の3−HP生合成経路を提供するように遺伝子改変を行うことができる。
本出願は、EFS−WebによりASCIIフォーマットで提出され、本明細書にその全体が参照により組み込まれている配列表を含む。2010年9月24日に創出された上記ASCIIコピーは、34246744.txtと命名され、2,228,808バイトのサイズである。
石油炭化水素の供給量が減少し、そのコストが極めて上昇していることがますます受け入れられるにつれ、化学物質および燃料を生成するための工業微生物系の開発および改良に対する関心が高まっている。このような工業微生物系は、いくつかの化学物質を生成するための石油炭化水素の使用に完全または部分的に取って代わる可能性がある。
ける基質としてマロニル−CoAを有する、上記化学物質を生成するように適合された改変微生物において、例えば商業的に重要なレベルまで比生産性および容積生産性(volumetric productivity)をどのように改善するかということが挙げられる。
一実施形態によると、本発明は、アクリル酸ベースの消費者向け製品を製造するための方法であって、i)炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせて3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程であって、a)上記細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または上記微生物が、その微生物(organism)の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されているか、またはb)上記微生物が、単機能性マロニル−CoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、上記微生物のマロニル−CoA還元酵素(mcr)経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されているか、またはc)上記3−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞1グラム当たり1時間当たり0.05グラムより多い比生産性で生成されるかまたは1リットル当たり1時間当たり0.50グラムより多い容積生産性で生成される工程と、ii)上記3−ヒドロキシプロピオン酸をアクリル酸に変換する工程と、iii)上記アクリル酸を消費者向け製品に加工する工程とを含む方法を対象とする。様々な態様では、その炭素源は、約1.0×10−14以上の炭素12に対する炭素14の比を有する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
アクリル酸ベースの消費者向け製品を製造するための方法であって、
i)炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせて3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する工程であって、
a)該細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、もしくは該微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されているか、またはb)該微生物が、単機能性マロニル−CoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、該微生物のマロニル−CoA還元酵素(mcr)経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されているか、または
c)該3−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞1グラム当たり1時間当たり0.05グラムより多い比生産性もしくは1リットル当たり1時間当たり0.50グラムより多い容積生産性で生成される
工程と、
ii)該3−ヒドロキシプロピオン酸をアクリル酸に変換する工程と、
iii)該アクリル酸を消費者向け製品に加工する工程と
を含む方法。
(項目2)
前記炭素源が、約1.0×10 −14 以上の炭素12に対する炭素14の比を有する、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記炭素源が、主にグルコース、スクロース、フラクトース、デキストロース、ラクトースまたはそれらの組み合わせである、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記炭素源が、50%未満のグリセロールである、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記細胞培養物が、脂肪酸合成酵素の阻害剤を含むか、または前記微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減のために遺伝子改変されている、項目1に記載の方法。
(項目6)
脂肪酸合成酵素の前記阻害剤が、チオラクトマイシン、トリクロサン、セルレニン、チエノジアザボリン、イソニアジドおよびそれらの類似体からなる群から選択される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記微生物が、単機能性マロニル−CoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、該微生物のマロニル−CoA還元酵素(mcr)経路における酵素活性の増加のために遺伝子改変されている、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記単機能性マロニル−CoA還元酵素が、NADPH非依存性である、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記3−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞1グラム当たり1時間当たり0.05グラムより多い比生産性で生成されるかまたは1リットル当たり1時間当たり0.05グラムより多い容積生産性で生成される、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記細胞培養物が、遺伝子改変微生物を含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記遺伝子改変微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減、該微生物のマロニル−CoA還元酵素経路における酵素活性の増加、3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加、該微生物のNADPH依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加、細胞内重炭酸塩レベルの増加、該微生物のアセチル−CoAカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加およびそれらの組み合わせから選択される形質について改変されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記遺伝子改変微生物が、該微生物の脂肪酸合成酵素経路における酵素活性の低減について改変されている、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記酵素活性の低減が、ベータ−ケトアシル−ACP還元酵素、3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドラターゼ、エノイル−ACP還元酵素およびチオエステラーゼからなる群から選択される酵素における酵素活性の低減である、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記微生物の脂肪酸合成酵素経路における前記酵素活性の低減が、該脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする配列に作動可能に連結した誘導性プロモーターをコードする異種核酸配列、または低減した活性を有する該脂肪酸合成酵素経路における酵素もしくはそのホモログをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目12に記載の方法。
(項目15)
前記脂肪酸合成酵素経路における前記酵素またはそのホモログが、温度感受性ベータ−ケトアシル−ACP還元酵素活性または温度感受性エノイル−ACP還元酵素活性を有するポリペプチドである、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記遺伝子改変微生物が、該微生物のマロニル−CoA還元酵素経路における酵素活性の増加について改変されている、項目11に記載の方法。
(項目17)
前記マロニル−CoA還元酵素(mcr)経路における酵素活性の前記増加が、二機能性マロニル−CoA還元酵素の酵素活性または単機能性マロニル−CoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記異種核酸配列が、配列番号780〜789から選択される配列と少なくとも70%の相同性を有する配列から選択される、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記遺伝子改変微生物が、3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加について改変されている、項目11に記載の方法。
(項目20)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の前記増加が、3−HP寛容原性複合体(3HPTGC)複合体の1つ以上の成分において生じるか、または3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の前記増加が、3HPTGCの群Aおよび群Bのそれぞれの少なくとも1つの遺伝子改変を行うことに起因する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記1つ以上の成分が、CynS、CynT、AroG、SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、Asd、CysM、IroK、IlvAおよびそれらのホモログから選択される、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記改変が、1つ以上の3HPTGCリプレッサー遺伝子の破壊である、項目20に記載の方法。
(項目23)
前記リプレッサー遺伝子が、tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdRおよびそれらのホモログから選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記微生物のNADPH依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の前記増加が、配列番号776または778から選択される配列と少なくとも70%の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目11に記載の方法。
(項目25)
細胞内重炭酸塩レベルの前記増加が、シアナーゼ活性および/またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目11に記載の方法。
(項目26)
前記異種核酸配列が、配列番号337から選択される配列と少なくとも70%の相同性を有する配列から選択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記微生物のアセチル−CoAカルボキシラーゼ経路における酵素活性の前記増加が、配列番号768〜775から選択される配列と少なくとも70%の相同性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により生じる、項目11に記載の方法。
(項目28)
前記遺伝子改変細菌が、乳酸脱水素酵素、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素またはピルビン酸−ギ酸リアーゼおよびそれらの組み合わせの活性を減少させるようにさらに改変されている、項目11に記載の方法。
(項目29)
工程(i)の後に、第3級アミンの存在下で前記細胞培養物から3−ヒドロキシプロピオン酸を抽出することにより、該培養物から3−ヒドロキシプロピオン酸を分離および/または精製する工程をさらに含む、項目1に記載の方法。
(項目30)
前記3−ヒドロキシプロピオン酸が、乾燥重量基準の微生物細胞1グラム当たり1時間当たり0.05グラムより多い比生産性で生成されるかまたは1リットル当たり1時間当たり0.50グラムより多い容積生産性で生成される、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記消費者向け製品が、おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスからなる群から選択される、項目1に記載の方法。
(項目32)
前記消費者向け製品が、おむつである、項目31に記載の方法。
(項目33)
項目1〜32のいずれか一項に従って生成される、生物学的に生成された3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目34)
化学触媒を本質的に含まない、項目33に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目35)
前記化学触媒が、モリブデンベースの触媒および/またはバナジウムベースの触媒である、項目34に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目36)
約1.0×10 −14 以上の炭素12に対する炭素14の比を有する、項目33に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目37)
約10%未満の石油由来の炭素を含有する、項目33に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目38)
項目33に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸であって、その生成方法に関連付けられる残留量の有機物質を含有する、3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目39)
前記3−ヒドロキシプロピオン酸の1ppmから1,000ppmの間の量で残留量の有機物質を含有する、項目38に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸。
(項目40)
項目33〜39の一項に記載の3−ヒドロキシプロピオン酸から生成されるアクリル酸。
(項目41)
項目40に記載のアクリル酸を用いて生成されるポリマー。
(項目42)
項目40に記載のアクリル酸を用いて製造される消費者向け製品。
(項目43)
おむつ、カーペット、塗料、接着剤およびアクリルガラスから選択される、項目42に記載の消費者向け製品。
(項目44)
おむつである、項目43に記載の消費者向け製品。
(項目45)
項目40に記載のアクリル酸のバイオ生産のための系であって、
バイオマスの糖化のためのタンクと、
糖化の生成物を、必要に応じて前発酵タンクを介して発酵タンクに送るためのラインと、微生物細胞培養に適する発酵タンクと、
該発酵タンクからの内容物を抽出容器および/または分離容器に吐出するためのラインと、
細胞培養廃棄物から3−ヒドロキシプロピオン酸を取り出すのに適する抽出容器および/または分離容器と、
3−ヒドロキシプロピオン酸を脱水容器に移送するためのラインと、
3−ヒドロキシプロピオン酸からアクリル酸への変換に適する脱水容器と
を含む系。
(項目46)
1つ以上の前発酵タンク、蒸留カラム、遠心分離容器、逆抽出カラム、混合容器またはそれらの組み合わせをさらに含む、項目45に記載の系。
(項目47)
1年当たり少なくとも1トンのアクリル酸の最少生成能力を有する、項目45に記載の系。
(項目48)
0.05g/gDCW−hrより大きい、0.08g/gDCW−hr、0.1g/gDCW−hrより大きい、0.13g/gDCW−hrより大きい、0.15g/gDCW−hrより大きい、0.175g/gDCW−hrより大きい、0.2g/gDCW−hrより大きい、0.25g/gDCW−hrより大きい、0.3g/gDCW−hrより大きい、0.35g/gDCW−hrより大きい、0.4g/gDCW−hrより大きい、0.45g/gDCW−hrより大きいまたは0.5g/gDCW−hrより大きい速度から選択される比速度にて3−ヒドロキシプロピオネートを生成できる、遺伝子改変微生物。
(項目49)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性および酢酸キナーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目50)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目51)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性、酢酸キナーゼ活性およびアセチルリン酸トランスフェラーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目52)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目53)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびピルビン酸酸化酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。(項目54)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目55)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、β−ケトアシル−ACP合成酵素活性、乳酸脱水素酵素活性およびメチルグリオキサール合成酵素活性を増加させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目56)
マロニル−coA還元酵素活性およびアセチル−coAカルボキシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変と、エノイル−ACP還元酵素活性、グアノシン3’−二リン酸5’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン3’−二リン酸5’−二リン酸合成酵素活性を低減させる遺伝子改変とを含む、項目48に記載の遺伝子改変微生物。
(項目57)
NADH/NADPHトランスヒドロゲナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目48〜56のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目58)
前記トランスヒドロゲナーゼ活性が、可溶性である、項目57に記載の遺伝子改変微生物。
(項目59)
前記トランスヒドロゲナーゼ活性が、膜結合性である、項目57に記載の遺伝子改変微生物。
(項目60)
シアナーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目48〜59のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目61)
カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目48〜60のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目62)
ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目48〜60のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目63)
グアノシン3’−二リン酸5’−三リン酸合成酵素活性およびグアノシン3’−二リン酸5’−二リン酸合成酵素活性を減少させるさらなる遺伝子改変が行われた、項目48〜62のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目64)
通気環境におけるNADH/NAD+比を増加させる遺伝子改変が行われた、項目48〜63のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目65)
β−ケトアシル−ACP合成酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目48〜64のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目66)
3−ヒドロキシプロピオン酸還元酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目48〜65のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目67)
NAD+依存3−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目48〜66のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目68)
NAD+依存3−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を減少させる遺伝子改変が行われた、項目48〜67のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目69)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性を増加させる遺伝子改変が行われた、項目48〜68のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目70)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、3−HP寛容原性複合体における任意の酵素の活性を増加させる、項目48〜69のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目71)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ピルビン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目72)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、シアナーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目73)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、カルボニックアンヒドラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目74)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アスパラギン酸キナーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目75)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、トレオニンデヒドラターゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目76)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目77)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、システイン合成酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。(項目78)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リボース−リン酸ジホスホキナーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目79)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リボヌクレオシド−二リン酸還元酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目80)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、L−システインデスルフヒドラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目81)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、リシンデカルボキシラーゼ活性を増加させるか、または3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ホモシステイントランスメチラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目82)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、ジヒドロ葉酸還元酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目84)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、N−アセチルグルタミルリン酸還元酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目85)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アセチルグルタミン酸キナーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目86)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アルギニノコハク酸リアーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目87)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、アセチルオルニチンデアセチラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目88)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、コリスミ酸ムターゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。(項目89)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、プレフェン酸脱水酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目90)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、プレフェン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目91)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、2−デヒドロ−3−デオキシホスホヘプトン酸アルドラーゼ活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目92)
3−ヒドロキシプロピオン酸に対する耐性の増加をもたらす遺伝子改変が、D−3−ホスホグリセリン酸脱水素酵素活性を増加させる、項目69〜70のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物。
(項目93)
水性培地中の炭素源と、項目48〜92のいずれか一項に記載の遺伝子改変微生物とを含む培養系であって、該遺伝子改変微生物が、0.05gDCW/Lより多い量、0.1gDCW/L、1gDCW/Lより多い量、5gDCW/Lより多い量、10gDCW/Lより多い量、15gDCW/Lより多い量または20gDCW/Lより多い量、から選択される量で存在する培養系。
(項目94)
前記水性培地の容量が、5mLより多い容量、100mLより多い容量、0.5Lより多い、1Lより多い容量、2Lより多い容量、10Lより多い容量、250Lより多い容量、1000Lより多い容量、10,000Lより多い容量、50,000Lより多い容量、100,000Lより多い容量または200,000Lより多い容量、から選択される、項目93に記載の培養系。
(項目95)
前記水性培地の容量が、250Lより多く、鋼容器内に含有されている、項目93〜94のいずれか一項に記載の培養系。
(項目96)
前記炭素源が、デキストロース、スクロース、ペントース、ポリオール、ヘキソース、ヘキソースとペントースとの両方およびそれらの組み合わせから選択される、項目93〜95のいずれか一項に記載の培養系。
(項目97)
前記水性培地のpHが、7.5未満である、項目93〜96のいずれか一項に記載の培養系。
(項目98)
通気されている、項目93〜97のいずれか一項に記載の培養系。
(項目99)
i)5mmol/L−hrより大きく、200mmol/L−hr未満の酸素、
ii)5mmol/L−hrより大きく、100mmol/L−hr未満の酸素、
iii)5mmol/L−hrより大きく、80mmol/L−hr未満の酸素、およびiv)5mmol/L−hrより大きく、50mmol/L−hr未満の酸素
から選択される酸素移送速度で通気されている、項目98に記載の培養系。
(項目100)
項目93〜99のいずれか一項に記載の培養系から得られる水性ブロスであって、
i)5g/Lより多い、10g/Lより多い、15g/Lより多い、20g/Lより多い、25g/Lより多い、30g/Lより多い、35g/Lより多い、40g/Lより多い、50g/Lより多い、60g/Lより多い、70g/Lより多い、80g/Lより多い、90g/Lより多い、または100g/Lより多い濃度から選択される濃度の3−ヒドロキシプロピオネート、および
ii)30g/L未満、20g/L未満、10g/L未満、5g/L未満、1g/L未満または0.5g/L未満から選択される濃度の1,3−プロパンジオール
を含む水性ブロス。
(項目101)
20gDCW/L未満のバイオマス、15gDCW/L未満のバイオマス、10gDCW/L未満のバイオマス、5gDCW/L未満のバイオマスまたは1gDCW/L未満のバイオマスから選択される量のバイオマスを含む、項目100に記載の水性ブロス。
(項目102)
3−HP/スクシネート比(g3−HP/gスクシネート)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目103)
3−HP/フマレート比(g3−HP/gフマレート)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目104)
3−HP/グリセロール比(g3−HP/gグリセロール)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目105)
3−HP/アセテート比(g3−HP/gアセテート)が、1.5より大きい、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目106)
3−HP/アラニン比(g3−HP/gアラニン)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目107)
3−HP/ベータ−アラニン比(g3−HP/gベータ−アラニン)が、1.5より大きい、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目108)
3−HP/グルタメート比(g3−HP/gグルタメート)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目109)
3−HP/グルタミン比(g3−HP/gグルタミン)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目110)
3−HP/3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド比(g3−HP/g3−ヒドロキシプロピオンアルデヒド)が、1.5より大きい、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目111)
3−HP/1,3−プロパンジオール比(g3−HP/g1,3−プロパンジオール)が、1.5より大きい、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
(項目112)
3−HP/ラクテート比(g3−HP/gラクテート)が、3より大きい、10より大きい、30より大きい、60より大きい、100より大きい、150より大きいまたは200より大きい、項目100に記載の水性ブロス。
定義
本明細書および本特許請求の範囲で用いる場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈がそうでないことを明らかに命じていない限り、複数の言及を含む。つまり、例えば「発現ベクター」への言及は、単一の発現ベクターならびに同じ(例えば同じオペロン)であるかまたは異なっているかのいずれかの複数の発現ベクターを含み、「微生物」への言及は、単一の微生物ならびに複数の微生物を含む、などである。
3−HPについての生合成経路を有する組換え微生物とともに本発明において用いられるバイオ生産培地は、適切な炭素源または意図する代謝経路についての基質を含有しなければならない。適切な基質は、それらに限定されないが、グルコースおよびフラクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜および大麦麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物を含み得る。さらに、炭素基質は、二酸化炭素、一酸化炭素またはメタノールなどの、重要な生化学的中間体への代謝変換が証明されている1炭素基質であってもよい。1および2炭素基質に加えて、メチロトローフ(methylotrophic)微生物は、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性のための様々なアミノ酸などのいくつかのその他の炭素含有化合物を利用することも公知である。
バイオベースの炭素は、限定することなくASTM D6866または様々なその他の技術を含む様々な方法に従って、石油ベースの炭素から区別できる。例えば、炭素14と炭素12の比は、バイオベースの炭素源と石油ベースの供給源とでは異なり、バイオベースの炭素源においてより高い炭素14の比が見出される。様々な実施形態では、上記炭素源は石油ベースでないか、または主に石油ベースでない。様々な実施形態では、上記炭素源は、約50%より多く非石油ベースであり、約60%より多く非石油ベースであり、約70%より多く非石油ベースであり、約80%より多く非石油ベースであり、約90%より多くまたはそれより多く非石油ベースである。様々な実施形態では、上記炭素源は、約1.0×10−14以上の炭素12に対する炭素14の比を有する。
本明細書に記載され、請求される特徴は、本明細書で列挙する微生物またはこれもまた1つ以上の天然の、導入されたかまたは増強された3−HPバイオ生産経路を含む別の適切な微生物から選択される微生物にもたらすことができる。つまり、いくつかの実施形態では、上記微生物は、内因性3−HP生成経路(これは、いくつかのこのような実施形態では、増強されていることがある)を含み、他の実施形態では、上記微生物は、内因性3−HP生成経路を含まない。
plantarum、Enterococcus faecium、Enterococcus gallinarium、Enterococcus faecalis、Bacillus subtilisおよびSaccharomyces cerevisiaeを含む。
eutrophus(Cupriavidus necator)、Bacillus
licheniformis、Paenibacillus macerans、Rhodococcus erythropolis、Pseudomonas putida、Lactobacillus plantarum、Enterococcus faecium、Enterococcus gallinarium、Enterococcus faecalis、Bacillus subtilisおよびSaccharomyces cerevisiaeを含む。これらの種の任意の公知の株も、出発微生物として利用でき、任意の以下の種(それらの各株を含む)も同様に利用できる:Cupriavidus basilensis、Cupriavidus campinensis、Cupriavidus gilardi、Cupriavidus laharsis、Cupriavidus metallidurans、Cupriavidus oxalaticus、Cupriavidus pauculus、Cupriavidus pinatubonensis、Cupriavidus respiraculiおよびCupriavidus taiwanensis。
carboxidovoransおよびPseudomonas putidaから選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え微生物は、E.coli株である。
本明細書で開示する型の1つから選択されるような適当な炭素源に加えて、バイオ生産培地は、適切なミネラル、塩、補因子、緩衝剤ならびに培養物の増殖および3−HP生成または本発明の下で作製されるその他の生成物の生成のために必要な酵素経路の促進に適する当業者に公知のその他の成分を含有しなければならない。
本発明による方法および/または組成物を利用する発酵系も、本発明の範囲内である。
the Cell、第3版、B. Albertsら、Garland Publishing、New York、1994年、42〜45頁、66〜74頁(糖の基本的な代謝異化経路の教示が参照により組み込まれている);Principles of Biochemistry、第3版、D. L. NelsonおよびM. M. Cox、Worth Publishers、New York、2000年、527〜658頁(主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている);ならびにBiochemistry、第4版、L. Stryer、W. H. Freeman and Co.、New York、1995年、463〜650頁(これもまた主要な代謝経路の教示が参照により組み込まれている)を参照されたい。)
工業的バイオ生産の型についてさらに、本発明の様々な実施形態では、バッチ型の工業的バイオリアクタを採用してよい。伝統的なバッチバイオリアクタ系は、その培地の組成が各バイオ生産イベントの開始時に確立され、そのバイオ生産イベントの終末で実質的に終了する期間の間に人工的な変更および追加に供されないことを意味する「閉鎖」であるとみなされる。つまり、上記バイオ生産イベントの開始時に、上記培地には、所望の1つの微生物または複数の微生物が接種され、バイオ生産は、その系に何も添加しないで生じることが許容される。典型的には、しかし、「バッチ」型のバイオ生産イベントは、炭素源の添加に関してバッチであり、pHおよび酸素濃度などの因子の制御に対してしばしば試みがなされる。バッチ系において、その代謝産物およびその系のバイオマス組成は、バイオ生産イベントが停止するときまで常に変化する。バッチ培養において、細胞は、静止誘導期から高増殖対数期および最後には増殖速度が減らされるかまたは休止する定常期まで穏やかである。処理しなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、一般的に、所望の最終生成物または中間体の生成の大半を担う。
本発明の実施形態は、宿主微生物への発現ベクターの導入から起こり得、ここでその発現ベクターは、宿主微生物で通常見出されるかまたは見出されない酵素をコードする核酸配列を含有する。
Science Drive、Madison、Wis.53711)などの公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り決定できる。Bestfitまたは任意のその他の配列アラインメントプログラムを用いて特定の配列が本発明による参照配列と例えば95%同一であるかを決定する場合、パラメータは、同一性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるアミノ酸残基の合計数の5%までの相同性におけるギャップが許容されるように設定される。
により組み込まれているが、このような教示は、当業者に一般的に公知でもある。認識される保存アミノ酸置換は(各組のコロンの後に置換可能なアミノ酸が続く):ala:ser;arg:lys;asn:glnまたはhis;asp:glu;cys:ser;gln:asn;glu:asp;gly:pro;his:asnまたはgln;ile:leuまたはval;leu:ileまたはval;lys:argまたはglnまたはglu;met:leuまたはile;phe:metまたはleuまたはtyr;ser:thr;thr:ser;trp:tyr;tyr:trpまたはphe;val:ileまたはleuを含む。
遺伝子改変微生物などの本発明の構成物(composition)は、マロニル−CoAが基質である化学生成物についての生成経路を含み、脂肪酸合成酵素系遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の活性を低減するための1つ以上の遺伝子改変も含み得る。上記構成物は、本発明の方法および系において用いることができる。
様々な実施形態では、本発明の構成物、方法および系は、マロニル−CoAを対象の化学生成物へ変換する代謝生成経路を含むことに関与する。
表2
Chloroflexus aurantiacusおよびその他の微生物種から得ることができるような二機能性マロニル−CoA還元酵素。この関係における二機能性とは、上記マロニル−CoA還元酵素が、マロニル−CoAからマロネートセミアルデヒドへの変換と、マロネートセミアルデヒドから3−HPへの変換との両方を触媒することを意味する。
限定されることなく、二機能性マロニル−CoA還元酵素は、Chloroflexus aurantiacusのマロニル−CoA還元酵素(例えばATCC29365から)およびその他の配列から選択してよい。これもまた限定されることなく、単機能性マロニル−CoA還元酵素は、Sulfolobus tokodaiiのマロニル−CoA還元酵素(配列番号826)から選択してよい。C.aurantiacusのマロニル−CoA還元酵素に関して、その配列および他の種の配列も、この酵素活性について二機能性であり得る。
いくつかの相互に関係する代謝経路の全てまたは構成部分を含む複合体が同定されており、ここでは、その3−HP寛容原性複合体(「3HPTGC」)と命名されたこのような複合体の酵素の酵素活性を増加させる遺伝子改変が、3−HPへの曝露に対する微生物の耐性を増加させることが証明されている。上記3HPTGCは、2010年1月28日に公開されたWO2010/011874に記載され、これは、3HPTGC、ならびに3HP生成に関する遺伝子改変と、3HPTGCおよびその中の群に基づく耐性との組み合わせに関するその教示について、本出願に組み込まれている。
2010年1月28日に公開されたWO2010/011874に記載されるように、遺伝情報を得るために、初期の3−HP関連適合度データが、SCALES技術を用いて、ゲノムライブラリー集団からのクローンの適合度の評価により得られた。これらのクローンは、3−HP耐性の信頼できる試験であることが示されている、3−HP濃度の上昇を強制した選択的環境中で増殖した。
2010年1月28日に公開されたWO2010/011874にも記載されるように、3−HP耐性SCALEsデータの分析は、様々な同定された経路およびその構成部分の間に相互関係があることの理解を導いている。上記3HPTGCが、その全体で、適合度の値が上昇している遺伝子間に相互関係があることから推定されたことが注目される。上記3HPTGCの全ての酵素が、上記SCALESデータにおいて、正の適合度の値を有することが示されたわけではない。このことは、このSCALESデータを得るために用いた商業的なアレイにおけるある特定の欠陥に帰すると考えられる。よって、SCALES遺伝要素データからそのようにして導かれなかったE.coli 3HPTGCのいくつかのメンバーは、上記3HPTGCを充足するように推定された。しかし、上記3HPTGCにおける酵素のほとんどは、正の適合度の値を有し、本明細書で示す補充物質と遺伝子改変物のデータとの組み合わせの全体的な適合度のデータは、上記3HPTGCが3−HP耐性と関連付けられるという推定および全体的な重要性の妥当性を証明する。
本発明の様々な実施形態について、上記3HPTCGの任意の経路および経路の構成部分ならびに上記3−HPバイオ生産経路のいずれかに対する遺伝子改変は、各経路のいずれかで同定される酵素または酵素の酵素活性の調節ならびにそれによって最終的にはその活性を変化させることに関するものを含む、様々な遺伝子操作を含むように記載され得る。このような遺伝子改変は、選択されたおよび/または同定された培養条件下での酵素活性および/または全体的な酵素変換速度の変化をもたらす転写改変、翻訳改変および翻訳後改変、ならびに/あるいは上記3HPTGCの酵素のコピー数および/または変異体を増加させるような追加の核酸配列(実施例のいくつかに示すような)を提供することを目的としてよい。
3−HP耐性関連経路または3−HP生合成経路のいずれかの酵素のいずれかと少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む遺伝子改変(組換え)微生物であって、上記ポリペプチドが、各3−HP耐性関連経路酵素または3−HP生合成経路酵素の酵素反応を行うために効果的な酵素活性および特異性を有し、上記組換え微生物が、このような核酸配列を欠く適当な対照微生物よりも大きい3−HP耐性および/または3−HPバイオ生産を示す微生物。
IX.遺伝子改変の組み合わせ
米国仮特許出願第61/246,141号(参照により組み込まれ、これに対する優先権を主張する)に記載されるように、遺伝子改変の様々な組み合わせを、本発明の様々な実施形態で実行してよい。これらは、以下の段落ならびに表6A、6Bおよび7に記載され、特に、その初めの段落は、上記組み合わせで用い得るマロニル(malonlyl)−CoA還元酵素(reductace)の様々な形態に関するものであることに留意する。
Key Enzyme of the 3−Hydroxypropionate Cycle for Autotrophic CO2 Fixation」、J. Bacter、184巻(9号):2404〜2410頁(2002年))。
Eng. Rev. 14巻:365414頁を参照されたい(そのような教示について本明細書に参照することにより組み込まれている))。
X.化学生成物3−HPの分離および精製
3−HPが化学生成物である場合、その3−HPは、分離および精製の多くの方法が当技術分野で公知であり、以下の開示は、限定的なものではないことを考慮に入れて、以下の段落に記載のアプローチによって分離し、精製することができる。浸透圧ショック、超音波処理、均質化、および/または凍結融解サイクルを繰り返した後の濾過および/または遠心分離、その他の方法の間では、pHの調整および熱処理などを使用して、インタクトな細胞から無細胞抽出物を生成することができる。これらの方法の任意の1つ以上を使用して、抽出工程として3−HPを細胞から遊離させることもできる。
本明細書で考察した通り、本明細書に記載の種々の実施形態は、特定の化学生成物、3−ヒドロキシプロピオン酸(3−HP)の生成に関する。この有機酸、3−HPは、産業上の用途を有する種々の他の生成物、例えば、これらに限定されないが、アクリル酸、アクリル酸のエステル、および、「下流の生成物」と称される3−HPから得られる他の化学物質に変換することができる。いくつかのアプローチの下で、上記3−HPは、アクリル酸、アクリルアミド、および/または他の下流の化学生成物に変換することができ、ある場合には、その変換は分離工程および/または精製工程を伴う。そのような下流の生成物への多くの変換が本明細書に記載されている。本発明の方法は、3−HPの下流の生成物を生成するための工程を含む。
表8: 脱水触媒
(2005年)に記載されている。
3−HPに関する開示は、限定的なものではなく、他の化学生成物を、そのような化学生成物の生成経路を含む微生物宿主細胞において本発明を使用することによってマロニルCoAから生成することができることが理解される。本明細書に開示されている種々の教示および遺伝子改変の組み合わせを、適切に、3−HPを作製する微生物、方法および系に適用することができる。
マロニルCoA還元酵素(mcr)を発現するプラスミドの構築
Chloroflexus aurantiacus由来のマロニルCoA還元酵素遺伝子のヌクレオチド配列を、商業的なDNA遺伝子合成の提供者であるDNA2.0(Menlo Park、CA USA)のサービスに従いE.coliに対してコドン最適化した。この遺伝子配列(配列番号803)には開始コドンの前にEcoRI制限酵素認識部位を組み入れ、その後ろにHindIII制限酵素認識部位を続けた。さらに、リボソーム結合部位を上記開始コドンの前に置いた。この遺伝子構築物はDNA2.0によって合成され、pJ206ベクターの骨格(配列番号804)中に提供される。合成されたmcr遺伝子を含有するプラスミドDNA pJ206を、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たEcoRI酵素およびHindIII酵素を製造者の指示に従って用いて酵素による制限消化に供した。その消化混合物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、適切なDNA断片を共通の方法セクションに記載の通り回収した。pKK223−aroHを担持するE.coliクローニング株を、BoulderにあるUniversity of ColoradoのRyan T.Gill教授の研究室からの寄贈品として得た。上記プラスミドを担持するこの株の培養物を増殖させ、プラスミドDNAを上記共通の方法セクションに記載の通り調製した。プラスミドDNAを、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得た制限エンドヌクレアーゼの、EcoRIおよびHindIIIを製造者の指示に従って用いて消化した。この消化は、aroH読み枠をpKK223骨格から分離するのに役立った。その消化混合物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、pKK223プラスミドの骨格に対応するDNA片を含有するアガロースゲルの薄片を上記共通の方法セクションに記載の通り回収した。
トランスヒドロゲナーゼ(pntAB)を発現するプラスミドの構築
tpiA遺伝子(PtpiA)から得られた、誘導因子非依存性E.coliプロモーターとピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ遺伝子であるpntAB(配列番号779および配列番号781)の融合物を、ゲノムE.coli K12のDNA由来のtpiAプロモーター領域およびpntAB領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することによって創製した。pntAB遺伝子について、その領域を、pntAのタンパク質配列に対するイニシエーターMetを組み入れるNcoI部位を含有するpntABフォワードプライマーGGGAACCATGGCAATTGGCATACCAAG(配列番号807、本明細書に開示されている全てのプライマーは人工的な配列であることに留意する)およびpntABリバースプライマーGGGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATCC(配列番号808)を使用して増幅した。同様に、上記PtpiA領域を、フォワードプライマーGGGAACGGCGGGGAAAAACAAACGTT(配列番号809)およびNcoI制限酵素認識部位を含有するリバースプライマーGGTCCATGGTAATTCTCCACGCTTATAAGC(配列番号810)を使用して増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応の生成物を、Qiagen Corporation(Valencia、CA、USA)からのPCR精製キットを製造者の説明書を用いて使用して精製した。精製した後、その生成物を、酵素NcoIを用いた酵素による制限消化に供した。制限酵素は、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得、製造者の指示に従って使用した。その消化混合物を、上記共通の方法セクションに記載の通り、アガロースゲル電気泳動によって分離し、UV透過照明の下で視覚化した。増幅したpntAB遺伝子産物およびPtpiA産物に対応するDNA断片を含有するアガロースゲルの薄片をゲルから切り出し、Qiagenからのゲル抽出キットを製造者の指示に従って使用してDNAを回収した。その回収された生成物をT4 DNAリガーゼ(New England BioLabs、Ipswich、MA USA)と、製造者の指示に従ってライゲーションした。
アセチル−CoAカルボキシラーゼ(accABCD)を発現するプラスミドの構築
E.coli由来のアセチル−CoAカルボキシルトランスフェラーゼ複合体の成分を発現することができる2つのオペロンを保有するプラスミド、を商業的なDNA遺伝子合成の提供者であるDNA2.0(Menlo Park、CA USA)が構築した。この構築物には、E.coli tpiA遺伝子から得られた誘導因子非依存性プロモーターの制御下にあるaccA遺伝子およびaccD遺伝子のDNA配列、ならびにE.coli rpiA遺伝子から得られた誘導因子非依存性プロモーターの制御下にあるaccB遺伝子およびaccC遺伝子のDNA配列を組み入れた。リボソーム結合配列を各コード配列に先行させた。設計されたオペロンをpJ251ベクターの骨格中に提供し、pJ251:26385(配列番号817)と名付けた。
3−HP寛容原性複合体に関連する遺伝子を発現するプラスミドの構築
上記3HPTGCの酵素活性を示すポリペプチドを発現する遺伝子を含むプラスミドのためのプラスミド構築の例が、2010年1月28日に公開されたWO2010/011874から組み込まれる。3−HP耐性を増加させるために、特定の実施形態において多くの単一の上記3HPTGCの遺伝子改変または上記3HPTGCの遺伝子改変の組み合わせが提供され得るが、ごくわずかのみが本実施例において提供される。これは、限定的であることを示すものではない。
3−ヒドロキシプロピオン酸を生成する特定の株の構築
以下の表に示されているそれぞれの組み合わせに従って、本明細書に記載のプラスミドをそれぞれの基本株に導入した。全てのプラスミドを、標準の方法を使用して、電気穿孔によって同時に導入した。形質転換された細胞を、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、選択培地におけるそれらの適切な増殖に基づいてコロニーを選択した。mcr発現プラスミドpKK223−mcrを、E.coli DF40(Hfr、garB10、fhuA22、ompF627、fadL701、relA1、pitA10、spoT1、rrnB−2、pgi−2、mcrB1、creC527)またはE.coli JP1111(Hfr、galE45(GalS)、LAM−、fabI392(ts、温度感受性)、relA1、spoT1、thi−1)に、上記共通の方法セクションに記載の通り形質転換した。当技術分野で公知の通り、上記DF40株およびJP1111株は、Yale Coli Genetic Stock Collection(New
Haven、CT USA)を含めた供給源から入手可能である、一般に入手可能なE.coli株である。これらのmcr形質転換体から、上記共通の方法セクションに記載の通り形質転換に対して適格な細胞を電気穿孔によって調製し、追加のプラスミドで形質転換することによって、複数の適合性のプラスミドを保有する株を構築した。その後、適切に組み合わせた抗生物質を含有する培地で形質転換体を選択した。
3−ヒドロキシプロピオン酸の生成
KX3_0001による3−HPの生成を、流加(富栄養)またはAM2(最小塩)培地において100mL規模で実証した。培養を標準作業方法(SambrookおよびRussell、2001年)によって冷凍ストックを100μg/mLのアンピシリンを加えたLB培地50mLに入れて開始し、37℃で一晩、225rpmで回転させながら静止期になるまで増殖させた。この培養物5mlを、100mlの、40g/Lのグルコース、100μg/mLのアンピシリン、1mMのIPTGを加えた流加培地またはAM2培地に、3連の250mlのバッフルフラスコ中に移し、37℃、225rpmでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および3−HPの生成をモニターするために、600nmにおける光学濃度(OD600、光路長1cm)を測定するために、指定の時点で試料(2ml)を取り出し、12,000rpmで5分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクション中の「3−HPの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、3−HPの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量(DCW)を、OD600を決定するためのベースラインのDCWに基づいて、測定されたOD600値の0.33倍として算出する。全てのデータは、3連の培養物の平均である。比較する目的で、24時間の時点の平均データから比生産性を算出し、DCW1g当たりの、生成された3−HPのgとして表す。流加培地におけるKX3_001株による3−HPの生成が、以下の表に示されている。これらの条件下で、24時間後の比生産性は、DCW1g当たり0.0041gの3−HPである。
脂肪酸の合成を阻害することによってマロニルCoA前駆体プールを増加させることの、3−HPの生成に対する影響
本明細書に記載の通り、ある特定の化学物質が、上記脂肪酸合成酵素系の種々の酵素を阻害することが公知であり、そのいくつかは、膜の維持および増殖、および微生物の増殖における脂肪酸の合成の役割を考慮して、抗生物質として使用される。これらの阻害剤には、KASI β−ケトアシル−ACPシンターゼを阻害するセルレニンがある(例えば、E.coliにおけるfabB)。選択された化学生成物、ここでは3−HPへの生成経路(ここでは、マロニルCoAがその経路における基質である)を含む微生物におけるマロニルCoAの利用を調節し、シフトさせるアプローチをさらに評価するために、培養中のセルレニンの添加について評価した。
温度感受性脂肪酸合成変異体を使用してマロニルCoA前駆体プールを増加させることの、3−HPの生成に対する影響
内部のマロニルCoAプールを増加させるための代替のアプローチは、化学阻害剤ではなく遺伝子突然変異を使用することである。脂肪酸を合成する機能をコードする遺伝子における不活化突然変異は、通常致死的であり、したがって入手できないが、温度感受性変異体などの条件付の変異体については記載されている(de Mendoza、D.、およびCronan、J. E.、Jr.(1983年)Trends Biochem.
Sci.、8巻、49〜52頁)。例えば、JP1111株のエノイルACP還元酵素をコードするfabI遺伝子における温度感受性突然変異(遺伝子型fabI392(ts))は30℃などの温度低減時に比較的正常な活性を有し、温度を上昇させて、例えば、37℃から42℃まで上昇させて培養した場合におそらく変性および不活化によって非許容になり、自身のエノイルACP還元酵素として、この温度感受性変異体のみを含む微生物は、実質的により少ない脂肪酸およびリン脂質を生成する。これにより、増殖が減少する、または増殖が起こらない。しかし、マロニルCoAからの、例えば3−HPへの生成経路も含む遺伝子改変された微生物においてそのような変異体がもたらされる場合、培養温度を上昇させることを伴う有効な培養方法により、3−HPの比生産性の増加がもたらされ得ることが仮定された。
表14.流加培地におけるJX3_0097による3−HPの生成
fabIts変異体の配列
JP1111株が保有するfabIts対立遺伝子における的確な配列の変化の性質を再確認した。この変化を確認することにより、温度感受性が異なる代替の株および野生型とfabI392温度感受性対立遺伝子の中間の安定性を持つ変異体を産生するための標的変異誘発が可能になり、30℃よりも高い一定温度で増殖させ、その一方で内部のマロニルCoAプールの増加の利益をもたらすことが可能になる。野生型(BW25113)E.coliおよびJP1111突然変異E.coliの染色体のこのセグメントのDNA配列を確認するために、これらの株から染色体DNAを調製した。これらのDNAを、以下のプライマーを用いたPCR反応の鋳型として使用した:
3−HP寛容原性複合体由来の遺伝子が過剰発現することの、3−HPの生成に対する影響
mcrを発現するプラスミド(pTrc−Ptrc−mcrまたはpSMART(HC)Amp−PtalA−mcr)を、単独で、または、上記3−HP寛容原性複合体由来の代表的な遺伝子を保有する適合性のプラスミド(pJ61−aroG、pJ61−thrA、pACYC177−cynTS、pJ61−cynTS)と一緒に保有する一連の株を構築した。表19ではその株およびそれらの特性がカテゴリー化されている。
温度感受性脂肪酸合成変異体を使用してマロニルcoA前駆体プールを増加させることの、1Lの発酵3−HPの容量生成に対する影響
4つの1L流加発酵実験を、JX3_0098株を使用して行った。簡単に述べると、種培養を開始し、LB培地(ルリアブロス(Luria Broth))中で一晩増殖させ、それを使用して1LのNew Brunswick発酵容器4つに接種した。その第1の容器は30℃で限定AM2培地(defined AM2 medium)を含有し、OD600nmが2において、2mMでIPTG誘導を加え、グルコースが1g/Lから2g/Lの間に枯渇したら、追加のグルコース供給を開始した。標的のOD10において1時間にわたって温度を37℃にシフトさせた。グルコースが1g/Lを超える濃度で蓄積し始めるまで、>3g/L/時間の高いグルコース供給速度を維持し、その時点で供給速度を変化させて残留グルコースを1g/Lから10g/Lの間に維持した。その第2の容器は30℃で限定AM2培地を含有し、OD600nmが2において、2mMでIPTG誘導を加え、グルコースが0g/Lまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のOD10において1時間にわたって温度を37℃にシフトさせた。上記グルコース供給速度を3g/L/時間以下に維持した。その第3の容器は30℃で富栄養培地を含有し、OD600nmが2において、2mMでIPTG誘導を加え、グルコースが1〜2g/Lまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のOD10において1時間にわたって温度を37℃にシフトさせた。グルコースが1g/Lを超える濃度で蓄積し始めるまで、>3g/L/時間の高いグルコース供給速度を維持し、その時点で供給速度を変化させて残留グルコースを1g/Lから10g/Lの間に維持した。その第4の容器は30℃で富栄養培地を含有し、OD600nmが2において、2mMでIPTG誘導を加え、グルコースが0g/Lまで枯渇したら追加のグルコース供給を開始した。標的のOD10において1時間にわたって温度を37℃にシフトさせた。上記グルコース供給速度を3g/L/時間以下に維持した。
250リットルの発酵における3−HPの生成
容量250リットルのステンレス鋼の発酵槽における2つの流加発酵の例を、その遺伝子型が本明細書の他の箇所に記載されているBX3_0240株を使用して行った。2段階の播種プロセスを使用して250Lの発酵槽用に種菌を産生した。その第1段階では、この株のグリセロールストック1mlを振とうフラスコ中、100mlのTB培地(Terrific Broth)に播種し、OD600が3から4の間になるまで30℃でインキュベートした。その第2段階では、その振とうフラスコ培養物85mlを、TB培地8Lを含有する14LのNew Brunswick発酵槽に無菌的に移し、OD600が5から6の間になるまで30℃において、500rpmで撹拌して増殖させた。その14Lの発酵槽からの培養物を使用して、限定FM5培地(共通の方法セクションを参照されたい)を含有する250L容量のバイオリアクターに、30℃で無菌的に接種し、接種後の容積を155Lにした。
1Lの発酵における、3−HPの生成に対する増殖培地の影響
8つの1L流加発酵実験を、BX3_0240株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中400mlのTB培地(Terrific Broth)に接種した株のグリセロールストック1mlから開始し、OD600が5から6の間になるまで30℃でインキュベートした。振とうフラスコ培養物を使用して1L容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種して、接種後の各容器における体積を653mlにした。
1Lの発酵における、バッチリン酸塩濃度の3−HPの生成に対する影響。
1Lの発酵における3−HPの生成
2つの1L流加発酵実験を、BX3_0240株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、100mLのTB培地(Terrific Broth)に接種した株のグリセロールストック1mlから開始し、OD600が5から6の間になるまで30℃でインキュベートした。その振とうフラスコ培養物を使用して1L容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種し(5%体積/体積)、接種後の各容器における体積を800mLにした。本実験で使用した発酵槽はDas Gip流加プロ並行発酵システム(pro
parallel fermentation system)(DASGIP AG、Julich、Germany、SR0700ODLSモデル)であった。この発酵システムは、溶存酸素(%DO)、pH、温度、撹拌、および供給をリアルタイムにモニターし制御することを含んだ。発酵槽1および2は、クエン酸を2.0g/Lで加え、MgSO4を0.40g/Lで加えたこと以外は上記共通の方法セクションに示されているように作製した限定FM5培地を含有した。各発酵槽内の最初の温度は、30℃であった。IPTGを、OD600値17〜19において最終濃度が2mMになるように加えることによって、誘導をもたらし、これは、接種の14.5時間後に対応した。上記発酵槽内の残留グルコースが約1g/Lになったら、グルコース供給(500g/Lのグルコース溶液からなる)を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを>3g/Lに維持した。誘導の3時間後、温度を、1時間にわたって37℃にシフトさせた。その温度シフトを開始した時点で、気流および撹拌をそれぞれ1.08vvmおよび1000rpmに設定することによって、OTRを40mmol/L−hrに設定した。2バールに圧縮した空気を空気の供給として使用した。各発酵槽のブロスのpHを、pH滴定剤を制御添加することによっておよそ7.4に維持した。IPTG誘導の2時間後、上記pH滴定剤を50%のNH4(OH)から7.4MのNaOHに変更した。光学濃度を測定するため、ならびに3−HPの濃度についてHPLC分析するために、試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の3−HPの力価が以下の表25に要約されている。
1Lの発酵における3−HPの生成
4つの1L流加発酵実験を、BX3_0240株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、100mLのTB培地(Terrific Broth)に接種した株のグリセロールストック1mlから開始し、OD600が5から6の間になるまで30℃でインキュベートした。上記振とうフラスコ培養物を使用して1L容量のバイオリアクターのそれぞれに無菌的に接種し(5%体積/体積)、接種後の各容器における体積を800mlにした。本実験で使用した発酵槽はDas Gip流加プロ並行発酵システム(DASGIP AG、Julich、Germany、SR0700ODLSモデル)であった。この発酵システムは、溶存酸素(%DO)、pH、温度、撹拌、および供給をリアルタイムにモニターし制御することを含んだ。全ての発酵槽が、クエン酸を2.0g/Lで加え、MgSO4を0.40g/Lで加えたこと以外は上記共通の方法セクションに示されているように作製した限定FM5培地を含有した。各発酵槽内の最初の温度は、30℃であった。IPTGを、OD600値15〜19において最終濃度が2mMになるように加えることによって、誘導をもたらし、これは接種の15.75時間後という時間に対応した。上記発酵槽内の残留グルコースが約3g/Lになったら、グルコース供給(500g/Lのグルコース溶液からなる)を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを>3g/Lに維持した。誘導の3時間後、1時間にわたって温度を37℃にシフトさせた。各発酵槽のブロスのpHを、pH滴定剤である50%のNH4(OH)を制御添加することによっておよそ7.4に維持した。温度シフトを開始した時点で、撹拌および気流を表27に従って変化させることによって、OTRを各発酵槽に対して変更した。2バールに圧縮した空気を空気の供給として使用した。光学濃度を測定するため、ならびに3−HP濃度についてHPLC分析するために試料を取得した。各発酵槽における最大バイオマス濃度および回収時のバイオマス濃度ならびに最大の3−HPの力価が以下の表27に要約されている。
1.8Lの発酵における3−HPの生成
1.8Lの流加発酵実験を、BX3_0240株を使用して行った。種培養を、振とうフラスコ中、105mlのTB培地(Terrific Broth)に接種した株のグリセロールストック1mlから開始し、OD600が5から7の間になるまで30℃でインキュベートした。その振とうフラスコ培養物90mlを使用して、バッチ培地中のリン酸塩の濃度が、0.33g/LのK2HPO4および0.17g/LのKH2PO4であった以外はFM5増殖培地である培地1.71Lに無菌的に接種した。上記FM5培地の組成中の他の構成要素は上記共通の方法セクションに列挙されている通りである。発酵槽内の最初の温度は30℃であった。IPTGを、OD600値が15.46である場合に最終濃度が2mMになるように加えることによって、誘導をもたらした。上記発酵槽内の残留グルコースが約10g/Lになったら、グルコース供給(500g/Lのグルコース溶液からなる)を開始した。その供給速度を調整して、残留グルコースを>6.5g/Lに維持した。誘導の3時間後、温度を1時間にわたって37℃にシフトさせた。上記温度シフトを開始した時点で、溶存酸素(DO)設定点を、20%の空気飽和から1%の空気飽和に変更した。各発酵槽のブロスのpHを、濃水酸化アンモニウムと水の50:50混合物を制御添加することによって7.4に維持した。溶存酸素を、滅菌濾過した空気を散布することによって所望のレベルに維持した。光学濃度を測定するため、ならびに3−HP濃度についてHPLC分析するために試料を取得した。最大の最終バイオマス濃度は、9.84g/Lであり、最大の3−HPの力価は48.4g/Lであり、グルコースからの最終収率は、グルコース1g当たり0.53gの3−HPであった。
3−HPの生成をさらに評価するための株の構築
以下の表28に示されているそれぞれの組み合わせに従って、本明細書に記載のプラスミド(例えば、実施例1を参照されたい)をそれぞれの株に導入した。全てのプラスミドを、標準の方法を使用して、電気穿孔によって同時に導入した。形質転換された細胞を、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、選択培地におけるそれらの適切な増殖に基づいてコロニーを選択した。表28に要約されている通り、mcr発現プラスミドである、pTrc−ptrc−mcrまたはpACYC(kan)−ptalA−mcrを、上記共通の方法セクションに記載の通りGene Bridges技術を使用して導入した追加の染色体の修飾を含むE.coliのBW25113(F−、Δ(araD−araB)567、ΔlacZ4787(::rrnB−3)、lamba−、rph−1、Δ(rhaD−rhaB)568、hsdR514)から得られた2つの株へと形質転換した。BX_0590株は、ldhA遺伝子、pflB遺伝子、mgsA遺伝子、およびpoxB遺伝子の追加の欠失を含む。BX_0591株は、BX_0590株の追加の欠失およびack_pta遺伝子の追加の欠失を含む。その後に、形質転換体を、適切に組み合わせた抗生物質を含有する培地において選択した。
評価用の追加の株の構築
パート1:遺伝子欠失
本明細書の他の箇所に記載のとおりのRed/ET組換えを使用する相同組換え方法を、E.coli株において遺伝子欠失させるために使用した。この方法は当業者に公知であり、Stewartらに発行され、この方法のその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,355,412号および同第6,509,156号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Gene Bridges(Gene Bridges GmbH、Heidelberg(以前はDresden)、Germany、<<www.genebridges.com>>)から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進められた。この方法により、λファージ由来のリコンビナーゼによって成される相同組換えを介して標的遺伝子が選択マーカーで置き換えられる。λ−redリコンビナーゼを発現する宿主生物体を、標的遺伝子またはプロモーターの配列と相同な末端領域(一般に約50bp、あるいは最大約300bp)が隣接する選択マーカーをコードする直鎖DNA産物で形質転換する。その後、そのマーカーは、FLP−リコンビナーゼ、またはCreなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターによって成される別の組換え工程によって除去される。
細胞が非許容温度(37℃)で増殖する場合、E.coliのJP1111株におけるfabIts突然変異(Ser241→Phe)により、マロニルCoA濃度が著しく増加し、したがって、この温度でより多くの3−HPが生成する。しかし、JP1111は、NTG変異誘発の生成物であり、したがって未知の変異を有する可能性があり、ストリンジェンシー調節因子であるrelAおよびspoTに突然変異を保有し、Hfr因子が存在することによってコンジュゲーション傾向が増強されているので、JP1111は試験的な規模および商業的な規模に移行するための理想的な株ではない。したがって上記fabIts突然変異を、追加の突然変異、ΔldhA、ΔpflB、ΔmgsA、ΔpoxB、Δpta−ackを保有する、よく特徴付けられたBW23115から開発された株であるBX_591株に移動した。これらの突然変異は、上のパート1に記載の遺伝子欠失方法を逐次的に適用することによって起こった。
本明細書の他の箇所に記載の相同組換え方法を使用して、種々の遺伝子のプロモーターを置き換えた。言及した通り、Red/ET組換えの使用は当業者に公知であり、Stewartらに発行され、この方法についてのその教示に関して参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,355,412号および同第6,509,156号に記載されている。そのような方法のための材料およびキットは、Gene Bridges(Gene Bridges GmbH、Heidelberg、Germany、<<www.genebridges.com>>)から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進めることができる。この方法は、標的遺伝子(または、この場合、プロモーター領域)を、λファージ由来のリコンビナーゼによって成される相同組換えを介して選択マーカーにより置き換えることを含む。λ−redリコンビナーゼを発現する宿主生物体を、上記標的遺伝子またはプロモーターの配列と相同な末端領域(一般に約50bp、あるいは最大約300bp)が隣接する選択マーカーをコードする直鎖DNA産物で形質転換する。次いで、そのマーカーを、FLP−リコンビナーゼ、またはCreなどの別のリコンビナーゼを保有するプラスミドベクターによって成される別の組換え工程によって除去することができる。この方法を製造者の指示に従って使用した。それぞれ、示されている対象遺伝子に対するネイティブなプロモーターを所望の交換プロモーターで置き換えるための組換えを実現するための末端配列を含む鋳型配列、および抗生物質マーカー配列は、外部の製造者(Integrated DNA Technologies、Coralville、IA)が合成した。これらの配列は、これらの遺伝子の前のネイティブなプロモーターをT5プロモーターで置き換えるように設計する。そのT5−aceEFカセット(配列番号863)は、loxP部位が隣接するゼオシン抵抗性カセットも含む。T5−pntABカセット(配列番号864)、T5−udhAカセット(配列番号865)およびT5−cynTS(配列番号866)カセットは、それぞれ、loxP部位が隣接するブラスチシジン抵抗性カセットを含む。また、T5−cynTS(配列番号866)は、Lambertら、AEM 73巻(4号)1126〜1135頁と一致する修飾されたloxP部位を含む。
以下の表に、下記の株において使用したプラスミドの構築が要約されている。そのプラスミドを作製するために、対象のそれぞれの遺伝子または遺伝子領域を、その遺伝子を保有する適切な供給源をPCR増幅し制限酵素(RE)消化すること、または直接制限酵素消化することのいずれかによって単離した。次いで、その単離した遺伝子を所望のベクターにライゲーションし、E.coli 10G(Lucigen、Middleton、WI)コンピテント細胞へと形質転換し、制限酵素マッピングによってスクリーニングし、標準の分子生物学の手順を使用したDNA配列決定によって確認した(例えば、SambrookおよびRussell、2001年)。
England Biolabs, Ipswich, MA; * C: DNA 2.0, Menlo Park, CA。
pACYC−cat−accABCD−udhAにおけるudhAの発現を誘導するPtalプロモーターを、より強力なT5プロモーターと置き換えた。BX_00635株由来のゲノムPT5−udhA構築物を、プライマーAS1170(udhAの300bp上流)を使用して増幅した。udhAの配列については配列番号886を参照されたい。上で得られたPT5−udhAのPCR断片をPmeIおよびNdeI(New England BioLabs、Ipswich、MA)で消化した。ベクターpACYC−cat−accABCD−Ptal−udhAを同様にSwaIおよびNdeI(New England BioLabs)で消化した。2つの消化されたDNA断片をライゲーションし、形質転換してpACYC−cat−accABCD−PT5−udhA(配列番号887)を創製した。プラスミド消化物を使用して、正確な配列を確認した。このプラスミドを、表31に示されている株に組み入れる。
上記の方法によって作製した構築物を使用して、表31に示されている、遺伝子型をもたらす株を生成し、示されている株名を与えた。これは、限定されるものではなく、他の株を、これらの方法を使用し、耐性について異なる遺伝子および遺伝子領域、および/または3−HPの生成および脂肪酸合成酵素系を調節するための改変をもたらすことを含めた、本出願で提供される教示に従って作製することができる。後者に付け加えて、そのような株は、染色体を修飾すること、および/または非染色体性の導入、例えばプラスミドを導入することによって生成することができる。
対照E.coli細胞と比較して3−HPの生成を増加させるための、マロニルCoA還元酵素(Mcr)を他の遺伝子改変と組み合わせて含む遺伝子改変されたE.coli宿主細胞の調製(予測的)
遺伝子改変を行って、Pseudomonas auruginos由来のものなどのmmsBを含むベクターを導入し、それをさらにE.coliに対してコドン最適化する。galPおよびネイティブなppcまたは突然変異ppcを含むベクターも、当業者に公知の方法によって導入し(例えば、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、2001年(1〜3巻)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、「SambrookおよびRussell、2001年」を参照されたい)、突然変異は、XL1−Red変異誘発株を使用した方法によって、適切な材料を使用し、製造者の指示に従って行い(Stratagene QuikChange Mutagenesis Kit、Stratagene、La Jolla、CA USA)、標準のプロトコールの下で選択またはスクリーニングすることができることがさらに認識される。
選択されたポリヌクレオチドの突然変異発生(予測的)
選択された遺伝子配列、例えば配列番号783〜791のいずれかをコードする核酸配列を、エラー誘発PCR部位特異的変異誘発法を使用することによって、ネイティブなポリヌクレオチドまたは以前進化させた、かつ/またはコドン最適化したポリヌクレオチドの変異体ライブラリーを構築することから始める突然変異発生プロトコールに供する。
実施例12の株を使用した3−HPの生成の評価
BX3_0194による3−HPの生成が、100mL規模のSM3(最少塩)培地において実証された。標準作業方法(SambrookおよびRussell、2001年)によって冷凍ストックを100μg/mLのアンピシリンを加えたLB培地50mL中に入れて培養を開始し、37℃で一晩、225rpmで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物5mlを、3連の250mlのバッフルフラスコ中、40g/Lのグルコース、100μg/mLのアンピシリンおよび1mMのIPTGを加えたSM3培地100mlに移し、37℃、225rpmでインキュベートした。これらの培養物による細胞の増殖および3−HPの生成をモニターするために、600nmにおける光学濃度(OD600、光路長1cm)を測定するために、指定の時点で試料(2ml)を抜き取り、12,000rpmで5分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「3−HPの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、3−HPの生成を分析するために上清を回収した。乾燥細胞重量(DCW)を、OD600を決定するためのベースラインのDCWに基づいて、測定されたOD600値の0.33倍として算出する。全てのデータは、3連の培養物の平均である。比較する目的で、24時間の時点で平均したデータから比生産性を算出し、DCW1g当たりの、生成された3−HPのgとして表す。これらの条件下で、およそ1.0g DCWに対応するOD600まで増殖する培養物において24時間後に3−HPは生成されない。SM3培地における、BX3_0194株による3−HPの生成が表32に示されている。
3−HPの生成についての株の評価
以下の表に列挙されている生体触媒(株)における3−HPの生成が、100mL規模のSM3(最少塩)培地において実証された。使用したSM3は、上記共通の方法セクションの下に記載されているが、200mMのMOPSを補充した。培養は、標準作業方法(SambrookおよびRussell、2001年)によって、抗生物質を含有するLBプレートの、示されている通り適切な抗生物質を加えたTB培地50mL中から開始し、30℃で一晩、250rpmで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物5mlを、3連の250mlのバッフルフラスコ中、30g/Lのグルコース、抗生物質および1mMのIPTG(「誘導」の欄において「あり」と特定されている)を加えたSM3培地100mlに移し、30℃、250rpmでインキュベートした。フラスコを、4時間後に37℃、250rpmにシフトさせた。これらの培養物による細胞の増殖および3−HPの生成をモニターするために、600nmにおける光学濃度(OD600、光路長1cm)を測定するために、24時間の時点で試料(2ml)を抜き取り、14000rpmで5分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「3−HPの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、3−HPの生成を分析するために上清を回収した。3−HPの力価および標準偏差は、g/Lとして表されている。乾燥細胞重量(DCW)を、OD600を決定するごとのベースラインのDCWに基づいて、測定されたOD600値の0.33倍として算出する。全てのデータは、3連の培養物の平均である。比較する目的で、生成物対細胞比を24時間にわたって平均したデータから算出し、DCW1g当たりの、生成された3−HPのgとして表す。比生産性を、生成の20時間にわたって得られた細胞/生成物比から算出し、1時間当たり、DCW1g当たりの、生成された3−HPのgとして表す。
炭酸塩の添加を用いたBX3_240株の評価
E.coli BX3_240(上記の方法によって作製した)における3−HPの生成を、炭酸ナトリウムを添加した100mL規模のSM3(最少塩)培地において評価した。使用したSM3は、上記共通の方法セクションの下に記載されており、それには処理剤として10mM、20mMおよび50mMのNa2CO3を添加した。培養は、標準作業方法(SambrookおよびRussell、2001年)によって、抗生物質を含有するLBプレートの、適切な抗生物質kanおよびcatを加えたTB培地50mL中から開始し、30℃で一晩、250rpmで回転させながら静止期まで増殖させた。この培養物5mlを、3連の250mlのバッフルフラスコ中、30g/Lのグルコース、抗生物質、示されている炭酸ナトリウム、0.1%の酵母抽出物および1mMのIPTGを加えたSM3培地100mlに移し、30℃、250rpmでインキュベートした。フラスコを、4時間後に37℃、250rpmにシフトさせた。これらの培養物による細胞の増殖および3−HPの生成をモニターするために、600nmにおける光学濃度(OD600、光路長1cm)を測定するために、24時間、48時間および60時間の時点で試料(2ml)を抜き取り、14000rpmで5分間遠心分離することによってペレットにし、上記共通の方法セクションにおける「3−HPの生成についての培養物の分析」の下で記載されている通り、3−HPの生成を分析するために上清を回収した。3−HPの力価および標準偏差は、g/Lで表されている。乾燥細胞重量(DCW)を、OD600を決定するごとのベースラインのDCWに基づいて、測定されたOD600値の0.33倍として算出する。全てのデータは、3連の培養物の平均である。比較する目的で、生成物対細胞比を60時間にわたって平均したデータから算出し、DCW1g当たりの、生成された3−HPのgとして表す。
宿主細胞に対する遺伝子改変の一般的な例(予測的かつ非特異的)。
Bridges GmbH、Dresden、Germany、<<www.genebridges.com>>)から入手可能であり、この方法は、製造者の指示に従って進めることができる。ゲノムDNAの標的欠失を実施して、宿主細胞の代謝を、望ましくない代謝産物の生成を低減させる、または排除するように変化させることができる。これは、本明細書において、この一般的な実施例に記載のような他の遺伝子改変と組み合わせて使用することができる。
3−HPおよび他の生成物を生成するためのフィードストックとしてのスクロースの利用(部分的に予測的)
E.coliの一般的な研究室および工業用の株、例えば本明細書に記載の株は、スクロースを唯一の炭素供給源として利用することができないが、この性質は、病原性のE.coli株を含めたいくつもの野生株に見出される。スクロースおよび糖蜜などのスクロースを含有するフィードストックは豊富であり、多くの場合、有機酸、アミノ酸、ビタミンおよび他の生成物を微生物発酵によって生成するためのフィードストックとして使用される。したがって、スクロースを利用することができる3−HP−生成株の別の誘導体により、3−HPを生成するために利用することができるフィードストックの範囲が拡大するはずである。
追加の株の構築および評価(予測的)
本明細書に記載の種々の遺伝エレメント(付加、欠失および修飾)の組み合わせを含むように生成された他の株を3−HPの生成について評価し、商業規模の生成を含めた3−HPの生成のために使用する。以下の表にいくつものこれらの株を例示している。
表39
3−HPの生成の予測的な実施例
上記のとおり、3−HPの生成経路および他の遺伝子改変物を保有する遺伝子改変された微生物の種菌を培養容器に提供し、その培養容器には、栄養分を所望のバイオプロセスの培養期間に十分な濃度で含む液体培地も提供する。
Review、Stephen A. Leeper、99〜194頁、Separation and Purification Technology、Norman N. LiおよびJoseph M. Calo編、Marcel Dekker(1992年)において。特定の方法論の組み合わせは、本明細書に記載のものから選択し、一部においては、最終ブロスにおける3−HPおよび他の成分の濃度に基づく。
3−HPの、特定の下流の化学物質への変換の予測的な実施例
例えば、実施例13からの3−HPを、環形成内部エステル化反応(水分子の脱離)によってプロピオラクトンの任意の1つ以上に、エタノールを用いたエステル化によってエチル−3−HPに、酸化反応によってマロン酸に、および還元反応によって1,3−プロパンジオールに変換する。
3−HPからのバイオアクリル酸の生成の予測的な実施例
3−HPを、例えば実施例15に記載されている通り上記微生物のバイオ生産イベントから、比較的純粋な状態で得る。上記3−HPを、例えば真空下、触媒の存在下で加熱することにより、脱水反応によってアクリル酸に変換する。より詳細には、酸または塩としての3−HPの水溶液を、上のXIセクションからこの実施例に組み込まれた表8から選択される触媒を含む回転フラスコに加える。
3−HPからのバイオアクリル酸の生成の代替の予測的な実施例
3−HPを、例えば実施例15に記載されている通り上記微生物のバイオ生産イベントから、比較的純粋な状態で得る。上記3−HPを、例えば真空下、触媒の存在下で、しかし、3−HPからアクリル酸が形成された後のアクリル酸の制御重合に好都合な条件下で加熱することにより、脱水反応によってアクリル酸に変換する。温度、反応中に産生する熱の除去を含めた温度の変化の速度、上記微生物のバイオ生産イベントから得られた3−HP溶液の純度、減圧(および圧力の変化の速度)、ならびに1種以上種の触媒の種類および濃度および/または光への曝露などのパラメータの種々の組み合わせを、望ましくない副反応を伴わない高変換率という目的をもって評価する。そのように形成されたアクリル酸は、上記の開示された方法などの当技術分野で公知の方法によって分離し、精製することができる。
アクリル酸の、下流の生成物への変換の予測的な実施例
実施例17のアクリル酸を、本明細書に記載のとおりの下流の生成物の1つ(つ以上)にさらに変換する。例えば、その変換方法は、アクリル酸メチルを生成するメタノールを用いたエステル化、または他のアクリル酸エステルのための、他のアルコールを用いた他のエステル化、アクリルアミドを生成するアミド化、アクリロニトリルを生成するニトリル部分の付加である。本明細書に記載のとおりの置換された下流の化合物を得るために、他の付加を所望の通り行う。
アクリル酸のポリアクリル酸への変換の予測的な実施例
実施例17のアクリル酸を、アクリル酸を水溶液中で加熱し、その溶液を光に曝露させることによって重合反応を開始し、その後、重合の熱を除去することによって温度および反応速度を制御することにより、ポリアクリル酸にさらに変換する。
発酵ブロスからの3−HPの分離および反応抽出
発酵実験の終わりにあたって10リットル発酵槽から得た発酵ブロスを、微生物を死滅させる工程として1時間にわたって60℃まで加熱し、次いで、3−HP(サブセクションIIIa、上記共通の方法セクションに記載の方法によって生成した)をおよそ1リットル当たり100グラムに調整し、pHを、硫酸アンモニウムを用いておよそ7.0に調整した。1Mの塩化カルシウムを綿状物として加えて最終濃度を約8.2g/Lに到達させた。その後、pHを、硫酸を使用しておよそpH2.0に調整した。その後この修飾された発酵ブロスの体積をおよそ3,200gで5分間にわたって遠心分離して澄んだブロスおよびペレットを得、ペレットを廃棄した。
酸触媒を用いた3−HPのアクリル酸への脱水
1リットル当たり約350グラムの3−HP(サブセクションIIIa、上記共通の方法セクションに記載の方法によって生成した)を含む水溶液およそ15mLを、フラスコ内で濃硫酸およそ15mLと混ぜ合わせた。そのフラスコをロータリーエバポレーター装置(Rotovapor Model R−210、BUCHI Labortechnik AG、Switzerland)に取り付け、加熱浴中(BUCCHI、Model B−491)、減圧下で(10〜20mbar)80℃まで加熱し、冷却剤として冷水を用いて動作する凝縮装置の下で凝縮物を回収した。およそ5時間後に上記凝縮物を回収し、その体積を測定し、一定分量をHPLC分析にかけた(共通の方法セクションを参照されたい)。上記フラスコ内の反応混合物の一定分量も、HPLC分析にかけた。HPLC分析により、上記凝縮物中1リットル当たりおよそ24グラムのアクリル酸が得られ、一方1リットル当たりおよそ4.5グラムが上記フラスコの反応混合物に残ったことが示された。したがって、これらの条件下で3−HPがアクリル酸を形成することが示された。この実施例は、限定的なものではない。
アクリル酸のポリアクリル酸への変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、アクリル酸を水溶液中で加熱し、その溶液を光に曝露させることによって遊離基重合反応を開始し、その後、その重合の熱を除去することによって温度および反応速度を制御することにより、ポリアクリル酸にさらに変換する。
アクリル酸の、ポリアクリル酸への塊状重合の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、塊状重合によってポリアクリル酸にさらに変換する。アクリル酸単量体、単量体可溶性開始剤および中和用塩基を重合反応器内で混ぜ合わせる。重合を開始し、温度を制御して所望の変換レベルを実現する。開始剤は、当技術分野で周知であり、上記の様々な有機過酸化物および他の化合物を含む。上記アクリル酸またはポリアクリル酸は、水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて少なくとも部分的に中和する。
高吸収性ポリマーの生成の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、溶液重合によって高吸収性ポリアクリル酸にさらに変換する。アクリル酸単量体の水溶液(約25〜30wt%で)、開始剤、中和用塩基、抗酸化剤、架橋剤(トリメチロールプロパントリアクリレートなど)および必要に応じて、他の添加剤を重合反応器内で混ぜ合わせ、重合を開始する。中和するために使用することができる塩基としては、これらに限らないが、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが挙げられる。
高吸収性ポリマーの生成の代替の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、懸濁重合によって高吸収性ポリアクリル酸にさらに変換する。水、アクリル酸単量体および中和用塩基を含む水相を、不活性な疎水性の液体を含む油相と混ぜ合わせ、必要に応じて、懸濁化剤をさらに提供する。上記水相および上記油相を、微細な単量体の液滴が形成される条件下で(約75℃の温度を含めて)接触させる。重合を開始し、重合したポリアクリル酸の微小粒子を、遠心分離機を使用してその懸濁液から回収する。
アクリル酸の、アクリル酸メチルへの変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸メチルに変換する。アクリル酸を、メタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約50℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および/またはメタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸の、アクリル酸エチルへの変換の予測的な実施例
例えば、実施例19で提供されるアクリル酸を、直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸エチルに変換する。アクリル酸をエタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約75℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および/またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸の、アクリル酸ブチルへの変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を直接的な、触媒エステル化によってアクリル酸ブチルに変換する。アクリル酸を1−ブタノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約100℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および/またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸の、エチルヘキシルアクリレートへの変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を直接的な、触媒エステル化によってエチルヘキシルアクリレートに変換する。アクリル酸を2−エチル−1−ヘキサノールと接触させ、その混合物をエステル化触媒の存在下で約120℃まで加熱する。エステル化の間に形成される水を蒸留によってその反応混合物から除去する。エステル化反応の進行を、上記混合物中のアクリル酸および/またはエタノールの濃度を測定することによってモニターする。
アクリル酸の、消費者向け製品を含めた最終製品への変換の予測的な実施例
実施例24〜27で提供されるような1つ以上のアクリレートを、接着剤、表面被覆剤、水性被覆剤、塗料、インク、革仕上げ剤、製紙用塗布剤、フィルム被覆剤(film coatings)、可塑剤、または凝集剤の前駆体の1つ以上にさらに変換する。そのような最終製品への変換には、当技術分野で公知の方法を使用する。
アクリルベースの塗料の製造の予測的な実施例
アクリル酸、アクリル酸エチル、アクリル酸メチル、アクリル酸2−エチルヘキシル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ラウリルまたは本明細書の他の箇所に記載されるとおり微生物によって生成された3−HPから変換したアクリル酸から得られる他の共重合体の1つ以上を含む少なくとも1つの粒子の水不溶性の共重合体を含む水性分散物を、そのような成分を十分に撹拌しながら一緒に混合して上記共重合体の安定な分散物を形成することによって得る。上記共重合体の有する平均分子量は少なくとも50,000であり、0.5〜3.0ミクロンにわたる直径を有する共重合体粒子を伴い、水性分散物中の他の成分は、色素、充填剤(例えば、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム)、溶媒(例えば、アセトン、ベンゾール、アルコールなど、ただし、これらは、ある特定の非VOC塗料においては見出されない)、増粘剤および条件、適用、意図された表面などに応じた追加の添加剤を含んでよい。
3−HPの1,3−プロパンジオールへの変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を1,3−プロパンジオールに変換する。3−HPを、液相において非補強(unsupported)ルテニウム触媒の存在下で水素化させて、1,3−プロパンジオールを調製する。上記液相は水およびシクロヘキサンを含む。撹拌槽反応器において、約150℃の温度および約1000psiの圧力で水素添加を連続的に行う。水素添加の進行を、上記反応器内の3−HPおよび/または水素の濃度を測定することによってモニターする。
3−HPのマロン酸への変換の予測的な実施例
例えば実施例22で提供されるアクリル酸を、Rhを含む補強触媒による3−HPの接触酸化によってマロン酸に変換する。上記接触酸化は、トリクルベッド手順で動作する固定層反応器において行う。トリクルベッド手順では3−HP出発材料、ならびにその酸化生成物を含む水相およびpHを調整するための手段および酸素または酸素を含有する気体を、向流で送ることができる。十分に短い反応時間を実現するために、その変換を、pH約8において行う。酸化を、約40℃の温度において行う。マロン酸はほぼ定量的な収率で得られる。
3HPTGCにおける遺伝因子のコピーの増加は、3−HPに対する耐性を付与する
SCALEs技法を使用する、3−HP曝露と関係するライブラリークローンの適合度についてのSCALEs評価からのデータは、多くの遺伝子および酵素についての3−HP耐性に関する関係について明らかな証拠を与える。このデータからおよび上記3HPTGCの他の構成部分からの適合度データを考慮して、上記3HPTGCの遺伝子もしくは酵素のいずれかの適切な改変および/またはそのような酵素の酵素活性を提供する核酸配列の提供(必ずしも酵素全体をコードするものではない)が、3−HP耐性の増加に至る酵素活性の改変をもたらし得るという大まかな見解が得られ得る。
野生型Escherichia coli K12(ATCC#29425)を、ゲノムDNAの調製のために使用した。精製ゲノムDNAについての6つの試料は、37℃で、異なるそれぞれの時間−10、20、30、40、50、および60分間、2つの平滑カッターAluIおよびRsaI(Invitrogen、Carlsbad、CA USA)を用いて消化し、次いで、15分間、70℃で熱不活化した。制限消化物を混合し、断片化されたDNAは、アガロースゲル電気泳動を使用し、サイズに基づいて分離した。0.5、1、2、4、および8kbを超えるサイズのそれぞれのDNA断片をゲルから切り取り、製造者の指示に従って、ゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。ゲノムライブラリーは、製造者の指示に従って、pSMART−LCKANベクター(Lucigen、Middleton、WI USA)との、それぞれの精製断片化DNAのライゲーションによって構築した。次いで、それぞれのライゲーション産物は、E.Cloni 10G Supreme Electrocompetent Cells(Lucigen)に電気穿孔し、LB+カナマイシン上にまいた。コロニーは、採取し、プラスミドDNAは、製造者の指示に従って、Qiagen HiSpeed Plasmid Midi Kitを使用して抽出した。それぞれのライブラリーの精製プラスミドDNAは、電気穿孔によって、Escherichia coli株Mach1−T1(登録商標)(Invitrogen、Carlsbad、CA USA)に導入した。それぞれのライブラリー−0.5、1.0、2.0、4.0、および>8.0kbのゲノムDNAに相当するこれらの培養物は、組み合わせ、所望の密度まで、およそ0.50のOD600まで37℃でインキュベートした。この組み合わせたライブラリー培養混合物を、選択に使用した(本明細書におけるセクションを参照されたい、また、Lynch,
M.、Warencke, TE、Gill, RT、SCALEs: multiscale analysis of library enrichment. Nature Methods、2007年、4巻(87〜93頁);Warnecke, T.E.、Lynch, M.D.、Karimpour−Fard, A.、Sandoval, N.、Gill, R.T.、A genomics approach to improve the analysis and design of strain selections. Metabolic Engineering、2008年 10巻(154〜156頁)もまた参照されたい)。pSMART−LCKAN空ベクターを含有するMach1−T1(登録商標)は、全ての対照実験に使用した。増殖曲線は、MOPS最少培地において作製した(Neidhardt, F.、Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol、1974年、119巻:736〜747頁を参照されたい)。抗生物質濃度は、20ugカナマイシン/mLとした。
3−HPは、TCI America(Portland、OR)から得た。かなりのアクリル酸および2−オキシジプロピオン酸混在物が、HPLC分析を介して観察された。試料は、続いて、ジエチルエーテル抽出によって処理し、アクリル酸および2−オキシジプロピオン酸混入物の一部を除去した。次いで、試料は、7.0の最終pHまで、10M NaOHを用いて中和した。かなりの不溶物が、およそ35g/Lを超過した濃度において中性pHで観察された。中和した試料は、4℃で、30分間、4000rpmで遠心分離した。その可溶性3−HP画分は、このように遠心分離した不溶物から単離し、作業用の原液の濃度および純度の最終の定量化のためにHPLCによってさらに分析した。作業用の原液は、本実施例において選択およびMIC評価のために使用した。
本明細書において述べられるように、5つの代表的なゲノムライブラリーを、0.5、1、2、4、および8kbの確定された挿入物サイズを有するE.coli K12ゲノムDNAから生成し、それぞれのライブラリーを、MACH1(商標)−T1(登録商標)E.coliに形質転換し、培養し、次いで、混合した。その混合物は、2本の15mLねじ蓋付き試験管に等分し、最終濃度は、10M NaOHを用いてpH7に中和した20g/L 3−HP(TCI America)とした。その選択培養物の細胞密度は、それらが0.3〜0.4の最終OD600に接近するとおりにモニターした。その元の選択培養物は、反復バッチ選択戦略の一部として、15mL MOPS最少培地+カナマイシン+3−HPの別のラウンドに接種するために続いて使用した。全体として、選択は、60時間にわたる3−HPの減少勾配のため、8つの一続きの移動バッチに対して実行した。特に、上記3−HPの濃度は、一続きのバッチ1および2については20g 3−HP/Lとし、一続きのバッチ3および4については15g 3−HP/Lとし、一続きのバッチ5および6については10g 3−HP/Lとし、一続きのバッチ7および8については5g 3−HP/Lとした。一続きのバッチ7および8については、その培養培地を、栄養分の不足を回避するために、その培養物が静止期に接近する場合に、交換した(本明細書において参照によって組み込まれるWarnecke, T.E.、Lynch, M.D.、Karimpour−Fard, A.、Sandoval, N.、Gill, R.T.、A genomics approach to improve the analysis and design of strain selections. Metabolic Engineering、2008年 10巻(154〜156頁)もまた参照されたい)。バッチ移動時間は、栄養不足の選択環境を回避するために必要に応じて調節した。試料は、それぞれのバッチの最終段階(culmination)で採取した。3−HPを含有する反復バッチ培養物は、モニターし、60時間の期間にわたって接種し、3−HPの存在下で増殖の増加を示すクローンの濃度を増強させた。試料は、それぞれのバッチで、選択プレート(カナマイシンを有するLB)上に、1mLの選択した集団をまくことによって選択した。プラスミドDNAは、それぞれの試料から抽出し、以前の研究(Lynch, M.、Warencke, TE、Gill, RT、SCALEs: multiscale analysis of library enrichment. Nature Methods、2007年、4巻(87〜93頁)を参照されたい)および製造者の指示に従って、Affymetrix E.coli Antisense GeneChip(登録商標)アレイ(Affymetrix、Santa Clara、CA)にハイブリダイズさせた。
データ分析は、本明細書においておよびLynch, M.、Warencke, TE、Gill, RT、SCALEs: multiscale analysis of library enrichment. Nature Methods、2007年、4巻(87〜93頁))においてもまた記載されるように、SCALEsに適切なソフトウェアを利用することによって完成させた。特異的なゲノムエレメント由来の適合度寄与は、先に記載されるように、上記選択した集団の画分としてのそれぞれの領域の富化物から計算した(Lynch, M.、Warencke, TE、Gill, RT、SCALEs: multiscale analysis of library enrichment. Nature Methods、2007年、4巻(87〜93頁))。手短かに言えば、上記選択においてそれぞれのバッチの最終段階で採取した試料由来のプラスミドDNAは、上記に従って、Affymetrix E.coli Antisense GeneChip(登録商標)アレイにハイブリダイズさせ、これから得られたデータは、さらに分析した。それぞれのアレイについて、個々のプローブセットに対応するシグナル値は、Affymetrixデータファイルから抽出し、類似する親和性値に基づいてプローブセットに分配した(Naef, F.およびMagnasco, M. O.、2003年、Solving the riddle of the
bright mismatches: labeling and effective binding in oligonucelotide arrays. Phys. Rev. E68、011906)。それぞれのプローブのバックグラウンドシグナルは、従来のAffymetrixアルゴリズム(MAS 5.0)に従って減算した。非特異的なノイズは、完全マッチシグナルと完全マッチシグナルに対するミスマッチシグナルとの差異についてのロバスト回帰の切片として決定した。次いで、プローブシグナルは、最も近い25のプローブシグナルについてtukey bi−weightとしてゲノム位置にマッピングし、1000bpウィンドウ長の中間フィルターを適用することによってノイズを除去した。プローブの間のギャップは、線形補間によって埋めた。この連続的なシグナルは、N−sieveベースの分析を使用して、分解し、Lynchら(2007年)によって詳細に記載されるように500bpの最小規模で再構築した。シグナルは、ライブラリーベクター骨格上にあり、かつチップに追加された全プラスミド濃度に対応するシグナルに相当するプライマーの全抑制因子(repressor of primer)(ROP)シグナルによってさらに標準化した。
図9A、シート1〜7は、E.coliについて上記3HPTGCにおいて同定された遺伝子を図面で示す。さらに、表3は、上記3HPTGCにおける遺伝子のいくつかについて本明細書において計算したとおりの累積適合度値を示す。
3HPTGC産物の追加、第1部
本実施例および上記3HPTGCの概念化に基づいて、上記3HPTGCの律速酵素変換産物(つまり酵素変換工程の産物(複数可))を加えることによって、微生物の3−HP耐性を増加させることが可能である。本実施例は、E.coliにおいて3−HP耐性を増加させるためのいくつかのそのような産物の追加を実証する。
野生型Escherichia coli K12(ATCC#29425)を、ゲノムDNAの調製のために使用した。Mach1−T1(登録商標)は、Invitrogen(Carlsbad、CA USA)から得た。
3−HPは、TCI America(Portland、OR)から得た。かなりのアクリル酸および2−オキシジプロピオン酸混在物が、HPLC分析を介して観察された。試料は、続いて、ジエチルエーテル抽出によって処理し、アクリル酸および2−オキシジプロピオン酸混入物の一部を除去した。次いで、試料は、7.0の最終pHまで、10M NaOHを用いて中和した。かなりの3−HPの重合が、およそ35g/Lを超過した濃度において中性pHで観察された。中和した試料は、4℃で、30分間、4000rpmで遠心分離した。その可溶性3−HP画分は、固体ポリマー産物から単離し、作業用の原液の濃度および純度の最終の定量化のためにHPLCによってさらに分析した。上記作業用の原液は、本実施例において選択、増殖速度、およびMIC評価のために使用した。
最小発育阻止濃度
市販で得た3−HP(TCI America、Portland、OR USA、本明細書における3−HPの調製を参照されたい)を使用する最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて微好気的に(microaerobically)決定した。株の一晩培養物を5mlのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で増殖させた。MOPS最少培地を上部に充填し、かつ覆った15mlコニカルチューブに接種するために1v/v%を使用した。細胞が中間指数期(mid exponential phase)に達した後、その培養物は、0.200のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:20にさらに希釈し、10ulの一定分量を、それぞれのウェルに接種するために使用した(1ウェル当たり約104細胞)。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜70g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件ならびに2.4mMチロシン(Sigma)、3.3mMフェニルアラニン(Sigma)、1mMトリプトファン(Sigma)、0.2mM p−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド(MP Biomedicals)、0.2mM p−アミノ安息香酸(MP Biomedicals)、0.2mM 2,3−ジヒドロキシ安息香酸(MP
Biomedicals)、0.4mMシキミ酸(Sigma)、2mM塩酸ピリドキシン(Sigma)、35uMホモセリン(Acros)、45uMホモシステインチオラクトン塩酸塩(MP Biomedicals)、0.5mMオキソブタノエート(Fluka)、5mMトレオニン(Sigma)であることが特定される最適な補充濃度で補充したそれぞれの培地における増殖を測定した。最小発育阻止3−HP濃度(つまり、目に見える増殖がない最低の濃度)および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間(その期間を延長した場合に、データは、結果において実質的な変化を示さなかったが、24〜25時間)後に記録した。
E.coli Mach1−T1(登録商標)の3−HP耐性は、培地に補充物質を加えることによって増加した。本明細書において記載される補充により、以下のMICの増加がもたらされた:40%(チロシン)、33%(フェニルアラニン)、33%(トリプトファン)、33%(p−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド)、7%(p−アミノ安息香酸)、33%(2,3−ジヒドロキシ安息香酸(2,3−didyroxybenzoic
acid))、0%(塩酸ピリドキシン)、33%(ホモセリン)、60%(ホモシステインチオラクトン塩酸塩)、7%(オキソブタノエート)、および3%(トレオニン)。
3HPTGC産物の追加、第2部(3−HPの新しい供給源の使用)
本実施例および上記3HPTGCの概念化に基づいて、上記3HPTGCの律速酵素変換産物(これらのうちの少なくともいくつかは、代わりに「中間体」と呼ばれてもよい)を加えることによって、微生物の3−HP耐性を増加させることが可能である。本実施例は、E.coliにおいて3−HP耐性を増加させるためのプトレシン、スペルミジン、カダベリン、および重炭酸ナトリウムの追加を実証する。この文脈において使用される「律速」の概念は、克服された場合に対象の微生物または系による3−HP耐性の増加を実証し得る仮定される制限を指す。非排他的なアプローチとして、そのような仮定される制限は、特定の酵素変換産物または他の化合物の追加に際しての3−HPに対する耐性の増加の実証によるように、実験的に確認されてもよい。
野生型Escherichia coli K12(ATCC#29425)を、ゲノムDNAの調製のために使用した。M9最少培地およびEZリッチ培地は、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載する。
3−HPの調製
3−HPは、上記共通の方法セクションのサブセクションIIIにおいて記載されるようにベータプロピオラクトンから得た。
E.coliについての3−HPの最小発育阻止濃度(MIC)(本明細書における3−HPの調製を参照されたい)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。株の一晩培養物を、振盪インキュベーターにおいて37℃で5mlのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で増殖させた。1v/v%を、10mLのM9最少培地に接種するために使用した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、0.200のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:20にさらに希釈し、10ulの一定分量を、それぞれのウェルに接種するために使用した(1ウェル当たり約104細胞)。そのプレートを配置し、プトレシン(0.1g/L、MP Biomedicals、Santa
Ana、CA USA)、カダベリン(0.1g/L、MP Biomedicals)、またはスペルミジン(0.1g/L、Sigma−Aldrich、St.Louis、MO、USA)、または重炭酸ナトリウム(20mM、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA USA)(括弧中の値は、培地中の最終濃度を示す)を補充したM9最少培地中で、多様な株の増殖、または10g/Lの増分で3−HP濃度を0〜100g/Lに増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。最小発育阻止3−HP濃度(つまり、目に見える増殖がない最低の濃度)および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間(その期間を延長した場合に、データ(示さず)は、結果において実質的な変化を示さなかったが、24〜25時間)後に記録した。MIC終点は、目に見える増殖がなかった化合物の最低の濃度とする。
E.coliの3−HP耐性は、培地にポリアミンのプトレシン、スペルミジン、およびカダベリンを加えることによって増加した。対照および補充培地におけるE.coli
K12についての最小発育阻止濃度(MIC)は、以下の通りであった:プトレシンを補充したM9最少培地において40g/L、スペルミジンを補充したM9最少培地において40g/L、カダベリン(cadavarine)を補充したM9最少培地において30g/L。M9最少培地に加えた重炭酸ナトリウムについての最小発育阻止濃度(MIC)は、30g/Lであった。100g/L原液の3−HPにおけるE.coli K12についての最小発育阻止濃度(MIC)は、20g/Lであった。
3−HP耐性の増加のためのaroHの遺伝子改変
コピーの増加のときに3−HPに対する耐性を付与する遺伝因子としてのtyrA−aroFオペロンの同定に基づいて、この酵素活性をさらに検査した。野生型aroF遺伝子は、漸増濃度の最終産物チロシンおよびフェニルアラニンによって阻害される。しかしながら、この固有のフィードバック阻害制御を回避するために、上記aroH遺伝子のフィードバック抵抗性変異体を得て、以下のように細胞に導入した。
PCRは、上流aroFpプロモーターおよびrho非依存性転写ターミネーターを含むように設計したプライマーを用いて、aroF−tyrA領域に対応するE.coli
K12ゲノムDNAを増幅させるために使用した。pSMART−カナマイシンベクターとの精製した断片化DNAのライゲーションは、製造者の指示に従って、CloneSMARTキット(Lucigen、Middleton、WI USA)を用いて実行した。次いで、そのライゲーション産物は、ケミカルコンピテント(chemically
competent)Mach1−T1(登録商標)E.coli細胞(Invitrogen、Carlsbad、CA USA)に形質転換し、LB+カナマイシン上にまき、24時間37℃でインキュベートした。陽性形質転換体の挿入を確認するために、プラスミドは、Qiagen(Valencia、CA)からのQiaprep Spin
MiniPrep Kitを使用して、クローンから単離し、配列決定した(Macrogen、South Korea)。
MIC評価は、実施例35で記載するように行った。aroH変異体を含むMach1−T1(登録商標)細胞培養物は、対照細胞培養物と、両方ともMOPS最少培地中で比較した。
MICにおける増加倍数によって測定されるように、上記aroH変異体を含む細胞は、対照のMICよりも1.4倍大きなMICを示した。これは、40パーセントの改善に相当する。したがって、本実施例は、3−HP耐性における上記3HPTGCの重要性についての知識に基づく、選択した細胞での3−HP耐性を増加させることについての、多くの可能な遺伝子改変アプローチのうちの1つを実証する。
3−HP耐性の増加のためのシアナーゼ導入による遺伝子改変
E.coli K12由来のcynTS遺伝子を含有するプラスミドクローンは、実施例35において記載される選択物から得た。pSMART−LC−Kan−cynTSと呼ばれるこのプラスミドは、標準的な方法に従って単離し、精製した。(プラスミドの配列決定により最終配列(配列番号002)を明らかにした)。精製プラスミドは、標準的な技術によってE.coli K12に再形質転換し、MICは、実施例37において記載されるように測定した。
cynTS遺伝子を含有するプラスミドによる3−HP耐性の改善
M9最少培地中のE.coli K12およびE.coli K12+pSMART−LC−Kan−cynTSについての3−HPの最小発育阻止濃度(MIC)は、それぞれ、30g/Lおよび50g/Lであった。したがって、3−HP耐性における増加を示すMICにおける60パーセントを超える改善が、E.coli宿主細胞において上記3HPTGCのたった1つの遺伝子改変を含んだ本実施例において観察された。したがって、本実施例もまた、3−HP耐性における上記3HPTGCの重要性についての知識およびその知識の適切な使用に基づく、選択した細胞での3−HP耐性を増加させることについての、多くの可能な遺伝子改変アプローチのうちの1つを実証する。
オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を含むタンパク質配列をコードする核酸配列の開発(部分的に予測)
広い基質範囲を有するいくつかの2−ケト酸デカルボキシラーゼは、先に特徴付けられた(Pohl, M.、Sprenger, G.A.、Muller, M.、A new perspective on thiamine catalysis. Current Opinion in Biotechnology、15巻(4号)、335〜342頁(2004年))。特定に興味深いのは、精製され、特徴付けられたM.tuberculosis由来の酵素、アルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼである(Tian, J.、Bryk, R. Itoh, M.、Suematsu, M.、およびCarl Nathan, C. Variant tricarboxylic acid cycle in Mycobacterium tuberculosis: Identification of alpha−ketoglutarate decarboxylase. PNAS. 2005年7月26日 102巻(30号):10670〜10677頁;;Stephanopoulos, G.、Challenges in engineering microbes for biofuels production. Science、2007年、315巻(5813号):801〜804頁)。この酵素によって実行した反応を、図16Bに表す(図16Aは、天然のkgd遺伝子によってコードされる酵素による主な公知の化学反応を示す)。上記天然のkgd遺伝子は、技術的困難または宿主株に対する毒性作用を伴わないで、先に、クローニングされ、E.coliから発現され、精製されている(Tian, J.、Bryk, R. Itoh, M.、Suematsu, M.、and Carl Nathan, C. Variant tricarboxylic acid cycle in Mycobacterium tuberculosis: Identification of alpha−ketoglutarate decarboxylase. PNAS. 2005年7月26日、102巻(30号):10670〜10677頁;Stephanopoulos, G.、Challenges
in engineering microbes for biofuels production. Science,2007年、315巻(5813号):801〜804頁)。この酵素もまた、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼと関連しそうもないので、選択した。さらに興味深いのは、この酵素活性をアッセイするために好都合な比色法が開発されているということである。本明細書に提供するとおり、図16Bに表す測定可能な酵素機能である、マロネートセミアルデヒドへのオキサロアセテートの脱炭酸を有するように上記kgd酵素を進化させる。これを達成するための技術的な研究は、主として、所望のオキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を有するアルファケトグルタル酸デカルボキシラーゼの変異体に対する従来の選択およびスクリーニングに依存する。
T.Gill教授の研究室からの寄贈品として得た。上記プラスミドを持つこの株の培養物は、標準的な方法によって増殖させ、プラスミドDNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA USA)からの市販のミニプレップカラムによって調製した。プラスミドDNAは、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得た制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIを用いて消化した。この消化は、pKK223骨格からaroHリーディングフレームを分離する役目をした。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載されるようにUV透過照明下で視覚化した。pKK223プラスミドの骨格に対応するDNA片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、DNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA USA)からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
gamma−aminobutyrate aminotransferase from mitochondria of different subcellular
fractions of rat brain Can. J. Biochem.
55巻、479〜484頁(1977年))。この酵素は、ベータアラニンを生成するための基質としてマロネートセミアルデヒドを利用することができる。オキサロ酢酸アルファデカルボキシラーゼ活性を有する突然変異kgd遺伝子に加えてgabTを発現するE.coli AB354の株(E.coli AB354+gabT)は、代謝産物ベータアラニンを生成することができ、最少培地で増殖する能力が回復している。その選択の予測される結果を、図18に表す。
E.coli DF40+pKK223+MCRを使用する3−HPの1リットル規模のバイオ生産
実施例1に従って生成したE.coli株DF40+pKK223+MCRを使用して、およそ1リットルの作業用容量のバッチ培養を、3−HPの微生物のバイオ生産を評価するために行った。
耐性およびバイオ生産経路(予測の実施例)
3−HP耐性の増加をもたらし、かつ3−HPバイオ生産をもたらすために核酸配列を作製し、組み込むことに関し、上記共通の方法セクションにおいて提供されるものを含む、当業者に公知の方法を使用して、また、本明細書における他の実施例からの特定の方法をも使用して、非改変微生物において見出されるレベルを超えて3−HP耐性および3−HP生成の両方を増加させる異種核酸配列を、選択した微生物に提供するために遺伝子改変を作製する。選択した微生物の中に組み合わせ、微生物において発現された場合に、3HPTGCの1つ以上の性質(aspect)を改変することによって、3−HPに対する耐性を増加させる酵素(複数可)または他のポリペプチド(複数可)をコードする1つ以上の核酸配列を含むプラスミドまたは他のベクターまたはDNA配列(直接的な組み込みのための)を構築する。そのまたは異なるプラスミドまたは他のベクターまたはDNA配列(直接的な組み込みのための)は、選択した微生物において発現される場合に、3−HPのバイオ生産をもたらす(または増加させる)酵素(複数可)または他のポリペプチド(複数可)をコードする1つ以上の核酸配列を含むように構築する。
耐性改善の比較のための適切な計量の実証
増殖速度データは、細胞培養物において、一連の3−HP濃度にわたって、好気性および嫌気性の指定する条件下で以下の種について決定した。これは、対照と処理微生物の間の差異を評価するために使用されてもよい方法を実証する。これらのまたは他の方法は、本発明の様々な実施形態についての耐性の差異を実証するために使用されてもよい。
野生型E.coli BW25113の一晩培養物を、5mL標準LB培地中で三連で増殖させた。100uLの一晩培養物を使用して、47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、および0.4%グルコースを含有するM9最少培地+3HPからなる三連で5mL試料に接種し、そこでは3HP濃度を0〜50g/Lの範囲とした。開始OD600は、0.02〜0.08の範囲とした。培養物は、約24時間37℃でインキュベートし、OD600は、最初の8時間、1〜2時間毎に記録し、最終のOD600は、約24時間の時点で記録した。最大比増殖速度(μmax)は、評価期間のODデータとの指数傾向線(exponential trend line)の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ24時間にわたるOD600における特定の変化(Δ24hrOD600)は、t=24時間およびt=0の光学濃度における差異、Δ24hrOD600=(ODt=24)−(ODt=0)として計算した。特定の、倍化の数(Nd)は、式2N=(ODt=24)/(ODt=0)におけるNについて解くことによって計算した。
野生型E.coli BW25113の一晩培養物を、5mL標準LB培地中で三連で増殖させた。100uLの一晩培養物を使用して、47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、および0.4%グルコースを含有するM9最少培地+3HPからなる三連の5mL試料に接種し、そこでは3HP濃度を0〜50g/Lの範囲とした。開始OD600は、0.02〜0.08の範囲とした。培養物は、10秒間CO2を散布し、密閉し、約24時間37℃でインキュベートした。OD600は、最初の8時間の間、1〜2時間毎に記録し、最終のOD600は、約24時間の時点で記録した。それぞれのデータポイントについて、上記試料を開き、サンプリングし、CO2を再散布し、もう一度密閉した。最大比増殖速度(μmax)は、評価期間のODデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ24時間にわたるOD600における特定の変化(Δ24hrOD600)は、t=24時間およびt=0の光学濃度における差異、Δ24hrOD600=(ODt=24)−(ODt=0)として計算した。特定の、倍化の数(Nd)は、式2N=(ODt=24)/(ODt=0)におけるNについて解くことによって計算した。
野生型B.Subtilisの一晩培養物を、5mL標準LB培地中で三連で増殖させた。100uLの一晩培養物を使用して、47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.4%グルコース、および10mMグルタメートを含有するM9最少培地+3HP+グルタメート補充の三連の5mL試料に接種し、そこでは3HP濃度を0〜50g/Lの範囲とした。開始OD600は、0.02〜0.08の範囲とした。培養物は、約24時間37℃でインキュベートし、OD600は、最初の8時間、1〜2時間毎に記録し、最終のOD600は、約24時間の時点で記録した。最大比増殖速度(μmax)は、評価期間のODデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ24時間にわたるOD600における特定の変化(Δ24hrOD600)は、t=24時間およびt=0の光学濃度における差異、Δ24hrOD600=(ODt=24)−(ODt=0)として計算した。特定の、倍化の数(Nd)は、式2N=(ODt=24)/(ODt=0)におけるNについて解くことによって計算した。
S.cerevisiaeの一晩培養物は、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、および2%グルコースを含有する5mL標準YPD培地中で三連で増殖させた。100uLの一晩培養物を使用して、37.8mM(NH4)2SO4、8.1uM H3BO3、0.25uM CuSO4、0.6uM KI、1.25uM FeCl3、2.65uM MnSO4、1uM Na2MoO4、2.5uM ZnSO4、6.25mM KH2PO4、0.86mM K2HPO4、4.15mM MgSO4、1.71mM NaCl、0.90mM CaCl2、および2%グルコースを含有するSD最少培地(ビタミンなし)+3HPからなる三連の5mL試料に接種し、そこでは3HP濃度を0〜50g/Lの範囲とした。開始OD600は、0.03〜0.08の範囲とした。培養物は、10秒間CO2を散布し、密閉し、約24時間30℃でインキュベートした。OD600は、最初の8〜12時間、1〜2時間毎に記録し、最終のOD600は、約24時間の時点で記録した。最大比増殖速度(μmax)は、評価期間のODデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ24時間にわたるOD600における特定の変化(Δ24hrOD600)は、t=24時間およびt=0の光学濃度における差異、Δ24hrOD600=(ODt=24)−(ODt=0)として計算した。特定の、倍化の数(Nd)は、式2N=(ODt=24)/(ODt=0)におけるNについて解くことによって計算した。
S.cerevisiaeの一晩培養物は、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、および2%グルコースを含有する5mL標準YPD培地中で三連で増殖させた。100uLの一晩培養物を使用して、37.8mM(NH4)2SO4、8.1uM H3BO3、0.25uM CuSO4、0.6uM KI、1.25uM FeCl3、2.65uM MnSO4、1uM Na2MoO4、2.5uM ZnSO4、6.25mM KH2PO4、0.86mM K2HPO4、4.15mM MgSO4、1.71mM NaCl、0.90mM CaCl2、および2%グルコースを含有するSD最少培地(ビタミンなし)+3HPからなる三連の5mL試料に接種し、そこでは3HP濃度を0〜50g/Lの範囲とした。開始OD600は、0.03〜0.08の範囲とした。培養物は、10秒間CO2を散布し、密閉し、約24時間30℃でインキュベートした。OD600は、最初の8〜12時間、1〜2時間毎に記録し、最終のOD600は、約24時間の時点で記録した。それぞれのデータポイントについて、上記試料を開き、サンプリングし、CO2を再散布し、もう一度密閉した。最大比増殖速度(μmax)は、評価期間のODデータとの指数傾向線の最適なフィットを決定することによって計算した。およそ24時間にわたるOD600における特定の変化(Δ24hrOD600)は、t=24時間およびt=0の光学濃度における差異、Δ24hrOD600=(ODt=24)−(ODt=0)として計算した。特定の、倍化の数(Nd)は、式2N=(ODt=24)/(ODt=0)におけるNについて解くことによって計算した。
3−HPに対する微生物耐性を増加させることができるとして同定される、遺伝子の導入による遺伝子改変
1つからいくつかの遺伝子を含有する遺伝因子は、3−HP耐性にとって重要なものとして、SCALES 3−HP耐性データによって同定した。生物に対してより大きな耐性を与えるのに適切なこれらのエレメントの最適な組み合わせを開発するために、いくつかのこれらの遺伝因子は、異なる複製開始点および選択マーカーを含有する、一連の適合性のプラスミドにクローニングした。そのため、これらの適合性のプラスミドの組み合わせは、3−HP耐性に対する組み合わせの影響を評価するために細胞系に形質転換することができる。上記異なる複製開始点および選択マーカーを含有する親プラスミドベクターは、以下の表中に同定され、これは、個々のそのような親プラスミドベクターについて配列番号(配列番号005〜012および183〜186)を提供する。これらのプラスミドは、本明細書において記載されるプラスミドを構築するために使用し、挿入物なしのこれらのプラスミドもまた、耐性MIC試験のための対照細胞系を構築するために使用した。
多くの同定した遺伝因子を含む単一のプラスミドは、複数の他のプラスミドを容易に構築することができる方法において構築した(これらのうちのいくつかは記載されるように構築した)。構成的E.coliプロモーター、リボソーム結合部位、およびこれらの遺伝因子のオープンリーディングフレームを含むオペロンを、単一のプラスミド中に組み合わせ、これは、商業的DNA遺伝子合成供給者であるDNA2.0(Menlo Park、CA USA)からの遺伝子合成サービスによって生成した。タンパク質を生成するためのオープンリーディングフレームのそれぞれは、DNA2.0のサービスに従ってコドン最適化した。さらに、制限酵素認識部位は、一連の制限消化およびセルフライゲーションを通してこれらのタンパク質の全ての組み合わせを発現することができるプラスミドを創製するためにそれぞれのオペロンおよび遺伝子の間に組み込んだ。この構築物の他の特徴は、最後のオペロンの後のrrnBターミネーター配列および株へのこれらのエレメントの将来のゲノムの組み込みのために、EPICENTRE(Madison、Wisconsin)から得たEZ::TN(商標)トランスポゾン系による使用のための、コード領域のそれぞれの末端に隣接するAfeI制限酵素認識部位を含有するモザイク末端を含む。この構築プラスミドは、pJ61ベクター骨格中に提供した。pJ61:25135と呼ばれる、結果として生じるベクターの配列は、配列番号012として提供する。
これらの単一のオペロンのそれぞれを含有するプラスミドのセットを生成するために、一連の制限およびセルフライゲーションを実行する。そのため、いかなるオペロンも、それに隣接する制限酵素認識部位の間のDNA配列ならびに上記プラスミドのタンパク質コード領域全体に隣接するEcoICRI部位およびPmlI部位の除去によって単離することができる。例えば、PtpiAプロモーター下で発現され、SfoIおよびSmaIの制限酵素認識部位の間に位置するAroGポリペプチドを含むオペロンを含むプラスミドは、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たPmlIおよびSfoIを用いて上記pJ61:25135プラスミドを最初に消化することによって生成した。次いで、結果として生じるDNAは、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たT4DNAリガーゼを用いてセルフライゲーションし、E.coli K12に形質転換した。このE.coli K12形質転換由来の個々のコロニーは、液体培養において増殖させ、個々のコロニー由来のプラスミドは、製造者の指示に従って、Qiagen Miniprepキット(Valencia、CA USA)を使用して単離した。その単離したプラスミドは、AfeIを用いる制限消化によってスクリーニングし、的確なプラスミドは、制限およびセルフライゲーションの次のラウンドを実行した。第2のラウンドにおいて、これらのプラスミドは、製造者の指示に従って、それぞれ、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)およびPromega Corporation(Madison、Wisconsin)から得たSmaIおよびEcoICRIを用いて制限にかけた。次いで、結果として生じるDNAは、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たT4DNAリガーゼを用いてセルフライゲーションし、E.coli K12に形質転換した。このE.coli K12形質転換由来の個々のコロニーは、液体培養において増殖させ、個々のコロニー由来のプラスミドは、製造者の指示に従って、Qiagen Miniprepキット(Valencia、CA USA)を使用して単離した。その単離したプラスミドは、AfeIを用いる制限消化によってスクリーニングし、配列決定によって検証した。
上記3HPTGCのマップの開発の後、文献調査により、いくつかの同定された遺伝子について以前の研究を同定した。上記3HPTGCにおいて同定されたエレメントについての野生型遺伝子または突然変異遺伝子のいずれかを含有するプラスミドについて、これらの報告書を作製した研究室に依頼した。そのように得た遺伝子およびそれらがコードするタンパク質は、配列番号によって同定される。
Bacteriol. 1988年12月;170巻(12号):5500〜6頁 Mutational analysis of the catalytic and feedback sites of the tryptophan−sensitive 3−deoxy−D−arabino−heptulosonate−7−phosphate synthase of Escherichia coliにおいて記載された。上記野生型遺伝子を含有するpKK223プラスミドと共に、149位でのグリシンからシステインへの突然変異、149位でのグリシンからアスパラギン酸への突然変異、および18位でのプロリンからロイシンへの突然変異をコードする突然変異遺伝子を含有する3つのさらなるpKK223プラスミドを提供した。
Oxidation of cysteine 645 of cobalamin−independent methionine synthase causes a
methionine limitation in Escherichia coliにおいて記載された。このpKK233プラスミドは、645位でシステインからアラニンへの突然変異をコードするmetE遺伝子を持つ。
3−HP耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Lucigen Corporation(Middleton WI、USA)から得たpSMART−LC−kanベクター(配列番号027)において構築した。このベクターは、低コピー複製起点およびカナマイシン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、その導入遺伝因子およびそれらがコードするタンパク質は、その中の方法Cセクション下の表42中の配列番号によって同定される。方法C下の表42中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についてのそれぞれの配列情報を含有する。
3−HP耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Lucigen Corporation(Middleton WI、USA)から得たpSMART−HC−Ampベクターにおいて構築した。このベクターは、高コピー複製起点およびアンピシリン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表42中の方法Dとして同定される。表42中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
3−HP耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、Lucigen Corporation(Middleton WI、USA)から得たpSMART−HC−AMPベクターにおいて構築した。このベクターは、高コピー複製起点およびアンピシリン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表42中の方法Eとして同定される。表42中のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
3−HP耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、pACYC177(Kanのみ)ベクターにおいて構築した。この骨格は、EMD Chemical Corporation(Gibbstown、NJ USA)からのKODポリメラーゼを使用し、プライマーCPM0075(5’−CGCGGTATCATTGCAGCAC−3’)(配列番号123)およびプライマーCPM0018(5’−GCATCGGCTCTTCCGCGTCAAGTCAGCGTAA−3’)(配列番号124)を使用して、pACYC177プラスミドの一部を増幅させることによって創製した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Qiagen Corporation(Valencia、CA USA)によって提供されるゲル抽出キットを使用して、DNAをゲル抽出することによって単離した。このDNAは、pACYC177(Kanのみ)と命名し、本明細書において創製した産物へのライゲーションのために保存した。このpACYC177(Kanのみ)骨格DNAは、低コピー複製起点およびカナマイシン選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表42の方法Fとして同定される。表42のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
3−HP耐性に対するそれらの影響について評価したいくつかの遺伝因子を、pBT−3ベクターにおいて構築した。この骨格は、EMD Chemical Corporation(Gibbstown、NJ USA)からのKODポリメラーゼを使用し、プライマーPBT−FOR(5’−AACGAATTCAAGCTTGATATC−3’)(配列番号125)およびプライマーPBT−REV(5’−GAATTCGTTGACGAATTCTCTAG−3’)(配列番号126)を使用して、pBT−3プラスミドの一部を増幅させることによって創製した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Qiagen Corporation(Valencia、CA USA)によって提供されるゲル抽出キットを使用して、DNAをゲル抽出することによって単離した。このDNAは、pBT−3骨格と命名し、本明細書において創製した産物へのライゲーションのために保存した。このpBT−3骨格DNAは、低コピー複製起点およびクロラムフェニコール選択を提供する。これらのプラスミドは全て、類似する方法において創製し、表42の方法Gとして同定される。表42のそれぞれの列は、クローニングされたプラスミド内に含有されるタンパク質、あらゆるポリメラーゼ連鎖反応において使用されるプライマー、および新しいプラスミドを創製するために使用されるポリメラーゼ連鎖反応産物の配列についての配列情報を含有する。
Corporation(Gibbstown、NJ USA)からのKOD DNAポリメラーゼを使用して、正確な挿入物を増幅させるために使用した。5’末端または増幅DNA産物は、製造者の説明書を使用して、New England Biolabs(Ipswich、MA USA)のT4ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化した。この反応の結果として生じる産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、予測されるサイズのバンドは、ゲルからそれを切り離し、Qiagen Corporation(Valencia、CA USA)によって提供されるゲル抽出キットを使用して、DNAをゲル抽出することによって単離した。抽出したリン酸化DNAは、次いで、本明細書において記載されるpBT−3骨格DNAに平滑末端ライゲーションし、製造者の説明書を使用して、10G E.coli細胞に形質転換した。形質転換細胞は、リッチ培地において回収し、次いで、適切な選択のためにクロラムフェニコールを含有するLB寒天プレートでプレート培養した。コロニー増殖の後に、単一のコロニーをLB培地で増殖させ、プラスミドDNAは、Qiagen Corporation(Valencia、CA USA)から得たミニプレップキットを使用して抽出した。単離プラスミドDNAは、制限消化によってチェックし、配列決定し、他の実験における使用の前に検証した。
3−HP耐性に関係する新規なペプチドの評価
3−HP耐性を増加させるIroKと呼ばれる新規な21アミノ酸ペプチドを発見した。
方法:IroK発現研究
EcorIおよびHindIII制限酵素認識部位が隣接するIroKポリペプチド領域全体ならびにRBSを含むプライマーは、発現研究(Operon、Huntsville、AL)から得た:
最小発育阻止濃度(MIC)
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて微好気的に決定した。株の一晩培養物を5mLのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で増殖させた。1%(v/v)接種材料を、MOPS最少培地の15ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、0.200のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:20にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用した(1ウェル当たり約104細胞)。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜70g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間後に記録した。
結果
21アミノ酸(MKPALRDFIAIVQERLASVTA、配列番号129)から構成されるペプチドであるIroKの効果を調査するために、天然の予測されるRBSと共に、それをコードする配列を、誘導性発現ベクター(pKK223−3)に組み込んだ。図20は、3−HPに対する耐性を増強するのに十分な、短い87bp配列の発現の増加を示す(MICにおける>2倍の増加)。さらに、MICが、乳酸、アクリル酸、および酢酸を含む、類似する分子の性質を有する他のいくつかの有機酸については変わらなかったので、耐性機構は、3−HPによる増殖阻害に対して特異的のようである。付与される耐性のモードを分析するために、ほとんど同一の配列を、翻訳開始部位において単一の突然変異(ATGからTTGに)を有する同じベクターに組み込むと、野生型E.coliに等価なMICの減少がもたらされた(図20)。この結果は、耐性の機構が、DNAまたはRNAの段階に対して発揮される(mapped)というよりはむしろ、翻訳されたポリペプチドの発現に対して特異的であるということを意味する。
E.coli DF40における3−HP生成のためのマロニル−CoA還元酵素の遺伝子改変/導入 Chloroflexus aurantiacus由来のマロニル−coA還元酵素遺伝子についてのヌクレオチド配列は、商業的DNA遺伝子合成供給者であるDNA 2.0(Menlo Park、CA USA)からのサービスに従って、E.coli用にコドン最適化した。この遺伝子配列は、開始コドンの前にEcoRI制限酵素認識部位を組み込み、HindIII制限酵素認識部位が後続した。さらに、シャインダルガルノ(Shine Delgarno)配列(つまりリボソーム結合部位)を開始コドンの前に配置し、EcoRI制限酵素認識部位をその前においた。この遺伝子構築物は、DNA
2.0によって合成され、pJ206ベクター骨格中に提供された。合成mcr遺伝子を含有するプラスミドDNA pJ206は、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得た酵素EcoRIおよびHindIIIを用いる酵素制限消化にかけた。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載されるようにUV透過照明下で視覚化した。mcr遺伝子に対応するDNA片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、DNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA USA)からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。pKK223−aroHを持つE.coliクローニング株は、University of Colorado at BoulderのRyan T.Gill教授の研究室からの寄贈品として得た。プラスミドを持つこの株の培養物は、標準的な方法によって増殖させ、プラスミドDNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA USA)からの市販のミニプレップカラムによって調製した。プラスミドDNAは、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得た制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびHindIIIを用いて消化した。この消化は、pKK223骨格からaroHリーディングフレームを分離する役目をした。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載されるようにUV透過照明下で視覚化した。pKK223プラスミドの骨格に対応するDNA片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、DNAは、製造者の指示に従って、Qiagenからの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
E.coli遺伝子欠失株の構築
以下の株は、Keioコレクションから得た:JW1650(△purR)、JW2807(△lysR)、JW1316(△tyrR)、JW4356(△trpR)、JW3909(△metJ)、JW0403(△nrdR)。Keioコレクションは、Open Biosystems(Huntsville、AL USA 35806)から得た。個々のクローンは、Yale Genetic Stock Center(New Haven、CT USA 06520)から購入してもよい。これらの株は、それぞれ、欠失遺伝子の代わりにカナマイシンマーカーを含有する。Keioコレクションおよびカナマイシンカセットの除去(curing)に関するより多くの情報については、Baba, Tら(2006年)、Construction of Escherichia coli K12 in−frame, single−gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology doi:10.1038/msb4100050およびDatsenko KAおよびBL Wanner(2000年)、One−step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K−12 using PCR products. PNAS 97巻、6640〜6645頁を参照されたい。これらの株は、標準的な方法によってエレクトロコンピテント(electrocompetent)にした。次いで、それぞれの株は、Dr.Ryan Gill(University of Colorado、Boulder、CO USA)からの寄贈品であったプラスミドpCP20を用いて標準的な電気穿孔法を介して形質転換した。形質転換は、20μg/mLクロラムフェニコールおよび100μg/mLアンピシリンを含有するLuria Broth寒天プレートにまき、摂氏30度で36時間インキュベートした。クローンは、これらの形質転換(these transformation)から単離し、いかなる抗生物質をも欠く10mLのM9培地で一晩増殖させた。コロニーは、いかなる抗生物質をも欠くLuria Broth寒天プレートに画線することによってこれらの培養物から単離した。コロニーは、抗生物質の、カナマイシン(20μg/mL)、クロラムフェニコール(20μg/mL)、およびアンピシリン(100μg/mL)を含有するLuriaブロス寒天プレート上での増殖がないことを確認することによって、カナマイシンマーカーならびにプラスミドpCP20を失ったことを確認した。単離したクローンは、カナマイシンカセットを失ったことをコロニーPCRによって確認した。PCRは、Lucigen(カタログ#30033)(Middleton、WI USA)から得たEconoTaq PLUS GREEN 2X master PCR mixを使用して実行した。PCRは、以下のサイクルを用いて、96ウェル勾配ROBOサイクラー(Stratagene、La Jolla、CA USA 92037)を使用して実行した:1)摂氏95度で10分、2)以下のサイクルを30回、a)摂氏95度で1分、b)摂氏52度で1分、b)摂氏72度で2分、続いて3)摂氏72度で10分間の1サイクル。クローンのそれぞれについてカナマイシンカセットの除去を確認するためのPCRについて使用したプライマーを、以下の表に示す。プライマーは、Integrated DNA Technologies(Coralville、IA USA)から購入した。BX_00341.0、BX_00342.0、BX_00345.0、BX_00346.0、BX_00348.0、およびBX_00349.0と呼ばれる結果として生じる欠落株(cured strain)は、それぞれ、JW1316(△tyrR)、JW4356(△trpR)、JW3909(△mctJ)、JW1650(△purR)、JW2807(△lysR)、およびJW0403(△nrdR)に対応する。
E.coli株の構築
表44および45におけるそれぞれの組み合わせに従って、プラスミドは、それぞれのベースの株に導入した。全てのプラスミドは、標準的な方法を使用して電気穿孔を介して同時に導入した。形質転換細胞は、抗生物質を補充した適切な培地で増殖させ、コロニーは、選択培地でのそれらの適切な増殖に基づいて選択した。
野生型E.coliに対する3HPTGC関連補充物質の評価
3HP耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、MIC評価によって決定した。試験した補充物質を、表46に列挙する。上記MIC評価の結果は、好気条件については表47および嫌気条件については表48に提供する。単一および複数の補充物質の追加を含むこのデータは、24時間のMIC評価に基づいて、これらの培養系における3−HP耐性における改善を実証する。
3HPTGC関連遺伝子改変E.coliの評価
実施例50は、24時間の期間にわたる、増殖速度に基づくトレラグラムを使用する、対照との、3HPTCの1つの遺伝子改変の直接的な比較を提供する。
CynTS遺伝子改変とのトレラグラム比較
24時間の期間のトレラグラム評価は、対照(野生型)E.coli(株BW25113)を、cynTSを導入するための遺伝子改変を含む遺伝子改変E.coli(株BW25113)と比較するために行った。
Bacillus subtilisへの耐性片の遺伝子改変/導入
Bacillus subtilisへの3−HP生成耐性片の創製のために、E.coli寛容原性複合体由来のいくつかの遺伝子を、BacillusシャトルベクターのpWH1520(配列番号010)(Boca Scientific(Boca Raton、FL USA)から得た)にクローニングした。このシャトルベクターは、誘導性Pxylキシロース誘導性プロモーターならびにE.coliにおける増殖のためのアンピシリン抵抗性カセットおよびBacillus subtilisにおける増殖のためのテトラサイクリン抵抗性カセットを持つ。これらの遺伝子についてのクローニング戦略を、表49に示す。
表49においてクローニング方法Aを指定したB.subtilisにおいて試験するためにクローニングした耐性遺伝子は、類似する方法において創製した。ここで記載されるクローニング方法は、遺伝子をキシロース誘導性プロモーター下に配置する。それぞれの遺伝子は、上記表のそれぞれの列において列挙したそれらの対応するプライマーAおよびプライマーBを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。それぞれのセットのプライマーAは、遺伝子の出発点およびSpeI制限酵素認識部位に対して相同性を有する。プライマーBは、遺伝子の終止コドンから下流の領域およびBamHI制限酵素認識部位に対して相同性を有する。ポリメラーゼ連鎖反応産物は、製造者の指示に従って、Qiagen Corporation(Valencia、CA USA)から得たPCR精製キットを使用して精製した。次に、その精製産物は、製造者の指示に従って、New England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たSpeIおよびBamHIを用いて消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載されるようにUV透過照明下で視覚化した。消化し、精製した耐性遺伝子に対応するDNA片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、DNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA USA)からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
Bacillus subtilisにおける3−HP生成のためのマロニル−CoA還元酵素の遺伝子改変/導入
Bacillus Subtilisにおける3−HP生成経路の創製のために、商業的DNA遺伝子合成供給者であるDNA2.0(Menlo Park、CA USA)からの遺伝子合成サービスによって構築したChloroflexus aurantiacus由来のマロニル−coA還元酵素遺伝子についてのコドン最適化ヌクレオチド配列を、Bacillus Subtilisシャトルベクターに加えた。このシャトルベクター、pHT08(配列番号011)は、Boca Scientific(Boca
Raton、FL USA)から得たものであり、誘導性Pgrac IPTG誘導性プロモーターを持つ。
England BioLabs(Ipswich、MA USA)から得たBamHIを用いて消化した。その消化混合物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、上記共通の方法セクションのサブセクションIIにおいて記載されるようにUV透過照明下で視覚化した。mcr遺伝子に対応するDNA片を含有するアガロースゲル切片は、ゲルから切り出し、DNAは、製造者の指示に従って、Qiagen(Valencia、CA
USA)からの標準的なゲル抽出プロトコールおよび成分を用いて回収した。
Bacillus subtilis株の構築
pWH1520における耐性遺伝因子のためのプラスミドおよび生成プラスミド、pHT08−mcrを2つのBacillus subtilis株に形質転換した。そのBacillus subtilis亜種subtilis 168株は、University of Colorado at BoulderのRyan T.Gill教授の研究室からの寄贈品として得た。形質転換は、Boca Scientific(Boca Raton、FL USA)によるpHT08シャトルベクターについての指示と共に提供されるAnagnostopoulos and Spizizen(Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81巻:741〜746頁(1961年))から開発された改変プロトコールを使用して実行した。
野生型B.subtilisに対する3HPTGC関連補充物質の評価
3HP耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、MIC評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。嫌気条件下でのMIC評価の結果は、表50に提供する。
表50:B.subtilisの補充物質および好気条件下での遺伝子改変結果
** 34時間後にOD600が減少し、0の読み取り値をもたらす対照BSX_0003.0と比較して、遺伝子改変株は、24時間後の増殖において陽性の変化を有した。
3HPTGC関連補充物質なしおよびありの3HPTGC関連遺伝子改変B.subtilisの評価
B.subtilisにおける補充および/または3HP耐性に対する遺伝子改変の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、MIC評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。B.subtilisについての試験した遺伝子改変および好気条件下でのMIC結果を、表50に提供する。単一の遺伝子改変ならびに単一および複数の補充物質の追加を含むこのデータは、ODにおける変化に基づいて、この培養系での3−HP耐性における改善を実証する。
3HP生成のための酵母の好気経路(予測)
ACC1に対して相同性の5’の200bp、選択のためのHis3遺伝子、Adh1酵母プロモーター、MCRのクローニングためのBamHI部位およびSpeI部位、cyc1ターミネーター、酵母由来のTef1プロモーター、ならびに酵母ACC1オープンリーディングフレームに対して相同性の最初の200bpを含有する以下の構築物(配列番号150)は、遺伝子合成(DNA 2.0)を使用して構築する。MCRオープンリーディングフレーム(配列番号151)を、BamHI部位およびSpeI部位にクローニングし、これにより、adh1プロモーターによる構成的転写を可能にする。上記構築物へのMCRのクローニングに続いて、遺伝因子(配列番号152)は、制限消化によってプラスミドから単離し、関連する酵母株に形質転換する。その遺伝因子は、酵母ACC1の天然のプロモーターをノックアウトし、それを、adh1プロモーターから発現されるMCRと交換し、Tef1プロモーターは、それから、酵母ACC1発現を駆動する。組込みは、ヒスチジンの非存在下における増殖によって選択する。陽性のコロニーは、PCRによって確認する。MCRの発現およびACC1の発現の増加は、RT−PCRによって確認する。
3HPに対する耐性の増加のための、Saccharomyces cerevisiae遺伝因子のクローニング
酵母遺伝子は、〈〈biocyc.org〉〉を使用して相同性および経路の比較によって同定し、それは図9D、シート1〜7において概説した。遺伝因子は、表51におけるプライマーを使用して、PCRによって増幅した。酵母遺伝因子は、天然のプロモーターおよび3’非翻訳領域の、PCR産物配列表51を含有するように増幅した。PCR産物は、ゲル電気泳動および、製造者の指示に従って、Qiagenゲル抽出(Valencia、CA USA、カタログ番号28706)を使用した、ゲル精製によって単離した。ゲル精製酵母遺伝因子は、次いで、製造者の指示に従って、pYes2.1−topoベクター(配列番号183、Invitrogen Corp、Carlsbad、CA、USA)にクローニングした。コロニーは、PCRによってスクリーニングし、次いで、Genewizによって配列決定した。
表51:酵母耐性プライマー
E.coli/酵母シャトルベクターpRS423およびpRS425への酵母遺伝因子のサブクローニング
遺伝因子は、制限酵素PvuIIおよびXbaIを用いる制限消化によってpYes2.1から切り取った。酵母遺伝因子を含有する制限断片は、ゲル電気泳動および、製造者の指示に従って、Qiagenゲル抽出(Valencia、CA USA、カタログ番号28706)を使用した、ゲル精製によって単離した。骨格ベクターpRS423およびpRS425は、SmaIおよびSpeI制限酵素を用いて消化し、ゲル精製した。酵母遺伝因子は、pRS423およびpRS425(配列番号184および185)にライゲーションした。プラスミドは全て、PCR分析および配列決定を使用してチェックした。
酵母株の構築
酵母株は、標準的な酵母形質転換を使用して構築し、栄養要求性マーカーの補完によって選択した。株は全て、S288Cバックグラウンドとする。一般的な酵母形質転換方法については、Gietz, R.D.およびR.A. Woods. (2002年)「Transformation of Yeast by the Liac/SS Carrier DNA/PEG Method.」 Methods in Enzymology 350巻:87〜96頁を参照されたい。
酵母における3HP耐性に対する補充物質および/または遺伝子改変の評価
補充および/または3HP耐性に対する遺伝子改変の効果は、本実施例において記載される方法を使用して、MIC評価によって決定した。試験した補充物質は、好気および嫌気条件について表52および53においてそれぞれ列挙する。酵母において試験した遺伝子改変は、好気および嫌気条件について表54および55においてそれぞれ列挙する。MIC評価の結果は、表52〜55において提供する。単一および複数の補充物質の追加ならびに遺伝子改変を含むこのデータは、本明細書において記載されるMIC評価に基づいて、これらの培養系における3−HP耐性における改善を実証する。
酵母の好気最小発育阻止濃度評価のための方法
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。そのプレートを配置し、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(ビタミンなしの合成最少グルコース培地(SD)標準培地に相当する):20g/Lデキストロース、5g/L硫酸アンモニウム、850mg/Lリン酸一カリウム、150mg/Lリン酸二カリウム、500mg/L硫酸マグネシウム、100mg/L塩化ナトリウム、100mg/L塩化カルシウム、500μg/Lホウ酸、40μg/L硫酸銅、100μg/Lヨウ化カリウム、200μg/L塩化第二鉄、400μg/L硫酸マンガン、200μg/Lモリブデン酸ナトリウム、および400μg/L硫酸亜鉛。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物は、ビタミンを有する5mL SD培地中で三連で増殖させた(Methods in Enzymology 350巻、17頁(2002年))。1%(v/v)接種材料を、ビタミンなしのSD最少培地の5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、0.200のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:5にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定するために並べた。プレートは、30℃で72時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、72時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
酵母の嫌気最小発育阻止濃度評価のための方法
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて嫌気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(ビタミンなしの合成最少グルコース培地(SD)標準培地に相当する):20g/Lデキストロース、5g/L硫酸アンモニウム、850mg/Lリン酸一カリウム、150mg/Lリン酸二カリウム、500mg/L硫酸マグネシウム、100mg/L塩化ナトリウム、100mg/L塩化カルシウム、500ug/Lホウ酸、40ug/L硫酸銅、100ug/Lヨウ化カリウム、200ug/L塩化第二鉄、400ug/L硫酸マンガン、200ug/Lモリブデン酸ナトリウム、および400ug/L硫酸亜鉛。株の一晩培養物は、ビタミンを有する5mL SD培地中で三連で増殖させた(Methods in Enzymology 350巻、17頁(2002年))。1%(v/v)接種材料を、ビタミンなしのSD最少培地の5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、0.200のOD600まで希釈した。その細胞は、1:5にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、30℃で72時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、72時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。プレートは、嫌気条件用のガス発生器を含有するバイオバッグ嫌気チャンバー内に密閉し、30℃で72時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、72時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
Cupriavidus necatorにおける3HPTGC関連補充物質の評価
C.necatorにおける3HP耐性に対する補充の効果は、上記共通の方法セクションにおいて記載される方法を使用して、MIC評価によって決定した。試験した補充物質を、補充物質の表中に列挙する。
3−HP生成遺伝子改変(複数可)と組み合わせた3HPTGC耐性指向性遺伝子改変(複数可)のさらなる例
3−HPを生成するための使用に適切な所望の遺伝子改変微生物を得るために耐性および3−HP生成遺伝子改変を組み合わせることの一般的な例を提供する実施例42に加え、また、実施例43に従う実施例を考慮し、また、本明細書におけるさらなる開示および当業者に公知の方法を考慮して(例えば、遺伝子改変のその方法について本実施例に組み込まれるSambrookおよびRussell、2001年)、本実施例は、3−HPに対する耐性増加をもたらすための3HPTGCの1つ以上の遺伝子改変(本明細書において議論されるものなどの任意の計量によって評価されてもよい)および3−HP生成を増加させるための1つ以上の遺伝子改変(本明細書において開示されるものなどの3−HP生成経路など)を含むように遺伝子改変された微生物種を提供する。
3HPTGC遺伝子改変と組み合わせたIrok配列をコードする遺伝子改変の導入
実施例45は、21アミノ酸から構成されるペプチドであるIrokおよびそれをコードするプラスミドをE.coli株に導入し、微好気条件下で評価した場合のその3−HP耐性改善効果を記載する。3HPTGCに関する本明細書における開示および当業者に公知の方法(例えば、遺伝子改変のその方法について本実施例に組み込まれるSambrookおよびRussell、2001年)を考慮して、微生物種は、総体として3−HPに対する耐性増加をもたらすために、IroKペプチド配列をコードする核酸配列および3HPTGCの1つ以上の遺伝子改変を含むように遺伝子改変する。3−HP耐性におけるそのような増加は、本明細書において議論されるものなどの任意の計量によって評価されてもよい。
pRhBR17およびpDA71を含むが、これらに限定されない一連のE.coli−Rhodococcusシャトルベクターは、R.erythropolisにおける発現のために利用可能である(Kostichkaら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 62巻:61〜68頁(2003年))。さらに、一連のプロモーターは、R.erythropolisにおける異種遺伝子発現のために利用可能である(例えばNakashimaら、Appl. Environ. Microbiol. 70巻:5557〜5568頁(2004年)およびTaoら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005年、DOI 10.1007/s00253−005−0064を参照されたい)。R.erythropolisにおける染色体遺伝子の標的遺伝子破壊は、Taoら、前掲、およびBransら(Appl. Environ. Microbiol. 66巻:2029〜2036頁(2000年))によって記載される方法を使用して生成されてもよい。これらの公開される手段は、それぞれの示される教示および組成について参照によって組み込まれる。
B.subtilisにおいて複製するほとんどのプラスミドおよびシャトルベクターは、プロトプラスト形質転換または電気穿孔のいずれかによってB.licheniformisを形質転換するために使用する。3−HP耐性の改善のためにおよび/または3−HP生合成のために必要とされる核酸配列は、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、プラスミドpBE20またはpBE60誘導体にクローニングする(Nagarajanら、Gene 114巻:121〜126頁(1992年))。B.licheniformisを形質転換するための方法は、当技術分野において公知である(例えばFlemingら Appl. Environ. Microbiol.,61巻(11号):3775〜3780頁(1995年)を参照されたい)。これらの公開される手段は、それらのそれぞれの示される教示および組成について参照によって組み込まれる。
プラスミドは、B.subtilisにおける発現のために本明細書において記載されるように構築し、プロトプラスト形質転換によって、Paenibacillus maceransを形質転換し、3−HP耐性の改善および必要に応じて3−HPバイオ生産を実証する組換え微生物を生成するために使用する。
Alcaligenes eutrophusにおける遺伝子発現および突然変異の作製のための方法は、当技術分野において公知である(例えばTaghaviら、Appl. Environ. Microbiol.、60巻(10号):3585〜3591頁(1994年)を参照されたい)。この公開される手段は、その示される教示および組成について参照によって組み込まれる。3−HP耐性を改善することが同定された核酸配列および/または3−HP生合成のための核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、3−HP耐性の改善および必要に応じて3−HPバイオ生産を実証する組換え微生物を生成するために電気穿孔する。Alcaligenesにおけるポリ(ハイドロキシブチレート)経路は、詳細に記載されており、Alcaligenes eutrophusゲノムを改変するための様々な遺伝学的技術は、公知であり、それらのツールは、3−HP寛容原性または必要に応じて3−HP−gena−寛容原性組換え微生物を設計製作するために適用することができる。
Pseudomonas putidaにおける遺伝子発現のための方法は、当技術分野において公知である(例えば、これらの教示が参照により本明細書において組み込まれるBen−Bassatら、米国特許第6,586,229号を参照されたい)。3−HP耐性を改善することが同定された核酸配列および/または3−HP生合成のための核酸配列はいずれも、様々な供給源から単離し、適切なようにコドン最適化し、本明細書において記載される広範囲の宿主領域のベクターのいずれかにクローニングし、3−HP耐性の改善および必要に応じて3−HP生合成による生成を実証する組換え微生物を生成するために電気穿孔する。例えば、これらの核酸配列は、pUCP18に挿入し、このライゲーションしたDNAは、3−HP耐性の増加を示し、また必要に応じて、導入した核酸配列の少なくとも一部分から構成される3−HP生合成経路をも含む組換えP.putida微生物を生成するために、エレクトロコンピテントPseudomonas putida KT2440細胞に電気穿孔する。
Lactobacillus属は、Lactobacillalesのファミリーに属し、Bacillus subtilisおよびStreptococcusの形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターは、Lactobacillusのために使用される。適切なベクターの非限定的な例は、pAMβ1およびその誘導体(Renaultら、Gene 183巻:175〜182頁(1996年);およびO’Sullivanら、Gene 137巻:227〜231頁(1993年));pMBB1およびpHW800、pMBB1の誘導体(Wyckoffら Appl. Environ. Microbiol 62巻:1481〜1486頁(1996年));pMG1、接合性プラスミド(Tanimotoら、J. Bacteriol. 184巻:5800〜5804頁(2002年));pNZ9520(Kleerebezemら、Appl. Environ. Microbiol. 63巻:4581〜4584頁(1997年));pAM401(Fujimotoら、Appl. Environ. Microbiol. 67巻:1262〜1267頁(2001年));ならびにpAT392(Arthurら、Antimicrob. Agents Chemother. 38巻:1899〜1903頁(1994年))を含む。Lactobacillus plantarum由来のいくつかのプラスミドもまた、報告されている(例えばvan Kranenburg R、Golic N、Bongers R、Leer R J、de Vos W M、Siezen R J、Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol. 2005年3月;71巻(3号):1223〜1230頁)。
Enterococcus属は、Lactobacillalesのファミリーに属し、Lactobacillus、Bacillus subtilisおよびStreptococcusの形質転換において使用される多くのプラスミドおよびベクターは、Enterococcusのために使用される。適切なベクターの非限定的な例は、pAMβ1およびその誘導体(Renaultら、Gene 183巻:175〜182頁(1996年);およびO’Sullivanら、Gene 137巻:227〜231頁(1993年));pMBB1およびpHW800、pMBB1の誘導体(Wyckoffら Appl. Environ. Microbiol. 62巻:1481〜1486頁(1996年));pMG1、接合性プラスミド(Tanimotoら、J. Bacteriol. 184巻:5800〜5804頁(2002年));pNZ9520(Kleerebezemら、Appl. Environ. Microbiol. 63巻:4581〜4584頁(1997年));pAM401(Fujimotoら、Appl. Environ. Microbiol. 67巻:1262〜1267頁(2001年));ならびにpAT392(Arthurら、Antimicrob. Agents Chemother. 38巻:1899〜1903頁(1994年))を含む。Lactococcus由来のnisA遺伝子を使用するE.faecalisのための発現ベクターもまた、使用されてもよい(Eichenbaumら、Appl.
Environ. Microbiol. 64巻:2763〜2769頁(1998年)。さらに、E.faecium染色体における遺伝子交換のためのベクターが、使用される(Nallaapareddyら、Appl. Environ. Microbiol. 72巻:334〜345頁(2006年))。
このセクションにおける方法は全て、参照される場合、実施例への組み込みのために提供される。
必要に応じて利用されてもよい細菌の種は、以下の通りである。
発酵槽の最初のバッチ培地において使用したリッチ培地(実施例11について)
1M MgSO4、1ml 1000×微量ミネラルストック、60mL 500g/Lグルコース、100mL 0.1M MOPS(pH7.4)、0.1mLの1M CaCl2、1000mLまでのDI水を用いる適量、および0.2μmフィルター滅菌。
10×SM3塩(1L)の作製:800mL DI水、28.7g K2HPO4、15g KH2PO4、31.3g (NH4)2SO4、1.5g KCl、0.5g クエン酸(無水)、および1000mLまでのDI水を用いる適量。
M9最少培地は、5×M9塩、1M MgSO4、20%グルコース、1M CaCl2、および滅菌脱イオン水を組み合わせることによって作製した。その5×M9塩は、1Lの最終容量まで、脱イオン水に以下の塩を溶解することによって作製する:64g Na2HPO4・7H2O、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl。その塩溶液は、200mL一定分量に分け、液体サイクルで15psiで15分間、オートクレーブ滅菌することによって殺菌した。MgSO4の1M溶液および1M CaCl2は、別々に作製し、次いで、オートクレーブ滅菌によって殺菌した。グルコースは、それを0.22μmフィルターに通過させることによって濾過滅菌した。その成分は全て、1LのM9を作製するために以下のように組み合わせる:750mL滅菌水、200mL 5×M9塩、1M MgS04の2mL、20mL 20%グルコース、0.1mL CaCl2、1Lの最終容量まで適量。
培地成分は全て、TEKnova(Hollister CA USA)から得、以下の容量で組み合わせた。100mL 10×MOPS混合物、10mL 0.132M K2 HPO4、100mL 10×ACGU、200mL 5×補充物質EZ、10mL 20%グルコース、580mL滅菌水。
TAE中1%アガロースを作製するために、分子生物学グレードのアガロース(RPI
Corp、Mt.Prospect、IL、USA)を1×TAEに加える。50×TAEを得るため、900ml蒸留H2Oに以下を加え:242gトリス塩基(RPI Corp、Mt.Prospect、IL、USA)、57.1ml氷酢酸(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO、USA)、18.6g EDTA(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA USA)、さらなる蒸留水を用いて1Lに容量を調整する。1×TAEを得るために、980mLの蒸留水に20mLの50×TAEを加える。次いで、沸騰が生じるまで、そのアガロースTAE溶液を加熱し、アガロースを完全に溶解する。50℃までその溶液を冷却させた後、10mg/mL臭化エチジウム(Acros Organics、Morris Plains、NJ、USA)を100mLの1%アガロース溶液当たり5ulの濃度で加える。一旦、臭化エチジウムを添加したら、その溶液を短時間混合し、試料分析あたり、適切な数のコームを有するゲル成型トレイ(Idea Scientific Co.、Minneapolis、MN、USA)に注ぐ。次いで、DNA試料は、5×TAEローディングバッファーと適宜混合する。5×TAEローディングバッファーは、5×TAE(本明細書において記載される50×TAEから希釈)、20%グリセロール(Acros Organics、Morris Plains、NJ、USA)、0.125%ブロモフェノールブルー(Alfa Aesar、Ward Hill、MA、USA)からなり、蒸留水を用いて50mLに容量を調整する。次いで、ロードしたゲルは、25〜30分間、125ボルトの定電圧で、1×TAEを満たしたゲル装置(Idea Scientific
Co.、Minneapolis、MN、USA)中で泳動する。この時点では、ゲルは、電圧を有するゲルボックスから取り出し、UVトランスイルミネーター(FOTODYNE Inc.、Hartland、WI、USA)下で視覚化する。
pSMARTベクターへのライゲーションについて:
ゲル抽出したDNAは、製造者の指示に従って、PCRTerminator(Lucigen Corp、Middleton、WI、USA)を使用して平滑化する。次いで、500ngのDNAを、2.5uL 4×CloneSmartベクタープレミックスに加え、1ul CloneSmart DNAリガーゼ(Lucigen Corp、Middleton、WI、USA)および蒸留水を加え、10ulの総容量にする。次いで、その反応物を、30分間、室温に置き、次いで、15分間、70℃で熱不活化し、次いで、氷上に置く。E.cloni 10Gケミカルコンピテント細胞(Lucigen Corp、Middleton、WI、USA)を氷上で20分間解凍する。40ulのケミカルコンピテント細胞を、微量遠心管の中に置き、1ulの熱不活化CloneSmartライゲーションをその管に加える。全反応物を、ピペットチップを用いて短時間撹拌する。その連結反応物(ligation)および細胞は、30分間、氷上でインキュベートし、次いで、その細胞は、42℃で45秒間、熱ショックを与え、次いで、2分間、氷上に戻す。960ulの室温の回収培地(Lucigen Corp、Middleton、WI、USA)を微量遠心管の中に置く。37℃で1時間250rpmで管を振盪させる。使用するpSMARTベクターに依存して適切な抗生物質を加えたLuria Brothプレート(RPI Corp、Mt.Prospect、IL、USA)に100ulの形質転換細胞をまく。37℃で一晩、プレートをインキュベートする。
ゲル抽出したDNAは、製造者の指示に従って、PCRTerminator(Lucigen Corp、Middleton、WI、USA)を使用して平滑化する。次いで、2ulのDNAを、3ul StrataClone Blunt Cloningバッファーおよび1ul StrataClone Bluntベクターミックスamp/kan(Stratagene、La Jolla、CA、USA)に加え、合計6ulにする。その反応物は、上下に穏やかにピペッティングすることによって混合し、30分間、室温でその反応物をインキュベートし、次いで氷上に置く。20分間、氷上でStrataCloneのケミカルコンピテント細胞(Stratagene、La Jolla、CA、USA)からなる試験管を解凍する。ケミカルコンピテント細胞の上記試験管に1ulのクローニング反応物を加え、ピペットチップを用いて穏やかに混合し、20分間、氷上でインキュベートする。45秒間、42℃でその形質転換物に熱ショックを与え、次いで、2分間、氷上に置く。250ulの予熱したLuria Broth(RPI Corp、Mt.Prospect、IL、USA)を加え、2時間、37℃で250rpmで振盪する。適切な抗生物質を加えたLuria Brothプレート(RPI
Corp、Mt.Prospect、IL、USA)に100ulの形質転換混合物をまく。37℃で一晩、プレートをインキュベートする。
1ul TOPOベクター、1ul塩溶液(Invitrogen Corp、Carlsbad、CA、USA)、および3ulゲル抽出DNAを微量遠心管に加える。30分間、室温でその管をインキュベートし、次いで、氷上にその反応物を置く。反応あたり、TOP10F’ケミカルコンピテント細胞(Invitrogen Corp、Carlsbad、CA、USA)の1本の試験管を解凍する。その解凍したTOP10F’細胞に1ulの反応混合物を加え、ピペットチップを用いて細胞を穏やかにかき混ぜることによって混合し、20分間、氷上でインキュベートする。45秒間、42℃でその形質転換物に熱ショックを与え、次いで、2分間、氷上に置く。250ulの予熱したSOC培地(Invitrogen Corp、Carlsbad、CA、USA)を加え、1時間、37℃で250rpmで振盪する。適切な抗生物質を加えたLuria Brothプレート(RPI Corp、Mt.Prospect、IL、USA)に100ulのその形質転換混合物をまく。37℃で一晩、プレートをインキュベートする。
ケミカルコンピテント形質転換プロトコールは、製造者の指示またはMolecular Cloning(SambrookおよびRussell、2001年)に含有される文献に従って実行する。一般に、プラスミドDNAまたはライゲーション産物は、ケミカルコンピテント細胞を有する溶液中で5〜30分間氷上で冷却する。ケミカルコンピテント細胞は、バイオテクノロジーの分野において広く使用される産物であり、本サブセクションにおいて示されるものなどの複数のベンダーから入手可能である。冷却期間後、細胞には、一般に、振盪させずに42℃で30秒間熱ショックを与え、再度冷却し、S.O.C.などの250マイクロリットルのリッチ培地と組み合わせる。次いで、細胞は、1時間250rpmで振盪させながら、37℃でインキュベートする。最後に、その細胞は、適切な抗生物質を含有する培地でプレート培養することによって形質転換の成功についてスクリーニングする。
USA)からの市販のミニプレップキットを使用して調製した。
3−HP原液は以下のように調製した。β−プロピオラクトン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO、USA)のバイアルを換気フード下で開き、ボトル内容物の全てを、25mLガラスピペットを続いて使用して、新しい容器に移した。そのバイアルは、50mLのHPLCグレード水を用いてすすぎ、このすすぎ液を新しい容器に注いだ。さらに2回すすぎ、それをその新しい容器に加えた。5mL β−プロピオラクトン当たり50mL水の比に達するように、さらなるHPLCグレード水を、その新しい容器に加えた。その新しい容器は、しっかりとキャップし、72時間、室温で換気フード中に置いた。72時間後、その内容物は、遠心分離管に移し、4,000rpmで10分間、遠心分離した。次いで、その溶液は、微粒子を除去するために濾過し、必要に応じて、室温でロータリーエバポレーターの使用によって濃縮した。濃度についてのアッセイを行い、必要に応じて、標準的な濃度原液を作製するために希釈した。
3−HPのHPLC分析について、Watersクロマトグラフィーシステム(Milford、MA)は、以下からなった:600S制御装置、616ポンプ、717プラスオートサンプラー、486調整可能UV検出器、および整列移動相脱気装置。さらに、Eppendorf外部カラムヒーターを使用し、データは、標準的なデスクトップコンピューターに連結したSRI(Torrance、CA)のアナログ−デジタル変換器を使用して、収集した。データは、SRI Peak Simpleソフトウェアを使用して分析する。Coregel 64Hイオン排除カラム(Transgenomic,Inc.、San Jose、CA)を使用する。そのカラム樹脂は、スルホン化ポリスチレンジビニルベンゼンであり、粒子サイズは10μmであり、カラム寸法は300×7.8mmである。その移動相は、0.02Nの濃度まで脱イオン(18MΩcm)水を用いて希釈し、0.2μmナイロンフィルターで真空濾過した硫酸(Fisher Scientific、Pittsburgh、PA USA)からなった。上記移動相の流速は、0.6mL/分とする。UV検出器は、210nmの波長で作動させ、そのカラムは、60℃まで加熱する。本明細書において記載されるものと同じ設備および方法は、関連する予測の実施例についての3−HP分析について使用される。3−HP標準物質(TCI America、Portland、OR)と共にこのHPLC方法を使用する代表的な検量線を図13に提供する。
MIC評価については、その最終結果は、HPLCによる原液の分析によって決定された化学薬剤濃度において表現される(つまり、サブセクションIIIbを参照されたい)。
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(標準的なM9培地に相当する):47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、および0.4%グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を5mLのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で三連で増殖させた。1%(v/v)接種材料を、M9最少培地の5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約0.200(つまり0.195〜0.205)のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:50にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、37℃で24時間インキュベートした。上記最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて嫌気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(標準的なM9培地に相当する):47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、および0.4%グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を5mLのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で三連で増殖させた。1%(v/v)接種材料を、M9最少培地の5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約0.200(つまり0.195〜0.205)のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:50にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、嫌気条件用のガス発生器を含有するバイオバッグ嫌気チャンバー内に密閉し、37℃で24時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(標準的なM9培地+補充グルタメートに相当する):47.7mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、8.6mM NaCl、18.7mM NH4Cl、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2、10mMグルタメート、および0.4%グルコース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を5mLのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で三連で増殖させた。1%(v/v)接種材料を、M9最少培地+グルタメートの5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約0.200(つまり0.195〜0.205)のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:50にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、37℃で24時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
最小発育阻止濃度(MIC)は、96ウェルプレートフォーマットにおいて好気的に決定した。プレートは、それぞれの個々のウェルが、接種後に100uLの最終容量にした場合に、以下の成分レベルを有するようにセットアップした(FGN培地に相当する):21.5mM K2HPO4、8.5mM KH2PO4、18mM NH4Cl、12mM NaCl、7.3uM ZnCl、0.15uM MnCl2、4.85uM H3BO3、0.21uM CoCl2、0.41uM CuCl2、0.50uM NiCl2、0.12uM Na2MoO4、0.19uM CrCl3、0.06mM CaCl2、0.5mM MgSO4、0.06mM FeSO4、0.2%グリセロール、0.2%フルクトース。培地の補充物質は、指定される場合、補充物質の表において報告されるレベルに従って加えた。株の一晩培養物を5mLのLB(適切な場合、抗生物質を有する)中で三連で増殖させた。1%(v/v)接種材料を、FGN培地の5ml培養物に導入した。細胞が中間指数期に達した後、その培養物は、約0.200(つまり0.195〜0.205)のOD600まで希釈した。上記細胞は、1:50にさらに希釈し、10μLの一定分量を、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに接種するために使用し(1ウェル当たり約104細胞)、100uLの総容量にした。そのプレートを配置し、多様な株の増殖、または5g/Lの増分で0〜60g/Lに3−HP濃度を増加させた場合の多様な増殖条件における増殖を測定した。プレートは、30℃で24時間インキュベートした。最小発育阻止3−HP濃度および目に見える細胞増殖(OD約0.1)に対応する最大の3−HP濃度を、24時間後に記録した。MIC>60g/Lである場合については、評価は、広範囲の3−HP濃度(5g/Lの増分で0〜100g/L)を有するプレートにおいて実行した。
Claims (13)
- 化学生成物の微生物生成経路において基質としてマロニル−CoAを有する化学生成物を生成するための方法であって、該方法は
i)炭素源と微生物細胞培養物とを組み合わせて該化学生成物を生成する工程を含み、
a)該微生物が、単機能性マロニル−CoA還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸配列の導入により、該微生物のマロニル−CoA還元酵素(mcr)経路における酵素活性の増加のために、かつ、β−ケトアシル−ACPシンターゼ(fabH、fabF、fabB)、β−ケトアシル−ACP還元酵素(fabG)、β−ヒドロキシアシル−ACPデヒドラターゼ(fabA)またはエノイル−ACP還元酵素(fabI)から選択される脂肪酸合成経路における酵素における酵素活性の低減のために遺伝子改変されており;そして
b1)該微生物が、udhAまたはpntABの過剰発現のために遺伝子改変されているか、あるいは
b2)該微生物が、accA、accB、accCもしくはaccDまたはそれらの任意の組み合わせの過剰発現のために遺伝子改変されているか、のいずれかである、
方法。 - 前記炭素源が、1.0×10−14以上の炭素12に対する炭素14の比を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記炭素源が、グルコース、スクロース、フラクトース、デキストロース、ラクトースまたはそれらの組み合わせである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 酵素活性の前記低減が、前記脂肪酸合成経路における酵素をコードする配列に作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む異種核酸の導入により、または低減した活性を有する該脂肪酸合成経路における酵素をコードする異種核酸の導入により生じる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記脂肪酸合成経路における酵素が、温度感受性β−ケトアシル−ACPシンターゼまたは温度感受性エノイル−ACP還元酵素活性を有するポリペプチドである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- NADPH依存性トランスヒドロゲナーゼ経路における酵素活性の増加が、配列番号780または782から選択される配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ、NADPH依存性トランスヒドロゲナーゼまたはピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸の導入により生じる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記微生物が、シアナーゼ活性および/またはカルボニックアンヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸の導入により、細胞内重炭酸塩レベルの増加のためにさらに遺伝子改変されている、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記異種核酸が、配列番号337と少なくとも90%の同一性を有する配列である、請求項7に記載の方法。
- 前記微生物のアセチル−CoAカルボキシラーゼ経路における酵素活性の増加が、配列番号772、774、776および778から選択される配列と少なくとも90%の同一性を有し、かつ、アセチル−CoAカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種核酸の導入により生じる、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記微生物が、乳酸脱水素酵素、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ピルビン酸酸化酵素、ピルビン酸−ギ酸リアーゼまたはそれらの組み合わせの活性を減少させるようにさらに遺伝子改変されている、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記微生物細胞培養物が、重炭酸塩または炭酸塩の補充による増加した細胞内重炭酸塩レベルを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記化学生成物が3−HPのエチルもしくはメチルエステルまたは3−HP−由来生成物のエチルもしくはメチルエステルを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記化学生成物が3−ヒドロキシプロピオン酸のメチルエステルまたは3−ヒドロキシプロピオン酸のエチルエステルを含む、請求項12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24614109P | 2009-09-27 | 2009-09-27 | |
US61/246,141 | 2009-09-27 | ||
US29884410P | 2010-01-27 | 2010-01-27 | |
US61/298,844 | 2010-01-27 | ||
US32148010P | 2010-04-06 | 2010-04-06 | |
US61/321,480 | 2010-04-06 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531103A Division JP2013505727A (ja) | 2009-09-27 | 2010-09-27 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016036346A JP2016036346A (ja) | 2016-03-22 |
JP6271494B2 true JP6271494B2 (ja) | 2018-01-31 |
Family
ID=43127955
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531103A Ceased JP2013505727A (ja) | 2009-09-27 | 2010-09-27 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
JP2013056264A Withdrawn JP2013128494A (ja) | 2009-09-27 | 2013-03-19 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
JP2015241185A Active JP6271494B2 (ja) | 2009-09-27 | 2015-12-10 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
JP2015241186A Pending JP2016039825A (ja) | 2009-09-27 | 2015-12-10 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012531103A Ceased JP2013505727A (ja) | 2009-09-27 | 2010-09-27 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
JP2013056264A Withdrawn JP2013128494A (ja) | 2009-09-27 | 2013-03-19 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015241186A Pending JP2016039825A (ja) | 2009-09-27 | 2015-12-10 | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US8883464B2 (ja) |
EP (1) | EP2480673B1 (ja) |
JP (4) | JP2013505727A (ja) |
KR (1) | KR20140015136A (ja) |
CN (1) | CN102695799A (ja) |
AU (1) | AU2010298004B2 (ja) |
BR (1) | BR112012006801A2 (ja) |
CA (1) | CA2775390C (ja) |
GB (2) | GB2487866A (ja) |
MX (1) | MX2012003604A (ja) |
WO (1) | WO2011038364A1 (ja) |
Families Citing this family (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
WO2011038364A1 (en) * | 2009-09-27 | 2011-03-31 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
US8772539B2 (en) * | 2009-10-29 | 2014-07-08 | Kabushiki Kaisha Sangi | Method for synthesizing unsaturated carboxylic acid and/or derivative of same |
WO2011063363A2 (en) * | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
WO2011100601A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-08-18 | Metabolix, Inc. | Process for gamma-butyrolactone production |
BR112013012630B1 (pt) | 2010-11-22 | 2021-09-08 | Novozymes, Inc. | Célula de levedura geneticamente modificada, e, método para produzir 3-hp |
EP2689020B1 (en) * | 2011-03-22 | 2018-05-16 | OPX Biotechnologies Inc. | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems |
BR112014005352A2 (pt) * | 2011-09-08 | 2017-03-28 | Genomatica Inc | organismos eucarióticos e métodos para aumentar a disponibilidade de acetil-coa citosólico e para produzir 1,3-butanodiol |
CA2849303C (en) * | 2011-09-30 | 2019-09-17 | Novozymes, Inc. | Dehydrogenase variants and polynucleotides encoding same |
DE102012004497A1 (de) * | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Gea Mechanical Equipment Gmbh | Verfahren und Anlage zur Aufarbeitung von Rohgülle und/oder Gärresten aus der Biogaserzeugung |
JPWO2013137277A1 (ja) * | 2012-03-14 | 2015-08-03 | 株式会社日本触媒 | 3−ヒドロキシプロピオン酸の製造方法、遺伝子組換え微生物、並びに前記方法を利用したアクリル酸、吸水性樹脂、アクリル酸エステル、およびアクリル酸エステル樹脂の製造方法 |
CA2869020A1 (en) * | 2012-04-09 | 2013-10-17 | BP Biofuels UK Limited | Low polysaccharide microorganisms for production of biofuels and other renewable materials |
DE102012207921A1 (de) | 2012-05-11 | 2013-11-14 | Evonik Industries Ag | Mehrstufiges Syntheseverfahren mit Synthesegas |
CN104350034B (zh) | 2012-06-08 | 2018-07-31 | Cj 第一制糖株式会社 | 可再生丙烯酸生产和自其制备的产物 |
US20130345470A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Purification of 3-Hydroxypropionic Acid from Crude Cell Broth and Production of Acrylamide |
WO2013192451A1 (en) * | 2012-06-20 | 2013-12-27 | Opx Biotechnologies, Inc. | Dehydration of 3-hydroxypropionic acid to acrylic acid |
CA2881666A1 (en) * | 2012-08-10 | 2014-02-13 | Opx Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
JP2015536669A (ja) | 2012-11-30 | 2015-12-24 | ノボザイムス,インコーポレイティド | 組換え酵母による3−ヒドロキシプロピオン酸の生産 |
CN110387352A (zh) * | 2013-01-16 | 2019-10-29 | Reg生命科学有限责任公司 | 具有改善特性的酰基-acp还原酶 |
WO2014145332A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Monfunctional mcr + 3-hp dehydrogenase |
BR112015023474B1 (pt) | 2013-03-15 | 2020-10-06 | Cargill, Incorporated | Método para recuperar uma composição enriquecida em ácido 3-hidroxipropiônico |
US9447438B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-09-20 | Cargill, Incorporated | Acetyl-coA carboxylases |
US9499465B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-11-22 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Synthesis of biobased and substituted terephthalic acids and isophthalic acids |
WO2014145096A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Cindy Hoppe | Flash evaporation for production purification and recovery |
US20150044746A1 (en) * | 2013-03-15 | 2015-02-12 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method of enhanced bioproduction |
EP3008179A1 (en) * | 2013-06-14 | 2016-04-20 | Technical University of Denmark | 3hp tolerance |
EP3013966A2 (en) * | 2013-06-28 | 2016-05-04 | Metabolix, Inc. | Genetically engineered methylotrophs for the production of pha biopolymers and c3, c4, and c5 biochemicals from methanol or methane as sole carbon feedstock |
US11408013B2 (en) | 2013-07-19 | 2022-08-09 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
US10337038B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-07-02 | Cargill, Incorporated | Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products |
BR112016002494A2 (pt) * | 2013-08-05 | 2017-09-05 | Greenlight Biosciences Inc | Proteí-nas construídas com um sítio de clivagem de protease, ácido nucléico, vetor, célula e processo de engenharia de uma proteína recombinante e de um grande número de variantes de ácidos nucleicos que codificam proteínas recombinantes |
KR20150018227A (ko) * | 2013-08-09 | 2015-02-23 | 삼성전자주식회사 | 외인성 푸마라아제 유전자를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 c4 디카르복실산의 생산 방법 |
EP3057931B1 (en) | 2013-10-17 | 2019-03-06 | Dow Global Technologies LLC | Ammonium bisulfate catalyzed dehydration of beta-hydroxy acids |
CN103805641B (zh) * | 2014-01-24 | 2016-05-11 | 武汉大学 | 一种在微生物体内固定二氧化碳生产3-羟基丙酸、丙烯酸和丙酸的方法 |
JP6730199B2 (ja) | 2014-06-11 | 2020-07-29 | デューク ユニバーシティ | 合成代謝弁を用いた迅速かつ動的なフラックス制御のための組成物及び方法 |
JP6786477B2 (ja) | 2014-08-29 | 2020-11-18 | エスケー イノベーション カンパニー リミテッドSk Innovation Co.,Ltd. | 3−hpを生産することができる組換え酵母およびこれを利用した3−hpの製造方法 |
EP2993228B1 (en) | 2014-09-02 | 2019-10-09 | Cargill, Incorporated | Production of fatty acid esters |
WO2016036872A1 (en) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Ciris Energy, Inc. | Production of 3-hydroxypropionic acid from carbonaceous material |
CN107108439B (zh) * | 2014-12-02 | 2019-12-24 | 阿彻丹尼尔斯米德兰德公司 | 由右旋糖制备丙烯酸的方法 |
CN104946576B (zh) * | 2015-04-27 | 2018-03-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和在生产丙酮酸中的应用 |
US10568960B2 (en) * | 2015-05-22 | 2020-02-25 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas | Molecular adjuvant and vaccine |
KR20180043242A (ko) * | 2015-06-04 | 2018-04-27 | 바이오엠버 인코퍼레이티드 | 작용화된 알파-치환된 아크릴레이트 및 c4-다이카복실산의 생체-기반 생성 |
CN108291231B (zh) | 2015-06-11 | 2022-04-08 | 纳路Ic有限公司 | 由3-羟基丙酸诱导表达的启动子系统及用其生物生产3-羟基丙酸的方法 |
WO2016200239A1 (ko) * | 2015-06-11 | 2016-12-15 | 부산대학교 산학협력단 | 3-하이드록시프로피온산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 시스템 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생물학적 생산방법 |
DE102016212497B4 (de) * | 2015-07-13 | 2024-04-25 | Sk Innovation Co., Ltd. | Mutanter Mikroorganismus, der ein Gen umfasst, das Methylmalonyl-CoA-Reductase codiert, und seine Verwendung |
US9988624B2 (en) | 2015-12-07 | 2018-06-05 | Zymergen Inc. | Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform |
US11208649B2 (en) | 2015-12-07 | 2021-12-28 | Zymergen Inc. | HTP genomic engineering platform |
KR20180084756A (ko) | 2015-12-07 | 2018-07-25 | 지머젠 인코포레이티드 | 코리네박테리움 글루타미컴으로부터의 프로모터 |
KR102547252B1 (ko) * | 2016-01-08 | 2023-06-23 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기물질 기상탈수반응 원료의 제조방법 |
KR101828551B1 (ko) * | 2016-01-11 | 2018-02-13 | 한국과학기술원 | 말론산 생성능을 가지는 재조합 변이미생물 및 이를 이용한 말론산의 제조방법 |
US11103547B2 (en) * | 2016-02-04 | 2021-08-31 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Methods for disrupting biofilms |
BR112018016979B8 (pt) | 2016-02-19 | 2023-01-10 | Alliance Sustainable Energy | Sistemas e métodos para produção de nitrilas |
JP2019524076A (ja) * | 2016-06-24 | 2019-09-05 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ヒドロキシチロソールを産生する細胞及び方法 |
EP3478845A4 (en) | 2016-06-30 | 2019-07-31 | Zymergen, Inc. | METHODS OF PRODUCING A GLUCOSE PERMEASE BANK AND USES THEREOF |
JP2019519242A (ja) | 2016-06-30 | 2019-07-11 | ザイマージェン インコーポレイテッド | 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用 |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
CN110312803B (zh) * | 2016-12-21 | 2024-04-30 | 许景焜 | 编辑核酸序列的组合物及方法 |
EP3577227A4 (en) | 2017-02-02 | 2020-12-30 | Cargill Inc. | GENETICALLY MODIFIED CELLS PRODUCING C6-C10 FATTY ACID DERIVATIVES |
CN108728469B (zh) * | 2017-04-14 | 2022-03-01 | 中国科学院微生物研究所 | 重组大肠杆菌工程菌的构建及其在生产β-丙氨酸中的应用 |
CN108728471B (zh) * | 2017-04-14 | 2020-01-31 | 中国科学院微生物研究所 | 产3-羟基丙酸的重组菌及其制备方法与应用 |
KR102418589B1 (ko) * | 2018-01-10 | 2022-07-06 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산 회수 방법 |
US20190233853A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-01 | Invista North America S.A.R.L. | Methods and materials for the biosynthesis of beta hydroxy acids and/or derivatives thereof and/or compounds related thereto |
WO2019152754A1 (en) * | 2018-02-01 | 2019-08-08 | Invista North America S.A.R.L. | Methods and materials for the biosynthesis of beta hydroxy acids and derivatives and compounds related thereto |
KR102419608B1 (ko) * | 2018-02-08 | 2022-07-08 | 주식회사 엘지화학 | 고농도 3-하이드록시프로피온산 수용액의 제조 방법 |
KR102519456B1 (ko) * | 2018-03-15 | 2023-04-06 | 주식회사 엘지화학 | 미생물을 이용한 폴리(3-하이드록시프로피오네이트-b-락테이트) 블록공중합체 |
KR102140596B1 (ko) | 2018-04-17 | 2020-08-04 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 유기산 내성 효모 유래 신규 프로모터 및 이를 이용한 목적유전자의 발현방법 |
RU2687135C1 (ru) * | 2018-10-02 | 2019-05-07 | Общество с ограниченной ответственностью "ГИПРОБИОСИНТЕЗ" | Штамм гетеротрофных бактерий Cupriavidus gilardii - ассоциант для получения микробной белковой массы |
JP2022515078A (ja) * | 2018-12-18 | 2022-02-17 | ブラスケム エス.エー. | マロン酸セミアルデヒドからの3-HPおよびアセチル-CoA誘導体の共産生経路 |
US20220049279A1 (en) * | 2018-12-18 | 2022-02-17 | Alderys | Malonic semi-aldehyde-producing yeasts |
CN109593697B (zh) * | 2018-12-18 | 2022-07-12 | 江苏师范大学 | 一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌及其构建方法 |
US10920189B2 (en) * | 2019-06-21 | 2021-02-16 | Inscripta, Inc. | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli |
KR20210041903A (ko) | 2019-10-08 | 2021-04-16 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 락테이트 대사 및 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법 |
KR20210158676A (ko) | 2020-06-24 | 2021-12-31 | 에스케이이노베이션 주식회사 | 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모 |
CN113278537A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-08-20 | 天津科技大学 | 系列低产高级醇酿酒酵母及其构建方法与应用 |
WO2023096439A1 (ko) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 및 3-하이드록시프로피온산 포함 슬러리 조성물 |
WO2023096456A1 (ko) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산염의 결정, 이의 제조 방법 및 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 |
EP4328215A1 (en) * | 2021-11-29 | 2024-02-28 | Lg Chem, Ltd. | Method for collecting alkali metal salt hydrate and 3-hydroxypropionic acid |
WO2023096366A1 (ko) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | 주식회사 엘지화학 | 3-하이드록시프로피온산의 회수 공정 및 3-하이드록시프로피온산 포함 슬러리 조성물 |
CN115216194B (zh) * | 2022-08-24 | 2022-12-27 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种包埋花椒粉碎物自抛光防污涂料及其制备方法和应用 |
CN116732081B (zh) * | 2023-08-07 | 2023-12-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种提高枯草芽孢杆菌合成七烯甲萘醌的方法、获得重组菌株及其应用 |
Family Cites Families (170)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2408889A (en) | 1946-10-08 | Production of organic compounds | ||
US2464768A (en) | 1946-02-13 | 1949-03-15 | American Cyanamid Co | Preparation of esters of acrylic acid |
US2469701A (en) | 1946-02-13 | 1949-05-10 | American Cyanamid Co | Preparation of acrylic acid |
US2798053A (en) | 1952-09-03 | 1957-07-02 | Goodrich Co B F | Carboxylic polymers |
US3904685A (en) | 1973-07-20 | 1975-09-09 | Celanese Corp | Polyacrylic acid having high chelation value and its production |
US3915921A (en) | 1974-07-02 | 1975-10-28 | Goodrich Co B F | Unsaturated carboxylic acid-long chain alkyl ester copolymers and tri-polymers water thickening agents and emulsifiers |
US4029577A (en) | 1975-11-17 | 1977-06-14 | Betz Laboratories, Inc. | Polymers for use in water treatment |
DE2757329C2 (de) | 1977-12-22 | 1980-02-07 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Verfahren zur Herstellung von Polymerisaten der Acrylsäure oder Methacrylsäure |
US4268641A (en) | 1979-04-24 | 1981-05-19 | Union Carbide Corporation | Acrylic acid-acrylate copolymer thickening agents |
US4431547A (en) | 1981-08-24 | 1984-02-14 | Nalco Chemical Company | Use of acrylamide/acrylic acid copolymers for prevention of fouling by Ca3 (PO4)2 |
US4985518A (en) | 1981-10-26 | 1991-01-15 | American Colloid Company | Process for preparing water-absorbing resins |
JPS58180233A (ja) | 1982-04-19 | 1983-10-21 | Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co Ltd | 吸収剤 |
US4685915A (en) | 1984-04-06 | 1987-08-11 | The Procter & Gamble Company | Disposable diaper having density and basis weight profiled absorbent core |
US4734478A (en) | 1984-07-02 | 1988-03-29 | Nippon Shokubai Kagaku Kogyo Co., Ltd. | Water absorbing agent |
US4708997A (en) | 1985-07-22 | 1987-11-24 | The Dow Chemical Company | Suspending agent for the suspension polymerization of water-soluble monomers |
DE3544770A1 (de) | 1985-12-18 | 1987-06-19 | Stockhausen Chem Fab Gmbh | Verfahren und vorrichtung zum kontinuierlichen herstellen von polymerisaten und copolymerisaten der acrylsaeure und/oder methacrylsaeure |
US5009653A (en) | 1988-03-31 | 1991-04-23 | The Procter & Gamble Company | Thin, flexible sanitary napkin |
US5135677A (en) | 1988-04-11 | 1992-08-04 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Process for producing acid-type maleic acid polymer and water-treating agent and detergent additive containing said polymer |
US4952505A (en) | 1988-08-08 | 1990-08-28 | Florida State University | Fermentation of trichoderma reesei and apparatus therefor |
IT1229506B (it) | 1989-01-26 | 1991-09-03 | Sigma Prodotti Chimici Srl | Polimero dell'acido acrilico esente da solventi residui e procedimento per la sua preparazione. |
US5252474A (en) | 1989-03-31 | 1993-10-12 | Merck & Co., Inc. | Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use |
US5145906A (en) | 1989-09-28 | 1992-09-08 | Hoechst Celanese Corporation | Super-absorbent polymer having improved absorbency properties |
JP2938920B2 (ja) | 1990-01-31 | 1999-08-25 | 住友精化株式会社 | 吸水性樹脂の製造方法 |
US5350799A (en) | 1990-05-31 | 1994-09-27 | Hoechst Celanese Corporation | Process for the conversion of fine superabsorbent polymer particles into larger particles |
US5342899A (en) | 1991-05-16 | 1994-08-30 | The Dow Chemical Company | Process for recycling aqueous fluid absorbents fines to a polymerizer |
DE4138408A1 (de) | 1991-11-22 | 1993-05-27 | Cassella Ag | Hydrophile, hochquellfaehige hydrogele |
CA2083346A1 (en) | 1991-12-13 | 1993-06-14 | Eric G. Lundquist | A catalyzed esterification process |
US5142023A (en) | 1992-01-24 | 1992-08-25 | Cargill, Incorporated | Continuous process for manufacture of lactide polymers with controlled optical purity |
US5827255A (en) | 1992-07-27 | 1998-10-27 | The Procter & Gamble Company | Sanitary napkin comprising an absorbent core having a density gradient |
US5405913A (en) | 1993-03-22 | 1995-04-11 | The University Of Akron | Free radical copper(II)-enolate polymerization initiators |
US5510307A (en) | 1993-04-08 | 1996-04-23 | Isp Investments Inc. | Free radical initiator delivery system |
US5510526A (en) | 1993-06-29 | 1996-04-23 | Cargill, Incorporated | Lactic acid production, separation and/or recovery process |
US5876983A (en) | 1993-08-24 | 1999-03-02 | Ajinomoto Co., Inc. | Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid |
US5487987A (en) | 1993-09-16 | 1996-01-30 | Purdue Research Foundation | Synthesis of adipic acid from biomass-derived carbon sources |
US5558656A (en) | 1993-12-20 | 1996-09-24 | The Procter & Gamble Company | Sanitary napkin having an internal shaping component |
US5723639A (en) | 1995-10-16 | 1998-03-03 | University Of Chicago | Esterification of fermentation-derived acids via pervaporation |
DE19629372A1 (de) | 1996-07-20 | 1998-01-22 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Malonsäure oder einem Salz derselben |
WO1998021339A1 (en) | 1996-11-13 | 1998-05-22 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms |
SK285201B6 (sk) | 1996-12-05 | 2006-08-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7 |
US6087140A (en) * | 1997-02-19 | 2000-07-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microbial production of 1,2-propanediol from sugar |
US7125938B2 (en) | 1997-03-11 | 2006-10-24 | Carnegie Mellon University | Atom or group transfer radical polymerization |
US6566583B1 (en) | 1997-06-04 | 2003-05-20 | Daniel Facciotti | Schizochytrium PKS genes |
BE1011197A3 (fr) | 1997-06-06 | 1999-06-01 | Brussels Biotech En Abrege Bb | Procede de purification d'acide lactique. |
US6229046B1 (en) | 1997-10-14 | 2001-05-08 | Cargill, Incorported | Lactic acid processing methods arrangements and products |
KR100250830B1 (ko) | 1997-12-09 | 2000-04-01 | 성재갑 | 자가분해에 의해 폴리하이드록시알킨산으로부터 광학활성을 가진 단량체 하이드록시카르복실산의 제조방법 |
JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 2012-04-11 | 味の素株式会社 | 核酸系物質の製造法 |
DE69938105T2 (de) | 1998-08-04 | 2009-01-29 | Metabolix, Inc., Cambridge | Herstellung von polyhydroxyalkanoaten aus polyolen |
WO2000026178A1 (en) | 1998-10-30 | 2000-05-11 | Catalytic Distillation Technologies | Production of amides and/or acids from nitriles |
US6297319B1 (en) | 1998-11-05 | 2001-10-02 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Water-absorbing agent and production process therefor |
US6410301B1 (en) | 1998-11-20 | 2002-06-25 | Kosan Biosciences, Inc. | Myxococcus host cells for the production of epothilones |
DK1163200T3 (da) | 1999-03-22 | 2004-11-01 | Purac Biochem Bv | Method of industrial-scale purification of lactic acid |
CA2366222A1 (en) | 1999-03-23 | 2000-09-28 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Synthesis of 1,2,3,4-tetrahydroxybenzenes and 1,2,3-trihydroxybenzenes using myo-inositol-1-phosphate synthase and myo-inositol 2-dehydrogenase |
BR0008355A (pt) | 1999-08-30 | 2002-07-16 | Wisconsin Alumni Res Found | Produção de ácido 3-hidroxipropionico em organismos recombinantes |
US6852517B1 (en) | 1999-08-30 | 2005-02-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Production of 3-hydroxypropionic acid in recombinant organisms |
AU1231701A (en) | 1999-10-25 | 2001-05-08 | Kosan Biosciences, Inc. | Production of polyketides |
US6531291B1 (en) | 1999-11-10 | 2003-03-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Antimicrobial activity of gemfibrozil and related compounds and derivatives and metabolites thereof |
WO2001038284A1 (en) | 1999-11-24 | 2001-05-31 | Cargill Dow Llc | Improved lactic acid processing; methods; arrangements; and, products |
NL1013682C2 (nl) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Purac Biochem Bv | Werkwijze en inrichting voor het zuiveren van een waterige oplossing van melkzuur. |
US6613553B1 (en) | 2000-02-04 | 2003-09-02 | St. Jude Children's Research Hospital | Enoyl reductases and methods of use thereof |
RU2212447C2 (ru) | 2000-04-26 | 2003-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Штамм escherichia coli - продуцент аминокислоты (варианты) и способ получения аминокислот (варианты) |
AU7599601A (en) | 2000-07-21 | 2002-02-05 | Metabolix Inc | Production of polyhydroxyalkanoates from polyols |
CA2322105A1 (en) | 2000-10-23 | 2002-04-23 | Plant Bioscience Limited | Antibiotic production (ii) |
CN1556855A (zh) | 2000-11-20 | 2004-12-22 | 卡吉尔公司 | 3-羟基丙酸及其它有机化合物 |
US6623944B2 (en) | 2001-03-14 | 2003-09-23 | Degussa Ag | Process for preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof |
MXPA03010183A (es) | 2001-05-07 | 2004-03-16 | Cargill Inc | Proceso para preparar acidos carboxilicos y derivados de los mismos. |
US6723799B2 (en) | 2001-08-24 | 2004-04-20 | E I. Du Pont De Nemours And Company | Acid-dyeable polymer compositions |
MXPA04004194A (es) | 2001-11-02 | 2005-03-31 | Rice University | Sistema de recirculacion para la manipulacion de disponibilidad de nadh intracelular. |
US6844447B2 (en) | 2001-12-18 | 2005-01-18 | Metabolix Inc. | Methods of making intermediates from polyhydroxyalkanoates |
BR0307010A (pt) | 2002-01-18 | 2006-04-11 | Cargill Inc | alanina 2,3-aminomutase |
US6709919B2 (en) | 2002-05-15 | 2004-03-23 | Taiwan Semiconductor Manufacturing Company | Method for making auto-self-aligned top electrodes for DRAM capacitors with improved capacitor-to-bit-line-contact overlay margin |
US7314974B2 (en) | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
CN100577628C (zh) | 2002-03-25 | 2010-01-06 | 嘉吉有限公司 | 制造β-羟基羧酸衍生物的方法 |
US8039237B2 (en) | 2002-05-10 | 2011-10-18 | Metabolix, Inc. | Bioabsorbable polymer containing 2-hydroxyacid monomers |
US7826975B2 (en) | 2002-07-10 | 2010-11-02 | The Penn State Research Foundation | Method for redesign of microbial production systems |
US8027821B2 (en) | 2002-07-10 | 2011-09-27 | The Penn State Research Foundation | Method for determining gene knockouts |
AU2003205041A1 (en) | 2002-07-12 | 2004-01-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by fermentation |
GB0218019D0 (en) | 2002-08-05 | 2002-09-11 | Ciba Spec Chem Water Treat Ltd | Production of a fermentation product |
BRPI0314498B1 (pt) | 2002-10-04 | 2019-08-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Escherichia coli transgênica e método para a bioprodução de 1,3-propanodiol |
DK1556320T3 (en) | 2002-11-01 | 2015-06-08 | Novozymes As | PROCEDURE FOR PREPARING 1,3-PROPANDIOL |
WO2004044210A2 (en) | 2002-11-06 | 2004-05-27 | University Of Florida | Materials and methods for the efficient production of acetate and other products |
US20060270013A1 (en) | 2003-02-18 | 2006-11-30 | Michel Chateau | Method for the production of evolved microorganisms which permit the generation or modification of metabolic pathways |
US7141154B2 (en) | 2003-03-06 | 2006-11-28 | Uchicago Argonne Llc | Single-stage separation and esterification of cation salt carboxylates using electrodeionization |
DE10314618A1 (de) | 2003-04-01 | 2004-10-14 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
US20040225116A1 (en) | 2003-05-08 | 2004-11-11 | Payne Mark S. | Nucleic acid fragments encoding nitrile hydratase and amidase enzymes from comamonas testosteroni 5-MGAM-4D and recombinant organisms expressing those enzymes useful for the production of amides and acids |
US7090008B2 (en) | 2003-05-29 | 2006-08-15 | Sensor Highway Limited | System to connect conduit sections in a subterranean well |
DE602004022305D1 (de) | 2003-06-26 | 2009-09-10 | Novozymes As | Verfahren zur trennung und rückgewinnung von 3-hydroxypropionsäure und acrylsäure |
FR2862068B1 (fr) | 2003-11-06 | 2007-10-12 | Metabolic Explorer Sa | Souches de microorganismes optimisees pour des voies de biosyntheses consommatrices de nadph |
US7326557B2 (en) | 2003-11-14 | 2008-02-05 | Rice University | Increasing intracellular NADPH availability in E. coli |
DK1706457T3 (da) | 2003-12-04 | 2012-05-21 | Novozymes As | Fremstilling af 3-hydroxypropionsyre ved anvendelse af beta-alanin/pyruvataminotransferase |
US7186214B2 (en) | 2004-02-12 | 2007-03-06 | Medtronic, Inc. | Instruments and methods for accessing an anatomic space |
EP1731604A4 (en) | 2004-03-26 | 2007-04-04 | Nippon Catalytic Chem Ind | PROCESS FOR THE PREPARATION OF 1,3-PROPANEL AND / OR 3-HYDROXYPROPIONIC ACID |
WO2005095320A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-13 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Preparation of acrylic acid derivatives from alpha or beta-hydroxy carboxylic acids |
AU2005238534A1 (en) | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Biogen Idec Ma Inc. | Arylphenylamino-, arylphenylamide-, and arylphenylether-sulfide derivatives |
US20050272135A1 (en) | 2004-06-02 | 2005-12-08 | The University Of Chicago | Processs for production and purification of fermentation derived organic acids |
US7652167B2 (en) | 2004-07-19 | 2010-01-26 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Process for production of organic acid esters |
MX2007001195A (es) | 2004-07-30 | 2007-10-03 | Cargill Inc | Alanina 2,3-aminomutasas. |
US7148051B2 (en) | 2004-08-16 | 2006-12-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of 3-hydroxycarboxylic acid using nitrilase |
EP3130676A1 (en) | 2004-08-27 | 2017-02-15 | Rice University | Mutant e. coli strain with increased succinic acid production |
US7987056B2 (en) | 2004-09-20 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Mixed-library parallel gene mapping quantitative micro-array technique for genome-wide identification of trait conferring genes |
JP5762666B2 (ja) | 2004-10-12 | 2015-08-12 | ボード、オブ、トラスティーズ、オブ、ミシガン、ステイト、ユニバーシティBoard Of Trustees Of Michigan State University | フロログルシノールの生合成およびそれからの1,3−ジヒドロキシベンゼンの製造 |
TWI529181B (zh) | 2005-02-28 | 2016-04-11 | 贏創德固賽有限責任公司 | 以可更新原料為基之吸水聚合物結構及其生產的方法 |
US7524660B2 (en) | 2005-05-05 | 2009-04-28 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Utilization of fructose in microbial production strains |
US7772444B2 (en) | 2005-05-19 | 2010-08-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism |
KR20080036608A (ko) | 2005-07-18 | 2008-04-28 | 바스프 에스이 | 메티오닌 생산 재조합 미생물 |
AU2006287257A1 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for the growth-coupled production of succinate |
DE102005048818A1 (de) * | 2005-10-10 | 2007-04-12 | Degussa Ag | Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxypropionsäure |
WO2007047680A2 (en) | 2005-10-14 | 2007-04-26 | Cargill, Incorporated | Increasing the activity of radical s-adenosyl methionine (sam) enzymes |
US8535916B2 (en) | 2006-02-13 | 2013-09-17 | Ls9, Inc. | Modified microorganisms and uses therefor |
US20070219390A1 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Battelle Memorial Institute | Method and apparatus for conversion of beta-hydroxy carbonyl compounds |
CN101573451B (zh) | 2006-03-15 | 2014-04-30 | Dsmip资产公司 | 利用pufa聚酮化合物合成酶系统在异源的生物体中产生多不饱和脂肪酸的方法 |
JP2009529891A (ja) * | 2006-03-15 | 2009-08-27 | マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション | 多価不飽和脂肪酸を含む植物種子油 |
US7687661B2 (en) | 2006-03-15 | 2010-03-30 | Battelle Memorial Institute | Method for conversion of β-hydroxy carbonyl compounds |
KR20090029708A (ko) | 2006-05-19 | 2009-03-23 | 엘에스9, 인코포레이티드 | 지방산 및 이의 유도체의 제조 |
US8110670B2 (en) | 2006-05-19 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Enhanced production of fatty acid derivatives |
DE102006025821A1 (de) * | 2006-06-02 | 2007-12-06 | Degussa Gmbh | Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd |
DE102006039203B4 (de) * | 2006-08-22 | 2014-06-18 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von durch Kristallisation gereinigter Acrylsäure aus Hydroxypropionsäure sowie Vorrichtung dazu |
US8906667B2 (en) | 2006-08-29 | 2014-12-09 | William Marsh Rice University | Increasing NADPH-dependent products |
BRPI0716212A2 (pt) | 2006-08-30 | 2013-10-15 | Cargill Inc | Beta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase para produção de ácido 3-hidroxipropiônico |
BRPI0719792A2 (pt) | 2006-10-04 | 2015-04-07 | Cargill Inc | Ácidos carboxílicos preparados usando um processo de divisão da molécula de sal |
BRPI0806695A2 (pt) * | 2007-01-12 | 2014-06-03 | Univ Colorado | Composições e métodos para aumentar a tolerância à produção de produtos químicos produzidos por microorganismos |
WO2008091627A2 (en) | 2007-01-22 | 2008-07-31 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for growth-coupled production of 3-hydroxypropionic acid |
AU2008212826A1 (en) | 2007-02-09 | 2008-08-14 | Zeachem Inc. | Energy efficient methods to produce products |
US8110093B2 (en) | 2007-03-14 | 2012-02-07 | Ls9, Inc. | Process for producing low molecular weight hydrocarbons from renewable resources |
JPWO2008133131A1 (ja) | 2007-04-16 | 2010-07-22 | 味の素株式会社 | 有機酸の製造方法 |
EP2152659B1 (de) | 2007-06-01 | 2013-04-24 | Evonik Röhm GmbH | Ein verfahren zur herstellung von methacrylsäure oder methacrylsäureestern |
US8198055B2 (en) | 2007-06-08 | 2012-06-12 | Coskata, Inc. | Process for converting syngas to liquid products with microorganisms on two-layer membrane |
JP2010263790A (ja) | 2007-09-04 | 2010-11-25 | Ajinomoto Co Inc | アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法 |
KR20090026230A (ko) * | 2007-09-09 | 2009-03-12 | 김건 | 임베디드 시스템의 범용 고속 실시간 모니터링 장치 |
US20090191599A1 (en) | 2007-09-10 | 2009-07-30 | Joule Biotechnologies, Inc. | Engineered light-harvesting organisms |
JP2009067775A (ja) | 2007-09-17 | 2009-04-02 | Rohm & Haas Co | ヒドロキシカルボン酸、またはその塩を、不飽和カルボン酸および/またはそのエステルに変換する方法 |
WO2009042950A1 (en) | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Ls9, Inc. | Reduction of the toxic effect of impurities from raw materials by extractive fermentation |
EP2217695A2 (en) * | 2007-11-10 | 2010-08-18 | Joule Unlimited, Inc. | Hyperphotosynthetic organisms |
US8048624B1 (en) | 2007-12-04 | 2011-11-01 | Opx Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass |
US8518678B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-08-27 | Butamax(Tm) Advanced Biofuels Llc | Strain comprising increased expression of a CFA coding region for butanol production |
US8183028B2 (en) | 2007-12-21 | 2012-05-22 | Ls9, Inc. | Methods and compositions for producing olefins |
WO2009089457A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Novozymes A/S | Methods for producing 3-hydroxypropionic acid and compounds thereof |
EP2245137B1 (en) | 2008-01-22 | 2017-08-16 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for utilizing synthesis gas or other gaseous carbon sources and methanol |
CN102015995B (zh) | 2008-03-03 | 2014-10-22 | 焦耳无限科技公司 | 产生碳基目的产物的二氧化碳固定工程微生物 |
US8598378B2 (en) | 2008-03-14 | 2013-12-03 | University Of Hawaii | Methods and compositions for extraction and transesterification of biomass components |
EP2283121B1 (en) | 2008-05-16 | 2015-02-11 | REG Life Sciences, LLC | Methods and compositions for producing hydrocarbons |
US8153859B2 (en) | 2008-05-23 | 2012-04-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | DGAT genes from oleaginous organisms for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants |
WO2009149240A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Deletion mutants for the production of isobutanol |
WO2009151342A1 (en) | 2008-06-09 | 2009-12-17 | Lanzatech New Zealand Limited | Production of butanediol by anaerobic microbial fermentation |
DE102008002309A1 (de) | 2008-06-09 | 2009-12-10 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
US20100021978A1 (en) | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Genomatica, Inc. | Methods and organisms for production of 3-hydroxypropionic acid |
CA2731509A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Opx Biotechnologies, Inc. | Methods, systems and compositions for increased microorganism tolerance to and production of 3-hydroxypropionic acid (3-hp) |
US20160362710A9 (en) | 2008-08-18 | 2016-12-15 | REG Life Sciences, LLC | Systems and methods for production of mixed fatty esters |
WO2010031083A2 (en) | 2008-09-15 | 2010-03-18 | Opx Biotechnologies, Inc. | Methods, systems and compositions related to reduction of conversions of microbially produced 3-hydroxypropionic acid (3-hp) to aldehyde metabolites |
ES2692918T3 (es) | 2008-10-07 | 2018-12-05 | REG Life Sciences, LLC | Métodos y composiciones para producir aldehídos grasos |
AU2009324422A1 (en) | 2008-12-12 | 2011-07-07 | Celexion, Llc | Biological synthesis of difunctional alkanes from alpha ketoacids |
CN110129296A (zh) | 2008-12-23 | 2019-08-16 | Reg生命科学有限责任公司 | 硫酯酶相关的方法和组合物 |
BRPI1014952A2 (pt) | 2009-04-10 | 2019-09-24 | Ls9 Inc | "composição produzida por um microrganismo e composição de biocombustível." |
CA2759273C (en) | 2009-04-27 | 2018-01-09 | Ls9, Inc. | Production of fatty acid esters |
US20110144377A1 (en) | 2009-06-16 | 2011-06-16 | E. I. Du Pont Nemours And Company | Process for the biological production of 3-hydroxypropionic acid with high yield |
WO2011038364A1 (en) | 2009-09-27 | 2011-03-31 | Opx Biotechnologies, Inc. | Method for producing 3-hydroxypropionic acid and other products |
US8809027B1 (en) | 2009-09-27 | 2014-08-19 | Opx Biotechnologies, Inc. | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase |
EP2501820A4 (en) | 2009-11-20 | 2014-05-14 | Opx Biotechnologies Inc | METHODS, SYSTEMS AND COMPOSITION FOR THE MICROBIAL BIOHODULATION OF BIOMOLECULES USING SYNAMIC COMPONENTS OR SUGAR AS RAW MATERIALS |
WO2011063363A2 (en) | 2009-11-20 | 2011-05-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Production of an organic acid and/or related chemicals |
IN2012DN04907A (ja) | 2009-12-02 | 2015-09-25 | Univ Michigan State | |
US8530221B2 (en) | 2010-01-14 | 2013-09-10 | Ls9, Inc. | Production of branched chain fatty acids and derivatives thereof in recombinant microbial cells |
EP2529023A4 (en) | 2010-01-27 | 2015-06-10 | Opx Biotechnologies Inc | MICRO-ORGANISM MANUFACTURE FROM HIGH-FLOW CHEMICAL PRODUCTS AND CORRESPONDING COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS |
US8859259B2 (en) | 2010-02-14 | 2014-10-14 | Ls9, Inc. | Surfactant and cleaning compositions comprising microbially produced branched fatty alcohols |
CA2807561C (en) | 2010-08-06 | 2022-04-12 | Mascoma Corporation | Production of malonyl-coa derived products via anaerobic pathways |
US8372610B2 (en) | 2010-09-15 | 2013-02-12 | Ls9, Inc. | Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells |
AU2011317281A1 (en) | 2010-10-18 | 2013-06-06 | Zeachem, Inc. | Recovery of organic acid using a complex extraction solvent |
US20120264902A1 (en) | 2011-04-18 | 2012-10-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP) |
US20130345470A1 (en) | 2012-06-20 | 2013-12-26 | Opx Biotechnologies, Inc. | Purification of 3-Hydroxypropionic Acid from Crude Cell Broth and Production of Acrylamide |
CN110387352A (zh) | 2013-01-16 | 2019-10-29 | Reg生命科学有限责任公司 | 具有改善特性的酰基-acp还原酶 |
WO2014145096A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Cindy Hoppe | Flash evaporation for production purification and recovery |
US9447438B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-09-20 | Cargill, Incorporated | Acetyl-coA carboxylases |
-
2010
- 2010-09-27 WO PCT/US2010/050436 patent/WO2011038364A1/en active Application Filing
- 2010-09-27 EP EP10819620.5A patent/EP2480673B1/en active Active
- 2010-09-27 KR KR1020127010712A patent/KR20140015136A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 CN CN2010800536926A patent/CN102695799A/zh active Pending
- 2010-09-27 MX MX2012003604A patent/MX2012003604A/es not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 JP JP2012531103A patent/JP2013505727A/ja not_active Ceased
- 2010-09-27 BR BR112012006801A patent/BR112012006801A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-09-27 GB GB1207409.2A patent/GB2487866A/en not_active Withdrawn
- 2010-09-27 US US13/498,468 patent/US8883464B2/en active Active
- 2010-09-27 CA CA2775390A patent/CA2775390C/en active Active
- 2010-09-27 GB GB1016137A patent/GB2473755B/en active Active
- 2010-09-27 AU AU2010298004A patent/AU2010298004B2/en not_active Ceased
-
2013
- 2013-03-19 JP JP2013056264A patent/JP2013128494A/ja not_active Withdrawn
- 2013-06-12 US US13/916,534 patent/US9388419B2/en active Active
-
2014
- 2014-12-18 US US14/575,927 patent/US9428778B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-10 JP JP2015241185A patent/JP6271494B2/ja active Active
- 2015-12-10 JP JP2015241186A patent/JP2016039825A/ja active Pending
-
2016
- 2016-05-27 US US15/167,439 patent/US10100342B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-12 US US16/159,135 patent/US20190119708A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150344916A1 (en) | 2015-12-03 |
US20170114377A1 (en) | 2017-04-27 |
EP2480673A1 (en) | 2012-08-01 |
CA2775390A1 (en) | 2011-03-31 |
AU2010298004A1 (en) | 2012-04-26 |
US8883464B2 (en) | 2014-11-11 |
MX2012003604A (es) | 2012-09-12 |
JP2016036346A (ja) | 2016-03-22 |
GB201016137D0 (en) | 2010-11-10 |
US20130071893A1 (en) | 2013-03-21 |
US20190119708A1 (en) | 2019-04-25 |
US9388419B2 (en) | 2016-07-12 |
JP2016039825A (ja) | 2016-03-24 |
WO2011038364A1 (en) | 2011-03-31 |
GB2487866A (en) | 2012-08-08 |
KR20140015136A (ko) | 2014-02-06 |
BR112012006801A2 (pt) | 2018-04-10 |
CA2775390C (en) | 2021-06-29 |
GB201207409D0 (en) | 2012-06-13 |
US10100342B2 (en) | 2018-10-16 |
AU2010298004B2 (en) | 2016-02-25 |
EP2480673A4 (en) | 2014-10-08 |
US20140045231A1 (en) | 2014-02-13 |
JP2013505727A (ja) | 2013-02-21 |
JP2013128494A (ja) | 2013-07-04 |
CN102695799A (zh) | 2012-09-26 |
GB2473755A (en) | 2011-03-23 |
GB2473755B (en) | 2011-09-07 |
US9428778B2 (en) | 2016-08-30 |
EP2480673B1 (en) | 2018-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6271494B2 (ja) | 3−ヒドロキシプロピオン酸および他の生成物を生成するための方法 | |
EP2689020B1 (en) | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems | |
AU2011210852B2 (en) | Microorganism production of high-value chemical products, and related compositions, methods and systems | |
US8809027B1 (en) | Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase | |
US20150056684A1 (en) | Methods, systems, and compositions for increased microorganism tolerance to and production of 3-hydroxypropionic acid (3-hp) | |
US20110125118A1 (en) | Production of an Organic Acid and/or Related Chemicals | |
US20120264902A1 (en) | Methods, Systems and Compositions for Increased Microorganism Tolerance to and Production of 3-Hydroxypropionic Acid (3-HP) | |
US20180312887A1 (en) | Microbial production of chemical products and related compositions, methods and systems | |
WO2013043758A2 (en) | Compositions and methods regarding direct nadh utilization to produce 3-hydroxypropionic acid, derived chemicals and further derived products |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160920 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20161219 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20161219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20161219 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20170118 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20170118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20170118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170216 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20170704 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171102 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20171109 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171205 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171227 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6271494 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |