KR20090029708A - 지방산 및 이의 유도체의 제조 - Google Patents

지방산 및 이의 유도체의 제조 Download PDF

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제이 디. 키슬링
지하오 후
크리스 솜머빌
조지 처치
데이비드 베리
리사 프리드먼
안드레아스 쉬르머
쉐인 브루베이커
스티븐 비. 델 카르다이레
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엘에스9, 인코포레이티드
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Abstract

지방산 생합성 경로로부터 생성물(지방산 유도체)을 생산하는, 유전자 조작된 미생물, 그리고 이들의 사용 방법이 제공된다.

Description

지방산 및 이의 유도체의 제조{PRODUCTION OF FATTY ACIDS AND DERIVATIVES THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2006년 5월 19일자로 출원된 미국 가출원 제 60/802,016 호, 2006년 5월 19일자로 출원된 미국 가출원 제 60/801,995 호, 2007년 3월 28일자로 출원된 미국 가출원 제 60/908,547 호 및 2007년 2월 13일자로 출원된 PCT 출원 PCT/US2007/003736 호의 이익을 주장하며, 이들 모두는 본 명세서에 참조 병합되어 있다.
분야
지방산 생합성 경로로부터 생성물(지방산 유도체)을 생산하는 유전자 조작된 미생물과, 이들의 사용 방법이 제공된다.
기술 발달은 연료 소스(fuel source)에 관한 의존(reliance) 증가를 수반하였고, 그리고 이러한 연료 소스는 점점 제한되고 있고 그리고 획득하기 어렵게 되고 있다. 전례가 없던 속도로 화석 연료를 태우고 있어, 세계의 연료 수요는 현재 연료 공급을 곧 능가할 것으로 보인다.
그 결과, 햇빛, 물, 바람, 및 바이오매스(biomass)와 같은 재생가능한 에너 지(renewable energy)의 소스를 이용하려는 노력이 진행되어 왔다. 석유 소스로부터 유도되지 않은 새로운 연료(즉, 바이오연료(biofuel)) 소스를 생산하기 위해 바이오매스를 사용하는 것이 한 대안적 옵션으로 밝혀졌다. 바이오연료(바이오디젤(biodiesel))는 장쇄 알칸 및 에스테르로 만들어진 생분해성, 청정-연소 가연성 연료(clean-burning combustible fuel)이다. 바이오디젤은 순수한(pure) 형태로, 이는 "순(neat)" 바이오디젤이라 함, 또는 통상의 석유 디젤과의 어떤 농도의 혼합물(mix)로서 대부분의 내부 연소 디젤 엔진에 사용될 수 있다. 현재의 바이오디젤 제조 방법은, 지방산 에스테르 및 원하지 않는 부산물 글리세린의 혼합물에 이르게 하는 트리아실글리세라이드(주로 식물성유)의 에스테르 교환(transesterification)을 포함하며, 이에 따라, 불균질한 생성물 및 경제적인 비효율성을 유발하는 폐기물을 제공한다.
간단한 설명
지방산 생합성 경로로부터 유래된 생성물(지방산 유도체)을 합성할 수 있고, 그리고 선택적으로 이러한 생성물을 발효 브로스(fermentation broth)로 배출할 수 있는 재조합 미생물이 본 명세서에 개시된다. 이러한 지방산 유도체는 바이오연료 및 특수 화학제(specialty chemicals)로서 특히 유용하다. 이러한 바이오연료 및 특수 화학제는 영양 보충제(nutritional supplement), 중합체, 파라핀 대체제(paraffin replacement), 및 퍼스널 케어 제품(personal care product)과 같은 부차적인 제품을 만들기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 재조합 미생물은, 에탄올, 프로판올 이소프로판올 및 부탄올과 같은 단쇄 알콜, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 탄화수소 및 왁스 에스테르를 포함하되, 이에 제한되지 않는 다양한 지방산 유도체를 생산하도록 조작될(engineered) 수 있다.
일례에서, 미생물이 재생가능한 탄소 소스로부터 발생된 지방산 유도체를 생산하고, 그리고 선택적으로 배출하도록 미생물을 변형시키는 방법이 개시된다. 이러한 미생물은, 예를 들어, 지방산 유도체를 생산하고 그리고 일부 예에서는 분비하도록 재생가능한 탄소 소스를 물질대사할 수 있는 하나 이상의 단백질을 암호화하는 외인성(exogenous) DNA 서열을 도입함으로써 유전자 조작된다. 이어서, 변형된 미생물은 발효 공정에 사용되어, 출발 물질로서 재생가능한 탄소 소스(바이오매스)를 사용하여 유용한 지방산 유도체를 생산할 수 있다. 일부 예에서, 존재하는 유전적으로 다루기 쉬운 미생물이 사용되는데, 성장, 생산, 그리고 생합성 경로 효율을 감소시키는 부반응의 감소 또는 제거 조절을 위해 이의 경로를 조작하기 쉽기 때문이다. 또한, 이러한 변형된 미생물은, 저장 또는 수송을 위한 특별한 방법이 필요 없이, 바이오연료로서 직접 사용될 수 있는 연료를 생산하기 위해 재생가능한 탄소 소스를 소비하도록 사용될 수 있다. 다른 예에서, 본래 탄화수소를 생산하는 미생물이, 지방산 생산을 증가시키는 외인성 핵산 서열을 발현시킴으로써 탄화수소를 과발현하도록 조작된다.
정의된 탄소 사슬 길이, 분지(branching), 및 포화 수준을 갖는 지방산 유도체를 생산하는 미생물이 본 명세서에 제공된다. 특정 예에서, 균질한 생성물의 생산은 발효 및 분리와 관련 있는 전체 비용을 감소시킨다. 일부 예에서, 적어도 하나의 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14), 및 적어도 하나의 왁스 신타아제 (EC 2.3.1.75)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물이 제공된다. 다른 예에서, 적어도 하나의 티오에스테라아제(EC 3.1.2.14) 및 적어도 하나의 알콜 아세틸트랜스퍼라아제(2.3.1.84)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물이 제공된다. 또다른 예에서, 적어도 하나의 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14), 적어도 하나의 아실-CoA 리덕타아제 (EC 1.2.1.50) 및 적어도 하나의 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물이 제공된다. 적어도 하나의 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14) 및 적어도 하나의 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (1.1.1.*)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하는 미생물이 또한 제공된다. 외인성 핵산 서열에 의해 암호화된 티오에스테라아제 펩티드가 균질한 생성물을 제공하기 위해 선택될 수 있다.
일부 예에서, 지방산 유도체를 생산하도록 조작되는 미생물은 E. 콜라이(E. coli), Z. 모빌리스(Z. mobilis), 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 비브리오 푸르니시(Vibrio furnissii), 사카로마이세즈 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 스트렙토미세트(Streptomycetes), 스테노트로포모나스 말토필라(Stenotrophomonas maltophila), 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 마이크로코커스 류튜스(Micrococus leuteus) 및 이의 계통(relative)이다.
다른 예에서, 내인적으로(endogenously) 탄화수소를 생산하는 미생물이 본 명세서에 기재된 바와 같이 지방산 생합성 경로를 최적화함으로써 탄화수소를 과잉생산하도록 조작될 수 있다. 탄화수소를 생산하는 것으로 공지되어 있고 그리고 본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여 탄화수소를 과잉-생산하도록 조작될 수 있는 대표적인 미생물에는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 크로마티움 종(Chromatium sp.), 클라도스포리움 레지나(Cladosporium resina)(ATCC22711), 클로스트리디움 파스테우리아눔 VKM(Clostridium pasteurianum VKM), 클로스트리디움 테나노모르품(Clostridium tenanomorphum), 클로스트리디움 아시디우리시(Clostridium acidiurici), 코리네박테리움 종(Corynebacterium species), 시아노박테리움 종(cyanobacterial species)(노스톡 뮤스코룸(Nostoc muscorum), 아나시스티스(시네초코커스) 니둘란스(Anacystis (Synechococcus) nidulans), 포르미디움 루리둠(Phormidium luridum), 클로로글로에아 프릿치(Chlorogloea fritschii), 트리코데스미움 에리테움(Trichodesmium erythaeum), 오실라토리아 윌리암시(Oscillatoria williamsii), 미크로콜레우스 크토노플라세이스(Microcoleus chthonoplaseis), 코코클로리스 엘라벤스(Coccochloris elabens), 아그메넬룸 쿠아드루플리카툼(Agmenellum quadruplicatum), 플렉토네마 테레브란스(Plectonema terebrans), M 바지나투스(M vaginatus), 및 C. 스코풀로룸(C. scopulorum)), 데슐포비브리오 데슐퓨리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577), 키네오코커스 라디오톨레란스(Kineococcus radiotolerans)(BAA-149), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.)(ATCC 146, 398, 401, 533), 마이크로코커스 로세우스(Micrococcus roseus)(ATCC 412, 416, 516), 마이크로코커스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 미코박테리움 종(Mycobacterium species), 페니실리움 종(Penicillium sp.), 아스페르질루스 종(Aspergillus sp.), 트리코데르마 비리다(Trichoderma virida), 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 제오트갈리코커스 종(Jeotgalicoccus sp.)(M. candicans)(ATCC 8456), 로도슈도모나스 스페로이즈 클로로비움 종(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.), 로도스피릴리움 루브룸(Rhodospirillium rubrum)(ATCCl1170), 로도마이크로비움 바니엘리(Rhodomicrobium vannielii), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.)(오비포르머스(oviformus), 루드위기(ludwiggi), 트로피칼리스(tropicalis)), 비브리오 푸르니시 M1(Vbrio furnissii Ml), 비브리오 마리누스 MP-1(Vibrio marinus MP-1), 비브리오 폰티쿠스(Vibrio ponticus), 세라티아 마리노루브라(Serratia marinorubra), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 누다(Ustilago nuda), 우로시스티스 아그로피리(Urocystis agropyri), 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana), 또는 틸레티아 종(Tilletia sp.)(포에티다(foetida), 카리에스(caries), 콘트로베르사(controversa))가 포함된다.
지방산 유도체의 생산을 허용하는 외인성 핵산 서열을 발현하도록 조작되는 것에 추가로, 미생물은 기능적으로(functionally) 결실되거나(deleted) 또는 약화된(attenuated) 하나 이상의 내인성 유전자를 부가적으로 가질 수 있다. 예를 들어, ackA (EC 2.7.2.1), ackB (EC 2.7.2.1), adhE (EC 1.1.1.1, 1.2.1.10), fabF (EC 2.3.1.179), fabR (accession NP_418398), fadE (EC 1.3.99.3, 1.3.99.-), GST (EC 6.3.2.3), gpsA (EC 1.1.1.94), ldhA (EC 1.1.1.28), pflB (EC 2.3.1.54),plsB (EC 2.3.1.15),poxB (EC 1.2.2.2), pta (EC 2.3.1.8), 글루타티온 신타아제 (EC 6.3.2.3) 및 이의 조합이 약화될 수 있다.
지방산 유도체의 생산을 허용하는 외인성 핵산 서열을 발현하도록 조작되는 것에 추가로, 미생물은 부가적으로 과-발현되는 하나 이상의 부가적 유전자를 가질 수 있다. 예를 들어, pdh, panK, aceEF (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나아제(dehydrogenase) 복합체의 E1p 데하이드로게나아제 성분 및 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라아제 성분을 암호화, Accessions: NP_414656, NP_414657, EC: 1.2.4.1. 2.3.1.61, 2.3.1.12), accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (FAS를 암호화, Accessions: CAD85557, CAD85558, NP_842277, NP_841683, NP_415613, EC: 2.3.1.180, 2.3.1.39, 1.1.1.100, 1.6.5.3, 2.3.1.179), 지방-아실-coA 리덕타아제(fatty-acyl-coA reductase)를 암호화하는 유전자(Accessions: AAC45217, EC 1.2.1.-), UdhA 또는 유사한 유전자 (피리딘 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나아제를 암호화, Accession: CAA46822, EC: 1.6.1.1) 및 지방-아실-coA 리덕타아제를 암호화하는 유전자(Accessions: AAC45217, EC 1.2.1.-).
일부 예에서, 본 명세서에 기재된 미생물은 발효 브로스 리터 당 적어도 1 mg의 지방산 유도체를 생산한다. 다른 예에서, 미생물은 발효 브로스 리터 당 적어도 100 mg/L, 500 mg/L, 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 100 g/L, 또는 120 g/L의 지방산 유도체를 생산한다. 일부 예에서, 지방산 유도체가 미생물로부터 생산 및 배출되고 그리고 또다른 예에서 미생물은 생성물의 분리 전에 용해된다(lysed).
일부 예에서, 지방산 유도체는 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34 탄소 길이인 탄소 사슬을 포함한다. 일부 예에서, 만들어진 지방산 유도체 생성물의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 또는 34 탄소 길이인 탄소 사슬을 포함한다. 또다른 예에서, 지방산 유도체 생성물의 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 1, 2, 3, 4, 또는 5의 불포화 점(points of unsaturation)을 포함한다.
지방산 유도체의 제조 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 미생물을 배양하는 단계 및 발효 브로스로부터 생성물을 분리하는 단계를 포함한다.
이러한 예 및 다른 예가 이하의 상세한 설명에 더 기재된다.
도 1은 FAS 생합성 경로를 도시한다.
도 2는 왁스를 생산하는 생합성 경로를 도시한다. 왁스는 숙주 세포 내에 생 산된 알콜을 사용하여 숙주 세포 내에서 생산될 수 있거나 또는 이들은 배지 내에 외인성 알콜을 첨가함으로써 생산될 수 있다. 왁스를 생산하도록 디자인된 미생물은 외인성 핵산 서열과 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14) 서열을 사용하여 왁스 신타아제 효소 (EC 2.3.1.75)를 생산할 것이다. 왁스의 생산을 증가시키기 위해 또한 조절될 수 있는 다른 효소에는 지방산 합성에 관련된 효소(FAS 효소 EC 2.3.1.85), 아실-CoA 신타아제 (EC 2.3.1.86), 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (EC 1.1.1.*), 아실-CoA 리덕타아제 (1.2.1.50) 및 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)가 포함된다.
도 3은 지방 알콜을 생산하는 생합성 경로를 도시한다. 정의된 탄소 사슬 길이를 갖는 지방 알콜은, 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14), 그리고 아실-CoA 리덕타아제 (EC 1.2.1.50), 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1) 및 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR, EC 1.1.1*)의 조합을 암호화하는 외인성 핵산 서열을 발현함으로써 생산될 수 있다. 지방 알콜의 생산을 증가시키기 위해 또한 조절될 수 있는 다른 효소에는 지방산 합성에 관련된 효소(FAS 효소 EC 2.3.1.85), 및 아실-CoA 신타아제 (EC 2.3.1.86)가 포함된다.
도 4는 지방산 에스테르를 생산하는 생합성 경로를 도시한다. 정의된 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산 에스테르는, 아실-CoA 리덕타아제 (1.2.1.50), 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1), 및 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR, EC 1.1.1*)의 조합, 다양한 티오에스테라아제 (EC 3.1.2.14)와, 아세틸 트랜스퍼라아제 (EC 2.3.1.84)를 외인적으로 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 지방산 에스테르 의 생산을 증가시키기 위해 조절될 수 있는 다른 효소에는 지방산 합성에 관련된 효소(FAS 효소 EC 2.3.1.85), 및 아실-CoA 신타아제 (EC 2.3.1.86)가 포함된다.
도 5는 다양한 티오에스테라아제 유전자를 포함하는 플라스미드 및 pCDFDuet-1-fadD-acrl로 동시-형질전환된(co-transformed), 실시예 4에 기재된 균주(strain)에 의한 지방 알콜 생산을 도시한다. 균주는 진탕 플라스크(shake flask) 내에서 0.4% 글루코오스를 갖는 M9 미네랄 배지 내에 25 ℃에서 호기적으로 성장되었다. 포화된 ClO, C12, C14, C16 및 Cl8 지방 알콜이 확인되었다. 소량의 C 16:1 및 Cl8:1 지방 알콜이 또한 일부 샘플에서 검출되었다. 지방 알콜이 에틸 아세테이트를 사용하여 세포 펠렛(pellet)으로부터 추출되었고 그리고 검출을 증가시키기 위해 N-트리메틸실릴 (TMS) 이미다졸로 유도체화되었다(derivatized).
도 6은 생산 균주로부터의 지방 알콜의 배출을 도시한다. 이들이 37 ℃에서 성장되었을 때 생산된 지방 알콜의 약 50%가 세포로부터 배출되었다.
도 7A-7D는 알콜 아세틸 트랜스퍼라아제 (AATs, EC 2.3.1.84)를 발현하는 생산 숙주 및 왁스 신타아제 (EC 2.3.1.75)를 발현하는 생산 숙주에 의해 생산된 옥틸 옥타노에이트(C8C8)의 GS-MS 스펙트럼을 도시한다. 도 7A는, pHZ1.43 플라스미드가 ADPl (왁스 신타아제)를 발현한 균주 C41(DE3, △fadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B)의 아세틸 아세테이트 추출물(extract)을 도시한다. 도 7B는 pHZ1.43 플라스미드가 SAAT를 발현한 균주 C41(DE3, △fadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B)의 아세틸 아세테이트 추출물을 도시한다. 도 7C는 pHZ1.43 플라스미드가 ADPl (왁스 신타아제) 또는 SAAT를 포함하지 않은 균주 C41(DE3, △ fadE/pHZl.43)/pRSET B+pAS004.114B)의 아세틸 아세테이트 추출물을 도시한다. 도 7D는 pHZ1.43 플라스미드가 SAAT를 발현한 C41(DE3, △fadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)에 의해 생산된 C8C8의 질량 스펙트럼 및 단편화(fragmentation) 패턴을 도시한다.
도 8은 생산 숙주에서 A. 배일리 ADPl(A. baylyi ADP1)(WSadp1)로부터의 왁스 신타아제가 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana)로부터의 티오에스테라아제 유전자와 함께 동시-발현되었을 때 만들어진 에틸 에스테르의 분포를 도시한다.
도 9A 및 9B는 GC/MS 분석의 크로마토그램을 도시한다. 도 9A는 플라스미드 pCDFDuet-1-fadD-WSadp1, pETDuet-l-'tesA로 형질전환된 E. 콜라이 LS9001 균주의 배양물의 에틸 추출물의 크로마토그램을 도시한다. 에탄올이 발효물(fermentation)에 공급되었다. 도 9B는 대조구(reference)로서 사용된 에틸 헥사데카노에이트 및 에틸 올리에이트(ethyl oleate)의 크로마토그램을 도시한다.
도 10a 내지 도 10l는 지방산 유도체 생산을 증가시키기 위해 과-발현되거나 또는 약화될 수 있는 다양한 유전자들을 확인하는 표를 도시한다. 표를 통해 또한 지방산 유도체 생성물의 구조를 바꾸기 위해 조절될 수 있는 다양한 유전자가 확인된다. 당업자는 지방산 유도체의 구조를 바꾸기 위해 사용되는 유전자들의 일부가 지방산 유도체의 생산을 또한 증가시킬 것임을 이해할 것이다.
약어 및 용어
이하의 용어 및 방법의 설명은 본 개시내용을 더 잘 기재하기 위해 그리고 본 개시내용을 실시하는 당업자들을 안내하기 위해 제공된다. 본 명세서에서 사용될 때, "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"을 의미하고 그리고 단일 형태("a" 또는 "an" 또는 "the")는, 문맥에서 달리 명백히 지시되지 않는 한, 복수를 포함한다. 예를 들어, "세포를 포함하는"은 하나 또는 복수의 이러한 세포들을 포함하고, 그리고 "티오에스테라아제를 포함하는"은 하나 이상의 티오에스테라아제 펩티드 및 당업자에게 알려진 이의 등가물 등을 포함한다. 용어 "또는"은, 문맥에서 달리 명백히 지시되지 않는 한, 언급된 대안적 요소들의 단일 요소 또는 둘 이상의 요소들의 조합을 나타낸다. 예를 들어, 어구 "티오에스테라아제 활성 또는 지방 알콜-형성 아실-CoA 리덕타아제 활성"은 티오에스테라아제 활성, 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 활성, 또는 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 활성, 및 티오에스테라아제 활성 모두의 조합을 나타낸다.
달리 설명되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 시험 또는 실시에 사용될 수 있다 할지라도, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이고 그리고 제한하고자 하는 것이 아니다. 개시내용의 다른 특징들은 이하의 상세한설명 및 특허청구범위로부터 명백하다.
등록 번호(accession number): 이 상세한설명 전반에 걸친 등록 번호는 미국 국립보건원(National Institute of Health, U. S. A)이 유지하는 NCBI 데이터베이 스 (National Center for Biotechnology Information)에서 유래한다. 등록 번호는 2007년 3월 27일자로 데이터베이스에서 제공된 바와 같다.
효소 분류 번호(Enzyme Classification Number)(EC): 본 상세한설명 전반에 걸쳐 제공된 EC 번호는, 교토 대학이 일부 후원하는, 유전자 및 게놈의 교토 엔사이크로페디아(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)가 유지하는, KEGG 리간드 데이터베이스로부터 유래한다. EC 번호는 2007년 3월 27일자로 데이터베이스에서 제공된 바와 같다.
약화(Attenuate): 무엇인가의 영향(impact), 활성 또는 세기를 감소시키는 것이다. 일례에서, 효소 활성이 화합물의 존재에 의해 영향받지 않도록, 피드백 저해(inhibition) 또는 생성물 또는 반응물이 아닌 조성물에 기인하는 저해(비-경로 특이적 피드백(non-pathway specific feedback))에 대한 특정 효소의 민감도가 감소된다. 예를 들어, fabH 유전자 및 이의 대응하는 아미노산 서열은 온도 민감성이고 그리고 온도 변동에 대한 민감도를 감소시키도록 변경될 수 있다. fabH 유전자의 약화는, 분지된(branched aminoic acid) 아미노산이 요구될 때 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 덜 활성이 되도록 변경된 효소가, 약화된 것으로 언급될 수 있다.
효소의 기능적 결실(functional deletion)이 효소를 약화시키기 위해 사용될 수 있다. 기능적 결실은, 유전자 서열 또는 유전자 서열의 전사를 조절하는 서열에 만들어진 돌연변이, 일부 또는 전부 결실, 삽입, 또는 다른 변형이며, 이는 유전자 생성물의 생산을 감소시키거나 또는 저해하고, 또는 유전자 생성물을 비-기능적으로 만든다(즉, plsB 유전자에 대해 본 명세서에 기재된 돌연변이). 예를 들어, E. 콜라이에서 fabR의 기능적 결실은 지방산 생합성 경로의 억제(repression)를 감소시키고 그리고 E. 콜라이가 보다 많은 불포화 지방산(UFAs)을 생산하도록 한다. 일부 예에서, 기능적 결실은 녹-아웃 돌연변이(knockout mutation)로서 기재된다.
당업자는 효소 활성을 약화시키는 많은 방법이 존재한다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 약화는, 핵산 서열 변경을 통해 아미노산 서열 변화를 도입하고, 유전자를 덜 활성인 프로모터의 조절 하에 두고, 관심 대상 유전자를 표적화(targeting)하는 간섭(interfering) RNA, 리보자임 또는 안티센스 서열을 발현시킴으로써, 또는 이 기술분야에서 공지된 어떤 다른 기술을 통해 수행될 수 있다.
탄소 소스: 일반적으로 원핵 또는 단순한(simple) 진핵 세포 성장을 위한 탄소의 소스로서 사용되기에 적합한 기질 또는 화합물을 나타낸다. 탄소 소스는, 중합체, 탄수화물, 산, 알콜, 알데하이드, 케톤, 아미노산, 펩티드 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 여기에는 예를 들어, 글루코오스와 같은 다양한 단당류, 올리고당류, 다당류, 셀룰로오스 물질, 자일로오스, 및 아라비노오스(arabinose), 수크로오스와 같은 이당류, 포화 또는 불포화 지방산류, 숙시네이트, 락테이트, 아세테이트, 에탄올 등, 또는 이의 혼합물이 포함된다. 탄소 소스는 부가적으로 글루코오스를 포함하되 이에 제한되지 않는 광합성의 생성물이 될 수 있다.
cDNA (상보적DNA): 전사를 결정하는 규칙적인 서열 및 내부의, 비-코딩 세그먼트(인트론(intron))가 결핍된 DNA의 피스(piece). cDNA는 세포로부터 추출된 메신저 RNA로부터 역전사에 의해 합성될 수 있다.
결실: 핵산 분자로부터의 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 단백질로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거, 양 쪽 상의 영역들이 함께 접합됨.
검출가능한: 확인된 존재 또는 실재를 가질 수 있는. 예를 들어, 반응물로부터의 생성물의 생산, 예를 들어 C18 지방산의 생산이 이하 실시예 1에 제공된 방법을 사용하여 검출가능하다.
DNA: 데옥시리보핵산(Deoxyribonucleic acid), DNA는 대부분의 살아있는 유기체의 유전 물질을 포함하는 장쇄 중합체이다(일부 바이러스는 리보핵산, RNA를 포함하는 유전자를 갖는다). DNA 중합체 내 반복 단위는 네개의 상이한 뉴클레오타이드이며, 이들의 각각은 포스페이트기가 부착된 데옥시리보오스 당에 속박된 네 염기들, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 하나를 포함한다. DNA 분자 내에, 코돈이라고 하는 뉴클레오타이드의 트리플렛(triplet)이 펩티드 내 아미노산을 암호화한다. 코돈이라는 용어는 DNA 서열이 전사되는 mRNA 내 세 뉴클레오타이드의 대응하는 (및 상보적인) 서열에 대해서도 사용된다.
내인성(endogenous): 핵산 분자 및 특정 세포 또는 미생물을 참조하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 재조합 조작 기술(recombinant engineering technique)을 사용하여 세포 내에 도입되지 않은 그리고 세포 내에 있는 핵산 서열 또는 펩티드를 지시한다. 예를 들어, 세포가 자연으로부터 처음에 분리되었을 때 세포 내에 존재했던 유전자이다. 전사 또는 번역을 활성화하는 프로모터 또는 인핸서 서열과 같은 조절 서열이 재조합 기술을 통해 변경된다면 유전자는 여전히 내인성으로 간주된다.
외인성(exogenous): 핵산 분자 및 특정 세포를 참조하여 본 명세서에 사용된 바와 같이 자연에서 발견된 대로의 특정 세포로부터 유래하지 않은 어떤 핵산 분자를 지시한다. 따라서, 비-자연-발생 핵산 분자는 일단 세포 내에 도입될 때 세포에 대해 외인성인 것으로 간주된다. 자연-발생하는 핵산 분자가 특정 세포에 대해 외인성일 수도 있다. 예를 들어, 세포 X로부터 분리된 전체 코딩 서열은 일단 코딩 서열이 세포 Y에 도입되면, 심지어 X 및 Y가 동일한 세포 타입일지라도, 세포 Y에 대해 외인성 핵산이다.
발현: 유전자의 코딩된 정보가 단백질, 전달 RNA, 또는 리보솜 RNA와 같은, 세포의 구조 및 기능으로 전환되는 공정. 발현된 유전자는, mRNA로 전사되고 그리고 나서 단백질로 번역되는 것 그리고 RNA로 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 것(예를 들어,전달 및 리보솜 RNA)을 포함한다.
지방 에스테르: 지방산으로부터 만들어진 어떤 에스테르를 포함한다. 지방산 내 탄소 사슬은 본 명세서에 기재된 변형의 어떤 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 탄소 사슬은, 하나 이상의 불포화 점, 사이클릭 분지화를 포함하는 하나 이상의 분지화 점을 포함할 수 있고, 그리고 짧거나 또는 길게 조작될 수 있다. 모든 알콜이 지방산 에스테르를 형성하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 지방산 생합성 경로로부터 유래된 알콜, 비-지방산 생합성 경로를 통해 생산 숙주에 의해 생산된 알콜, 및 발효 브로스 내에 공급되는 알콜이 있다.
지방산 유도체: 부분적으로 숙주 유기체의 지방산 생합성 경로로부터 만들어진 생성물을 포함한다. 지방산 생합성 경로는 지방산 유도체를 생산하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작될 수 있는 지방산 신타아제 효소를 포함하고, 그리고 일부 예에서 원하는 탄소 사슬 특성을 갖는 지방산 유도체를 생산하기 위해 부가적인 효소와 함께 발현될 수 있다. 대표적인 지방산 유도체는, 예를 들어 단쇄 및 장쇄 알콜, 탄화수소, 및 왁스를 포함하는 지방산 에스테르를 포함한다.
발효 브로스: 미생물 생명(즉, 탄소를 활발하게 물질대사하고 있는 미생물)을 유지하는 어떤 배지든 포함한다. 발효 배지는 일반적으로 탄소 소스를 포함한다. 탄소 소스는 에너지를 위해 미생물에 의해, 부가적인 효소가 있거나 또는 없이, 사용될 수 있는 어떤 것이 될 수 있다.
탄화수소: 원소 탄소(C) 및 수소(H)를 포함하는 화학적 화합물을 포함한다. 모든 탄화수소는 탄소 골격 및 골격에 부착된 수소 원자들로 구성된다. 때때로, 용어 "지방족성 탄화수소" 의 축약된 형태로서 사용된다. 본질적으로 세 타입의 탄화수소가 존재한다: (1) 적어도 하나의 방향족성 고리를 갖는 방향족성 탄화수소; (2) 이중, 삼중 또는 방향족성 결합이 없는, 알칸으로서 알려지기도 한, 포화 탄화수소; 및 (3) 알켄, 알킨, 및 디엔으로 나뉘는, 탄소 원자들 사이에 하나 이상의 이중 또는 삼중 결합을 갖는, 불포화 탄화수소. 액체 지질학적으로-추출된(geologically-extracted) 탄화수소는 석유(글자 뜻대로 "석유(rock oil)") 또는 광물유(mineral oil)라고 하고, 반면에 기체 지질학적 탄화수소는 천연 가스라고 한다. 이 모두는 유기 화학제의 생산을 위한 공급원료로서 연료 및 원료(raw material)의 중요한 소스이고 그리고 일반적으로 석유 지질학의 도구를 사용하여 지구 표면에서 발견된다. 퇴적암 내 오일 매장량(oil reserves)은 에너지 및 화학 제 산업을 위한 탄화수소의 주요 소스이다. 탄화수소는 경제적으로 가장 중요한데, 이들이 주 화석 연료(석탄, 석유, 천연 가스, 등) 및 바이오연료와, 플라스틱, 왁스, 용매 및 오일의 성분을 포함하기 때문이다.
분리된: (핵산 분자, 단백질, 또는 세포와 같은) "분리된" 생물학적 성분은, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질과 같은, 상기 성분이 자연적으로 발생하는 다른 생물학적 성분들로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다. "분리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 분자 및 단백질과, 화학적으로 합성된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다.
일례에서, 분리된은 이것이 유래되는 유기체의 자연-발생 게놈에서 이것이 바로 인접하는 서열의 양쪽(5' 말단 상의 하나 및 3' 말단 상의 하나)에 바로 인접하지 않는 자연-발생 핵산 분자를 나타낸다.
미생물(Microorganism): 도메인(Domain) 고세균(Archaea), 세균(Bacteria) 및 진핵생물(Eucarya)로부터의 원핵 및 진핵 미생물 종을 포함하며, 후자는 효모(yeast) 및 곰팡이(filamentous fungi), 원생동물(protozoa), 조류(algae), 또는 고등 미생물(higher Protista)을 포함한다. 용어 "미생물 세포(microbial cells)" 및 "미생물(microbes)"은 미생물이라는 용어와 교환가능하게 사용된다.
핵산 분자: cDNA, 게놈 DNA, 및 mRNA를 제한 없이 포함하는 RNA 및 DNA 분자를 모두 포함한다. 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 생산되는 것과 같은, 합성 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자는 이중-가닥(double-stranded) 또는 단일- 가닥이 될 수 있다. 단일-가닥인 경우, 핵산 분자는 센스 가닥(sense strand) 또는 안티센스 가닥(antisense strand)이 될 수 있다. 또한, 핵산 분자는 원형 또는 선형일 수 있다.
작동가능하게 연결된(Operably linked): 제 1 핵산 서열은, 제 1 핵산 서열이 제 2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치될 때 제 2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 준다면, 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고 그리고, 두 단백질 코딩 영역을 결합시키기 위해 필요한 경우, 동일한 판독 프레임에 있다. 단일 메신저 RNA로서 앞뒤로 일렬이 되어(in tandem) 전사되는 개별 유전자들의 구조는 오페론이라 한다. 이와 같이, 유전자들을 매우 근접하게, 예를 들어 한 플라스미드 벡터 내에, 단일 프로모터의 전사 조절 하에 위치시키는 것은, 합성 오페론을 형성한다.
ORF (개방 판독 프레임(open reading frame)): 어떤 종결 코돈 없이 아미노산에 대해 코딩하는 일련의 뉴클레오타이드 트리플렛(triplet)(코돈). 이러한 서열은 일반적으로 펩티드로 번역가능하다.
과-발현: 유전자가 그 유전자의 내인성 전사 속도보다 상승된 속도로 전사되도록 초래되는 경우. 일부 예에서, 과-발현은 부가적으로 그 유전자의 내인성 번역 속도보다 상승된 유전자의 번역 속도를 포함한다. 과-발현의 시험 방법은 이 기술분야에서 주지되어 있으며, 예를 들어 전사된 RNA 수준은 rtPCR을 사용하여 평가될 수 있고 그리고 단백질 수준은 SDS 페이지 겔 분석(SDS page gel analysis)을 사용 하여 평가될 수 있다.
정제된: 정제된이라는 용어는 절대적인 순도를 요구하지 않는다; 오히려, 이는 상대적 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 왁스와 같은 정제된 지방산 유도체 제제(preparation), 또는 지방산 에스테르 제제는, 세포 내 이의 환경에 있는 생성물보다 생성물이 더 농축된 것이다. 예를 들어, 정제된 왁스는 실질적으로 이와 함께 있을 수 있는 세포 성분들(핵산, 지질, 탄수화물, 및 다른 펩티드)으로부터 분리된 것이다. 다른 예에서, 정제된 왁스 제제는, 발효를 따라 존재할 수 있는 것과 같은, 오염물이 실질적으로-없는 것이다.
일례에서, 지방산 에스테르는, 샘플의 적어도 약 50 중량%가 지방산 에스테르로 이루어지는 경우에, 예를 들어 샘플의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 98%, 또는 99% 이상이 지방산 에스테르로 이루어지는 경우에 정제되어진다. 왁스, 지방 알콜, 및 지방산 에스테르를 정제하기 위해 사용될 수 있는 방법들의 예에는 이하 실시예 11에 기재된 방법이 포함된다.
재조합: 재조합 핵산 분자 또는 단백질은, 자연 발생되지 않는 서열을 갖는, 서열의 두개의 달리 분리된 세그먼트들의 인공 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는, 또는 이 모두를 갖는 것이다. 이 인공 조합은, 예를 들어 화학 합성에 의해, 또는 유전자 조작 기술(genetic engineering technique)과 같은, 단백질 또는 핵산 분자의 분리된 세그먼트들의 인공 조작에 의해 달성될 수 있다. 재조합은 또한 인공적으로 조작된(manipulated) 핵산 분자들을 나타내기 위해 사용되지만, 핵산이 분리된 유기체 내에서 발견되는 동일한 조절(regulatory) 서열 및 코딩 영역을 포함한 다. 재조합 세포 또는 미생물은, 재조합 핵산 분자와 같은, 외인성 핵산 분자를 포함하는 것이다.
배출: 세포 내부(세포내)로부터 세포 외부(세포외)로의 화합물의 이동. 이동은 능동 또는 수동일 수 있다. 배출이 능동일 때, 이는 하나 이상의 수송체(transporter) 펩티드에 의해 용이해질 수 있고 그리고 일부 예에서 이는 에너지를 소비할 수 있다. 배출이 수동일 때, 이는 막을 통한 확산을 통해 가능하고 그리고 세포외 환경으로부터 원하는 화합물을 연속적으로 수집하고, 이에 따라 추가 확산을 촉진함으로써 용이해질 수 있다. 화합물의 배출은 세포를 용해시킴으로써 달성될 수도 있다.
계면활성제(Surfactant): 이들이 용해되는 액체의 표면 장력을 감소시킬 수 있는 물질. 이들은 일반적으로 수용성 헤드(head) 및 탄화수소 사슬 또는 테일(tail)로 이루어진다. 수용성 기는 친수성이고 그리고 이온성 또는 비이온성일 수 있고, 그리고 탄화수소 사슬은 소수성이다. 계면활성제는 세제 및 클리너(cleaner)를 포함하는, 다양한 제품에 사용되고, 그리고 텍스타일, 가죽 및 종이의 보조제로서, 화학 공정에서, 화장품 및 약제에서, 식품 산업에서 그리고 건축에서 또한 사용된다. 또한, 이들은 환경에 접근이 어려운 것으로 밝혀진 원유(crude oil)의 추출 및 분리에 도움이 되도록 또는 물 에멀젼(water emulsion)으로서 사용될 수 있다.
다양한 사용을 특징으로 하는 네 타입의 계면활성제들이 존재한다. 음이온성 계면활성제는 세제-유사 활성을 가지고 그리고 일반적으로 세정 적용예에 사용된 다. 양이온성 계면활성제는 장쇄 탄화수소를 포함하고 그리고 단백질 및 합성 중합체를 처리하기 위해 종종 사용되거나 또는 페브릭 연화제(softener) 및 헤어 컨디셔너의 성분이다. 양성(amphoteric) 계면활성제는 또한 장쇄 탄화수소를 포함하고 그리고 일반적으로 샴푸에 사용된다. 비-이온성 계면활성제는 일반적으로 세정 제품에 사용된다.
형질전환된 또는 재조합 세포: 예를 들어 분자 생물학 기술에 의해, 아실-CoA 신타아제 암호화 핵산 분자와 같은 핵산 분자가 도입된 세포. 형질전환은, 바이러스 벡터를 사용한 트랜스펙션(transfection), 접합(conjugation), 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환, 그리고 전기영동(electroporation), 리포펙션(lipofection), 및 입자 건 가속(particle gun acceleration)에 의한 네이키드 DNA(naked DNA)의 도입을 포함하되 이에 제한되지 않는, 핵산 분자가 이러한 세포 내에 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다.
생성물 생산을 허용하는 조건 하에서: 미생물이 지방산, 탄화수소, 지방 알콜, 왁스 또는 지방산 에스테르와 같은 원하는 생성물을 생산하도록 허용하는 어떤 발효 조건. 발효 조건은 일반적으로 온도 범위, 폭기(aeration) 수준, 및 배지 선택을 포함하고, 이는 조합될 때 미생물이 성장하도록 허용한다. 대표적인 배지는 브로스 또는 겔을 포함한다. 일반적으로, 배지가 미생물에 의해 직접 물질대사될 수 있는 글루코오스, 프럭토오스, 셀룰로오스 등과 같은 탄소 소스를 포함하거나, 또는 효소가 탄소 소스를 물질대사하기 용이하도록 하는 배지 내에 사용될 수 있다. 배양 조건이 생성물 생산을 허용하는지를 결정하기 위해, 미생물은 24, 36, 또 는 48 시간동안 배양될 수 있고 그리고 샘플이 얻어지고 그리고 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포가 성장된 배지 또는 샘플 내 세포는 원하는 생성물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 생성물의 존재에 대해 시험될 때, 이하 실시예에 제공된 것과 같은 어세이(assay)가 사용될 수 있다.
벡터: 세포 내에 도입된, 이에 의해 형질전환된 세포를 생산하는 핵산 분자. 벡터는 복제의 출발점(origin)과 같은, 이것이 세포 내에서 복제하도록 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 이 기술분야에서 공지된 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 및 다른 유전 요소들을 포함할 수 있다.
왁스: 확인된 세트의 물리적 조건 하에 고체 또는 유연한 물질들을 형성하는 다양한 지방산 에스테르. 왁스라고 불리는 지방산 에스테르는 일반적으로 왁스가 아닌 지방산 에스테르보다 긴 탄소 사슬들을 갖는다. 예를 들어, 왁스는 일반적으로 실온에서 유연한 물질을 형성한다.
상세한 설명
I. 지방산 유도체의 생산
내부로 외인성 DNA 서열이 형질전환되는 숙주 유기체는, 아실-ACP 또는 아실-CoA의 생산을 증가시키거나, 지방산 유도체 및 중간체의 이화작용을 감소시키거나, 또는 생합성 경로의 특정 시점에서 피드백 저해를 감소시키도록 변형된 유기체와 같은, 변형된 숙주 유기체일 수 있다. 본 명세서에 기재된 유전자를 변형시키는 것에 추가로, 부가적인 세포 리소스(resource)가 지방산을 과잉 생산하도록 전환될 수 있다. 예를 들어 락테이트, 숙시네이트 및/또는 아세테이트 경로가 약화될 수 있고, 그리고 아세틸-CoA 카르복실라아제(ACC)가 과발현될 수 있다. 본 명세서에 기재된 생산 숙주에 대한 변형은 게놈 변경, 염색체외 발현 시스템, 또는 이의 조합을 통해 가능하다. 경로의 개요는 도 1 및 2에 제공되어 있다.
A. 아세틸-CoA-말로닐-CoA에서 아실-ACP로
지방산 신타아제(FAS)는 아실 사슬의 개시(initiation) 및 연장(elongation)을 촉매작용하는 펩티드의 그룹이다(Marrakchi et al., Biochemical Society, 30:1050-1055, 2002). FAS 경로에서 효소와 함께 아실 캐리어 단백질(acyl carrier protein)(ACP)이 생산된 지방산의 길이, 포화도 및 분지화(branching)를 조절한다. FAS에 포함될 수 있는 효소에는 AccABCD, FabD, FabH, FabG, FabA, FabZ, FabI, FabK, FabL, FabM, FabB, 및 FabF가 포함된다. 원하는 생성물에 따라, 하나 이상의 이러한 유전자가 약화 또는 과-발현될 수 있다.
예를 들어, 생산 숙주 내 지방산 생합성 경로는 전구체 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 사용한다(도 2). 이러한 성분들을 과잉생산하도록 조작된 E. 콜라이 또는 다른 숙주 유기체는 연이은 유전자 조작 단계를 위한 출발점 역할을 하여, (지방산 에스테르, 탄화수소, 지방 알콜과 같은) 특정 생산 생성물(output product)을 제공할 수 있다. 수가지 상이한 변형이 아세틸 CoA/말로닐 CoA/지방산 및 지방산 유도체 생산을 증가시키기 위해 숙주 균주에 조합하여 또는 개별적으로 만들어질 수 있다. 예를 들어, 아세틸 CoA 생산을 증가시키기 위해, pdh, panK, aceEF, (피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나아제 복합체의 E1p 데하이드로게나아제 성분 및 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라아제 성분을 암호화), fabH/fabD/fabG/acpP/fabF, 및 일부 예에서 지방-아실-CoA 리덕타아제 및 알데하이드 데카르보닐라아제(aldehyde decarbonylase)를 암호화하는 부가적인 DNA를 갖는 플라스미드가, 모두 구조성(constitutive), 또는 이와 달리 조절성(controllable) 프로모터의 조절 하에, 형성될 수 있다(constructed). 이러한 유전자들의 대표적인 Genbank 등록 번호는 다음과 같다: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (coaA, AAC76952라고도 함), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), fabD (AAC74176), fabG (AAC74177), acpP (AAC74178), fabF(AAC74179).
부가적으로, fadE, gpsA, ldhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, 및/또는 ackB 가 대응하는 유전자의 무효화(null) 또는 결실 돌연변이를 포함하는 조건적 복제 또는 비-복제 플라스미드를 사용한 형질전환에 의해 또는 프로모터 또는 인핸서 서열을 치환함으로써 조작된 미생물 내에서 녹-아웃될 수 있거나(knocked-out), 또는 이들의 발현 수준이 감소될 수 있다. 이러한 유전자의 대표적인 Genbank 등록 번호는 다음과 같다; fadE (AAC73325), gspA (AAC76632), IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ackA (AAC75356), 및 ackB (BAB81430).
얻어지는 조작된 미생물은 원하는 환경, 예를 들어 제한된 글리세롤(배양 배지 내 1 % w/v 미만)을 갖는 환경에서 성장될 수 있다. 이와 같이, 이러한 미생물은 증가된 아세틸-CoA 생산 수준을 가질 것이다. 말로닐-CoA 과잉생산은, 새로 합성된 플라스미드 내에 포함된 accABCD 를 암호화하는 DNA(아세틸 CoA 카르복실라아 제, 예를 들어 등록 번호 AAC73296, EC 6.4.1.2)를 사용하여, 미생물을 상기된 바와 같이 조작함으로써 이루어질 수 있다. 지방산 과잉생산은 새로 합성된 플라스미드 내에 리파아제를 암호화하는 DNA(예를 들어, 등록 번호 CAA89087, CAA98876)를 더 포함시켜 달성될 수 있다.
일부 예에서, 아세틸-CoA 카르복실라아제 (ACC) 는 이의 세포내 농도를, 예를 들어 본래의 발현 수준에 비해 적어도 2-배, 이를테면 적어도 5-배, 또는 적어도 10-배까지 증가시키기 위해 과-발현된다.
또한, plsB (예를 들어 등록 번호 AAC77011) D311E 돌연변이는 아실-CoA의 풀(pool)에 대한 제한(limitation)을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
또한, sfa 유전자(FabA의 억제인자(suppressor), 예를 들어 등록 번호 AAN79592)의 과-발현이 단일불포화 지방산의 생산을 증가시키기 위해 생산 숙주에 포함될 수 있다(Rock et al, J. Bacteriology 178:5382-5387, 1996).
B. 아실-ACP에서 지방산으로
지방산 유도체의 균질 집단(homogeneous population)의 생산을 위해 생산 숙주를 조작하기 위해, 하나 이상의 내인성 유전자가 약화되거나 또는 기능적으로 결실될 수 있고 그리고 하나 이상의 티오에스테라아제가 발현될 수 있다. 예를 들어, 티오에스테라아제 C18(예를 들어 등록 번호 AAC73596 및 P0ADAl)을 약화시키고, 이는 C18:1-ACP 를 사용함, 그리고 티오에스테라아제 C10(예를 들어 등록 번호 Q39513)을 발현시킴으로써, 이는 C10-ACP를 사용함, C10 지방산 유도체가 생산될 수 있다. 이에 따라, 10의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산 유도체의 상대적 균질 집 단이 얻어진다. 다른 예에서, C14 지방산 유도체가 비-C14 지방산을 생산하는 내인성 티오에스테라아제를 약화시키고 그리고 티오에스테라아제 등록 번호 Q39473 (이는 C14-ACP를 사용함)를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 또다른 예에서, C12-ACP를 사용하는 티오에스테라아제(예를 들어 등록 번호 Q41635)를 발현시키고 그리고 비-C12 지방산을 생산하는 티오에스테라아제를 약화시킴으로써 C12 지방산 유도체가 생산될 수 있다. 아세틸 CoA, 말로닐 CoA, 및 지방산 과잉생산은, 예를 들어 세포 용해에 연이어 방사성 전구체, HPLC, 및 GC-MS 를 사용함으로써, 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 변화될 수 있다.
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C. 지방산에서 아실-CoA로
생산 숙주는 다양한 길이의 지방산을 생산하기 위해 알려진 펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 지방산을 제조하는 한 방법은, 하나 이상의 아실-CoA 신타아제 펩티드(EC 2.3.1.86)의 발현을 증가시키거나, 또는 이의 보다 활성인 형태를 발현시키는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 아실-CoA 신타아제는 효소 분류 번호 EC 2.3.1.86 의 펩티드와, 지방산의 아실-CoA로의 전환을 촉매작용할 수 있는 어떤 다른 펩티드를 포함한다. 부가적으로, 당업자는, 일부 아실-CoA 신타아제 펩티드가 다른 반응을 마찬가지로 촉매작용할 것임을, 예를 들어 일부 아실-CoA 신타아제 펩티드는 지방산에 추가하여 다른 기질을 허용할 것임을 알 것이다. 따라서, 이러한 비-특이적 아실-CoA 신타아제 펩티드가 또한 포함된다. 아실-CoA 신타아제 펩티드 서열은 공개적으로 이용가능하다. 대표적인 GenBank 등록 번호가 도 10a 내지 도 10l에 제공된다.
D. 아실-CoA에서 지방 알콜로
아실-CoA로부터 지방 알콜을 생산하기 위해 공지된 폴리펩티드를 사용하여 생산 숙주가 조작될 수 있다. 지방 알콜의 한 제조 방법은 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR, EC 1.1.1.*), 또는 아실-CoA 리덕타아제 (EC 1.2.1.50) 및 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)의 발현을 증가시키거나 또는 이의 보다 활성인 형태를 발현하는 것을 포함한다. 이하에서 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (FAR, EC 1.1.1.*), 아실-CoA 리덕타아제 (EC 1.2.1.50) 및 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)는 집합적으로 지방 알콜 형성 펩티드라 한다. 일부 예에서, 지방 알콜 형성 유전자의 셋 모두가 생산 숙주 내에서 과발현될 수 있고, 그리고 또다른 예에서, 하나 이상의 지방 알콜 형성 유전자가 과-발현될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 지방 알콜 형성 펩티드는 효소 분류 번호 EC 1.1.1.*, 1.2.1.50, 및 1.1.1.1 의 펩티드와, 아실-CoA의 지방 알콜로의 전환을 촉매작용할 수 있는 어떤 다른 펩티드를 포함한다. 부가적으로, 당업자는, 일부 지방 알콜 형성 펩티드가 다른 반응을 마찬가지로 촉매작용할 것임을, 예를 들어 일부 아실-CoA 리덕타아제 펩티드가 지방산에 추가하여 다른 기질을 허용할 것임을 알 것이다. 따라서, 이러한 비-특이적 펩티드가 또한 포함된다. 지방 알콜 형성 펩티드 서열은 공개적으로 이용가능하다. 대표적인 GenBank 등록 번호가 도 10a 내지 도 10l에 제공된다.
지방 알콜은 탄화수소-계 계면활성제로서 설명될 수도 있다. 계면활성제 생산을 위해, 미생물은, 이것이 재생가능한 탄소 소스로부터 계면활성제를 생산하도록 변형된다. 이러한 미생물은 지방산을 지방 알데하이드로 전환시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 제 1 외인성 DNA 서열 및 지방 알데하이드를 알콜로 전환시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 제 2 외인성 DNA 서열을 포함한다. 일부 예에서, 제 1 외인성 DNA 서열은 지방산 리덕타아제를 암호화한다. 일실시형태에서, 제 2 외인성 DNA 서열은 포유동물 마이크로좀(microsomal) 알데하이드 리덕타아제 또는 장쇄 알데하이드 데하이드로게나아제를 암호화한다. 추가 예에서, 제 1 및 제 2 외인성 DNA 서열은 아트로박터 AK 19(Arthrobacter AK 19), 로도토룰라 글루티닌(Rhodotorula glutinin), 아시노박터 종(Acinobacter sp) 균주 M-1, 또는 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica)로부터의 다중효소 복합체(multienzyme complex)에서 유래한다. 일실시형태에서, 제 1 및 제 2 이종(heterologous) DNA 서열들은 아시노박터 종 균주 M-1 또는 칸디다 리폴리티카로부터의 다중효소 복합체에서 유래한다.
계면활성제 생산에 사용될 수 있는, 지방산에서 장쇄 알콜로의 전환 단백질을 암호화하는 이종 DNA 서열의 부가적인 소스는 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(ATCC 32222), 크리토코커스 커바투스(Crytococcus curvatus), (아피오트리쿰 커바툼(Apiotricum curvatum)이라고도 함), 알카니보락스 자덴시스(Alcanivorax jadensis)(T9T=DSM 12718=ATCC 700854), 아시네토박터 종(Acinetobacter sp.) HOl-N, (ATCC 14987) 및 로도코커스 오파쿠스 (PD630 DSMZ 44193)을 포함하되 이에 제한되지 않는다.
일례에서, 지방산 유도체는 6 내지 36개의 탄소 원자로 제한된 탄소 원자 범위를 갖는 포화 또는 불포화된 계면활성제 생성물이다. 또다른 예에서, 계면활성제 생성물은 24 내지 32 탄소 원자로 제한된 탄소 원자 범위를 갖는다.
계면활성제를 생산하기에 적당한 숙주는 진핵 또는 원핵 미생물이 될 수 있다. 대표적인 숙주에는 아트로박터 AK 19, 로도토룰라 글루티닌, 아시노박터 종 균주 M-1, 아라비돕시스 탈라니아(Arabidopsis thalania), 또는 아세틸 CoA 카르복실라아제를 발현하도록 조작된 E. 콜라이, 칸디다 리폴리티카, 및 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)가 포함된다. 높은 수준의 계면활성제 전구체를 지질 및 오일의 형태로 합성할 타고난 능력(innate ability)이 증명되는 숙주, 이를테면 로도코커스 오파쿠스, 아트로박터 AK 19, 로도토룰라 글루티닌, 아세틸 CoA 카르복실라아제를 발현하도록 조작된 E. 콜라이, 및 다른 유성 박테리아(oleaginous bacteria), 효모 및 진균류(fungi)가 사용될 수도 있다.
E. 지방 알콜에서 지방 에스테르로
생산 숙주는 다양한 길이의 지방 에스테르를 생산하기 위해 공지된 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 지방 에스테르를 제조하는 한 방법은 하나 이상의 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드(EC 2.3.1.84)의 발현을 증가시키거나, 또는 이의 보다 활성인 형태를 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 펩티드는 CoA 및 아세트산 에스테르(acetic ester)를 형성하기 위한 아세틸-CoA 및 알콜의 반응을 촉매작용한다. 일부 예에서, 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드는, 선택된 티오에스테라아제 펩티드, FAS 펩티드 및 지방 알콜 형성 펩티드와 함께 발현될 수 있고, 이와 같이, 탄소 사슬 길이, 포화 및 분지화도가 조절되도록 허용한다. 일부 경우에서, bkd 오페론이 분지된 지방산 전구체가 생산될 수 있도록 동시-발현될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드는 효소 분류 번호 EC 2.3.1.84 내 펩티드와, CoA 및 아세트산 에스테르를 형성하기 위한 아세틸-CoA 및 알콜의 전환을 촉매작용할 수 있는 어떤 다른 펩티드를 포함한다. 부가적으로, 당업자는, 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드가 다른 반응을 마찬가지로 촉매작용 할 것임을, 예를 들어 일부 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드가 지방 알콜 또는 아세틸-CoA 티오에스테르에 추가하여 다른 기질들, 이를테면 다른 알콜 및 다른 아실-CoA 티오에스테르를 허용할 것임을 알 것이다. 따라서, 이러한 비-특이적 또는 분기 특이성(divergent 특이적ty) 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드도 포함된다. 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드 서열은 공개적으로 이용가능하다. 대표적인 GenBank 등록 번호가 도 10a 내지 도 10l에 제공된다. 특정 알콜 O-아세틸트랜스퍼라아제 펩티드의 활성을 특징화하기 위한 어세이가 이 기술분야에서 주지되어 있다. 공여체 아실기 또는 수용체 알콜 잔기에 대한 새로운 활성 및 특이성을 갖는 조작된 O-아세틸트랜스퍼라아제 및 O-아실트랜스퍼라아제가 또한 만들어질 수 있다. 조작된 효소는 이 기술분야에서 잘 문서기록되어 있는 합리적인 그리고 진화론적인 접근법을 통해 얻어진다(generated).
F. 아실-CoA에서 지방 에스테르(바이오디젤 및 왁스)로
생산 숙주는 아실-CoA 및 알콜로부터 지방산 에스테르를 생산하기 위해 공지된 펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 일부 예에서, 알콜이 발효 배지 내에 제공되고 그리고 다른 예에서 생산 숙주가 알콜을 본 명세서에 기재된 바와 같이 제공할 수 있다. 당업자는, 구조적으로, 지방산 에스테르는 A 및 B 쪽(side)을 갖는다는 것을 알 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 에스테르의 A 쪽은 알콜에 의해 제공된(contributed) 탄소 사슬을 설명하기 위해 사용되고, 그리고 에스테르의 B 쪽은 아실-CoA에 의해 제공된 탄소 사슬을 설명하기 위해 사용된다. 둘 중 하나의 사슬(Either chain)은 포화 또는 불포화, 분지 또는 비분지될 수 있다. 생산 숙주는 지방 알콜 또는 단쇄 알콜을 생산하도록 조작될 수 있다. 생산 숙주는 특정 아실-CoA 분자를 생산하도록 조작될 수도 있다. 본 명세서에 사용될 때 지방산 에스테르는 지방 아실-티오에스테르 및 알콜로부터 유래된 에스테르이고, 여기서 에스테르의 A 쪽 및 B 쪽은 길이가 독립적으로 변화될 수 있다. 일반적으로, 에스테르의 A 쪽은 길이가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 탄소인 반면, 에스테르의 B 쪽은 길이가 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 탄소이다. A 쪽 및 B 쪽은 직쇄이거나 또는 분지, 포화 또는 불포화될 수 있다.
아실-CoA 및 알콜로부터의 왁스를 포함하는 지방 에스테르의 생산은 공지된 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때 왁스는 장쇄 지방산 에스테르이며, 여기서 에스테르의 A 쪽 및 B 쪽은 길이가 독립적으로 변화될 수 있다. 일반적으로, 에스테르의 A쪽은 길이가 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 탄소이다. 유사하게, 에스테르의 B 쪽은 길이가 적어도 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 탄소이다. A 쪽 및 B 쪽은 일-, 이-, 삼- 불포화될 수 있다. 아실-CoA 및 알콜로부터의 왁스를 포함하는 지방 에스테르의 생산은, 공지된 폴리펩티드를 사용하여 조작될 수 있다. 지방 에스테르의 한가지 제조 방법에는 하나 이상의 왁스 신타아제(EC 2.3.1.75)의 발현을 증가시키거나 또는 이의 보다 활성인 형태를 발현시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용될 때, 왁스 신타아제는 효소 분류 번호 EC 2.3.1.75 의 펩티드와, 아실-티오에스테르의 지방 에스테르로의 전환을 촉매작용할 수 있는 어떤 다른 펩티드를 포함한다. 부가적으로, 당업자는 일부 왁스 신타아제 펩티드가 다른 반응을 마찬가지로 촉매작용 할 것임을, 예를 들어 일부 왁스 신타아제 펩티드는 단쇄 아실-CoAs 및 단쇄 알콜이 지방 에스테르를 생산하도록 허용할 것임을 알 것이다. 따라서, 이러한 비-특이적 왁스 신타아제도 포함된다. 왁스 신타아제 펩티드 서열은 공개적으로 이용가능하다. 대표적인 GenBank 등록 번호는 도 10a 내지 도 10l에 제공된다. 왁스 신타아제 활성을 확인하는 방법은 U.S. 특허 번호 7,118,896에 제공되며, 이는 본 명세서에 참조 병합된다.
특정 예에서, 원하는 생성물이 지방 에스테르(fatty ester) 계 바이오연료라면, 미생물은, 이것이 재생가능한 에너지 소스로부터 생성된 지방 에스테르를 생산하도록 변형된다. 이러한 미생물은 재생가능한 에너지 소스로부터 포화, 불포화, 또는 분지된 지방 에스테르를 합성하는 능력을 상기 미생물 상에 부여하도록 발현되는, 왁스 에스테르 신타아제를 암호화하는 외인성 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 왁스 에스테르 합성 단백질에는 다음이 포함되며 이에 제한되지 않는다: 시몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis), 아시네토박터 종 균주 ADPl (이전에 아시네토박터 칼코아세티쿠스 ADP1(Acinetobacter calcoaceticus ADPl)), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 펀디박터 자덴시스(Fundibacter jadensis), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 또는 알칼리진스 유트로푸스(Alkaligenes eutrophus)로부터의 다중효소 복합체로부터 선택된 지방산 엘론게이즈(elongase), 아실-CoA 리덕타아제, 아실트랜스퍼라아제 또는 왁스 신타아제, 지방 아실 트랜스퍼라아제, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제, 아실-coA 왁스 알콜 아실트랜스퍼라아제, 이작용성 왁스 에스테르 신타아제/아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제. 일실시형태에서, 지방산 엘론게이즈, 아실-CoA 리덕타아제 또는 왁스 신타아제는 알칼리진스 유트로푸스 그리고 왁스 및 지방산 에스테르를 생산하기 위해 문헌에 공지된 다른 유기체로부터의 다중효소 복합체에서 유래한다.
지방 에스테르 생산에 유용한 왁스 합성 단백질을 암호화하는 이종 DNA의 부가적인 소스에는 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(예를 들어 ATCC 32222), 크리토코커스 커바투스(Crytococcus curvatus), (아피오트리쿰 커바툼이라고도 함), 알카니보락스 자덴시스 (예를 들어 T9T =DSM 12718 =ATCC 700854), 아시네토박터 종 HOl-N, (예를 들어 ATCC 14987) 및 로도코커스 오파쿠스 (예를 들어 PD630, DSMZ 44193)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방법은 변화된 길이의 지방 에스테르의 생산을 허용한다. 일례에서, 지방 에스테르 생성물은 24 내지 46 개의 탄소 원자의 탄소 원자 함량을 갖는 포화 또는 불포화된 지방 에스테르 생성물이다. 일실시형태에서, 지방 에스테르 생성물은 24 내지 32 개의 탄소 원자의 탄소 원자 함량을 갖는다. 또다른 실시형태에서, 지방 에스테르 생성물은 14 내지 20개의 탄소의 탄소 함량을 갖는다. 또다른 실시형태에서, 지방 에스테르는 C18:1의 메틸 에스테르이다. 또다른 실시형태에서, 지방산 에스테르는 C 16:1의 에틸 에스테르이다. 또다른 실시형태에서, 지방 에스테르는 C 16:1의 메틸 에스테르이다. 또다른 실시형태에서, 지방산 에스테르는 옥탄올의 옥타데실 에스테르이다.
지방 에스테르의 생산에 유용한 숙주는 진핵 또는 원핵 미생물이 될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 숙주에는 사카로마이세즈 세레비지에, 칸디다 리폴리티카, E. 콜라이 아트로박터 AK 19, 로도토룰라 글루티닌, 아시노박터 종 균주 M-1, 칸디다 리폴리티카 및 다른 유질 미생물이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일례에서, 유전자좌(locus) AAO17391의 아시네토박터 종 ADPl으로부터의 왁스 에스테르 신타아제(본 명세서에 참조 병합된 Kalscheuer and Steinbuchel, J. Biol. Chem. 278:8075-8082, 2003에 기재됨)가 사용된다. 또다른 예에서, 유전자좌 AAD38041의, 시몬드시아 키넨시스(Simmondsia chinensis)로부터의 왁스 에스테르 신타아제가 사용된다.
선택적으로, FATP 패밀리의 한 멤버와 같은 왁스 에스테르 익스포터(exporter)가 왁스 또는 에스테르의 세포외 환경으로의 배출을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 왁스 에스테르 익스포터의 일례는 지방산 (장쇄) 수송 단백질 CG7400-PA, 유전자좌 NP_524723의 드로소필리아 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)로부터의 이소형 A(isoform A)이다.
G. 아실-ACP, 아실-CoA에서 탄화수소로
다양한 미생물이 알칸, 올레핀 및 이소프레노이드와 같은 탄화수소를 생산하는 것으로 알려져 있다. 많은 이러한 탄화수소들은 지방산 생합성에서 유래한다. 이러한 탄화수소의 생산은 본래 숙주(native host) 내 지방산 생합성과 관련있는 유전자를 조절함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 조류 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 의 탄화수소 생합성은 지방 알데하이드의 카르보닐 이탈반응(decarbonylation)을 통해 일어난다. 지방 알데하이드는 지방 아실-CoA 리덕타아제에 의한 지방 아실-티오에스테르의 환원에 의해 생산된다. 따라서, 최종 알칸의 구조는 티오에스테라아제와 같은 특정 유전자를 발현하도록 B. 브라우니를 조작함으로써 조절될 수 있으며, 이는 알칸 생합성에 보내지는(channeled) 지방산의 사슬 길이를 조절한다. B. 브라우니에서 분지된 사슬 지방산 생합성이 일어나게 되는 효소를 발현시키면, 분지된 사슬 알칸이 생산될 것이다. 지방산의 탈포화물(desaturation)의 생산에 영향을 주는 유전자의 도입으로 올레핀이 생산될 것이다. 이러한 유전자들을 추가 조합하면 생산된 탄화수소의 최종 구조 상에 추가 조절을 제공할 수 있다. 고도 수준의 본래의 또는 조작된 탄화수소를 생산하기 위해, 지방산 및 이들의 전구체의 생합성 또는 다른 생성물로의 분해(degradation)와 관련된 유전자가 발현, 과발현 또는 약화될 수 있다. 이러한 접근법들의 각각은 비브리오 퍼니시 M1(Vibrio furnissi Ml) 및 이의 기능적 상동체(homologue) 내에서의 알칸의 생산에 적용될 수 있으며, 이는 지방 알콜의 환원을 통해 알칸을 생산한다(지방 알콜 생산의 조작 및 생합성에 대해 상기 참조). 각각의 이러한 접근법은 또한 마이크로코커스 류테우스(Micrococcus leuteus), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia), 제오갈리코커스 종(Jeogalicoccus sp.)(ATCC8456), 및 관련된 미생물의 많은 균주들에 의해 생산된 올레핀의 생산에 적용될 수도 있다. 이러한 미생물은 지방산 전구체의 헤드로부터 헤드까지의 축합으로부터 유래된 장쇄 내부 올레핀을 생산한다. 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 지방산 전구체의 구조 및 수준을 조절하면, 상이한 사슬 길이, 분지화, 및 포화 수준의 올레핀이 형성될 것이다.
탄화수소가 일차 알콜의 환원을 위해 진화된(evolved) 옥시도/리덕타아제를 사용하여 생산될 수도 있다. 일차 지방 알콜은 비브리오 퍼니시 M1과 같은 미생물에서 알칸을 생산하기 위해 사용되는 것으로 알려져 있다(Myong-Ok, J. Bacteriol., 187: 1426-1429, 2005). NAD(P)H 의존성 옥시도/리덕타아제는 책임을 다할 수 있는(responsible) 촉매이다. 합성 NAD(P)H 의존성 옥시도리덕타아제는 진화 조작(evolutionary engineering)의 사용을 통해 생산될 수 있고 그리고 지방산 유도체를 생산하기 위해 생산 숙주에서 발현될 수 있다. 당업자는 원하는 활성을 갖도록 지방 알콜 리덕타아제를 "진화시키는(evolving)" 과정이 주지되어 있다는 것을 알 것이다(Kolkman and Stemmer Nat Biotechnol. 19:423-8, 2001, Ness et al. , Adv Protein Chem. 55:261-92, 2000, Minshull and Stemmer Curr Opin Chem Biol. 3:284-90, 1999, Huisman and Gray Curr Opin Biotechnol. Aug;13:352-8, 2002, 그리고 U.S. 특허 출원 2006/0195947 참조). NAD(P)H 의존성 옥시도리덕타아제의 라이브러리가, 에러 유발 PCR(error prone PCR), 부위-특이적 무작위 돌연변이유발(mutagenesis), 부위 특이적 포화 돌연변이유발, 또는 부위 지시된(directed) 특이적 돌연변이유발과 같은 표준 방법에 의해 얻어진다(generated). 부가적으로, 라이브러리는 자연적으로 발생하는 NAD(P)H 의존성 옥시도리덕타아제 암호화 서열의 "셔플링(shuffling)"을 통해 만들어질 수 있다. 라이브러리는 E. 콜라이과 같은 적합한 숙주에서 발현된다. 이어서, 옥시도/리덕타아제 라이브러리의 상이한 멤버를 발현하는 개별 콜로니들이 지방 알콜의 환원을 촉매작용할 수 있는 옥시도/리덕타아제의 이의 발현을 위해 분석된다. 예를 들어, 각각의 세포는 전체 세포 바이오전환물(bioconversion), 세포 추출물, 투과화된(permeabilized) 세포, 또는 정제된 효소로서 어세이될 수 있다. 지방 알콜 리덕타아제는 NAD(P)H의 지방 알콜 의존성 산화를 분광광도법으로(spectrophotometrically) 또는 형광측정으로(fluorometrically) 모니터링함으로써 확인된다. 알칸의 생산은 GC/MS, TLC, 또는 다른 방법에 의해 모니터링된다. 이런 방식으로 확인된 옥시도/리덕타아제는 알칸, 알켄 및 관련된 분지화된 탄화수소를 생산하기 위해 사용된다. 이는 생체 외에서(in vitro) 또는 생체 내에서(in vivo) 달성된다. 후자는 본 명세서에 기재된 것과 같은, 지방 알콜을 생산하는 유기체 내에서 진화된 지방 알콜 리덕타아제 유전자를 발현함으로써 달성된다. 지방 알콜은 알칸을 생산하는 알콜 리덕타아제에 대한 기질로서 작용한다. 다른 옥시도리덕타아제가, 분자 수소, 글루타티온(glutathione), FADH, 또는 다른 환원 조효소를 사용하는 것과 같이, 이 반응을 촉매작용하기 위해 조작될 수도 있다.
II. 지방산 유도체 생산을 증가시키기 위한 생산 균주의 유전자 조작
지방산 유도체의 생산을 위한 생합성 경로에 관련된 이종 DNA 서열이 이 기술분야에서 주지된 기술, 예를 들어 전기영동, 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션(dextran mediated transfection), 리포좀-매개 트랜스펙션(liposome-mediated transfection), 접합, 형질도입(transduction) 등을 사용하여 숙주 세포로 안정적으로(stably) 또는 일시적으로(transiently) 도입될 수 있다. 안정한 형질전환을 위하여, DNA 서열은 또한 선택가능한 마커, 이를테면 항생 내성(antibiotic resistance), 예를 들어 영양요형성 결핍(auxotrophic deficiency)을 보완하는(complement) 네오마이신(neomycin), 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin)에 대한 내성 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시형태는, 물질대사 또는 생합성 경로와 관련 있는 단백질을 암호화하는 이종 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한다. 적합한 발현 벡터에는 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터와 같은 바이러스성 벡터, 박테리오파지 벡터와 같은 파지 벡터, 플라스미드, 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 포스미드(fosmid), 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome), 바이러스성 벡터(예를 들어, 바시니아(vaccinia) 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV40, 단순 포진(herpes simplex) 바이러스 등에 기초한 바이러스성 벡터), P1-계 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 (E. 콜라이, 슈도모나스 피슘(Pseudomonas pisum) 및 사카로마이세즈 세레비지에와 같은) 관심 대상의 특정 숙주에 대해 특이적인 어떤 다른 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
유용한 발현 벡터에는 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성(phenotypic trait)을 제공하기 위해 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자가 포함될 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 선택적인 배양 배지 내에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 선택가능한 마커 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지 내에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요형성 결핍(auxotrophic deficiencies)을 보충하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요 영양소(critical nutrient)를 공급하는 단백질을 암호화하며, 예를 들어 바실러스(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마아제(D-alanine racemase)를 암호화하는 유전자이다. 대안적 실시형태에서, 선택가능한 마커 유전자는 (진핵 세포 배양에 사용하기 위해) 네오마이신 내성을 부여하거나 또는 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 리덕타아제를 암호화하는 것, 또는 (E. 콜라이과 같은 원핵 숙주 세포에 사용하기 위해) 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 부여하는 것이다.
발현 벡터 내 생합성 경로 유전자 생성물-암호화 DNA 서열이, 암호화된 유전자 생성물의 합성을 지시하기 위해 적당한 발현 조절 서열, (프로모터, 인핸서, 등)에 작동가능하게 연결된다. 이러한 프로모터는 CMV 및 SV40을 포함하는, 미생물(microbial) 또는 바이러스 소스에서 유래될 수 있다. 사용된 숙주/벡터 시스템에 따라, 구조성 및 유도성(inducible) 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결인자(transcription terminators) 등을 포함하는, 다수의 적합한 전사 및 번역 조절 요소의 어떤 것이 발현 벡터 내에 사용될 수 있다(예를 들어, Bitter et al, Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987 참조).
원핵 숙주 세포에 사용하기 위한 적합한 프로모터는, T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라아제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PB 및 PL 프로모터, E. 콜라이의 trp, recA, 열 충격(heat shock), 및 lacZ 프로모터, B.서브틸리스(B. subtilis)의 알파-아밀라아제 및 시그마-특이적 프로모터, 바실러스(Bacillus)의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 베타-락타마아제 유전자의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제 유전자의 CAT 프로모터를 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 원핵 프로모터는 상기 문헌(Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987; Watson et al, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987); 및 Sambrook 등)에서 검토된다.
진핵 숙주에 사용하기 적합한 진핵 프로모터의 비-제한적 예는 기원이 바이러스성이고, 그리고 마우스 메탈로티오네인 I 유전자(mouse metallothionein I gene)의 프로모터(Hamer et al. , J. Mol. Appl. Gen. 1 :273, 1982); 허피스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31 :355, 1982); SV40 초기 프로모터(Benoist et al, Nature (London) 290:304, 1981); 로우스 사르코마(Rous sarcoma) 바이러스 프로모터; 시토메갈로바이러스 프로모터 (Foecking et al, Gene 45:101, 1980); 효모 gal4 유전자 프로모터 (Johnston, et al, PNAS (USA) 79:6971, 1982; Silver, et al. , PNAS (USA) 81 :5951, 1984); 및 IgG 프로모터 (Orlandi et al., PNAS (USA) 86:3833, 1989)를 포함한다.
미생물 숙주 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 생합성 경로 유전자 생성물을 암호화하는 이종 DNA 서열로 유전적으로 변형될 수 있다. 유도성 프로모터는 이 기술분야에서 주지되어 있다. 적합한 유도성 프로모터에는 단백질, 대사산물, 또는 화학제(chemical)에 의해 영향 받는 프로모터를 포함하되, 이에 제한되지 않는다. 이는 다음을 포함한다: 소 백혈병 바이러스 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 테트라사이클린-유도성 CMV 프로모터(이를테면, 인간 즉시-초기 CMV 프로모터(human immediate-early CMV promoter))와 trp 및 lac 오페론으로부터의 것들.
일부 예에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포는 구조성 프로모터에 작동가능하게 연결된 생합성 경로 유전자 생성물을 암호화하는 이종 DNA 서열로 유전적으로 변형된다. 적합한 구조성 프로모터가 이 기술분야에서 공지되어 있고, 그리고 구조성 아데노바이러스 주 후기 프로모터(constitutive adenovirus major late promoter), 구조성 MPSV 프로모터, 및 구조성 CMV 프로모터를 포함한다.
일부 예에서, 변형된 숙주 세포는 생합성 경로와 관련 있는 단일 단백질을 암호화하는 외인성 DNA 서열로 유전적으로 변형된 것이다. 다른 실시형태에서, 변형된 숙주 세포는 생합성 경로와 관련 있는 둘 이상의 단백질-- 예를 들어, 생합성 경로의 제 1 및 제 2 효소를 암호화하는 외인성 DNA 서열로 유전적으로 변형된 것이다.
숙주 세포가 생합성 경로와 관련 있는 둘 이상의 단백질을 발현하도록 유전적으로 변형되는 경우, 이러한 DNA 서열은 각각 단일 또는 개별 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 DNA 서열이 단일 발현 벡터 내에 포함될 때, 뉴클레오타이드 서열은 공동 조절 요소(common control element)(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 것이다. 예를 들어, 공동 조절 요소는 단일 발현 벡터 내에서 생합성 경로 단백질-암호화 DNA 서열의 모두의 발현을 조절한다.
변형된 숙주 세포는 생합성 경로와 관련 있는 둘 이상의 단백질을 암호화하는 이종 DNA 서열로 유전적으로 변형될 때, DNA 서열 중 하나가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 하나 이상의 DNA 서열이 구조성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생합성 경로 중간체의 세포내 농도(예를 들어, 유전적으로 변형된 숙주 세포 내 중간체의 농도)는 최종 생성물의 수율을 더 증가시키기 위해 증가될 수 있다. 중간체의 세포내 농도는, 생합성 경로에 대한 기질의 배양 배지 내 농도를 증가시키고; 생합성 경로에서 활성인 효소의 촉매 활성을 증가시키고; 생합성 경로에서 활성인 효소에 대한 기질(예를 들어, 일차 기질)의 세포내 양을 증가시키는 등을 포함하되 이에 제한되지 않는 다수의 방식으로 증가될 수 있다.
일부 예에서, 지방산 유도체 또는 중간체는 세포의 세포질 내에서 생산된다. 세포질 농도는 아실-CoA 티오에스테르를 형성하기 위한 지방산의 조효소 A에 대한 결합을 포함하되, 이에 제한되지 않는 다수의 방식으로 증가될 수 있다. 부가적으로, 아실-CoA의 농도는, 판토테네이트(pantothenate) 생합성과 관련있는 유전자(panD)를 과잉-발현시키거나 또는 글루타티온 생합성과 관련있는 유전자(글루타티온 신타아제)를 노킹 아웃(knocking out) 시킴으로써와 같이, 세포 내 CoA의 생합성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
III. 탄소 사슬 특성(characteristics)
본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여, 광범위한 생성물이 생산될 수 있다. 이러한 생성물에는 탄화수소, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 및 왁스가 포함된다. 이러한 생성물 중 일부는 바이오연료 및 특수 화학제로서 사용된다. 이러한 생성물은 미생물 내에서 디자인 및 생산될 수 있다. 생성물은, 이들이 분지점(branch point), 포화의 수준, 및 탄소 사슬 길이를 포함하고, 이에 따라 이러한 생성물을 많은 적용예에서 사용하기에 바람직한 출발 물질로 만들도록 생산될 수 있다(도 10a 내지 도 10l는 다양한 지방산 유도체를 만들기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 다양한 효소들의 상세한설명을 제공한다).
다른 예에서, 상이한 종들 또는 조작된 변형체들(engineered variants)에서 유래하는 외인성 FAS 유전자의 발현이 숙주 세포 내에 도입되어, 본래의 숙주의 것과 (길이, 분지화, 불포화도 등에서) 구조적으로 상이한 지방산 대사산물이 생합성될 수 있다. 이러한 이종 유전자 생성물은 또한, 이들이 숙주 세포 내에서 자연 복합 조절 메커니즘(natural complex regulatory mechanism)에 의해 영향받지 않도록, 그리고 따라서 바람직한 시판 생성물의 생산을 위해 보다 조절가능한 방식으로 작용하도록 선택되거나 또는 조작될 수 있다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세즈 세레비지에, 스트렙토마이세즈 spp(Streptomyces spp), 랄스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 코리네박테리아(Corynebacteria), 브레비박테리아(Brevibacteria), 미코박테리아(Mycobacteria), 유질 효모 등으로부터의 FAS 효소가 생산 숙주 내에서 발현될 수 있다.
당업자는, 생산 숙주가 특정 수준의 불포화, 분지화, 또는 탄소 사슬 길이를 포함하는 지방산 생합성 경로로부터의 지방산을 생산하도록 조작될 때, 얻어지는 조작된 지방산이 지방산 유도체의 생산에 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 생산 숙주로부터 생성된 지방산 유도체는 조작된 지방산의 특징을 보일 수 있다. 예를 들어, 생산 숙주는 분지된, 단쇄 지방산을 만들기 위해 조작될 수 있고, 그리고 이어서 지방 알콜 생산과 관련하여 본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여(즉 FAR과 같은 알콜 형성 효소를 포함), 생산 숙주는 분지된, 단쇄 지방 알콜을 생산한다. 유사하게, 탄화수소는 정의된 수준의 분지화, 불포화, 및/또는 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산을 생산하도록 생산 숙주를 조작함으로써 생산될 수 있고, 따라서 균질 탄화수소 집단이 생산된다. 또한, 불포화된 알콜, 지방산 에스테르, 또는 탄화수소가 요구될 때, 지방산 생합성 경로는 낮은 수준의 포화된 지방산을 생산하도록 조작될 수 있고 그리고 부가적인 디세추라아제(desaturase)가 포화된 생산물 생산을 감소시키기 위해 발현될 수 있다.
A. 포화
생산 숙주는, fabB를 과-발현시키기 위해 생산 숙주를 조작함으로써, 또는 저온(예를 들어, 37 ℃ 미만)에서 생산 숙주를 성장시킴으로써, 불포화 지방산을 생산하도록 조작될 수 있다. FabB는 시스-δ3 데세노일-ACP(cis-δ3 decenoyl-ACP)에 대한 선호도(preference)를 가지고 그리고 E. 콜라이에서 불포화 지방산 생산이 이루어진다. FabB의 과-발현으로 상당한 백분율의 불포화 지방산의 생산이 이루어진다(de Mendoza et al, J. Biol. Chem., 258:2098-101, 1983). 이어서, 이러한 불포화된 지방산이 지방 알콜, 에스테르, 왁스, 올레핀, 알칸 등과 같은 지방산 유도체를 생산하기 위해 조작되는 생산 숙주에서 중간체로서 사용될 수 있다. 당업자는, fabA를 약화시키거나, 또는 FabB 를 과-발현시키고 그리고 특정 티오에스테라아제(이하 기재됨)를 발현시킴으로써, 원하는 탄소 사슬 길이를 갖는 불포화 지방산 유도체가 생산될 수 있다는 것을 알 것이다. 대안적으로, 지방산 생합성의 억압인자(repressor), FabR (Genbank accession NP 418398)가 결실될 수 있고, 이를 통해 E. 콜라이에서 불포화된 지방산 생산이 증가될 수도 있을 것이다(Zhang et al. , J. Biol. Chem. 277:pp. 15558, 2002.). 불포화 지방산의 추가적 증가는 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae)로부터의 FabK (트랜스-2-에노일-ACP 리덕타아제 II, Genbank accession N P_357969)의 조절된 발현 및 FabM (트랜스-2, 시스-3-데세노일-ACP 아이소머라아제, Genbank accession DAA05501)의 과발현에 의해(Marrakchi et al, J. Biol. Chem. 277: 44809, 2002), 반면 E. 콜라이 Fab I(트랜스-2-에노일-ACP 리덕타아제, Genbank accession NP_415804)를 결실하면서, 달성될 수 있다. 부가적으로, 불포화 지방산 에스테르의 백분율을 증가시키기 위해, 미생물이 fabB (β-케토아실-ACP 신타아제 I을 암호화, Accessions: BAA16180, EC:2.3.1.41), Sfa (fabA의 억제인자(suppressor)를 암호화, Accession: AAC44390), 그리고 gnsA 및 gnsB (모두 secG 결손 돌연변이 억제인자(secG null mutant suppressor), a.k.a. 냉 충격(cold shock) 단백질을 암호화, Accession: ABD18647.1, AAC74076.1)를 과발현하게 할 수 있다.
일부 예에서, 내인성 fabF 유전자가 약화될 수 있으며, 따라서 생산된 팔미톨리에이트(palmitoleate)(C 16:1)의 백분율이 증가될 수 있다.
B. 사이클릭 잔기(cyclic moiety)를 포함하는 분지화
본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여, 분지점, 사이클릭 잔기, 및 이의 조합을 포함하는 지방산 유도체가 생산될 수 있다.
본래 직쇄(straight) 지방산(sFAs)을 생산하는 미생물이, 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현시킴으로써 분지쇄(branched chain) 지방산(brFAs) 을 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이는 본래 직쇄 지방산(sFAs)을 생산한다. brFAs를 생산하고자 E. 콜라이를 조작하기 위해, 분지된 전구체(bkd 오페론)를 제공하고 그리고 분지된 전구체(fabH)로부터의 지방산 생합성의 개시를 허용하는 수개의 유전자가 도입되고 그리고 발현될 수 있다. 부가적으로, 유기체는 brFAs의 신장(elongation)(예를 들어, ACP, FabF) 및/또는 일반적으로 sFAs에 이르게 하고 그리고 도입된 유전자(예를 들어, FabH, FabF)와 경쟁하는, 대응하는 E. 콜라이 유전자의 결실을 위한 유전자를 발현시킬 수 있다.
분지된 아실-CoAs 2-메틸-부튜릴-CoA(acyl-CoAs 2-methyl-buturyl-CoA), 이소발레릴-CoA(isovaleryl-CoA) 및 이소부튜릴-CoA(isobuturyl-CoA)는 brFA의 전구체이다. 대부분의 brFA-함유 미생물에서, 이들은 분지된 아미노산(이소류신, 류신 및 발린)으로부터 두 단계(이하에서 상세히 기재됨)로 합성된다(Kadena, Microbiol. Rev. 55: pp. 288, 1991). brFAs를 생산하거나, 또는 brFAs를 과잉생산하도록 미생물을 조작하기 위해, 하나 이상의 효소들의 이러한 두 단계로의 발현 또는 과-발현이 조작될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 생산 숙주는 한 단계를 수행할 수 있는 내인성 효소를 가질수 있고 그리고 따라서, 제 2 단계와 관련 있는 효소만이 재조합적으로 발현될 필요가 있다.
분지된 지방산 형성에서의 제 1 단계는 분지-쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제에 의한, 대응하는 α-케토산의 생산이다. E. 콜라이는 이러한 효소, IlvE (EC 2.6.1.42; Genbank accession YP_026247)를 갖는다. 일부 예에서, 이종 분지-쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제가 발현되지 않을 수 있다. 그러나, 아미노트랜스퍼라아제 반응이 지방산 유도체 생산을 위해 선택된 숙주 미생물에서의 brFA 생합성에서 속도 제한성(rate limiting)인 것으로 판명된다면, E. 콜라이 IlvE 또는 어떤 다른 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라아제, 예를 들어 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 ilvE (Genbank accession AAF34406), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터의 ilvE (Genbank accession NP_745648) 또는 스트렙토마이세스 코엘리칼라(Streptomyces coelicolor)로부터의 ilvE(Genbank accession NP_629657)가 숙주 미생물에서 과-발현될 수 있다.
제 2 단계, α-케토산의 대응하는 분지-쇄 아실-CoA로의 산화적 탈카르복실화는 분지-쇄 α-케토산 데하이드로게나아제 복합체(bkd; EC 1.2.4.4.)에 의해 촉매작용되고(Denoya et al. J. Bacteriol 177:pp. 3504, 1995), 이는 Elα/β (데카르복실라아제), E2 (디하이드로리포일 트랜스아실라아제(dihydrolipoyl transacylase)) 및 E3 (디하이드로리포일 데하이드로게나아제) 서브유닛으로 구성되고 그리고 피루베이트 및 α-케토글루타레이트 데하이드로게나아제 복합체와 유사하다. 표 2는 몇가지 미생물로부터의 잠재적인(potential) bkd 유전자를 나타내며, 이는 분지-쇄 아실-CoA 전구체를 제공하기 위해 생산 숙주 내에서 발현될 수 있다. 기본적으로, brFAs를 가지고 및/또는 분지쇄 아미노산 상에서 성장하는 모든 미생물이, 예를 들어 E. 콜라이와 같은 생산 숙주에서의 발현을 위해 bkd 유전자를 분리하기 위한 소스로서 사용될 수 있다. 또한, E. 콜라이는 E3 성분 (이의 피루베이트 데하이드로게나아제 복합체의 일부로서; lpd, EC 1.8.1.4, Genbank accession NP_414658)을 가지고, 따라서 이는 단지 El α/β 및 E2 bkd 유전자를 발현시키기에 충분할 수 있다.
Figure 112008082616218-PCT00002
다른 예에서, 이소부튜릴-CoA는 크로토닐-CoA 리덕타아제(crotonyl-CoA reductase) (Ccr, EC 1.1.1.9) 및 이소부튜릴-CoA 뮤타아제(isobuturyl-CoA mutase) (큰 서브유닛 IcmA, EC 5.4.99.2; 작은 서브유닛 IcmB, EC 5.4.99.13) 의 동시발현을 통해 생산 숙주, 예를 들어 E. 콜라이에서 만들어질 수 있다(Han and Reynolds J. Bacteriol 179:pp. 5157, 1997). 크로토닐-CoA는 E. 콜라이 및 다른 미생물에서 지방산 생합성의 중간체이다. 선택된 미생물부터의 ccr 및 icm 유전자에 대한 예가 표 3에 주어진다.
Figure 112008082616218-PCT00003
bkd 유전자(상기 참조)의 발현에 추가로, brFA 생합성의 개시는 분지쇄 아실 CoAs에 대한 특이성을 갖는 β-케토아실-아실-캐리어-단백질 신타아제 III (FabH, EC 2.3.1.41)을 이용한다(Li et al. J. Bacteriol. 187:pp. 3795, 2005). 이러한 FabHs의 예는 표 4에 나타낸다. 어떤 brFA-함유 미생물의 지방산 생합성과 관련 있는 FabH 유전자가 생산 숙주 내에서 발현될 수 있다. 본래 brFA를 만들지 않는 생산 숙주로부터의 Bkd 및 FabH 효소는 brFA 생산을 지지하지 않을 수 있고 그리고 따라서 Bkd 및 FabH는 재조합적으로 발현될 수 있다. 유사하게, Bkd 및 FabH 생산의 내인성 수준은 brFA를 생산하기에 충분하지 않을 수 있고, 따라서 이들은 과-발현될 수 있다. 부가적으로, 지방산 생합성기(fatty acid biosynthesis machinery)의 다른 성분은 아실 캐리어 단백질 (ACPs)과 같이 발현될 수 있고, 그리고 β-케토아실-아실-캐리어-단백질 신타아제 II 후보(candidate)는 아실 캐리어 단백질 (ACPs) 및 β-케토아실-아실-캐리어-단백질 신타아제 II (fabF, EC 2.3.1.41)이다(후보는 표 4에 나타낸다). 이러한 유전자들을 발현시키는 것에 추가로, 내인성 지방산 생합성 경로에서의 일부 유전자가 생산 숙주 내에서 약화될 수 있다. 예를 들어, E. 콜라이에서 brFA 생합성을 가장 방해할 것 같은 후보는 fabH (Genbank accession # NP_415609) 및/또는 fabF 유전자 (Genbank accession # NP_415613)이다.
상기된 바와 같이, brFA 합성 및 알콜 합성을 지지하는 발현 유전자의 조합을 통해, 분지쇄 알콜이 생산될 수 있다. 예를 들어, 아시네토박터 배일리 ADP1(Acinetobacter baylyi ADP1)로부터의 Acr1과 같은 알콜 리덕타제가 bkd 오페론과 함께 동시발현될 때, E. 콜라이는 이소펜탄올, 이소부탄올 또는 2-메틸 부탄올을 합성할 수 있다. 유사하게, Acr1이 ccr/icm 유전자와 동시-발현될 때, E. 콜라이는 이소부탄올을 합성할 수 있다.
E. 콜라이와 같은 생산 숙주를 ω-사이클릭 지방산(cyFAs)을 합성할 수 있는 유기체로 전환시키기 위해, 사이클릭 전구체 사이클로헥실카르보닐-CoA를 제공하는 몇가지 유전자가 도입 및 발현될 필요가 있다(Cropp et al. Nature Biotech. 18:pp. 980, 2000). 이어서, 표 4에 나타낸 유전자(fabH, ACP 및 fabF)가 ω-사이클릭 지방산의 개시 및 신장을 허용하도록 발현될 수 있다. 대안적으로, 동종 유전자가 cyFAs를 만드는 미생물로부터 분리되고 그리고 E. 콜라이에서 발현될 수 있다.
Figure 112008082616218-PCT00004
다음 유전자의 발현은 E. 콜라이 내에서 사이클로헥실카르보닐-CoA를 제공하기에 충분하다: S. 콜리누스(S. collinus), S. 아베르미틸리스(S. avermitilis) 또는 S. 코엘리칼라(S. coelicolor)로부터의 chcB 유전자(Patton et al. Biochem., 39:pp. 7595, 2000)와 함께 스트렙토마이세즈 콜리누스(Streptomyces collinus)의 안사트리에닌 유전자 클러스터(ansatrienin gene cluster)로부터의 ansJ, ansK, ansL, chcA 및 ansM (Chen et al., Eur. J. Biochem. 261 :pp. 1999, 1999) 또는 스트렙토마이세즈 종 HK803의 포슬락토마이신 B(phoslactomycin B) 유전자 클러스터로부터의 plmJ, plmK, plmL, chcA 및 plmM (Palaniappan et al., J. Biol. Chem. 278:pp. 35552, 2003)(Genbank 등록 번호에 대해서는 표 5 참조).
Figure 112008082616218-PCT00005
chcA 만이 Genbank entry U72144 에서 주석이 달려있고(annotated), ansJKLM은 문헌에 따름(Chen et al.)(Eur. J. Biochem. 261: pp. 1999, 1999)
표 4에 기재된 유전자(fabH, ACP 및 fabF)는 ω-사이클릭 지방산의 개시 및 신장을 허용하기에 충분한데, 이들이 넓은 기질 특이성을 가질 수 있기 때문이다. 어떤 이러한 유전자를 표 5로부터의 ansJKLM/chcAB 또는 pmlJKLM/chcAB 유전자와 함께 공동발현시켜 cyFAs가 얻어지지 않는 경우, cyFAs를 만드는 미생물로부터의 fabH, ACP 및/또는 fabF 동족체는 분리되고(예를 들어, 퇴행성(degenerate) PCR 프라이머 또는 이종 DNA 프로브를 사용함으로써), 그리고 동시발현될 수 있다. 표 6은 ω-사이클릭 지방산을 포함하는 선택된 미생물을 나타낸다.
Figure 112008082616218-PCT00006
*cyFA 생합성을 위한 전구체로서 사이클로헥실카르보닐-CoA가 아닌 사이클로헵틸카르보닐-CoA를 사용한다.
C. 에스테르 특성
당업자는, 에스테르가 A 쪽 및 B 쪽을 포함한다는 것을 알 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, B 쪽은 숙주 유기체 내에서의 새로운(de novo) 합성으로부터 생산된 지방산이 기여한다(contributed). 숙주가 부가적으로 지방 알콜을 포함하는 알콜을 만들기 위해 조작되는 일부 경우, A 쪽은 숙주 유기체에 의해 또한 생산된다. 또다른 예에서, A 쪽은 배지 내에 제공될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 원하는 티오에스테라아제 유전자를 선택함에 의해 B 쪽, 그리고 지방 알콜이 만들어지는 경우에 A 쪽은, 특정한 탄소 사슬 특성을 갖도록 디자인될 수 있다. 이러한 특성은 불포화점, 분지화, 및 원하는 탄소 사슬 길이를 포함한다. 장쇄 지방산 에스테르를 제조하는 대표적인 방법은, 여기서 A 및 B 쪽은 생산 숙주에 의해 생산됨, 이하, 실시예 6에서 제공된다. 유사하게, 실시예 5는 중간 사슬 지방산 에스테르의 제조 방법을 제공한다. A 및 B 쪽 모두가 생산 숙주에 의해 기여받고 그리고 이들이 지방산 생합성 경로 중간체를 사용하여 생산될 때, 이들은 유사한 탄소 사슬 특성을 가질 것이다. 예를 들어, 생산된 지방산 에스테르의 적어도 50%, 60%, 70%, 또는 80%가, 길이가 6, 4, 또는 2 탄소에 의해 변화되는 A 쪽 및 B 쪽을 가질 것이다. A 쪽 및 B 쪽은 또한 유사한 분지화 및 포화 수준을 보일 것이다.
A 쪽에 기여하기 위한 지방 알콜을 생산하는 것에 추가로, 숙주는 이 기술분야에서 주지된 기술을 사용하여 A 쪽 상에 포함시키기 위한 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 이소부탄올, 및 부탄올과 같은 다른 단쇄 알콜을 생산할 수 있다. 예를 들어, 부탄올은 숙주 유기체에 의해 만들어질 수 있다. 부탄올 생산 세포를 만들기 위해, LS 9001 균주 (이하, 실시예 1에 기재됨)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12로부터의 atoB (아세틸-CoA 아세틸트랜스퍼라아제), 부티리비브리오 피브리솔벤(Butyrivibrio fibrisolven)으로부터의 β-하이드록시부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 클로스트리듐 베이제린키(Clostridium beijerinckii)로부터의 크로토나아제, 클로스트리듐 베이제린키로부터의 부티릴 CoA 데하이드로게나아제, 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)으로부터의 CoA-아실화 알데히드 데하이드로게나아제(ALDH), 및 prpBCDE 프로모터 시스템 하에 pBAD24 발현 벡터 내에서 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)의 알데히드-알콜 데하이드로게나아제를 암호화하는 adhE를 발현하도록 더 조작될 수 있다. 유사하게, 에탄올이 본 명세서에 참조병합된 문헌(Kalscheuer et al, Microbiology 152:2529-2536, 2006)에 교시된 방법을 사용하여 생산 숙주 내에서 생산될 수 있다.
IV. 발효
지방산 유도체의 생산 및 분리는 특정 발효 기술을 사용함으로써 향상될 수 있다. 비용을 감소시키면서 생산을 최대화하는 한 방법은 탄화수소 생산물로 전환되는 탄소 공급원의 백분율을 증가시키는 것이다. 정상적인 세포 라이프사이클동안, 탄소는 지질, 당류, 단백질, 유기산, 및 핵산을 생산하는 것을 포함하는 세포 작용에 사용된다. 성장-관련 활성에 필요한 탄소의 양을 감소시키면 생성물로의 탄소 소스 전환의 효율을 증가시킬 수 있다. 이는, 먼저 미생물을 성장의 log 상(phase)의 피크에서 달성된 밀도와 같은 원하는 밀도로 성장시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 시점에서, 복제 체크포인트(checkpoint) 유전자가 세포의 성장을 멈추기 위해 이용될 수 있다(harnessed). 구체적으로, 쿼럼 센싱 메커니즘(quorum sensing mechanisms)(Camilli and Bassler Science 311:1113, 2006; Venturi FEMS Microbio Rev 30:274-291, 2006; 및 Reading and Sperandio FEMS Microbiol Lett 254:1-11, 2006에서 검토)이 p53, p21와 같은 유전자, 또는 다른 체크포인트 유전자를 활성화하기 위해 사용될 수 있다. E. 콜라이에서 세포 복제 및 성장을 중단하기 위해 활성화될 수 있는 유전자에는 umuDC 유전자가 포함되며, 이의 과-발현은 정지상(stationary phase)으로부터 급격한 성장((exponential growth))으로의 과정을 멈춘다(Murli et al, J. of Bact. 182:1127, 2000). UmuC는 비-코딩 병소(lesion) 상에 트랜스리전(translesion) 합성을 실시할 수 있는 DNA 폴리머라아제이다 - 대부분의 UV 및 화학적 돌연변이유발(mutagenesis)의 역학적 기초(mechanistic basis). umuDC 유전자 생성물은 트랜스리전 합성의 과정에 사용되고 그리고 또한 DNA 손상 체크포인트로서 작용한다. UmuDC 유전자 생성물은 UmuC, UmuD, umuD', UmuD'2C, UmuD'2 및 UmuD2를 포함한다. 동시에, 생성물 생산 유전자는 활성화될 것이고, 따라서 지방산 유도체가 만들어지고 있는 동안에 사용될 복제 및 유지 경로에 대한 필요성이 최소화된다.
탄화수소 생성물로 전환되는 투입 탄소의 백분율은 비용 동인(cost driver)이다. 보다 효율적일수록(즉, 백분율이 보다 고도일수록), 공정은 보다 낮은 비용이다. 산소-함유 탄소 소스(즉, 글루코오스 및 다른 탄수화물계 소스)에 대하여, 산소는 이산화탄소의 형태로 배출되어야 한다. 배출된 모든 2 산소 원자들에 대해, 탄소 원자가 또한 (지방산 유도된 생성물에 대해) ~34 %(w/w)의 최대 이론적 물질대사 효율에 이르면서 배출된다. 그러나, 이 수치는 다른 탄화수소 생성물 및 탄소 소스들에 대해 변화된다. 문헌 내 전형적인 효율은 ~<5%이다. 탄화수소 생성물을 생산하는 조작된 미생물은 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 및 30% 보다 큰 효율을 가질 수 있다. 일례에서, 미생물은 약 10% 내지 약 25%의 효율을 보일 것이다. 다른 예에서, 이러한 미생물은 약 25% 내지 약 30%의 효율을 보일 것이고, 그리고 다른 예에서 이러한 미생물은 >30% 효율을 보일 것이다.
최종 생성물이 세포로부터 배출되는 일부 예에서, 연속적인 공정이 사용될 수 있다. 이러한 접근법에서, 지방산 유도체를 생산하는 유기체들을 갖는 리액터(reactor)가 다수의 방법으로 집합될 수 있다(assembled). 일례에서, 배지의 일부분이 제거되고 그리고 방치된다(sit). 지방산 유도체가 수성층으로부터 분리되고, 이는 차례로 발효 챔버(fermentation chamber)에 되돌려질 것이다.
일례에서, 발효 챔버는 연속 환원을 겪고 있는 발효물(fermentation)을 둘러쌀 것이다. 이 경우에, 안정한 환원 환경이 생성될 것이다. (가스상 형태의) 이산화탄소의 배출에 의해 전자 밸런스가 유지될 것이다. NAD/H 및 NADP/H 밸런스를 증가시키려는 노력이 또한 전자 밸런스 안정화를 용이하게 할 수 있다.
NADH:NADPH 트랜스하이드로게나아제를 발현시키기 위해 생산 숙주를 조작함으로써 세포내 NADPH의 이용가능성이 향상될 수도 있다. 하나 이상의 NADH :NADPH 트랜스하이드로게나아제의 발현은 당분해(glycolysis)에서 생산된 NADH를 지방산 유도체의 생산을 증진시키는 NADPH로 전환시킨다.
수송 단백질을 통해 재조합 숙주 미생물에서 지방산 유도체를 연속적으로 생산하고 그리고 밖으로 보내기 위한(exporting) 시스템이 본 명세서에 개시되어 있다. 많은 수송 및 유출(efflux) 단백질은 많은 다양한 화합물을 분비하는 역할을 하고 그리고 특정 타입의 지방산 유도체에 대해 선택적일 수 있도록 진화될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, ABC 수송체를 암호화하는 외인성 DNA 서열이 재조합 숙주 미생물에 의해 기능적으로 발현되어, 미생물은 지방산 유도체를 배양 배지로 밖으로 보낼 수 있을 것이다. 일례에서, ABC 수송체는 캐노르해브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 아라비돕시스 탈라니아, 알칼리진 유트로푸스(Alkaligenes eutrophus) 또는 로도코커스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis)(유전자좌 AAN73268)로부터의 ABC 수송체이다. 다른 예에서, ABC 수송체는 CER5 (유전자좌 At1g51500 또는 AY734542), AtMRP5, AmiS2 및 AtPGPl으로부터 선택된 ABC 수송체이다. 일부 예에서, ABC 수송체는 CER5이다. 또다른 예에서, CER5 유전자는 아라비돕시스(Arabidopsis)(유전자좌 At1g51500, AY734542, At3g21090 및 At1g51460)로부터 유래한다.
예를 들어, 수송 단백질은 이하로부터 선택된 유출 단백질이 될 수도 있다: E. 콜라이로부터의 AcrAB, TolC 및 AcrEF, 또는 테르모시네코커스 엘론가투스 BP-1(Thermosynechococcus elongatus BP-1)으로부터의 tll1618, tll1619 및 tll0139.
또한, 수송 단백질은 예를 들어, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 캐노르해브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 사카로마이세즈 세레비지에로부터 선택된 지방산 수송 단백질 (FATP), 또는 어떤 하나의 포유동물 FATP's일 수 있다. FATPs는 부가적으로 기질 흐름의 방향을 반대로 하기 위해(invert) 역전된(reversed) 막 영역과 함께 재합성될 수 있다. 구체적으로, 단백질의 친수성 도메인(또는 막 도메인)을 형성하는 아미노산의 서열은, 각각의 특정 아미노산에 대해 동일한 코돈을 유지하면서 반대로 될 수 있다. 이러한 영역들의 확인은 이 기술분야에서 주지되어 있다.
생산 숙주는 또한, 이들의 내인성 능력이 지방산 유도체를 배출하도록 선택될 수 있다. 생산물 생산 및 발효 브로스로의 배출의 효율은 세포내 생성물 대 세포외 생성물 비율로서 표현될 수 있다. 일부 예에서, 이 비율은 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 또는 1:5가 될 수 있다.
생산 숙주는 부가적으로 PCT 출원 번호 PCT/US2007/003736에 기재된 것과 같은 재조합 셀룰로좀(cellulosome)을 발현하도록 조작될 수 있고, 이는 생산 숙주가 셀룰로오스 물질(cellulosic material)을 탄소 소스로서 사용하도록 허용할 것이다. 예를 들어, 생산 숙주는 부가적으로 인베르타아제(invertase)(EC 3.2.1.26)를 발현하도록 조작될 수 있어, 수크로오스는 탄소 소스로서 사용될 수 있다.
유사하게, 생산 숙주는 U.S. 특허 번호 5,00O,OOO, 5,028,539, 5,424,202, 5,482,846, 및 5,602,030(Ingram et al)에 기재된 교시내용을 사용하여 조작될 수 있어, 생산 숙주는 탄소를 효율적으로 동화하고 그리고 셀룰로오스 물질을 탄소 소스로서 사용할 수 있다.
IV. 생산 후 처리(Post production processing)
발효동안 생산된 지방산 유도체는 발효 배지로부터 분리될 수 있다. 수성 매질로부터 지방산 유도체를 분리하기 위해 알려진 모든 기술이 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 한 대표적인 분리 공정은 두가지 상(2-상(bi-phasic)) 분리 공정이다. 이 공정은 지방산 유도체를 생산하기에 충분한 조건 하에서 유전자 조작된 생산 숙주를 발효시키는 것을 포함하며, 유도체가 유기상 내에서 수집되도록 허용하고 그리고 유기상을 수성 발효 브로스로부터 분리한다. 이 방법은 배치(batch) 및 연속 발효 세팅(setting) 모두로 실시될 수 있다.
2-상 분리는 분리를 용이하게 하도록 지방산 유도체의 상대적 비혼화성(relative immisiciblity)을 이용한다. 비혼화성(immiscible)은 화합물이 물에 용해되는 것이 상대적으로 불가능하다는 것을 나타내고 그리고 화합물 분배 계수(compounds partition coefficient)에 의해 정의된다. 분배 계수, P는 (2-상 시스템에서 생산 공정동안 유기상이 일반적으로 지방산 유도체에 의해 상 형성된다) 유기상에서의 화합물의 평형 농도로서 정의되지만, 그러나 일부 예에서, 유기상은 수성 상(즉, 발효 브로스) 내 평형에서의 농도로 나뉘어 제공될 수 있다(이를테면 생산물 분리를 용이하게 하기 위한 옥탄의 층). 두가지 상 시스템을 설명할 때, P는 일반적으로 logP의 관점에서 논의된다. 10의 logP를 갖는 화합물은 유기상에 10:1 분배될 것이고, 반면에 0.1의 logP의 화합물은 수성 상에 대해 10:1 분배될 것이다. 당업자는, 생산되는 지방산 유도체가 높은 logP 값을 갖도록 발효 브로스 및 유기 상을 선택함으로써, 지방산 유도체가, 심지어 발효 용기 내에서의 매우 낮은 농도에서도, 유기상 내로 분리될 것임을 알 것이다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 지방산 유도체는 발효 브로스 내에서, 그리고 세포질 내에서 상대적으로 비혼화성일 것이다. 따라서, 지방산 유도체는 세포내적으로 또는 세포외적으로 유기상 내에 수집될 것이다. 유기상 내에 생성물이 수집되면 세포 기능에 미치는 지방산 유도체의 영향을 감소시킬 것이고, 그리고 생산 숙주가 보다 많은 생성물을 생산하도록 허용할 것이다. 또다른 방식으로 언급될 때, 지방산 유도체의 농도는 숙주 세포에 대해 큰 영향을 갖지 않을 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생산된 지방 알콜, 지방산 에스테르, 왁스, 및 탄화수소는 균질한 화합물의 생산을 허용할 것이고, 여기서 생산된 지방 알콜, 지방산 에스테르, 및 왁스의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%가 4 미만의 탄소, 또는 2 미만의 탄소까지 변화되는 탄소 사슬 길이를 가질 것이다. 이러한 화합물들은 또한, 이들이 상대적으로 균일한 정도의 포화를 갖도록 생산될 수도 있다. 예를 들어, 지방 알콜, 지방산 에스테르, 탄화수소 및 왁스의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%가 일-, 이- 또는 삼-불포화될 것이다. 이러한 화합물은 연료, 퍼스널 케어 첨가제(personal care additive), 영양 보충제로서 바로 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 또한 다른 생성물을 만들기 위해 연이은 반응, 예를 들어 에스테르교환(transesterification), 수소화, 수소화, 열분해(pyrolisis), 또는 이 모두를 통한 촉매작용 크래킹(catalytic cracking), 또는 에폭시화 반응을 위한 공급원료(feedstock)로서 사용될 수 있다.
V. 연료 조성물
본 명세서에 기재된 지방산 유도체는 연료로서 사용될 수 있다. 당업자는, 연료의 원하는 목적에 따라, 상이한 지방산 유도체가 생산되고 그리고 사용될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 차가운 기후(cold climate)에서 사용되도록 의도되는 자동차 연료의 경우, 분지된 지방산 유도체가 바람직할 수 있고, 그리고 본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여, 분지된 탄화수소, 지방산 에스테르, 및 알콜이 만들어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여, 바람직한 연료 품질을 갖는 비교적 균질한 지방산 유도체를 포함하는 연료가 생산될 수 있다. 이러한 연료는 탄소 지문법(fingerprinting), 석유 유래 연료 또는 트리글리세라이드에서 유래된 바이오-디젤과 비교될 때 이들의 불순물 결핍에 의해 특징화될 수 있고, 그리고 또한 지방산 유도체 계 연료는 원하는 특성을 갖는 연료를 생산하기 위해 다른 연료 또는 연료 첨가제와 함께 결합될 수 있다.
A. 탄소 지문법
생물학적으로 생산된 지방산 유도체는 알콜, 디젤 및 가솔린과 같은 연료들에 대한 새로운 공급원료이다. 지방산 유도체를 사용하여 만들어진 일부 바이오연료는, 재생가능한 소스로부터는 생산되지 않아왔고, 그리고 따라서 중요한 신규 조성물이다. 이러한 신규 연료는 듀얼 탄소-동위원소 지문법(dual carbon-isotopic fingerprinting)의 기초 하에 석유화학 탄소에서 유래된 연료로부터 구별될 수 있다. 부가적으로, 바이오소스(biosourced) 탄소의 특정 소스(예를 들어, 글루코오스 vs. 글리세롤)가 듀얼 탄소-동위원소 지문법에 의해 결정될 수 있다(본 명세서에 참조 병합되어 있는, US 특허 번호 7,169,588 참조).
이 방법은 유용하게 화학적으로-동일한(chemically-identical) 물질들을 구별하고, 그리고 생물권(biospheric)(식물) 성분의 성장의 소스(및 아마도 해(year))로 생성물 내의 탄소를 배분한다. 동위원소, 14C 및 13C은, 이 문제에 보충적(complementary) 정보를 가져온다. 방사성탄소 연대측정 동위원소(radiocarbon dating isotope)(14C)는, 5730년의 핵 반감기를 가지며, 명백히 화석 ("죽은") 및 생물권 ("살아있는")의 공급원료들 간의 표본 탄소를 배분하도록 해준다[Currie, L. A. "Source Apportionment of Atmospheric Particles," Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3 74]. 방사성탄소 연대측정의 기본 가설(assumption)은, 대기내 14C 농도의 항상성(constancy)이 살아있는 유기체 내에서 14C 의 항상성에 이르게 한다는 것이다. 분리된 샘플을 취급할 때, 샘플의 나이는 관계식 t=(-5730/0.693)ln(A/A.sub.O) (식 5)에 의해 대략적으로 추론될 수 있으며, 여기서 t=나이이고, 5730 년이 방사성탄소의 반감기이고, 그리고 A 및 A.sub.O는 각각 샘플 및 현대 표준물의 특정 14C 활성이다[Hsieh, Y., Soil Sci. Soc. Am J., 56, 460, (1992)]. 그러나, 1950년 이래로 대기 핵 실험 그리고 1850년 이래로 화석 연료의 연소(burning) 때문에, 14C 는 제 2의, 지구화학 시간 특성(geochemical time characteristic)을 얻었다. 대기 CO2에서-- 그리고 이에 따라 살아있는 생물권에서-- 이의 농도는 1960년대 중반, 핵 실험의 최고조에 약 두배가 되었다. 이후, 정상-상태(steady-state) 우주기원(cosmogenic) (대기) 베이스라인, 7-10년의 대략적인 이완(relaxation) "반감기"로 ca. 1.2xlO12의 동위원소 비율(14C /12C)로 점차 되돌아가고 있다(이 후자의 반감기를 그대로(literally) 취하지 말아야 한다; 오히려, 핵 시대의 개막 이후로 대기 및 생물권 14C의 변화를 추적하기 위해 상세화된 대기 핵 투입/붕괴(detailed atmospheric nuclear input/decay) 함수를 사용해야 한다). 이 후자의 생물권 14C 시간 특성은, 최근 생물권 탄소의 1년 년도측정(annual dating)의 전망(promise)을 제공한다(holds out). 14C는 가속기 질량 분광분석법(accelerator mass spectrometry)(AMS)에 의해 측정될 수 있으며, 결과는 "현대 탄소의 분획(fraction of modern carbon)" (fM)의 단위로 주어진다. fM은, 각각 옥살산 표준물 HOxI 및 HOxII로서 알려진, NIST(National Institute of Standards and Technology) SRMs(Standard Reference Materials) 4990B 및 4990C에 의해 정의된다. 기본적인 정의(fundamental definition)는 14C /12C 동위원소 비율 HOxI (AD 1950로 참조됨)의 0.95배에 관련된다. 이는 붕괴-보정된 산업 혁명 전 나무(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)와 대략 동등하다. 현재의 살아있는 생물권(식물 물질)에 대해, fM 은 약 1.1이다.
안정한 탄소 동위원소 비율(13C /12C)은 소스 식별(source discrimination) 및 할당(apportionment)에 대한 보충적 경로를 제공한다. 주어진 바이오소스 물질(biosourced material)에서의 13C /12C 비율은, 이산화탄소가 고정된 시기에 대기 이산화탄소의 13C /12C 비율의 결과이며 또한 정확한 물질대사 경로를 반영한다. 지역적인 편차도 발생한다. 석유, C3 식물 (활엽수(broadleaf)), C.sub.4 식물 (풀), 및 해양 카보네이트는 모두 13C /12C 및 대응하는 델타13C 값들에서 상당한 차이를 보인다. 또한, C3 및 C4 식물의 지질(lipid) 물질은 물질대사 경로의 결과로서 동일한 식물의 탄수화물 성분으로부터 유래된 물질과 상이하게 분석된다. 측정의 정확도 내에서, 13C은 동위원소 분별 효과(isotopic fractionation effect)로 인해 큰 편차를 보이며, 이의 가장 중요한 것은 본 발명에 대해 광합성 메커니즘이다. 식물에서의 탄소 동위원소 비율에서의 차이의 주된 원인은, 식물에서의 광합성 탄소 물질대사, 특히 일차 카르복실화, 즉 대기 CO2의 초기 고정동안 일어나는 반응의 경로에서의 차이와 밀접하게 관련되어 있다. 식물(vegetation)의 두 가지 큰 부류는 "C3"(또는 Calvin-Benson) 광합성 사이클을 편입하는 것 그리고 "C4"(또는 Hatch-Slack) 광합성 사이클을 편입하는 것이다. 활엽수(hardwood) 및 침엽수(conifer)와 같은 C3 식물은 온화한 기후 구역(temperate climate zone)에서 지배적이다. C3 식물에서, 일차 CO2 고정 또는 카르복실화 반응은 효소 리뷸로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제(ribulose-1,5-diphosphate carboxylase)를 필요로 하고, 그리고 일차 안정한 생성물은 3-탄소 화합물이다. 다른 한편으로, C4 식물은 열대림, 옥수수 및 사탕수수와 같은 식물을 포함한다. C4 식물에서, 다른 효소, 포스포에놀-피루베이트(phosphoenol-pyruvate) 카르복실라아제를 필요로 하는 부가적인 카르복실화 반응은 일차 카르복실화 반응이다. 일차의 안정한 탄소 화합물은, 연이어 카르복실 이탈되는(decarboxylated) 4-탄소산이다. 이와 같이 배출된 CO2는 C3 사이클에 의해 재고정된다.
C4 및 C3 식물은 모두 13C /12C 동위원소 비율 범위를 나타내지만, 전형적인 값은 ca. -10 내지 -14(C4) 퍼밀(per mil) 그리고 -21 내지 -26(C3) 퍼밀이다[Weber et al., J. Agric. Food Chem., 45, 2942 (1997)]. 석탄 및 석유는 일반적으로 이 후자의 범위에 속한다. 13C 측정 척도(measurement scale)는 일반적으로 PDB(pee dee belemnite) 석회석에 의해 제로 세트(zero set)에 의해 정의되었고, 여기서 값들은 이 물질로부터의 천분율 편차(parts per thousand deviations)로 주어진다. "△13C ", 값은 천분율(퍼밀)이고, 생략된 %(abbreviated %)이고, 그리고 다음과 같이 계산된다:
Figure 112008082616218-PCT00007
PDB 기준물질(PDB reference material)(RM)이 고갈되었으므로, 일련의 대안적인 RMs이 IAEA, USGS, NIST 및 다른 선택된 국제 동위원소 실험실과 협력하여 개발되었다. PDB로부터의 퍼밀 편차(per mil deviations)의 표기는 △13C이다. 측정은 질량 44, 45 및 46의 분자 이온 상에서의 고도 정확도 안정 비율 질량 분광분석(high precision stable ratio mass spectrometry)(IRMS)에 의해 CO2 에 대해 이루어진다.
지방산 유도체 및 관련된 바이오연료, 화학제, 및 혼합물은 14C(fM) 및 듀얼 탄소-동위원소 핑거프린팅(dual carbon-isotopic fingerprinting)을 기초로 하여 이들의 석유화학(petrochemical) 유래된 대응물로부터 완전히 구별될 수 있고, 중요한 새로운 조성물을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 지방산 유도체는 바이오연료 및 화학제의 생산에 유용성을 갖는다. 본 발명에 의해 제공된 새로운 지방산 유도체 계 생성물 조성물은 부가적으로는 단독으로 석유화학 소스로부터 유래된 물질로부터 듀얼 탄소-동위원소 핑거프린팅에 기초하여 구별될 수 있다. 이러한 생성물을 구별하는 능력은 상업적으로 이러한 물질들을 추적하기에 유리하다. 예를 들어, "새로운" 및 "오래된" 탄소 동위원소 프로파일을 모두 포함하는 연료 또는 화학제는 "오래된" 물질로만 만들어진 연료 및 화학제로부터 구별될 수 있다. 따라서, 본(instant) 물질은 이들의 독특한 프로파일에 기초하여 및 경쟁품을 정의할 목적으로, 그리고 저장 수명(shelf life)을 결정하기 위해 상업적으로 수행될 수 있다.
일부 예에서, 약 -10.9 내지 약 -15.4의 δ13C를 갖는 지방산 유도체를 포함하는 바이오연료 조성물이 만들어지며, 여기서 지방산 유도체는 조성물 내 (셀룰로오스 물질 및 당과 같은 재생가능한 자원으로부터 유래된) 바이오소스 물질(biosourced material)의 적어도 약 85% 를 차지한다. 다른 예에서, 바이오연료 조성물은 다음 식을 갖는 지방산 유도체를 포함한다.
X-(CH(R))nCH3
여기서, X는 CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; 또는 -C(O)NR3R4이고;
R은 각각의 n에 대해, 독립적으로 부재하거나, H 또는 저급 지방족이고;
n은 10 내지 24와 같은 8 내지 34의 정수이고; 그리고
R1, R2, R3 및 R4 는 독립적으로 H 및 저급 알킬로부터 선택된다.
전형적으로, R은 저급 지방족이고, R은 분지, 비분지 또는 사이클릭 저급 알킬 또는 저급 알케닐 잔기이다. 대표적인 R기는 제한 없이, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, 2차-부틸, 사이클로펜테닐 등을 포함한다. 지방산 유도체는 부가적으로 약 -10.9 내지 약 -15.4의 δ13C를 갖는 것으로 특징화되고; 그리고 지방산 유도체는 조성물 내 바이오소스 물질의 적어도 약 85%를 차지한다. 일부 예에서, 바이오연료 조성물 내 지방산 유도체는 적어도 약 1.003, 1.010, 또는 1.5의 현대 탄소 분획(fM 14C)을 갖는 것을 특징으로 한다.
B. 지방산 유도체
다양한 지방산 에스테르에 대한 세탄가(centane number)(CN), 점도, 융점 및 연소열은, 예를 들어 문헌(Knothe, Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005)에서 특징화되었으며, 이는 본 명세서에 참조 병합되어 있다. 본 명세서에 제공된 교시내용을 사용하여, 생산 숙주는 문헌(Knothe, Fuel Processing Technology 86:1059-1070, 2005)에 기재된 지방산 에스테르의 어떤 것을 생산하도록 조작될 수 있다.
알콜(단쇄, 장쇄, 분지 또는 불포화)은 본 명세서에 기재된 생산 숙주에 의해 생산될 수 있다. 이러한 알콜은 연료로서 바로 사용될 수 있거나 또는 이들은 에스테르, 즉 상기된 바와 같은 에스테르의 A 쪽을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 에스테르는 단독으로 또는 본 명세서에 기재된 다른 지방산 유도체와 조합하여 연료로 유용하다.
유사하게, 본 명세서에 기재된 미생물로부터 생산된 탄화수소는 바이오연료로서 사용될 수 있다. 이러한 탄화수소계 연료는 분지점, 정의된 포화도(defined degree of saturation), 그리고 특정 탄소 길이를 포함하도록 디자인될 수 있다. 단독으로 또는 다른 지방산 유도체와 조합하여 바이오연료로서 사용될 때, 탄화수소는 부가적으로 첨가제 또는 다른 전통적인 연료(알콜, 트리글리세라이드 유래 디젤, 및 석유계 연료)와 결합될 수 있다.
C. 불순물
본 명세서에 기재된 지방산 유도체는 바이오-연료 제조에 유용하다. 이러한 지방산 유도체는 트리글리세라이드의 화학 처리로부터가 아니고 그리고 지방산으로부터 바로 만들어진다. 따라서, 개시된 지방산 유도체를 포함하는 연료는, 식물성유 및 지방으로부터 유래된 연료와 같은, 일반적으로 트리글리세라이드로부터 유래된 바이오-연료와 관련된 것보다 더 적은 불순물들을 포함할 것이다.
(지방산 유도체를 전통적인 연료와 같은 다른 연료와 혼합하기 전의) 본 명세서에 기재된 조(crude) 지방산 유도체 바이오-연료는 석유화학 디젤 또는 바이오-디젤보다 적은 에스테르 교환 촉매를 포함할 것이다. 예를 들어, 지방산 유도체는 약 2%, 1.5%, 1.0%, 0.5%, 0.3%, 0.1%, 0.05%, 또는 0% 미만의 에스테르 교환 촉매 또는 에스테르 교환 촉매로부터 얻어지는 불순물을 포함할 수 있다. 에스테르 교환 촉매는, 예를 들어 NaOH, KOH, LiOH와 같은 하이드록사이드 촉매, 및 무기산( mineral acid) 촉매 및 루이스산 촉매와 같은 산성 촉매를 포함한다. 에스테르교환 촉매로부터 얻어지는 촉매 및 불순물은 제한 없이, 주석, 납, 수은, 카드뮴, 아연, 티탄, 지르코늄, 하프늄, 붕소, 알루미늄, 인, 비소, 안티몬, 비스무트, 칼슘, 마그네슘, 스트론튬, 우라늄, 칼륨, 나트륨, 리튬, 및 이의 조합을 포함한다.
유사하게, (지방산 유도체를 석유화학 디젤 또는 바이오-디젤과 같은 다른 연료와 혼합하기 전의) 본 명세서에 기재된 조 지방산 유도체 바이오-연료는 트리글리세라이드로부터 만들어진 바이오-연료보다 적은 글리세롤(또는 글리세린)을 포함할 것이다. 예를 들어, 지방산 유도체는 약 2%, 1.5%, 1.0%, .5%, .3%, .1%, .05%, 또는 0% 보다 적은 글리세롤을 포함할 수 있다.
지방산 유도체로부터 유래된 조 바이오연료는 또한 트리글리세라이드로부터 만들어진 바이오-디젤보다 적은 유리 알콜(free alcohol)(즉, 에스테르를 생성하기 위해 사용되는 알콜)을 포함할 것이다. 이는 생산 숙주에 의한 알콜의 이용 효율에 일부 기인한다. 예를 들어, 지방산 유도체는 약 2%, 1.5%, 1.0%, .5%, .3%, .1%, .05%, 또는 0% 보다 적은 유리 알콜을 포함할 것이다.
개시된 지방산 유도체로부터 유래된 바이오연료는 부가적으로 석유 유래된 디젤에 비해 이의 낮은 황의 농도를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 지방산 유도체로부터 유래된 바이오연료는 약 2%, 1.5%, 1.0%, .5%, .3%, .1%, .05%, 또는 0% 보다 적은 황을 가질 수 있다.
D. 첨가제
연료 첨가제는 연료 또는 엔진의 성능을 향상시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 연료 첨가제는 동결/겔화점(freezing/gelling point), 운점(cloud point), 평활도( lubricity), 점도, 산화 안정성, 착화성(ignition quality), 옥탄 수준, 및 인화점(flash point)을 변경하기 위해 사용될 수 있다. 미국에서, 모든 연료 첨가제는 환경보호국(Environmental Protection Agency)에 등록되어야 하고 그리고 연료 첨가물을 판매하는 회사 및 연료 첨가제의 이름은 상기 환경보호국 웹사이트 상에서 그리고 또한 상기 환경보호국과 접촉함으로써 공개적으로 이용가능하다. 당업자는, 본 명세서에 기재된 지방산 유도체가, 원하는 품질을 부여하기 위해 하나 이상의 이러한 첨가제와 함께 혼합될 수 있다는 것을 알 것이다.
당업자는 또한, 본 명세서에 기재된 지방산 유도체가 트리글리세라이드로부터 유래된 바이오-디젤과 같은 다른 연료, 에탄올 및 부탄올과 같은 다양한 알콜, 및 가솔린과 같은 석유 유래된 생성물과 함께 혼합될 수 있다는 것을 알 것이다. 일부 예에서, 낮은 겔점(gel point)을 갖는 C 16:1 에틸 에스테르 또는 C l8:1 에틸 에스테르와 같은 지방산 유도체가 생산된다. 이 낮은 겔점 지방산 유도체는 연료의 전체적인 겔링점을 감소시키기 위해 트리글리세라이드로부터 만들어진 바이오-디젤과 혼합된다. 유사하게, C l6:1 에틸 에스테르 또는 C l8:1 에틸 에스테르와 같은 지방산 유도체가 적어도 5 % 바이오디젤 그리고 종종 5 %보다 많은 바이오디젤인 혼합물을 제공하기 위해 석유 유래된 디젤과 혼합될 수 있다. 일부 예에서, 혼합물은 적어도 20% 또는 이보다 많은 지방산 유도체를 포함한다.
예를 들어, 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3인 탄소 사슬을 포함하는, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 의 지방산 유도체를 포함하는 바이오연료 조성물이 만들어질 수 있다. 이러한 바이오연료 조성물은 부가적으로, 운점을 약 5℃, 또는 0℃ 미만으로 낮출 수 있는 운점 저하 첨가제, 계면활성제, 또는 마이크로에멀젼(microemulsion), 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 트리글리세라이드로부터의 디젤 연료, 석유 유래 가솔린 또는 석유로부터의 디젤 연료로부터 선택된 하나 이상의 첨가제를 포함할 수 있다.
도 1은 아실-ACP의 합성과 직접 관련있는 효소를 보여주는 FAS 경로의 다이어그램이다. 왁스/지방산 에스테르, 및 지방 알콜의 생산을 증가시키기 위해, 하나 이상의 효소가 과발현되거나 또는 돌연변이되어 피드백 저해를 감소시킬 수 있다. 부가적으로, 중간체를 물질대사하여 비-지방산계 생성물(부반응)을 만드는 효소는, 지방산 생합성 경로를 통한 탄소의 흐름(flux)을 증가시키기 위해 기능적으로 결실 또는 약화될 수 있다. 이하의 실시예 1 , 2, 및 8은 지방산 생산을 증가시키기 위해 변형된 대표적인 생산 숙주를 제공한다.
도 2, 3 및 4는 지방 알콜 및 왁스/지방산 에스테르를 만들기 위해 조작될 수 있는 생합성 경로를 각각 도시한다. 도 2에 설명된 바와 같이, 각 기질(아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 아실-ACP, 지방산, 및 아실-CoA)의 각 생성물(아세틸-CoA, 말로닐-CoA, 아실-ACP, 지방산, 및 아실-CoA)로의 전환은 지시된 효소류의 멤버인 몇가 지 상이한 폴리펩타이드를 사용하여 수행될 수 있다. 이하 실시예들은 특정 지방 알콜 및 왁스/지방산 에스테르 및 탄화수소를 생산하기 위해 조작되었거나 또는 조작될 수 있는 미생물을 기재한다.
실시예 1, 생산 숙주 형성(Construction)
대표적인 생산 숙주는 LS9001이다. LS9001는 fadE 유전자 (아실-CoA 데하이드로게나아제)를 기능적으로 결실하기 위해 Overexpress.com (Saint Beausine, France)로부터의 C41(DE3)를 변형시킴으로써 생산되었다.
간단히 말하면, E. 콜라이의 fadE 녹-아웃(knock-out) 균주는, fadE의 약 830 bp 상류(upstream)를 증폭하기 위한 프라이머 YafV_NotI 및 Ivry_Ol 및 fadE의 약 960 bp 하류(downstream)를 증폭하기 위한 프라이머 Lpcaf_ol 및 LpcaR_Bam를 사용하여 만들어졌다. 오버랩 PCR(Overlap PCR)이 완전한 fadE 유전자의 인 프레임 결실(in frame deletion)을 위한 구조체(construct)를 만들기 위해 사용되었다. fadE 결실 구조체는 온도 민감성 플라스미드 pKOV3 내에 클로닝되었고(cloned), 이는 카운터선택(counterselection)을 위한 SacB 유전자를 포함함, 그리고 fadE의 염색체 결실이 문헌(Link et al. , J. Bact. 179:6228-6237, 1997)의 방법에 따라 이루어졌다. 얻어지는 균주는 지방산 및 지방 아실-CoAs 을 분해할 수 없었다(이 기능적 결실은 본 명세서에서 △fadE로서 나타낸다).
생산 숙주 내에 포함될 수 있는 부가적인 변형은 E. 콜라이 내에서 아세틸-CoA 카르복실라아제 활성을 담당하는 네 유전자(accA, B, C, 및 D, Accessions: NP_414727, NP_417721, NP_417722, NP_416819, EC 6.4.1.2)를 운반하는 플라스미드를 도입하는 것을 포함한다. accABCD 유전자는 pACYCDuet-1(Novagen, Madison, WI)의 NcoI/HindIII 및 NdeI/AvrII 부위 내에 바이시스트로닉 오페론(bicistronic operon)으로서 두 단계로 클로닝되었고, 얻어지는 플라스미드는 pAS004.126이라 불렸다.
생산 숙주에 포함될 수 있는 부가적인 변형에는 이하: aceEF(피루베이트 및 2-옥소글루타레이트 데하이드로게나아제 복합체의 E1p 데하이드로가아제(dehydrogase) 성분 및 E2p 디하이드로리포아미드 아실트랜스퍼라아제 성분을 암호화)의 과발현이 포함되고; 그리고 예를 들어 E. 콜라이, 니트로소모나스 유로패아(Nitrosomonas europaea) (ATCC 19718), 바실러스 서브틸리스, 사카로마이세즈 세레비지에, 스트렙토마이세스 spp(Streptomyces spp), 랠스토니아(Ralstonia), 로도코커스(Rhodococcus), 코리네박테리아(Corynebacteria), 브레비박테리아(Brevibacteria), 미코박테리아(Mycobacteria), 유질 효모, 등을 포함하는, 이러한 단백질을 암호화하기 위해 이 기술분야에서 공지된 어떤 유기체로부터의 fabH/fabD/fabG/acpP/fabF (FAS 암호화)가 생산 숙주에서 발현될 수 있다. 유사하게, 생산 숙주는 E. 콜라이 상동체 대신에, 또는 이에 추가하여 피슘 사비튬(Pisum savitum)으로부터의 accABCD (아세틸 co-A 카르복실라아제 암호화)를 발현하기 위해 조작될 수 있다. 그러나, 생산 숙주가 또한 부탄올을 생산하고 있는 경우, 피슘 사비튬 상동체를 발현시키는 것은 덜 바람직하다.
일부 대표적인 생산 숙주에서, 유전자는 문헌(Link, et al, J. Bacteriol 179:6228-6237, 1997)의 방법을 사용하여 녹 아웃되거나 또는 약화될 수 있다. 예를 들어, 녹-아웃되거나 또는 약화될 수 있는 유전자에는, gpsA (생합성 sn-글리세롤 3-포스페이트 데하이드로게나아제를 암호화, accession NP_418065, EC: 1.1.1.94); ldhA (락테이트 데하이드로게나아제를 암호화, accession NP_415898, EC: 1.1.1.28); pflb (포르메이트 아세틸트랜스퍼라아제 1을 암호화, accessions: P09373, EC: 2.3.1.54); adhE (알콜 데하이드로게나아제를 암호화, accessions: CAA47743, EC: 1.1.1.1, 1.2.1.10); pta (포스포트랜스아세틸라아제를 암호화, accessions: NP_416800, EC: 2.3.1.8); poxB (피루베이트 옥시다아제를 암호화, accessions: NP_415392, EC: 1.2.2.2); ackA (아세테이트 키나아제를 암호화, accessions: NP_416799, EC: 2.7.2.1) 및 이의 조합이 포함된다.
유사하게, PlsB [D311E] 돌연변이는 fadE 결실에 대해 상기된 방법을 사용하여 PlsB를 약화시키기 위해 LS9001 내에 도입될 수 있다. 일단 도입되면, 이 돌연변이는 인지질 생산으로 전환되는 탄소의 양을 감소시킬 것이다(도 1 참조). 간단히 말하면, PlsB[D311E]를 암호화하는 대립유전자(allele)는, 아스파테이트(aspartate) 311의 GAC 코돈을 글루타메이트의 GAA 코돈으로 대체함으로써 만들어진다. 변형된 대립유전자는 유전자 합성에 의해 만들어지고 그리고 염색체 plsB 야생형(wildtype) 대립유전자는 문헌(Link et al.)의 방법을 사용하여 돌연변이체(mutant) plsB[O311E] 대립유전자에 대해 교환된다(상기 참조).
실시예 2, 생산 숙주 변형
이하의 플라스미드는 지방산 유도체의 합성에 사용되는 다양한 단백질의 발현을 위해 형성되었다. 구조체(construct)는 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 만들어졌고, 그리고 모든 클로닝된 유전자는 IPTG-유도성 프로모터(T7, tac 또는 lac 프로모터)의 조절 하에 놓였다.
E. 콜라이의 리더(leader) 서열 없는 'tesA 유전자(티오에스테라아제 A 유전자 accession NP_415027)(Cho and Cronan, The J. of Biol. Chem., 270:4216-9, 1995, EC: 3.1.1.5, 3.1.2.-)가 NdeI/AvrII 소화된(digested) pETDuet-1 (본 명세서에 기재된 pETDuet-l 는 Novagen, Madison, WI로부터 이용가능하다) 내에 클로닝되었다. 움벨룰라리아 캘리포니아(Umbellularia California), 큐페아 후케리아나(Cuphea hookeriana) 및 신나모눔 캠포룸(Cinnamonum camphorum) 으로부터의 FatB-타입 식물 티오에스테라아제(TEs)를 암호화하는 유전자(accessions: UcFatBl=AAA34215, ChFatB2=AAC49269, ChFatB3=AAC72881, CcFatB=AAC49151)가 세 상이한 벡터: (i) NdeI/AvrII 소화된 pETDuet-1, (ii) XhoI/HindIII 소화된 pBluescript KS+ (Stratagene, La Jolla, CA)(N-말단 lacZ::TE 융합 단백질을 만들기 위해 사용됨) 및 (iii) XbaI/HindIII 소화된 pMAL-c2X (New England Lab, Ipswich, MA) (n-말단 MalE::TE 융합을 만들기 위해 사용됨) 내에 개별적으로 클로닝되었다. E.콜라이로부터의 fadD 유전자 (아실-CoA 신테타아제(synthetase)를 암호화)가 NcoI/HindIII 소화된 pCDFDuet-1 유도체 내에 클로닝되었고, 이는 이의 NdeI/AvrII 부위 내에 아시네토박터 배일리 ADP1(Acinetobacter baylyi ADPl)로부터의 acrl 유전자 (아실- CoA 리덕타아제)를 포함하였다. 표 7은 몇가지 대표적인 생산 균주를 만들기 위해 생성된 플라스미드를 요약하여 제공하며, 당업자는 상이한 플라스미드 및 게놈 변형이 유사한 균주를 얻기 위해 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.
Figure 112008082616218-PCT00008
선택된 발현 플라스미드는 양립성 레플리콘(compatible replicon) 및 항생 내성 마커(antibiotic resistance marker)를 포함하여, 네-플라스미드 발현 시스템이 확립될 수 있다. 따라서, LS9001는 (i) TE-발현 플라스미드 중 어느 것, (ii) FadD-발현 플라스미드, 이는 또한 acrl를 발현시킴, 및 (iii) 왁스 신타아제 발현 플라스미드로 동시-형질전환될 수 있다. IPTG로 유도될 때, 얻어지는 균주는 글루코오스와 같은 탄소 소스로부터 증가된 농도의 지방-알콜을 생산할 것이다. 생산된 지방 알콜의 탄소 사슬 길이 및 포화도는 발현되는 티오에스테라아제 유전자에 좌우된다.
실시예 3, 재조합 E. 콜라이 균주 내 지방 알콜의 생산
지방 알콜이 생산 숙주 내에서 티오에스테라아제 유전자 및 아실-CoA 리덕타아제 유전자(FAR)를 외인적으로(exogenously) 발현시킴으로써 생산되었다. 보다 구체적으로, 플라스미드 pCDFDuet-1-fadD-acrl (아실-CoA 리덕타아제) 및 pETDuet-l-'tesA (티오에스테라아제)가 E. 콜라이 균주 LS9001 내로 형질전환되었고(실시예 1에 기재됨) 그리고 대응하는 형질전환체(transformant)가 100 mg/L의 스펙티노마이신(spectinomycin) 및 50 mg/L의 카르베니실린(carbenicillin)으로 보충된 LB 플레이트 내에서 선택되었다. LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1의 네 형질전환체가 50 mg/L의 카르베니실린 및 100 mg/L의 스펙티노마이신으로 보충된 3 mL의 M9 배지 내에 독립적으로 접종되었다. 형질전환체를 포함하는 샘플이, 이들이 0.5 OD600에 이를 때까지 쉐이커(shaker)(250 rpm) 내에서 25 ℃에서 성장되었다. 1.5 mL의 각 샘플을 상기된 배지 30 mL를 포함하는 250 mL 플라스크 내에 옮겼다. 얻어지는 배양액은, 배양액이 0.5-1.0 OD600 사이에 이를 때까지 쉐이커 내에서 25°C 에서 성장되었다. 이어서, IPTG가 1mM의 최종 농도로 첨가되었다. 그리고 40 시간동안 계속 성장되었다.
이어서, 세포가 4000 rpm에서 스핀다운되었고(spun down) 그리고 세포 펠렛이 1.0 mL의 메탄올 중에 현탁되었다. 이어서, 3 mL의 에틸 아세테이트가 현탁된 세포와 혼합되었다. 이어서, 3 mL의 H2O가 혼합물에 첨가되었고 그리고 혼합물은 20 분동안 초음파처리되었다(sonicated). 얻어지는 샘플는 4000 rpm에서 5 분동안 원심분리되었고, 그리고 유기상(상부 상)은 지방 알콜을 포함하였고 GC/MS 분석되었다. 전체 알콜(테트라데칸올(tetradecanol), 헥사데칸올(hexadecanol), 헥사데센올(hexadecenol) 및 옥타데센올(octadecenol) 포함) 수율은 약 1-10 mg/L 였다. 빈(empty) 벡터만을 운반하는 E.콜라이 균주가 동일한 방식으로 배양되었을 때, 단지 0.2-0.5 mg/L 의 지방 알콜이 에틸 아세테이트 추출물 내에서 발견되었다.
실시예 4, 생산 숙주로부터의 지방 알콜의 생산 및 배출
아크릴(아실-CoA 리덕타아제)가 유일한(sole) 탄소 및 에너지 소스로서 글루코오스 상에 성장된 E. 콜라이 내에서 발현되었다. E. 콜라이는 도데칸올(C12:0-OH), 테트라데칸올(C14:0-OH) 및 헥사데칸올(C16:0-OH)과 같은 소량의 지방 알콜을 생산하였다. 다른 샘플에서는, FadD(아실-CoA 신테타아제)가 E.콜라이 내에서 acrl 과 함께 발현되었고, 그리고 지방 알콜 생산의 5-배 증가가 관찰되었다.
다른 샘플에서는, acr1, fadD, accABCD (아세틸-CoA 카르복실라아제)(실시예 1에 기재된 것과 같이 형성된 accABCD를 운반하는 플라스미드)가 야생형 E. 콜라이C41(DE3) 및 E. 콜라이 C41(DE3 △fadE), 아실-CoA 데하이드로게나아제 결핍 균주 내에서 다양한 개별 티오에스테라아제(TEs)와 함께 발현되었다. 이를 통해, 지방 알콜 생산이 부가적으로 증가하게 되었고 그리고 지방 알콜의 프로파일이 조절되었다(도 5 참조). 예를 들어, 이 시스템 내에서의 E. 콜라이 'tesA (pETDuet-1-'tesA)의 과발현으로 C12:0-OH, C14:0-OH 및 C16:0-OH의 약 60-배 증가가 달성되었고, C14:0-OH가 주 지방 알콜이었다. ChFatB3 효소(pMAL-c2X-TEcu 내 큐페아 후케리아나(Cuphea hookeriana)로부터의 FatB3)가 발현되었을 때 매우 유사한 결과가 얻어졌다. UcFatB1 효소(pMAL-c2X-TEuc 내 움벨룰라리아 캘리포니카인(Umbellularia californicain)으로부터의 FatBl)가 발현되었을 때, 지방 알콜 생산은 약 20-배 증가되었고 그리고 C12:0-OH가 주된 지방 알콜이었다.
ChFatB3 및 UcFatB1의 발현은 또한 상당한 양의 불포화된 지방 알콜 C16:1-OH 및 C14:1-OH의 생산에 각각 이르게 한다. tesA의 발현으로부터 생성된 샘플의 상등액(supernatant)에서 지방 알콜이 존재하는 것으로 밝혀졌다(도 6). 37 ℃에서 대략 동등한 양의 지방 알콜이 상등액에서 그리고 세포 펠렛에서 발견되었고, 반면에 25 ℃에서 약 25 %의 지방 알콜이 상등액에서 발견되었다.
실시예 5, 중간 사슬 지방산 에스테르(medium chain fatty acid ester)
알콜 아세틸 트랜스퍼라아제(AATs, EC 2.3.1.84)가, 이는 다양한 식물에서 아실 아세테이트 생산을 담당함, 옥틸 옥타노에이트, 데실 옥타노에이트(decyl octanoate), 데실 데카노에이트(decyl decanoate) 등과 같은 중간 사슬 길이 왁스를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 중간 사슬 알콜(이를테면, C6, C8) 및 중간 사슬 아실-CoA (또는 지방산, 이를테면 C6 또는 C8)로부터 합성된 지방 에스테르는 비교적 낮은 융점을 갖는다. 예를 들면, 헥실 헥사노에이트는 -55℃의 융점을 가지고 그리고 옥틸 옥타노에이트는 -18 내지 -17℃의 융점을 갖는다. 이러한 화합물들의 낮은 융점은 이들을 바이오연료로서 사용하기에 우수한 후보로 만든다.
이 실시예에서, SAAT 유전자는 생산 숙주 C41(DE3, △fadE) 내에서 E. 콜라이로부터의 fadD 및 acr1 (A. 배일리 ADP1으로부터의 알콜 리덕타아제)와 함께 공동-발현되었고 그리고 옥탄산이 발효 브로스 내에 제공되었다. 이를 통해 옥틸 옥타노에이트가 생산되었다. 유사하게, A. 배일리 ADP1으로부터의 왁스 신타아제 유전자가 SAAT 유전자 대신에 생산 숙주 내에서 발현되었을 때, 옥틸 옥타노에이트가 생산되었다.
재조합 SAAT 유전자가 DNA 2.0 (Menlo Park, CA 94025)을 사용하여 합성되었다. 합성된 DNA는 공개된 유전자 서열(등록 번호 AF 193789)에 기초하였고 그리고 NcoI 부위를 제거하기 위해 변형되었다. 합성된 SAAT 유전자(BamHI-HindIII 단편으로서)가 pRSET B(Invitrogen, Calsbad, California) 내에 클로닝되었고, BamHI 및 HindIII으로 선형화되었다. 얻어진 플라스미드, pHZ1.63A 는 pAS004.114B와 함께 E.콜라이 생산 숙주 내로 동시 형질전환되었고, 이는 E.콜라이로부터의 fadD 유전자 및 A. 배일리 ADP1으로부터의 acr1 유전자를 운반한다. 형질전환체는 2%의 글루코오스를 갖는 3 mL의 M9 배지 내에서 성장되었다. IPTG 유도 및 0.02%의 옥탄산의 첨가 후, 배양이 25 ℃에서 40 시간동안 계속되었다. 그 후, 3 mL의 아세틸 아세테이트가 전체 배양액에 첨가되었고 그리고 믹서로 수회 혼합되었다. 아세틸 아세테이트 상은 GC/MS에 의해 분석되었다.
놀랍게도, 아세틸 아세테이트 추출물에서, 아실 아세테이트는 발견되지 않았다. 그러나, 새로운 화합물이 발견되었고 그리고 화합물은 옥틸 옥타노에이트였다. 반면에, SAAT 유전자 [C41(DE3, △fadE)/pRSET B+pAS004.114B]가 없는 대조 균주(control strain)는 옥틸 옥타노에이트를 생산하지 않았다. 또한, A. 배일리 ADP1(A. baylyi ADP1)으로부터의 왁스 신타아제 유전자가 pHZ1.43에 의해 운반되었던 균주 [C41(DE3, △fadE)/pHZ1.43 B+pAS004.114B]가 옥틸 옥타노에이트를 생산하였다(도 7B 참조).
SAAT 활성이 옥틸 옥타노에이트를 생산한다는 연구 결과는, 전에는 보도된 바 없었고, 그리고 옥틸 옥타노에이트, 옥틸 데카노에이트와 같은 중간 사슬 왁스의 생산을 가능하게 하는데, 이는 낮은 융점을 가지고 그리고 트리글리세라이드계 바이오디젤을 대체하기 위한 바이오연료에 사용될 우수한 후보이다.
실시예 6, E. 콜라이 균주 LS9001 내에서의 왁스 에스테르의 생산
지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제, 티오에스테라아제, 및 왁스 신타아제를 발현하기 위해 E. 콜라이 생산 숙주를 조작함으로써 왁스 에스테르가 생산되었다. 따라서, 생산 숙주는 에스테르의 A 및 B 쪽 모두를 생산하였고, 그리고 두쪽 모두의 구조는 티오에스테라아제 유전자의 발현에 의해 영향받았다.
보다 구체적으로, A. 배일리 ADP1 (WSadp1이라 함, accessions AA017391, EC: 2.3.175)로부터의 왁스 신타아제가, 템플레이트(template)로서 A. 배일리 ADP1로부터의 게놈 DNA를 사용하여 다음의 프라이머들로 증폭되었다. 프라이머는 (1) WSadp1_NdeI, 5'-TCATATGCGCCCATTACATCCG-3' 및 (2) WSadp1_Avr, 5'-TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3' 였다. PCR 생성물은 NdeI 및 AvrII로 소화되었고 그리고 pHZ 1.43를 얻기 위해 pCOALDeut-1 내에 클로닝되었다. 이어서, WSadp1 운반 플라스미드가 E. 콜라이 균주 LS9001 내로 pETDuet-l'tesA 및 pCDFDuet-1-fadD-acr1 모두와 함께 동시-형질전환되었고, 그리고 형질전환체가 50 mg/L의 카나마이신(kanamycin), 50 mg/L의 카르베니실린(carbenicillin) 및 100 mg/L의 스펙티노마이신(spectinomycin)으로 보충된 LB 플레이트 내에서 선택되었다. 세 형질전환체가 3 mL의 LBKCS (50 mg/L 의 카나마이신, 50 mg/L의 카르베니실린, 100 mg/L의 스펙티노마이신 및 10 g/L 의 글루코오스를 갖는 LB 브로스 보충물) 내에 접종되었고 그리고 37℃ 쉐이커 (250 rpm)에서 배양되었다. 배양액이 0.5 OD6OO에 도달했을 때, 1.5 mL 의 각 배양액이 50 mL의 LBKCS를 포함하는 250 mL 플라스크 내에 옮겨졌고, 그리고 배양액이 0.5-1.0 OD600 에 도달할 때까지 플라스크가 37 ℃에서 쉐이커(250 rpm) 내에서 성장되었다. 이어서, IPTG가 1 mM의 최종 농도까지 첨가되었다. 유도된 배양액은 또다른 40 내지 48 시간동안 37°C 쉐이커에서 성장되었다.
이어서, 배양액이 50 mL 원추형 튜브(conical tube) 내에 위치되었고, 그리고 세포가 3500 X g으로 10분동안 스핀 다운되었다. 이어서, 세포 펠렛이 5 mL의 에틸 아세테이트와 함께 혼합되었다. 에틸 아세테이트 추출물은 GC/MS로 분석되었다. 왁스(C16C16, C14:1C16, C18:1C18:1, C2C14, C2C16, C2C16:1, C16C16:1 및 C2C18:1 포함)의 세포내 수율은 약 10 mg/L 였다. 단지 빈 벡터를 운반하는 E. 콜라이 균주가 동일한 방식으로 배양되었을 때, 단지 0.2 mg/L의 왁스가 에틸 아세테이트 추출물 내에서 발견되었다.
실시예 7, 생산 숙주로부터 지방-에틸 에스테르의 생산 및 배출
LS9001 균주는, 이를 A. 배일리로부터의 왁스 신타아제 유전자(플라스미드 pHZ1.43), 쿠페아 후케리아나(Cuphea hookeriana)로부터의 티오에스테라아제 유전자(플라스미드 pMAL-c2X-TEcu) 및 E. 콜라이로부터의 afadD 유전자(플라스미드 pCDFDuet-1-fadD)를 운반하는 플라스미드로 형질전환함으로써 변형되었다. 이 재조합 균주는 50mg/L의 카나마이신, 100 mg/L의 카르베니실린 및 100 mg/L의 스펙티노마이신(spectinomycin)을 갖는 3 mL의 M9 배지 내에서 25℃에서 성장되었다. IPTG 유도 후, 배지가 1% 에탄올 및 2%의 글루코오스의 최종 농도로 조정되었다. 배양액을 IPTG 유도 후 40 시간동안 성장시켰다. 세포가 10 분동안 3500 X g로 원심분리 함으로써 사용된 배지로부터 분리되었다. 세포 펠렛이 3 mL의 M9 배지를 사용하여 재-현탁되었다. 이어서, 세포 현탁액 및 사용된 배지가 1 부피의 에틸 아세테이트를 사용하여 추출되었다. 세포 현탁액 및 상등액으로부터 얻어지는 에틸 아세테이트 상들이 GC-MS 분석되었다. 결과는, C16 에틸 에스테르가 가장 탁월한 에스테르 종이고(이 티오에스테라아제에 대해 기대된 바와 같음, 표 1 참조), 그리고 생산된 지방산 에스테르의 20%가 세포로부터 배출되었다(도 8 참조)는 것을 보였다. pCOLADuet-1(왁스 신타아제 유전자에 대해 빈 벡터), pMAL-c2X-TEuc(U. California로부터의 FatB 포함) 및 pCDFDuet-1-fadD(E. 콜라이로부터의 fadD 유전자)을 포함하는 대조구 E. 콜라이 균주 C41(DE3, △fadE)는 검출가능한 양의 지방 에틸 에스테르를 생산하지 못했다. 지방산 에스테르가 대조구로서 시판 팔미트산 에틸 에스테르를 사용하여 정량되었다. 지방산 에스테르는 또한, 메탄올, 또는 이소프로판올이 발효 브로스에 첨가되었다는 것을 제외하고는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 만들어졌고, 그리고 기대된 지방산 에스테르가 생산되었다.
실시예 8, 재조합 E. 콜라이 균주에서 생산된 지방-에틸 에스테르의 조성물 상에 미치는 다양한 티오에스테라아제의 영향.
티오에스테라아제 FatB3(C. hookeriana), TesA (E. coli), 및 FatB (U. California)가 왁스 신타아제(A. baylyi)와 함께 동시에 발현되었다. pHZ1.61 이라 불리는 플라스미드가, NotI-AvrII 단편(acr1 유전자를 운반)을 pHZ1.43으로부터의 NotI-AvrII 단편으로 대체하여, fadD 및 ADPl 왁스 신타아제가 한 플라스미드 내에 있고 그리고 두 코딩 서열들 모두 개별 T7 프로모터의 조절 하에 있도록 함으로써 형성되었다. pHZ1.61을 형성하는 것은 실시예 6에 기재된 바와 같은 세 플라스미드 시스템 대신 두 플라스미드 시스템을 사용하는 것이 가능하도록 한다. 이어서, pHZ1.61가 E. 콜라이 C41(DE3, △fadE) 내로 상기된 상이한 티오에스테라아제 유전자를 운반하는 다양한 플라스미드 중 하나와 함께 동시-형질전환되었다.
이러한 형질전환체에 의해 생산된 전체 지방산 에틸 에스테르(상등액 및 세포내 지방산 에틸 에스테르)가 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 평가되었다. 지방산 에틸 에스테르의 수율 및 조성이 표 8에 요약된다.
Figure 112008082616218-PCT00009
주: 'TesA, pETDuet-l-'tesA; chFatB3, pMAL-c2X-TEcu; ucFatB, pMAL-c2X- TEuc; pMAL, pMAL-c2X, 연구에 사용된 티오에스테라아제 유전자에 대한 빈 벡터.
실시예 9, 생산 숙주 형성
지방산 생산을 조절하는 유전자가 미생물들 간에 유지된다. 예를 들어, 표 9에서, 탄화수소를 생산하는 미생물들 내에서 발현되는 것으로 알려진 본 명세서에 기재된 많은 유전자들의 상동체들이 확인된다. 지방산 생산, 및 이에 따라 표 9에서 확인된 것과 같은 미생물 내에서의 탄화수소 생산을 증가시키기 위해, 이종 유전자, 이를테면 E. 콜라이로부터의 것들이 발현될 수 있다. 당업자는 또한, 표 9에 제공된 미생물에 대해 내인성인 유전자가 또한 과-발현될 수 있거나, 또는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 약화될 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 도 10a 내지 도 10l에 기재되는 유전자는, 정의된 탄소 사슬 길이, 포화점, 및 분지점을 갖는 특정 탄화수소의 생산을 허용하기 위해 탄화수소를 내인적으로 생산하는 미생물 내에서 발현되거나 또는 약화될 수 있다.
예를 들면, 아세틸-CoA 카르복실라아제를 암호화하는 외인성 핵산 서열이 K.라디오톨러런스(K. radiotolerans) 내에 도입된다. 다음의 유전자는 K.라디오톨러런스(K. radiotolerans)에서 아세틸-CoA 카르복실라아제 단백질 생성물; 아세틸 CoA 카르복실라아제, 알파 서브유닛 (accA/ZP_00618306), 아세틸-CoA 카르복실라아제, 비오틴 카르복실 캐리어 단백질 (accB/ZP_00618387), 아세틸-CoA 카르복실라아제, 비오틴 카르복실라아제 서브유닛 (accC/ZP_00618040), 및 아세틸-CoA 카르복실라아제, 베타(카르복실트랜스퍼라아제) 서브유닛 (accD/ ZP_00618306)을 포함한다. 이러한 유전자는, 이들이 문헌(Ruyter et al., Appl Environ Microbiol. 62:3662-3667, 1996)에 개시된 발현 시스템과 같은 K.라디오톨러런스(K. radiotolerans) 발현 시스템의 조절 하에 합성 아세틸-CoA 카르복실라아제 오페론 (accABCD) 을 만들도록 플라스미드 내에 클로닝된다. 플라스미드의 K.라디오톨러런스(K. radiotolerans) 내로의 형질전환은 지방산 생산을 증진시킬 것이다. K.라디오톨러런스(K. radiotolerans)의 탄화수소 생산 균주는 또한 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 특정 탄소 사슬 길이를 갖는 분지된, 불포화된 탄화수소를 만들기 위해 조작될 수도 있다.
Figure 112008082616218-PCT00010
Figure 112008082616218-PCT00011
Figure 112008082616218-PCT00012
표 9에 대하여, 등록 번호는 2007년 4월 15일 현재 GenBank, 배포(release) 159.0 유래이고, EC 번호는 KEGG, 2007년 4월 현재 배포 42.0 (+ 05/09/07를 포함하여 이 때까지 날마다 업데이트) 유래이고, 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora) 균주 Ea273에 대한 결과는 생거 서열화 센터(Sanger sequencing center), 5/9/07 현재 완성된 산탄 서열(completed shotgun sequence) 유래이고, 에르위니아(Erwinia)에 대한 위치는 생거 슈도-염색체(Sanger psuedo-chromosome) 상의 위치를 나타내고, 비브리오 퍼니시 M1(Vibrio furnisii M1)으로부터의 서열은 9/28/06 현재 LS9 VFM1 슈도염색체, ν2 빌드(build) 유래이고, 그리고 전체 유전자를 포함하고, 그리고 플랭킹 서열(flanking sequence)을 또한 포함할 수 있다.
실시예 10, 부가적인 대표적인 생산 균주
표 10은 이하에서 부가적인 대표적인 생산 균주를 제공한다. 두 예시 생합성 경로가 지방산, 지방 알콜, 및 왁스 에스테르에 대해 기재된다. 유전적으로 조작된 숙주는, E. 콜라이로부터의 accABCD 유전자, E. 콜라이로부터의 'tesA 유전자, 및 E. 콜라이로부터의 fadD 유전자의 발현을 숙주 세포 내에 클로닝함으로써 생산될 수 있다. 숙주 세포는 E. 콜라이, 효모로부터 선택될 수 있고, 리스트에 부가된다. 이러한 유전자는 또한, 상기 실시예 1 및 2에 기재된 유전 조작(manipulation)을 하나 이상 포함하도록 변형되는 숙주 세포 내로 형질전환될 수도 있다. 표 10에 제공된 바와 같이, 부가적인 생산 숙주가 지시된 외인성 유전자를 사용하여 만들어질 수 있다.
Figure 112008082616218-PCT00013
Figure 112008082616218-PCT00014
실시예 11, 발효
숙주 미생물은 또한, 이 유전자의 적당한 최종-생산물 생산 유전자와의 새로운 합성(de novo synthesis)을 통해 prpBCDE 프로모터 시스템 하에 pBAD24 내에서 E. 콜라이로부터의 umuC 및 umuD 를 발현하도록 조작될 수 있었다. 소규모 탄화수소 생성물 생산을 위하여, pBAD24 (암피실린 내성 및 최종-생성물 합성 경로를 가짐)와 pUMVC1 (카나마이신 내성 및 아세틸 CoA/말로닐 CoA 과-발현 시스템을 가짐)을 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3) 세포가 37 ℃에서 밤새 배양되고, 배양액이 > 0.8의 OD600 에 이를 때까지 75 μg/mL 암피실린 및 50 μg/ml 카나마이신으로 보충된 500 ml LB 배지 내에서 2L 플라스크에서 >200 rpm로 교반되었다. > 0.8의 OD600가 달성될 때, 세포는 생산을 위해 조작된 유전자 시스템을 활성화하기 위해 그리고 (umuC 및 umuD 단백질의 활성화를 통해) 세포 증식을 멈추기 위해 25 mM 나트륨 프로피오네이트(pH 8.0)로 보충된다. 유도는 6 시간동안 30 ℃에서 수행된다. 배양 후, 배지는 GC-MS 를 사용하여 생성물에 대해 시험된다(이하 기재된 바와 같음).
대규모 생성물 생산을 위해, 조작된 미생물은 10 L, 100 L 또는 이보다 큰 배치(batch) 내에서 성장되고, 발효되고, 그리고 플라스미드 내에 암호화된 특정 유전자에 기초한 원하는 생성물을 적당히 발현하도록 유도된다. pBAD24 (암피실린 내성 및 최종-생성물 합성 경로를 가짐)와 pUMVC1 (카나마이신 내성 및 아세틸-CoA/말로닐-CoA 과-발현 시스템을 가짐)를 갖는 E. 콜라이 BL21(DE3) 세포가, 37 ℃에서 LB 배지(글리세롤 없음) 내에서 10 L 발효를 위한 500 mL 시드 배양액(seed culture)(100 L 발효를 위한 5 L)으로부터 배양되고, 배양액이 >0.8의 OD600 에 이를 때까지 > 200 rpm에서 교반되고(일반적으로 16 시간), 50 μg/mL 카나마이신 및 75 μg/mL 암피실린과 함께 배양된다. 배지는, 생산을 위해 조작된 유전자 시스템을 활성화하기 위해 그리고 (umuC 및 umuD 단백질의 활성화를 통해) 세포 증식을 멈추기 위해 25 mM 나트륨 프로피오네이트(pH 8.0)를 유지하도록 연속적으로 보충되면서 처리된다. 배지는 90 g/100 mL 농도를 유지하기 위해 글루코오스로 연속적으로 보충된다. 첫 시간의 유도 후, 전체 세포 부피의 10% 이하의 분취액(aliquot)이 각 시간에 제거되고 그리고 젓지 않고 방치되어, 탄화수소 생성물이 표면까지 상승하고 그리고 자발적으로 상 분리되도록 한다. 이어서, 탄화수소 성분이 수집되고 그리고 수상(aqueous phase)이 반응 챔버 내로 되돌려보내진다. 반응 챔버가 연속적으로 작동된다. OD600이 0.6 아래로 떨어질 때, 세포는 시드 배양액(seed culture)으로부터 성장된 새로운 배치로 대체된다.
왁스 에스테르 생산을 위해, 분리에 연이어, 왁스 에스테르는 에스테르 결합을 끊기 위해 1 M HCl 내에서 잠시 세척되고, 그리고 증류수로 많이 세척되어 pH 7로 회복된다.
실시예 12, 생성물 특징화
지방 알콜 및 지방산 에스테르를 특징화하고 그리고 정량하기 위해, 전자 충격 질량 스펙트럼(electron impact mass spectra)(MS) 검출과 커플링된 가스 크로마토그래피(GC)가 사용되었다. 지방 알콜 샘플은 먼저 검출 감도를 증가시키기 위해 과량의 N-트리메틸실릴(TMS) 이미다졸로 유도체화되었다. 지방산 에스테르는 유도체화를 요구하지 않았다. 지방 알콜-TMS 유도체 및 지방산 에스테르는 모두 에틸 아세테이트와 같은 적당한 휘발성 용매 중에 용해되었다. 샘플은 이하의 방법을 사용하여 30m DP-5 모세관 컬럼(capillary column) 상에서 분석되었다. GC/MS 컬럼 상에 1 μL 비분할 주입(splitless injection) 후, 오븐(oven)을 100 ℃에서 3 분동안 유지한다. 온도는 20 ℃/분의 속도로 320 ℃까지 상승되었다(ramped up). 오븐은 320 ℃에서 추가 5 분동안 유지되었다. 캐리어 가스 헬륨의 유량(flow rate)은 1.3 mL/분이었다. MS 사중극자는 50으로부터 550 m/z 까지 스캔한다. 생성물 피크의 단편화 패턴(fragmentation patterns) 및 머무름 시간(Retention time)이 피크 본질(peak identity)을 확인하기 위해 인증된 기준물질(authentic reference)과 비교되었다.
예를 들어, 헥사데콘산 에틸 에스테르(hexadeconic acid ethyl ester)가 10.18 분에 용리되었다(도 9A 및 9B). 284 질량 단위의 모이온(parent ion)이 쉽게 관찰되었다. 질량 단편화(mass fragmentation) 동안 생산된 딸이온들은 보다 풍부하였다. 이는 80 질량 단위의 가장 지배적인 딸이온을 포함하였다. 유도체화된 지방 알콜 헥사데칸올-TMS가 10.29 분에 용리되었고, 그리고 313의 모이온이 관찰될 수 있었다. 가장 지배적인 이온은 299 질량 단위의 M-14 이온이었다.
상기된 GC/MS 방법을 사용하여, 다양한 농도의 적당한 인증된 기준물질을 주입함으로써 정량화가 실시되었다. 이 정보는 반응(전체 합쳐진 이온 수(total integrated ion count)) 대 농도를 갖는 표준 곡선을 만들기 위해 사용되었다.
등가물(EQUIVALENT)
본 발명의 구체적인 예가 본 명세서에 명백히 개시되어 있지만, 상기 상세한설명 및 실시예는 본 명세서에서 설명하기 위한 것이며 제한하기 위한 것은 아니다. 본 발명의 다양한 변형예는, 실시예를 포함하여 이 상세한 설명의 검토 시에 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는, 실시예를 이들의 등가물의 전체 범위와 함께, 그리고 상세한설명을 이러한 변형예와 함께 참조함으로써 결정되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> LS9, Inc <120> Fatty Acids and Derivatives thereof <130> 7771-77376-02 <160> 30 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 498 <212> DNA <213> Vibrio furnisii <400> 1 gtagatgagc ctaaattttc tagaatttag aaaaacctat tgtagaactg gaagctaaaa 60 ttcaggcgct tcgtgacgtg tctcgtcatg gcggtggaac ttccgtagat cttgaaaaag 120 agatcgaaca gctagaaaag aaaagcctag agcttaaaaa gaaaattttc ggtgatttag 180 gggcatggca agtggcacag atggctcgcc atccacaacg tccttacacc ttagattaca 240 tcaacaacat gtttacggag ttcgatgaac tagccggtga ccgtgcattt gctgacgaca 300 aagcgatcgt gggcggcatg gcccgcttag atggtcgccc tgtgatggtg attggtcatc 360 agaaaggccg tgaaacccgt gaaaaagtaa aacgtaactt tgggatgcca aagccagaag 420 gttaccgtaa agccctgcgt ttgatggaaa tggctgagcg tttcaacatg ccaatcatta 480 ccttcatcga cacggcgg 498 <210> 2 <211> 564 <212> DNA <213> Vibrio furnisii <400> 2 atgaattcgc tttgtcggca gccgttcgcg cgctgcaagc aaagtaaacc caaacactct 60 gcagctcaat tgagctgtct tattcacaag ataaaagaga aagaaacaat ggatattcgt 120 aaaatcaaga agcttatcga attggttgaa 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Gln Ala Val 1 5 10 15 Gly Met Leu Ala Glu Leu Gly Glu Gln Tyr Asp Val Val Lys Gln Thr 20 25 30 Phe Ala Glu Ala Ser Asp Ala Leu Gly Tyr Asp Leu Trp Ala Leu Val 35 40 45 Gln Asn Gly Pro Val Glu Asp Leu Asn Gln Thr Phe Arg Thr Gln Pro 50 55 60 Ala Leu Leu Ala Ser Ser Val Ala Ile Trp Arg Val Trp Gln Ala Leu 65 70 75 80 Gly Leu Glu Gln Pro Glu Val Leu Ala Gly His Ser Leu Gly Glu Tyr 85 90 95 Ser Ala Leu Val Cys Ala Gly Val Ile Asp Phe Lys Ala Ala Ile Lys 100 105 110 Leu Val Glu Leu Arg Gly Gln Leu Met Gln Glu Ala Val Pro Ala Gly 115 120 125 Thr Gly Ala Met Tyr Ala Ile Ile Gly Leu Asp Asp Ala Ala Ile Ala 130 135 140 Lys Ala Cys Glu Asp Ala Ala Gln Gly Asp Val Val Ser Pro Val Asn 145 150 155 160 Phe Asn Ser Pro Gly Gln Val Val Ile Ala Gly Gln Lys Asp Ala Val 165 170 175 Glu Arg Ala Gly Ala Leu Cys Lys Glu Ala Gly Ala Lys Arg Ala Leu 180 185 190 Pro Leu Pro Val Ser Val Pro Ser His Cys Ala Leu Met Lys Pro Ala 195 200 205 Ala Glu Lys Leu Ala Val Ala Leu Glu Ala Leu Glu Phe Asn Ala Pro 210 215 220 Gln Ile Pro Val Ile Asn Asn Val Asp Val Ala Thr Glu Thr Asp Pro 225 230 235 240 Ala Lys Ile Lys Asp Ala Leu Val Arg Gln Leu His Ser Pro Val Arg 245 250 255 Trp Thr Glu Gly Val Glu Lys Met Ala Ala Gln Gly Ile Glu Lys Leu 260 265 270 Ile Glu Val Gly Pro Gly Lys Val Leu Thr Gly Leu Thr Lys Arg Ile 275 280 285 Val Lys Thr Leu Asp Ala Ala Ala Val Asn Asp Ile Ala Ser Leu Glu 290 295 300 Ala Val Lys 305 <210> 26 <211> 248 <212> PRT <213> Vibrio furnisii <400> 26 Met Ser Asn Phe Met Asn Leu Glu Gly Lys Ile Val Leu Val Thr Gly 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Ile Gly Lys Ala Ile Ala Glu Leu Leu Val Glu Arg 20 25 30 Gly Ala Thr Val Ile Gly Thr Ala Thr Ser Glu Ser Gly Ala Asp Ala 35 40 45 Ile Ser Ala Tyr Leu Gly Asp Asn Gly Lys Gly Leu Ala Leu Asn Val 50 55 60 Thr Asp Val Ala Ser Ile Glu Ser Val Leu Lys Ser Ile Asn Asp Glu 65 70 75 80 Phe Gly Gly Val Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp 85 90 95 Asn Leu Leu Met Arg Met Lys Asp Asp Glu Trp Thr Asp Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Asn Leu Thr Ser Ile Phe Arg Leu Ser Lys Ala Val Leu Arg Gly 115 120 125 Met Met Lys Lys Arg Gln Gly Arg Ile Ile Asn Val Gly Ser Val Val 130 135 140 Gly Thr Met Gly Asn Ala Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Ala Ala Lys Ala 145 150 155 160 Gly Val Ile Gly Phe Thr Lys Ser Met Ala Arg Glu Val Ala Ser Arg 165 170 175 Gly Val Thr Val Asn Thr Val Ala Pro Gly Phe Ile Glu Thr Asp Met 180 185 190 Thr Lys Ala Leu Asn Asp Asp Gln Arg Ala Ala Thr Leu Ala Gln Val 195 200 205 Pro Ala Gly Arg Leu Gly Asp Pro Arg Glu Ile Ala Ser Ala Val Ala 210 215 220 Phe Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Leu His 225 230 235 240 Val Asn Gly Gly Met Tyr Met Val 245 <210> 27 <211> 77 <212> PRT <213> Vibrio furnisii <400> 27 Met Ser Asn Ile Glu Glu Arg Val Lys Lys Ile Ile Val Glu Gln Leu 1 5 10 15 Gly Val Asp Glu Ala Glu Val Lys Asn Glu Ala Ser Phe Val Glu Asp 20 25 30 Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala Leu Glu 35 40 45 Glu Glu Phe Asp Thr Glu Ile Pro Asp Glu Glu Ala Glu Lys Ile Thr 50 55 60 Thr Val Gln Ala Ala Ile Asp Tyr Val Asn Ser Ala Gln 65 70 75 <210> 28 <211> 416 <212> PRT <213> Vibrio furnisii <400> 28 Met Ile Val Ser Lys Arg Arg Val Val Val Thr Gly Met Gly Met Leu 1 5 10 15 Ser Pro Val Gly Asn Thr Val Glu Ser Ser Trp Lys Ala Leu Leu Ala 20 25 30 Gly Gln Ser Gly Ile Val Asn Ile Glu His Phe Asp Thr Thr Asn Phe 35 40 45 Ser Thr Arg Phe Ala Gly Leu Val Lys Asp Phe Asn Cys Glu Glu Tyr 50 55 60 Met Ser Lys Lys Asp Ala Arg Lys Met Asp Leu Phe Ile Gln Tyr Gly 65 70 75 80 Ile Ala Ala Gly Ile Gln Ala Leu Asp Asp Ser Gly Leu Val Ile Thr 85 90 95 Glu Glu Asn Ala Pro Arg Val Gly Val Ala Ile Gly Ser Gly Ile Gly 100 105 110 Gly Leu Asp Leu Ile Glu Lys Gly His Gln Ala Leu Met Glu Lys Gly 115 120 125 Pro Arg Lys Val Ser Pro Phe Phe Val Pro Ser Thr Ile Val Asn Met 130 135 140 Val Ala Gly Asn Leu Ser Ile Met Arg Gly Leu Arg Gly Pro Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ile Ser Thr Ala Cys Thr Thr Gly Leu His Asn Ile Gly His Ala 165 170 175 Ala Arg Met Ile Ala Tyr Gly Asp Ala Glu Ala Met Val Ala Gly Gly 180 185 190 Ser Glu Lys Ala Ser Thr Pro Leu Gly Met Ala Gly Phe Gly Ala Ala 195 200 205 Lys Ala Leu Ser Thr Arg Asn Asp Glu Pro Ala Lys Ala Ser Arg Pro 210 215 220 Trp Asp Lys Asp Arg Asp Gly Phe Val Leu Gly Asp Gly Ala Gly Val 225 230 235 240 Met Val Leu Glu Gly Tyr Glu His Ala Lys Ala Arg Gly Ala Lys Ile 245 250 255 Tyr Ala Glu Ile Val Gly Phe Gly Met Ser Gly Asp Ala Tyr His Met 260 265 270 Thr Ser Pro Ser Glu Asp Gly Ser Gly Gly Ala Leu Ala Met Glu Ala 275 280 285 Ala Met Arg Asp Ala Ala Leu Ala Gly Thr Gln Ile Gly Tyr Val Asn 290 295 300 Ala His Gly Thr Ser Thr Pro Ala Gly Asp Val Ala Glu Val Lys Gly 305 310 315 320 Ile Lys Arg Ala Leu Gly Glu Asp Gly Ala Lys Gln Val Leu Ile Ser 325 330 335 Ser Thr Lys Ser Met Thr Gly His Leu Leu Gly Ala Ala Gly Ser Val 340 345 350 Glu Ala Ile Ile Thr Val Met Ser Leu Val Asp Gln Ile Val Pro Pro 355 360 365 Thr Ile Asn Leu Asp Asn Pro Glu Glu Gly Leu Gly Val Asp Leu Val 370 375 380 Pro His Thr Ala Arg Lys Val Glu Gly Met Glu Tyr Ala Met Cys Asn 385 390 395 400 Ser Phe Gly Phe Gly Gly Thr Asn Gly Ser Leu Ile Phe Lys Arg Val 405 410 415 <210> 29 <211> 344 <212> PRT <213> Vibrio furnisii <400> 29 Met Thr Asp Ser His Thr Asn Asn Ala Tyr Gly Lys Ala Ile Ala Met 1 5 10 15 Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr Gly Thr Ser Leu Ala Ile Ser Leu 20 25 30 Ala Arg Asn Gly Ala Asn Val Val Leu Trp Gly His Asp Pro Val His 35 40 45 Met Ala Arg Leu Glu Ala Glu Arg Ala Asn His Glu Phe Leu Pro Asp 50 55 60 Ile Asp Phe Pro Pro Ser Leu Ile Ile Glu Ser Asp Leu Gln Lys Ala 65 70 75 80 Val Gln Ala Ser Arg Asp Leu Leu Val Val Val Pro Ser His Val Phe 85 90 95 Ala Ile Val Leu Asn Ser Leu Gln Pro Tyr Leu Arg Glu Asp Thr Arg 100 105 110 Ile Cys Trp Ala Thr Lys Gly Leu Glu Pro Asp Thr Gly Arg Leu Leu 115 120 125 Gln Asp Val Ala His Asp Val Leu Gly Glu Ser His Pro Leu Ala Val 130 135 140 Leu Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys Glu Leu Ala Met Gly Met Pro Thr 145 150 155 160 Ala Ile Ser Val Ala Ser Pro Asp Ala Gln Phe Val Ala Asp Leu Gln 165 170 175 Glu Lys Ile His Cys Ser Lys Thr Phe Arg Val Tyr Ala Asn Ser Asp 180 185 190 Phe Ile Gly Met Gln Leu Gly Gly Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile 195 200 205 Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr 210 215 220 Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala Glu Met Thr Arg Leu Gly Ala Ala 225 230 235 240 Leu Gly Ala Gln Pro Glu Thr Phe Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp 245 250 255 Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly 260 265 270 Leu Ala Leu Gly Gln Gly Lys Asp Val Asp Thr Ala Gln Gln Asp Ile 275 280 285 Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg Asn Thr Lys Glu Val Trp Leu Leu 290 295 300 Ala Gln Arg Met Gly Val Glu Met Pro Ile Val Glu Gln Ile Tyr Gln 305 310 315 320 Val Leu Tyr Gln Gly Lys Asp Ala Arg Met Ala Ala Gln Asp Leu Leu 325 330 335 Ala Arg Asp Lys Lys Ala Glu Arg 340 <210> 30 <211> 284 <212> PRT <213> Vibrio furnisii <400> 30 Val Val Cys Ala Phe Val Asn Asp Asp Leu Ser Ala Thr Val Leu Glu 1 5 10 15 Glu Leu Tyr Gln Gly Gly Thr Arg Leu Ile Ala Met Arg Cys Ala Gly 20 25 30 Phe Asp Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Arg Ile Gly Met Gln Val 35 40 45 Val Arg Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Val 50 55 60 Gly Leu Met Met Cys Leu Asn Arg Arg Tyr His Lys Ala Tyr Gln Arg 65 70 75 80 Thr Arg Glu Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Val Gly Phe Asn Phe 85 90 95 Tyr Gly Lys Thr Val Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Ile Gly Ile Ala 100 105 110 Ala Met Arg Ile Leu Lys Gly Leu Gly Met Asn Ile Leu Cys Phe Asp 115 120 125 Pro Tyr Glu Asn Pro Leu Ala Ile Glu Ile Gly Ala Lys Tyr Val Gln 130 135 140 Leu Pro Glu Leu Tyr Ala Asn Ser Asp Ile Ile Thr Leu His Cys Pro 145 150 155 160 Met Thr Lys Glu Asn Tyr His Leu Leu Asp Glu Gln Ala Phe Ala Gln 165 170 175 Met Lys Asp Gly Val Met Ile Ile Asn Thr Ser Arg Gly Glu Leu Leu 180 185 190 Asp Ser Val Ala Ala Ile Glu Ala Leu Lys Arg Gly Arg Ile Gly Ala 195 200 205 Leu Gly Leu Asp Val Tyr Asp Asn Glu Lys Asp Leu Phe Phe Gln Asp 210 215 220 Lys Ser Asn Asp Val Ile Val Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala 225 230 235 240 Cys His Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gln Ala Phe Leu Thr Glu Asp 245 250 255 Ala Leu His Asn Ile Ala Gln Thr Thr Leu Asn Asn Val Leu Ala Phe 260 265 270 Glu Gln Gly Thr Lys Ser Gly Asn Glu Leu Val Asn 275 280

Claims (59)

  1. Figure 112008082616218-PCT00015
    및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 및 왁스 신타아제 (EC 2.3.1.75)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  2. Figure 112008082616218-PCT00016
    및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 및 알콜 아세틸트랜스퍼라아제 (2.3.1.84)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  3. Figure 112008082616218-PCT00017
    및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 및 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  4. Figure 112008082616218-PCT00018
    및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 펩티드, 및 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (1.1.1.*)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  5. Figure 112008082616218-PCT00019
    신타아제 (EC 6.3.2.3) 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 약화 내인성 핵산 서열, 및 왁스 신타아제 (EC 2.3.1.75) 또는 아실트랜스퍼라아제 (EC2.3.1.84)를 포함하는 제 2 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  6. Figure 112008082616218-PCT00020
    신타아제 (EC 6.3.2.3) 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 약화 내인성 핵산 서열, 및 알콜 아세틸트랜스퍼라아제 (EC 2.3.1.84)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  7. Figure 112008082616218-PCT00021
    Figure 112008082616218-PCT00022
    신타아제 (EC 6.3.2.3) 및 이의 조합로부터 선택된 하나 이상의 약화 내인성 핵산 서열, 및 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  8. Figure 112008082616218-PCT00023
    신타아제 (EC 6.3.2.3) 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 약화 내인성 핵산 서열, 및 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제 (1.2.1.*)를 포함하는 펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 미생물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 E. 콜라이인 것을 특징으로 하는 미생물.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 부가적으로 지방산 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 미생물은 부가적으로 ACP, Sfa, 또는 이의 조합을 암호화하는 외인성 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 미생물은
    Figure 112008082616218-PCT00024
    Figure 112008082616218-PCT00025
    및 이의 조합 중 하나 이상의 성분들로부터 선택된 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하고, 상기 지방산 유도체는 분지되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 미생물은 티오에스테라아제 (3.1.2.-, 3.1.1.-)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 미생물은 fabB (EC2.3.1.41), fabK (EC 1.2.1.9), fabL (EC 1.2.1.9), fabM (5.3.3.14), fadE (EC1.3.99.3, 1.3.99.-) 및 이의 조합으로부터 선택된 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하고, 그리고 상기 지방산 유 도체는 불포화되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  15. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    fadE는 약화되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  16. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    accABCE, fadD는 과-발현되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  17. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 적어도 10 mg/L 지방산 에스테르, 10 mg/L 지방 알콜, 10 mg/L 탄화수소 또는 적어도 10 mg/L 왁스를 포함하는 발효 브로스(발효 broth)를 포함하는 용기 내에 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
  18. 제 10 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 약 1 로부터 약 5개까지의 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  19. 제 10 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 약 8 로부터 약 30 개까지의 탄소 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  20. 제 10 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 약 1 로부터 약 5 개까지의 분지점을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  21. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 부가적으로 A 쪽 및 B 쪽을 갖는 지방산 에스테르 또는 왁스를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 A 쪽 및 상기 B 쪽은 상기 미생물에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 A 쪽, B 쪽, 또는 상기 A 쪽 및 상기 B 쪽 모두는 약 1 로부터 약 5개까지의 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 A 쪽, B 쪽, 또는 상기 A 쪽 및 상기 B 쪽 모두는 약 1 로부터 약 26 개까지의 탄소 사슬 길이를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  25. 제 21 항에 있어서,
    상기 A 쪽, B 쪽, 또는 상기 A 쪽 및 상기 B 쪽 모두는 약 1 로부터 약 5개까지의 탄소 분지점을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  26. 제 21 항에 있어서,
    상기 A 쪽, B 쪽, 또는 상기 A 쪽 및 상기 B 쪽 모두는 1 내지 5개의 사이클로프로필 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  27. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 아스로박터 종(Arthrobacter sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 크로마티움 종(Chromatium sp.), 클라도스포리움 레지나(Cladosporium resina)(ATCC22711), 클로스트리디움 파스테우리아눔 VKM(Clostridium pasteurianum VKM), 클로스트리디움 테나노모르품(Clostridium tenanomorphum), 클로스트리디움 아시디우리시(Clostridium acidiurici), 코리네박테리움 종(Corynebacterium species), 시아노박테리움 종(Cyanobacterial species)(노스톡 뮤스코룸(Nostoc muscorum), 아나시스티스(시네초코커스) 니둘란스(Anacystis (Synechococcus) nidulans), 포르미디움 루리둠(Phormidium luridum), 클로로글로에아 프릿치(Chlorogloea fritschii), 트리코데스미움 에리테움(Trichodesmium erythaeum), 오실라토리아 윌리암 시(Oscillatoria williamsii), 미크로콜레우스 크토노플라세이스(Microcoleus chthonoplaseis), 코코클로리스 엘라벤스(Coccochloris elabens), 아그메넬룸 쿠아드루플리카툼(Agmenellum quadruplicatum), 플렉토네마 테레브란스(Plectonema terebrans), M 바지나투스(M vaginatus), 및 C. 스코풀로룸(C. scopulorum)), 데슐포비브리오 데슐퓨리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577), 키네오코커스 라디오톨레란스(Kineococcus radiotolerans)(BAA-149), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.)(ATCC 146, 398, 401, 533), 마이크로코커스 로세우스(Micrococcus roseus)(ATCC 412, 416, 516), 마이크로코커스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 미코박테리움 종(Mycobacterium species), 페니실리움 종(Penicillium sp.), 아스페르질루스 종(Aspergillus sp.), 트리코데르마 비리다(Trichoderma virida), 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 제오트갈리코커스 종(Jeotgalicoccus sp.)(M. candicans)(ATCC 8456), 로도슈도모나스 스페로이즈 클로로비움 종(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.), 로도스피릴리움 루브룸(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170), 로도마이크로비움 바니엘리(Rhodomicrobium vannielii), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.)(오비포르머스(oviformus), 루드위기(ludwiggi), 트로피칼리스(tropicalis)), 비브리오 푸르니 시 M1(Vibrio furnissii Ml), 비브리오 마리누스 MP-1(Vibrio marinus MP-1), 비브리오 폰티쿠스(Vibrio ponticus), 세라티아 마리노루브라(Serratia marinorubra), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 누다(Ustilago nuda), 우로시스티스 아그로피리(Urocystis agropyri), 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana), 또는 틸레티아 종(Tilletia sp.)(포에티다(foetida), 카리에스(caries), 콘트로베르사(controversa))인 것을 특징으로 하는 미생물.
  28. 제 3 항, 제 4 항, 제 7 항, 또는 제 8 항 중 어느 한 항의 미생물을 지방 알콜을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 상기 지방 알콜을 분리하는 단계를 포함하는 지방 알콜의 생산 방법.
  29. 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 미생물을 지방산 에스테르를 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 상기 지방산 에스테르를 분리하는 단계를 포함하는 지방산 에스테르의 생산 방법.
  30. 제 1 항, 제 2 항, 제 6 항, 제 7 항 또는 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 미생물을 왁스를 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 상기 왁스를 분리하는 단계를 포함하는 왁스의 생산 방법.
  31. Figure 112008082616218-PCT00026
    및 이의 조합으로부터 선택된 제 1 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 포함하는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 크로마티움 종(Chromatium sp.), 클라도스포리움 레지나(Cladosporium resina)(ATCC22711), 클로스트리디움 파스테우리아눔 VKM(Clostridium pasteurianum VKM), 클로스트리디움 테나노모르품(Clostridium tenanomorphum), 클로스트리디움 아시디우리시(Clostridium acidiurici), 코리네박테리움 종(Corynebacterium species), 시아노박테리움 종(cyanobacterial species)(노스톡 뮤스코룸(Nostoc muscorum), 아나시스티스(시네초코커스) 니둘란스(Anacystis (Synechococcus) nidulans), 포르미디움 루리둠(Phormidium luridum), 클로로글로에아 프릿치(Chlorogloea fritschii), 트리코데스미움 에리테움(Trichodesmium erythaeum), 오실라토리아 윌리암시(Oscillatoria williamsii), 미크로콜레우스 크토노플라세이스(Microcoleus chthonoplaseis), 코코클로리스 엘라벤스(Coccochloris elabens), 아그메넬룸 쿠아 드루플리카툼(Agmenellum quadruplicatum), 플렉토네마 테레브란스(Plectonema terebrans), M 바지나투스(M vaginatus), 및 C. 스코풀로룸(C. scopulorum)), 데슐포비브리오 데슐퓨리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577), 키네오코커스 라디오톨레란스(Kineococcus radiotolerans)(BAA-149), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.)(ATCC 146, 398, 401, 533), 마이크로코커스 로세우스(Micrococcus roseus)(ATCC 412, 416, 516), 마이크로코커스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 미코박테리움 종(Mycobacterium species), 페니실리움 종(Penicillium sp.), 아스페르질루스 종(Aspergillus sp.), 트리코데르마 비리다(Trichoderma virida), 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 제오트갈리코커스 종(Jeotgalicoccus sp.)(M. candicans)(ATCC 8456), 로도슈도모나스 스페로이즈 클로로비움 종(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.), 로도스피릴리움 루브룸(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170), 로도마이크로비움 바니엘리(Rhodomicrobium vannielii), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.)(오비포르머스(oviformus), 루드위기(ludwiggi), 트로피칼리스(tropicalis)), 비브리오 푸르니시 M1(Vibrio furnissii Ml), 비브리오 마리누스 MP-1(Vibrio marinus MP-1), 비브리오 폰티쿠스(Vibrio ponticus), 세라티아 마리노루브라(Serratia marinorubra), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 누다(Ustilago nuda), 우로시스티스 아그로피리(Urocystis agropyri), 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana), 또는 틸레티아 종(Tilletia sp.)(포에티다(foetida), 카리에스(caries), 콘트로베르사(controversa))로부터 선택된 미생물로서, 상기 미생물은 야생-형 미생물에 비해 증가된 양의 탄화수소를 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  32. Figure 112008082616218-PCT00027
    및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 약화된 내인성 핵산 서열을 포함하는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.), 바실러스 종(Bacillus sp.), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 크로마티움 종(Chromatium sp.), 클라도스포리움 레지나(Cladosporium resina)(ATCC22711), 클로스트리디움 파스테우리아눔 VKM(Clostridium pasteurianum VKM), 클로스트리디움 테나노모르품(Clostridium tenanomorphum), 클로스트리디움 아시디우리시(Clostridium acidiurici), 코리네박테리움 종(Corynebacterium species), 시아노박테리움 종(cyanobacterial species)(노스톡 뮤스코룸(Nostoc muscorum), 아나시스티스(시네초코커스) 니둘란스(Anacystis (Synechococcus) nidulans), 포르미디움 루리둠(Phormidium luridum), 클로로글로에아 프릿치(Chlorogloea fritschii), 트리코데스미움 에리테움(Trichodesmium erythaeum), 오실라토리아 윌리암시(Oscillatoria williamsii), 미크로콜레우스 크토노플라세이스(Microcoleus chthonoplaseis), 코코클로리스 엘라벤스(Coccochloris elabens), 아그메넬룸 쿠아드루플리카툼(Agmenellum quadruplicatum), 플렉토네마 테레브란스(Plectonema terebrans), M 바지나투스(M vaginatus), 및 C. 스코풀로룸(C. scopulorum)), 데슐포비브리오 데슐퓨리칸스(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577), 키네오코커스 라디오톨레란스(Kineococcus radiotolerans)(BAA-149), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)(FD533, ATCC 272, 381, 382, ISU, 540, 4698, 7468, 27141), 마이크로코커스 종(Micrococcus sp.)(ATCC 146, 398, 401, 533), 마이크로코커스 로세우스(Micrococcus roseus)(ATCC 412, 416, 516), 마이크로코커스 리소데이크티쿠스(Micrococcus lysodeikticus), 미코박테리움 종(Mycobacterium species), 페니실리움 종(Penicillium sp.), 아스페르질루스 종(Aspergillus sp.), 트리코데르마 비리다(Trichoderma virida), 풀루라리아 풀루란스(Pullularia pullulans), 제오트갈리코커스 종(Jeotgalicoccus sp.)(M. candicans)(ATCC 8456), 로도슈도모나스 스페로이즈 클로로비움 종(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.), 로도스피릴리움 루브룸(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170), 로도마이크로비움 바니엘리(Rhodomicrobium vannielii), 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637, 17444, 17445, 17666, 17668, 17673, 17674, 17679, 17677), 사카로미코데스 루드위기(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711), 사카로 마이세스 종(Saccharomyces sp.)(오비포르머스(oviformus), 루드위기(ludwiggi), 트로피칼리스(tropicalis)), 비브리오 푸르니시 M1(Vibrio furnissii Ml), 비브리오 마리누스 MP-1(Vibrio marinus MP-1), 비브리오 폰티쿠스(Vibrio ponticus), 세라티아 마리노루브라(Serratia marinorubra), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 우스틸라고 누다(Ustilago nuda), 우로시스티스 아그로피리(Urocystis agropyri), 스파셀로테카 레일리아나(Sphacelotheca reiliana), 또는 틸레티아 종(Tilletia sp.)(포에티다(foetida), 카리에스(caries), 콘트로베르사(controversa))로부터 선택된 미생물로서, 상기 미생물은 야생-형 미생물에 비해 증가된 양의 탄화수소를 생산하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 부가적으로 왁스 신타아제 (EC 2.3.1.75), 알콜 아세틸트랜스퍼라아제 (2.3.1.84), 알콜 데하이드로게나아제 (EC 1.1.1.1), 및 지방 알콜 형성 아실-CoA 리덕타아제(1.1.1.*)로부터 선택된 효소를 발현하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  34. 제 31 항 또는 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은
    Figure 112008082616218-PCT00028
    의 하나 이상의 성분들, 및 이의 조합으로부터 선택된 효소를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 발현하는 것을 특징으로 하고, 상기 지방산 유도체는 분지되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  35. 제 31 항 또는 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 티오에스테라아제 (3.1.2.-, 3.1.1.-)를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열을 발현하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  36. 제 31 항 또는 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은
    Figure 112008082616218-PCT00029
    및 이의 조합으로부터 선택된 효소를 암호화하는 하나 이상의 외인성 핵산 서열 을 발현하는 것을 특징으로 하는 미생물.
  37. 제 1 항 내지 제 28 항, 및 제 31 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항의 미생물을 지방산 유도체를 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계;
    상기 지방산 유도체를 유기상 내로 분리되도록 하는 단계; 및
    상기 지방산 유도체를 상기 유기상으로부터 정제하는 단계를 포함하는 정제된 지방산 유도체의 수득 방법.
  38. 적어도 약 85 %의 지방산 유도체, 여기서 상기 지방산 유도체는 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3로 구성되는 그룹으로부터 선택된 탄소 사슬을 포함함; 및
    바이오연료 조성물의 운점을 약 0 ℃ 미만까지 낮추기에 충분한 적어도 하나의 첨가제를 포함하는 바이오연료 조성물.
  39. 적어도 약 17 %의 지방산 유도체, 여기서 상기 지방산 유도체는 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3로 구성되는 그룹으로부터 선택된 탄소 사슬을 포함함; 및
    적어도 약 80 %의 전통적인 디젤 연료를 포함하는 바이오연료.
  40. 약 -10.9 로부터 약 -15.4까지의 δ13C를 갖는 지방산 유도체를 포함하고, 상기 지방산 유도체는 조성물 내 바이오소스 물질(biosourced material)의 적어도 약 85%를 차지하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  41. 다음 식의 지방산 유도체를 포함하고,
    X-(CH(R))nCH3
    여기서, X는 CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; 또는 -C(O)NR3R4이고;
    R은, 각 n에 대해, 독립적으로 부재하거나, H 또는 저급 지방족이고;
    n은 8 내지 34의 정수이고; 그리고
    R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 H 및 저급 알킬로부터 선택됨;
    상기 지방산 유도체는 약 -10.9 로부터 약 -15.4까지의 δ13C를 가지고; 그리고 상기 지방산 유도체는 조성물 내 바이오소스 물질의 적어도 약 85%를 차지하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  42. 제 40 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 조성물 내 바이오소스 지방산-유도된 물질의 적어도 약 85 %를 차지하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 적어도 약 1.003의 현대 탄소(modern carbon)(fM 14C)의 분율을 갖는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  44. 제 41 항에 있어서,
    R은, 각 n에 대해, 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 이소부틸, 2차-부틸 및 사이클로펜텐일로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  45. 제 41 항에 있어서,
    식 (CH(R))n 은 적어도 하나의 알켄일 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  46. 제 41 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3로 구성되는 그룹으로부터 선택된 탄소 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  47. 제 41 항에 있어서,
    바이오연료 조성물 내에 저급 알콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 저급 알콜은 에탄올, 부탄올, 헥산올 또는 이의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  49. 제 47 항에 있어서,
    계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  50. 제 47 항에 있어서,
    상기 바이오연료 조성물은 마이크로에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  51. 적어도 약 55 %의 지방산 유도체, 여기서 상기 지방산 유도체는 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 탄소 사슬을 포함함; 및
    바이오연료 조성물의 운점을 약 0 ℃ 미만까지 낮추기에 충분한 적어도 하나의 첨가제를 포함하는 바이오연료 조성물.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 약 -10.9 로부터 약 -15.4까지의 δ13C를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  53. 제 51 항에 있어서,
    저급 알콜을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  54. 적어도 약 11 %의 지방산 유도체, 여기서 상기 지방산 유도체는 8:0, 10:0, 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, 20:1, 20:2, 20:3, 22:0, 22:1 또는 22:3로 구성되는 그룹으로부터 선택된 탄소 사슬을 포함함; 및
    적어도 약 80 %의 전통적인 디젤 연료를 포함하는 바이오연료 조성물.
  55. 다음 식의 지방산 유도체를 포함하고,
    X-(CH(R))nCH3
    여기서, X는 CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; 또는 -C(O)NR3R4이고;
    R은, 각 n에 대해, 독립적으로 부재하거나, H 또는 저급 알킬이고, 적어도 하나의 R은 저급 알킬이고;
    n은 8 내지 34의 정수이고;
    R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 H 및 저급 알킬로부터 선택되고; 그리고
    상기 지방산 유도체는 약 -10.9 로부터 약 -15.4까지의 δ13C를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물 또는 공급원료.
  56. 제 55 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는 상기 바이오연료 조성물의 적어도 약 10 %인 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  57. 본질적으로 다음 식의 지방산 유도체로 형성되고,
    X-(CH(R))nCH3
    여기서, X는 CH3, -CH2OR1; -C(O)OR2; 또는 -C(O)NR3R4이고;
    R은, 각 n에 대해, 독립적으로 부재하거나, H 또는 저급 알킬이고;
    n은 8 내지 34의 정수이고; 그리고
    R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 H 및 저급 알킬로부터 선택되고;
    상기 지방산 유도체는 약 -10.9 로부터 약 -15.4까지의 δ13C를 갖는 것을 특징으로 하는 바이오연료 조성물.
  58. 제 38 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오연료는 .1 % 미만의 글리세린을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료.
  59. 제 38 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이오연료는 0.1 % 미만의 에스테르 교환(transesterification) 촉매를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오연료.
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