FI122886B - Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa - Google Patents

Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa Download PDF

Info

Publication number
FI122886B
FI122886B FI20105733A FI20105733A FI122886B FI 122886 B FI122886 B FI 122886B FI 20105733 A FI20105733 A FI 20105733A FI 20105733 A FI20105733 A FI 20105733A FI 122886 B FI122886 B FI 122886B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
lipid
plasmid
seq
gene
ald
Prior art date
Application number
FI20105733A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20105733A (fi
FI20105733A0 (fi
Inventor
Merja Penttilae
Laura Ruohonen
Kari Koivuranta
Original Assignee
Valtion Teknillinen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Valtion Teknillinen filed Critical Valtion Teknillinen
Priority to FI20105733A priority Critical patent/FI122886B/fi
Publication of FI20105733A0 publication Critical patent/FI20105733A0/fi
Priority to PCT/FI2011/050594 priority patent/WO2011161317A2/en
Priority to SG2012094389A priority patent/SG186431A1/en
Priority to EP11738253.1A priority patent/EP2585588A2/en
Priority to US13/806,281 priority patent/US9518276B2/en
Publication of FI20105733A publication Critical patent/FI20105733A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI122886B publication Critical patent/FI122886B/fi
Priority to US15/374,811 priority patent/US20170088842A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/649—Biodiesel, i.e. fatty acid alkyl esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/0101—Acetaldehyde dehydrogenase (acetylating) (1.2.1.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01001—Acetate-CoA ligase (6.2.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Description

Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotan-nossa
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee sieniä, joita on muokattu geneettisesti 5 niiden lipidituotannon tehostamiseksi. Keksintö koskee myös menetelmää sienien valmistamiseksi sekä ekspressiokasetteja sienien geneettistä muokkausta varten. Keksintö koskee lisäksi lipidien tuotantomenetelmää näillä sienillä. Tuotetut lipidit ovat käyttökelpoisia biopolttoaineiden ja voiteluaineiden valmistuksessa. Keksinnössä aikaansaadaan siten myös menetelmä biopolttoaineiden 10 ja voiteluaineiden tuottamiseksi.
Keksinnön tausta
Biopolttoaineet ovat nykyisiä suosikkeja seuraavan sukupolven lii-kennepolttoaineiksi. Niitä tuotetaan uusiutuvista biologisista lähteistä kuten kasviöljyistä ja eläinrasvoista. Ne ovat biologisesti hajoavia, myrkyttömiä ja 15 niillä on pieni päästöprofiili. Biodieselin raaka-aineiden, kuten rypsiöljyn, soija-öljyn tai palmuöljyn rajallisten lähteiden takia on tärkeää laajentaa biodieselin raaka-aineita ei-elintarvikeaineisiin kuten mikrobeihin. Edut mikrobien käytöstä öljyjen tuottamiseksi ovat: niihin eivät vaikuta vuodenajat eivätkä ilmastot, ne kykenevät tuottamaan suuria lipidipitoisuuksia, ja öljyjä voidaan tuottaa laajas-20 ta valikoimasta lähteitä, joilla on lyhyet tuotantoajat, erityisesti jätteistä, joissa on runsaasti ravintoa.
Muutamat sienilajit akkumuloivat huomattavia lipidimääriä soluihin. On havaittu, että lipidit akkumuloituvat näihin niin sanottuihin lipidiä tuottaviin sieniin typen suhteen rajoittuneissa olosuhteissa, mikä on johtanut hypoteesiin ^ 25 tehokkaasta lipidien akkumulaatiosta (katsaus Ratledge ja Wynn 2002 ja viit- ™ teet siitä). Typen rajoitus aiheuttaa AMP-deaminaasin aktivoitumisen, joka o käyttää AMP:tä NH4:n tuottamiseksi. AMP-pitoisuuden pieneneminen inhiboi o mitokondrion isositraattidehydrogenaasin (IDH), joka on osa mitokondrion tri- g karboksyyli (TCA) -kiertoa, aktiivisuutta. IDH-aktiivisuuden väheneminen johtaa 30 isositraatin tasapainotukseen sitraatiksi akonitaasilla. Tuotettu sitraatti siirre-£2 tään sytosoliin, missä se muunnetaan koentsyymi A:n (CoA) kanssa asetyyli-
LO
o CoA:ksi ATP:sitraattilyaasilla (ACL) ATP:n hydrolyysin kanssa.
° Sytosolista asetyyli-CoA:ta voidaan edelleen käyttää rasvahappo- synteesissä. Kattava katsaus rasvahappojen synteesistä ja pidennyksestä hii-35 vassa, erityisesti Saccharomyces cerevisiaessa, on Tehlivetsin et ai., 1997.
2
Rasvahapposynteesin ensimmäisessä vaiheessa asetyyli-CoA karboksyloi-daan lisäämällä hiilidioksidia malonyyli-CoA:han entsyymillä asetyyli-CoA-karboksylaasi ATP:tä vaativassa reaktiossa. Seuraavissa reaktioissa asyyli- ja malonyyliosat asyyli-CoA:sta ja malonyyli-CoA:sta vastaavasti siirretään ras-5 vahapposyntaasijärjestelmillä asyylin kantajaproteiineille (ACP:t), sen jälkeen kun asyyliketju, jonka tyypillisesti aloittaa asetyyli-CoA, on kondensoitu malo-nyyli-ACP:n kanssa, mitä seuraa 3-ketoasyyli-ACP:n pelkistys 3-hydroksi-asyyli-ACP:ksi, dehydraatio enoyyli-ACP:ksi ja toinen pelkistys tyydyttyneeksi asyyliketjuksi, joka on pidentynyt kahdella hiiliatomilla. Näitä synteesivaiheita 10 toistetaan tavallisesti seitsemän kertaa, mikä johtaa palmitoyyli-ACP:hen (C16:0). Palmitiinihappoa ja rasvahapposynteesin välimuotoja, sen jälkeen kun ne on hydrolysoitu asyyli-CoA:iksi hydrolaasilla/ tioesteraasilla, voidaan lisäksi muokata erilaisilla elongaaseilla ja desaturaaseilla eripituisiksi asyyliketjuiksi kaksoissidosten kanssa tai ilman niitä. Yhdessä rasvahapposynteesikierrossa 15 tarvitaan kaksi NADPH:ta pelkistysvaiheissa. Asyyli-CoA:t voidaan edelleen syntetisoida triasyyliglyseroleiksi.
Triasyyliglyserolisynteesi alkaa glyseroli-3-fosfaatista tai dihydroksi-asetonifosfaatista, joka asyloidaan (dihydroksiasetonifosfaatti myös pelkistetään) 1 -asyyli-glyseroli-3-fosfaatiksi, joka asyloidaan edelleen fosfatidihapoksi. 20 Fosfatidihappo voidaan edelleen defosforyloida diasyyliglyseroliksi. Diasyyli-glyseroli asyloidaan edelleen triasyyliglyseroliksi pääasiassa asyyli-CoA:dia-syyliglyseroli-asyylitransferaasilla (DGAT) ja fosfolipidi:diasyyliglyseroli-asyyli-transferaasilla (PDAT) käyttäen asyyli-CoA:ta tai fosfatidyylikoliinia vastaavasti asyylin luovuttajina. Triasyyliglyserolireitti hiivassa S. cerevisiae on kuvattu 25 yksityiskohtaisemmin Sorgerin ja Daumin 2003 minikatsauksessa.
Fosfol ipidi:diasyyliglyseroli-asyylitransferaasia (PDAT) koodaavia 5 geenejä, jotka ovat peräisin S. cerevisiaesta ja Yarrowia lipolyticasta, on il-
(M
^ mennetty hiivoissa S. cerevisiae ja Y. lipolytica niiden triasyyliglyserolituotan- ° non tehostamiseksi (WO 00/60095 ja WO 2005/03322 vastaavasti).
° 30 Biodieselin ja muiden öljypohjaisten yhdisteiden valmistusmenetel- | miä, joissa käytetään glyserolia energialähteenä lipidiä tuottavien mikroeliöiden co fermentoinnissa, on kuvattu esim. julkaisussa US 2009/0004715. Lipidipohjais- 00
ten biopolttoaineiden tuotantomenetelmiä selluloosaa sisältävästä raaka-ai-° neesta mikroeliöiden heterotrofisella fermentoinnilla on kuvattu julkaisussa US
^ 35 2009/0064567. Molemmat julkaisut keskittyvät levien käyttöön lipidin tuottajina.
Yksityiskohtia ei ole annettu. Julkaisussa WO 2007/136762 aikaansaadaan 3 geneettisesti muokattuja mikroeliöitä, jotka tuottavat haluttuja tuotteita rasvahapon biosynteettisestä reitistä.
Edellä kuvatulla triasyyliglyserolin tuotantoreitillä suuria triglyseri-disaantoja, jotka merkitään triglyseridin tuotantona käytettyä hiililähdettä kohti, 5 ei voida saavuttaa tai triasyyliglyserolin tuotantoa solun biomassaa kohti ei voida merkittävästi lisätä. Yleensä lipidejä, erityisesti triglyseridejä tuotetaan, kun typestä tulee kasvua rajoittava tekijä myöhäisessä logaritmisessa tai varhaisessa stationaarisessa kasvuvaiheessa, mikä johtaa pieneen triglyseridin tuotantomäärään verrattuna esim. hiivan etanolituotantoon. Lisäksi useiden 10 hiilien ja pelkistyneiden kofaktorien tarve triasyyliglyserolin synteesissä johtaa pieneen saantoon käytettyä hiiltä kohti. Esillä olevassa keksinnössä käytetään toista reittiä mikrobiaalista lipidituotantoa varten. Esillä olevassa keksinnössä mikrobiaalisen lipidituotannon määrä ja saannot ovat lisääntyneet, ja pelkistyneiden kofaktorien tarve lipidireitin ulkopuolelta on vähentynyt. Esillä olevassa 15 keksinnössä aikaansaadaan lisäksi lipidituotanto, joka ei ole kytketty typen rajoitukseen.
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö perustuu pyruvaattidehydrogenaasin ohitusrei-tin käyttöön sytosolisen asetyyli-CoA:n tuottamiseksi. Keksinnössä hyödynne-20 tään aktiivista sytosolista reittiä asetyyli-CoA:n tuotantoa varten, joka etenee pyruvaattidekarboksylaasin (PDC) katalysoiman entsymaattisen reaktion kautta. Tämä reitti tunnetaan Crabtree-positiivisella hiivalla S. cerevisiae, mutta sitä ei ole karakterisoitu lipidiä tuottavilla hiivoilla ja lipidiä tuottavilla rihmasienillä. Lipidiä tuottavilla sienillä toinen sytosolinen reitti asetyyli-CoA:n tuotantoa var-25 ten, joka etenee pyruvaattidehydrogenaasin (PDH) katalysoiman reaktion kaut-
CM
^ ta, on hyvin tunnettu. Tämä reitti toimii mitokondrioiden kautta ja tässä reitissä ^ menetetään suurempi osa hiilestä kuin reitissä pyruvaattidekarboksylaasin 9 kautta. Pyruvaattidekarboksylaasireitissä, jota hyödynnetään tässä keksinnös- o sä, suurempi osa hiilestä kohdistuu triasyyIiglyseroliin eikä se ole riippuvainen | 30 mitokondrion entsyymiaktiivisuuksista. Lisäksi se tuottaa NAD(P)H:ta, jota tar- m vitaan seuraavassa rasvahapposynteesissä. Pyruvaattidehydrogenaasi-ohitus- £2 reitti mahdollisesti yhdessä tehostetun diasyyliglyseroli-asyylitransferaasiaktii- ? visuuden kanssa, kuten keksinnössä aikaansaadaan, poistaa monta pullon en w kaulaa mikrobiaalisesta lipidituotannosta.
4
Keksintö kohdistuu geneettisesti muokattuun sienisoluun, joka käsittää: a) vähintään yhden nukleiinihapon, joka koodaa entsyymin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetalde- 5 hydidehydrogenaasista (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja jonka ekspressio on muokattu mainitun entsyymin yli-ilmentämiseksi, ja b) nukleiinihapon, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroli-asyyli-transferaasi (DAT), ja jonka ekspressio on muokattu mainitun entsyymin yli-ilmentämiseksi.
10 Keksintö kohdistuu myös lipidien tuotantomenetelmään, joka käsit tää vaiheet, joissa viljellään keksinnön mukaista geneettisesti muokattua sie-nisolua alustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteet, ja otetaan tuotetut lipidit talteen.
Keksintö kohdistuu lisäksi biopolttoaineen tai voiteluaineen tuotan-15 tomenetelmään, jolloin mainittu menetelmä käsittää vaiheet, joissa viljellään keksinnön mukaista geneettisesti muokattua sienisolua alustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteet, ja otetaan tuotetut lipidit talteen, ja mahdollisesti esteröi-dään mainitut lipidit biodieselin tai voiteluaineen saamiseksi, tai hydrogenoi-daan lipidit uusiutuvan dieselin tai voiteluaineen saamiseksi.
20 Keksintö kohdistuu lisäksi vielä keksinnön mukaisen geneettisesti muokatun sienisolun valmistusmenetelmään, jolloin mainittu menetelmä käsittää vaiheet, joissa transformoidaan sienisolu a) nukleiinihapolla, joka on muokattu yli-ilmentämään vähintään yhtä nukleiinihappoa, joka koodaa entsyymin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu 25 pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetaldehydidehyrogenaasista (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja
CM
5 b) nukleiinihapolla, joka on muokattu yli-ilmentämään nukleiinihap-
CM
^ poa, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroliasyylitransferaasi (DAT).
° Lisäksi keksintö kohdistuu ekspressiokasettiin, joka käsittää
Is- ° 30 a) nukleiinihapon, joka on muokattu yli-ilmentämään vähintään yhtä | nukleiinihappoa, joka koodaa entsyymin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu „ pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetaldehydidehyrogenaasista (ALD) ja
CO
asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja ? b) nukleiinihapon, joka on muokattu yli-ilmentämään nukleiinihap- ^ 35 poa, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroliasyylitransferaasi (DAT).
5
Vielä lisäksi keksintö kohdistuu keksinnön mukaisen geneettisesti muokatun sienisolun käyttöön lipidien, biopolttoaineiden, biodieselin, uusiutuvan dieselin tai voiteluaineiden tuottamiseksi.
Piirustusten lyhyt kuvaus 5 Kuvio 1 esittää todennäköisiä metaboliareittejä sytosolin asetyyli-
CoA:n tuotannolle pyruvaattidehydrogenaasireitin kautta harmaalla ja pyru-vaattidehydrogenaasin ohitusreitin ts. pyruvaattidekarboksylaasireitin kautta mustalla.
Kuvio 2 esittää metaboliareittiä triasyyliglyserolin tuotannolle.
10 Kuvio 3 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK81.
Kuvio 4 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK82.
Kuvio 5 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK86.
Kuvio 6 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK95.
Kuvio 7 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK85.
15 Kuvio 8 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK75.
Kuvio 9 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK94.
Kuvio 10 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK96.
Kuvio 11 on kaavio, joka esittää plasmidia pKK98.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Oletettu pyruvaattidehydrogenaasi (PDH) -reitti sytosolisen asetyyli-
CoA:n tuottamiseksi on esitetty harmaalla kuviossa 1. Ensin sytosolinen pyru-vaatti kuljetetaan mitokondrioihin, missä se oksidatiivisesti dekarboksyloidaan asetyyli-CoA:ksi ja hiilidioksidiksi pyruvaattidehydrogenaasikompleksilla. Saatu asetyyli-CoA saapuu sitten trikarboksyyli (TCA) -kiertoon sitraattisyntaasin 25 (CS) avulla, joka katalysoi kaksihiilisen asetaattitähteen asetyyli-CoA:sta ja
O
^ nelihiilisen oksaloasetaatti (OAA) -molekyylin kondensaatioreaktion kuusihiili- o sen sitraatin muodostamiseksi. Sitraatti isomeroidaan sitten isositraatiksi, joka o on substraatti mitokondrion isositraattidehydrogenaasille (IDH). Rajallisessa g typpitarjonnassa AMP-deaminaasiaktiivisuus lisääntyy, mikä johtaa IMP:n ja Q_ 30 ammoniumin tuotantoon AMP:stä. AMP:n määrän väheneminen johtaa mito- 00 £2 kondrion isositraattidehydrogenaasi (IDH) -aktiivisuuden vähenemiseen, jolloin m o sitraatin määrä mitokondrioissa lisääntyy. Mitokondrion sitraatti kuljetetaan sy- ° tosoliin, missä ATP:sitraattilyaasi (ACL) muuntaa sitraatin, ATP:n ja CoA:n asetyyli-CoA:ksi ja oksaloasetaatiksi. Oksaloasetaatti hajotetaan malaattide-35 hydrogenaasilla (MDH) malaatiksi, joka puolestaan muunnetaan pyruvaatiksi ja 6 hiilidioksidiksi malaattientsyymillä (MAE) NAPDH:n tuotannon aikana, joka on tärkeä kofaktori rasvahapposynteesissä. Tässä keksinnössä sytosolista ase-tyyli-CoA:ta tuotetaan pyruvaattidehydrogenaasin ohitusreitin kautta, joka on esitetty mustalla kuviossa 1. Tätä reittiä kutsutaan myös pyruvaattidekarboksy-5 laasireitiksi. Tässä reitissä pyruvaatti dekarboksyloidaan asetaldehydiksi ja hiilidioksidiksi pyruvaattidekarboksylaasilla (PDC). Asetaldehydi hapetetaan edelleen asetaatiksi NAPD+- (tai NAD+) -riippuvaisella asetaIdehydidehydro-genaasilla (ALD). Asetaatti muunnetaan sitten asetyyli-CoA:ksi asetyyli-CoA-syntetaasilla (ACS) ATP:n ja koentsyymi A:n kanssa. Tässä sytosolisessa rei-10 tissä [pyruvaatti + CoA + ATP + NAD(P)+ = asetyyli-CoA + CO2 + NAD(P)H + AMP + PPi + H+] asetyyli-CoA:n kokonaissaanto on suurempi kuin pyruvaatti-dehydrogenaasi-ATP:sitraattilyaasi -reitissä [pyruvaatti + CoA + ATP + NAD+ (mitokondrioissa) + oksaloasetaatti (mitokondrioissa) = asetyyli-CoA + CO2 + ADP + Pi + NADH (mitokondrioissa) + H+ + oksaloasetaatti (sytosolissa)].
15 Sytosolista asetyyli-CoA:ta käyttävät NADPH:sta riippuvainen ras- vahapposyntaasi (FAS) ja muut entsyymit eripituisten asyyli-CoA-esterien tuottamiseksi, jotka kiinnitetään sitten esimerkiksi glyseroliin kuviossa 2 esitetyn triglyseridimetaboliareitin avulla. Tämän reitin viimeisessä vaiheessa asyyli-ryhmä asyyli-CoA:sta tai fosfolipidistä kiinnitetään diasyyliglyseroliin asyyli-20 CoA:diasyyliglyseroli-asyylitransferaasilla (DGAT) tai fosfolipidi:diasyyliglyse-roli-asyylitransferaasilla (PDAT).
Esillä olevassa keksinnössä sienien triasyyliglyserolituotanto tehostuu yli-ilmentämällä vähintään yhtä geeniä, joka koodaa entsyymiä, joka liittyy pyruvaattidekarboksylaattireittiin pyruvaatin muuntamiseksi asetyyli-CoA:ksi, 25 kuten on esitetty kuviossa 1, yhdessä geenin kanssa, joka koodaa entsyymiä, joka katalysoi diasyyliglyserolin asylaation triasyyliglyseroliksi, kuten on esitetty o kuviossa 2.
(M
^ Lipidituotanto sisältäen triasyyliglyserolin tuotannon solussa on run- ° säästi NADPH:ta vaativa prosessi. Esim. 1 moolin oleiinihapon (9-oktadekeeni- 0 30 happo) tuotannossa tarvitaan 17 moolia NADPH:ta. Malaattientsyymin tuotta- £ man NADPH:n on ehdotettu olevan päälähde NADPH:lle, jota tarvitaan rasvata happosynteesissä. Mainittu NADPH-tuotanto tapahtuu kokonaan sytosolisen 00 asetyyli-CoA -tuotantoreitin ulkopuolella, mikä johtaa ylimääräisten hiilten kuluin tukseen NADPH-tuotannossa, vaikka malaattientsyymin reaktio on kytketty ^ 35 ATP:sitraattilyaasin tuottaman oksaloasetaatin hajotukseen. Esillä olevassa keksinnössä rasvahappo-ja triasyyliglyserolin lisätuotanto on kytketty suoraan 7 NADPH-kofaktorin tuotantoon NADP:stä riippuvaisella asetaldehydidehydro-genaasilla, mikä vähentää siten tarvetta tuottaa NADPH:ta triglyseridituotanto-reitin ulkopuolella, mikä johtaa lisääntyneeseen triasyyliglyserolisaantoon. NADP+:sta riippuvainen asetaldehydidehydrogenaasi tuottaa samanaikaisesti 5 yhden NADPH- ja yhden asetaattimolekyylin NADP+:sta ja asetaldehydistä, mikä johtaa yhden NADPH-moolin tuotantoon yhtä pyruvaattimoolia kohti. Tämä tarkoittaa, että puolet NADPH-molekyyleistä, joita tarvitaan rasvahappo-synteesissä, tuotetaan samanaikaisesti sytosolisen asetyyli-CoA -tuotannon kanssa. Tämä samanaikainen NADPH-tuotanto pienemmällä hiilen menetyk-10 sellä sytosolisen asetyyli-CoA -tuotannon aikana johtaa parempaan saantoon rasvahappotuotannossa seuraten myös parempaa saantoa triasyyIigIyserolin tuotannossa. Tässä keksinnössä menetetään vain yksi hiili hiilirungosta myö-täsuuntaan pyruvaatista ennen sytosolista asetyyli-CoA:ta. Lisäksi ei tarvita sivureaktioita metaboliittien pilkkomiseksi edelleen triglyseridituotantoreitin ul-15 kopuolella. Sytosolisen asetyyli-CoA:n tuotanto pyruvaattidehydrogenaasin ohituksen kautta täydentää olemassa olevaa pyruvaattidehydrogenaasireittiä sytosolista asetyyli-CoA -tuotantoa varten.
Triasyyliglyseroleja ja muita lipidejä tuotetaan luonnostaan sienissä pyruvaattidehydrogenaasireitin kautta kasvun aikana, mutta merkittävin triasyy-20 liglyserolin ja lipidien akkumulaatio tapahtuu, kun ylimääräistä sitraattia on saatavissa typen rajoituksen jälkeen viljelyn myöhäisessä vaiheessa. Tämä tria-syyliglyserolituotanto viljelyn myöhäisissä logaritmisissa tai stationaarisissa vaiheissa johtaa pieniin triasyyIiglyserolin tuotantomääriin, erityisesti viljelyn varhaisessa vaiheessa. Tässä keksinnössä pyruvaattidehydrogenaasin ohituk-25 sen, jota katalysoivat PDC, ALD ja ACS, ekspressio johtaa tilanteeseen, jossa triasyyliglyserolin akkumulaatio ei ole kytketty typen rajoitukseen, mikä mah-5 dollistaa siten tehostuneen triasyyliglyserolituotannon viljelyn aikana, mikä joh- C\1 ^ taa parempaan triasyyliglyserolin tuotantomäärään. Varhaista triasyylig lyserol i- ° tuotantoa tehostetaan lisäksi ilmentämällä asyylitransferaasia, kuten fosfolipi- ° 30 di:diasyyliglyseroli-asyylitransferaasia (PDAT) koodaavaa geeniä esim. konsti- | tutiivisen promoottorin alaisena lisäten siten triasyyliglyserolipitoisuutta fosfoli- oo pidien kustannuksella.
CO
S. cerevisiaesta puuttuu pyruvaattidehydrogenaasireitti asetyyli-CoA
O
^ -tuotantoa varten. Tässä Crabtree-positiivisessa hiivassa sytosolista asetyyli- ^ 35 CoA:ta ja lisäksi rasvahappoja ja triasyyliglyseroleja tuotetaan vain pyruvaatti dehydrogenaasin ohituksen kautta. Pyruvaattidehydrogenaasin ohituksen, jo- 8 hon sisältyvät entsyymit pyruvaattidekarboksylaatti (PDC), asetaldehydidehyd-rogenaasi (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasi (ACS), olennainen rooli sytosolisen asetyyli-CoA:n ja edelleen lipidituotannossa sekä ALD:n osuus pelkistävien ekvivalenttien (NADH ja NADPH) tuotannossa S. cerevisiaeWa on kuvattu esi-5 merkiksi julkaisuissa Flikweert et ai. 1996, Pronk et ai 1996, Saint-Prix et ai 2004). Julkaisussa US 2009/0053797 endogeenisen NADP:stä riippuvaisen asetaldehydidehydrogenaasi- {ALD6) -geenin ja natiivin tai muokatun endogeenisen ACS1-geenin tai Salmonella enterican asetyyli-CoA-syntetaasi-(ACS1) -geenin ekspressio S. cerevisiaessa johti sytosolisen asetyyli-CoA:n 10 lisääntyneeseen pitoisuuteen isoprenoidien tuotannossa. Shiba et ai, 2007 havaitsivat, että ALD6:n ja ACS1:n yli-ilmentäminen S. cerevisiaessa lisäsi sy-tosolista asetyyli-CoA -peräistä amorfadieenin ylituotantoa, kun taas AC2:n yli-ilmentäminen ALD6:n kanssa ei lisännyt. Asetyyli-CoA-syntetaasin isoformit ACS1 ja ACS2 käyttäytyvät eri lailla S. cerevisiaessa: ACS1-geer\'\r\ on osoitet-15 tu olevan glukoosirepression alainen, kun taas ACS2-geenin on osoitettu olevan konstitutiivisesti ilmentyvä ja yhteissäädelty rasvahappobiosynteesin ra-kennegeenien kanssa (van den Berg et ai 1996, Hiesinger et ai. 1997).
Termi ’’pyruvaattidehydrogenaasin ohitus” viittaa vaihtoehtoiseen reittiin pyruvaattidehydrogenaasireaktiolle pyruvaatin muuntamiseksi asetyyli-20 CoA:ksi. Pyruvaattidehydrogenaasin ohitus käsittää entsyymit pyruvaattidekar-boksylaasi (PDC), asetaldehydidehydrogenaasi (ALD) ja asetyyli-CoA-synte-taasi (ACS). On osoitettu kirjallisuudessa, että pyruvaattidehydrogenaasin ohitus ei ole välttämätöntä Crabtree-negatiivisilla hiivoilla.
Esillä olevassa yhteydessä vastaavat geenit, jotka koodaavat ent-25 syymiproteiineja, on osoitettu kursiivilla.
Termi “PDC” viittaa pyruvaattidekarboksylaasientsyymiin (EC o 4.1.1.1). Tämä entsyymi katalysoi pyruvaatin tiamiinipyrofosfaatista ja Mg2+:sta
CVJ
£ riippuvaista dekarboksylaatiota asetaldehydiksi ja hiilidioksidiksi. Edullisesti ° PDC on sienen PDC, erityisesti Crabtree-positiviisen sienen, kuten S. cere- ° 30 visiae esim. S. cerevisiaen PDC1 (GenBank-talletusnumero CAA54522, versio | numero CAA54522.1). Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti PDC1 to sisältää sekvenssin numero 95 mukaisen aminohapposekvenssin ja/tai sitä 00 £5 koodaa polynukleotidi, joka sisältää sekvenssin nro 94 mukaisen nukleotidise- ° kvenssin.
o
^ 35 Termi ”ALD” viittaa asetaldehydidehydrogenaasientsyymiin (EC
1.2.1.5 ja EC 1.2.1.4). Tämä entsyymi katalysoi reaktiota, jossa asetaldehydi 9 hapetetaan asetaatiksi ja NAD+- tai NADP+-kofaktori pelkistetään NADH:ksi tai NADPH:ksi vastaavasti. NADP+-spesifiset ALD:t ovat edullisia. Esillä olevassa keksinnössä ALD on edullisesti sienen ALD, edullisemmin S. cerevisiaen ja edullisimmin se on S. cerevisiaen ALD6, jota koodaa esimerkiksi sekvenssin 5 nro 48 tai 49 mukainen polynukleotidi, ja/tai joka käsittää sekvenssin nro 47 mukaisen aminohapposekvenssin. Lisäksi ALD on edullisesti sytosolinen ALD. ALD6 on sytosolinen. Sytosolista ALD:tä voidaan muokata ALD:n mitokondrion isoformeista poistamalla mitokondrion kohdennussignaali alun perin mitokondrion ALD:stä geneettisellä muokkauksella. Mitokondrion kohdennussignaalin 10 pilkkomiskohta voidaan päättää esim. ohjelmilla, jotka on suunniteltu tätä tarkoitusta varten, kuten MITOPROT. Esimerkkejä mitokondrion ALD:stä, joita voidaan muokata, jotta ne olisivat sytosolisia, ovat S. cerevisiaen ALD4:ää ja ALD5:tä koodaavat geenit. Sopivia ALD:tä koodaavia geenejä voidaan löytää tietokannoista esim. KEGG Enzyme -tietokanta ja Brenda EC-numeroilla 15 1.2.1.4 ja 1.2.1.5. Taulukko 1 sisältää esimerkkejä NAD(P)+:sta riippuvaisista asetaldehydidehydrogenaaseista.
C\J
δ
CM
CD
O
l^- o
X
X
CL
CO
CO
N· LT) o δ
CM
10
Taulukko 1. NAD(P)+:sta riippuvaisia asetaldehydidehydrogenaasientsyy-mejä
Eliö Aminohappo- Aminohappo- Tietokanta sekvenssin sekvenssin __talletusnumero version numero__
Saccharomyces cerevisiae__AAB68304__AAB68304.1__GenBank
Saccharomyces cerevisiae__DAA07732__DAA07732.1__GenBank
Saccharomyces cerevisiae__DAA11133__DAA11133.1__GenBank
Aspergillus niger__A2QMA4__A2QMA4.1__TrEMBL
Aspergillus niger__A2QiG1__A2QiG1.1__TrEMBL
Aspergillus niger__A5AAZ8__A5AAZ8.1__TrEMBL
Aspergillus niger__A2Q9V7__A2Q9V7.1__TrEMBL
Aspergillus fumigatus__Q4WQP1__Q4WQP1.1__TrEMBL
Pichia angusta__Q12648__Q12648__Swiss-Prot
Pichia stipitis__A3M013__A3M013.2__TrEMBL
Candida dubliniensis__B9W6J2__B9W6J2.1__TrEMBL
Candida glabrata__CAG59952__CAG59952.1__GenBank
Kluyveromyces lactis__CAH00079__CAH00079.1__Genbank
Lachancea thermotolerans__CAR23570__CAR23570.1__Genbank
Burkholderia xenovorans__Q13WK4__Q13WK4.1__TrEMBL
Vibrio harveyi__Q56694__Q56694.1__Swiss-Prot
Mus musculus__P47739__P47739.1__Swiss-Prot
Mus musculus__Q80VQ0__Q80VQ0.1__Swiss-Prot
Rattus norvegicus__P11883__P11883.3__Swiss-Prot
Rattus norvegicus__Q5XI42__Q5XI42.1__Swiss-Prot
Canis lupus familiaris__A3RF36__A3RF36.1__Swiss-Prot ^ Bos taurus P30907 P30907.2 Swiss-Prot co---- 9 Bos taurus__Q1JPAO__Q1JPA0.1__Swiss-Prot o Homo sapiens__P30838__P30838.2__Swiss-Prot g Homo sapiens__P43353__P43353.1__Swiss-Prot co £2 Termi ’’sytosolinen” viittaa soluliman nestemäiseen osaan, johon βίο vät sisälly soluelimet ja muut suspendoidut solunsisäiset rakenteet, δ
CM
11
Termi ”ACS” viittaa asetyyli-CoA-syntetaasientsyymiin (EC 6.2.1.1). Entsyymi katalysoi reaktion, jossa asetyyli-CoA:ta muodostetaan asetaatista ja CoA:sta ATP:n hydrolyysin kanssa. Edullisesti ACS on sienen ACS, edullisemmin S. cerevisiaen ACS, erityisesti S. cerevisiaen ACS2. Edullisesti ilmen-5 nettävä ACS:ää koodaava geeni on geeni, joka ei ole glukoosirepression alainen ja/tai joka geenituote ei ole translaation jälkeisen säätelyn esim. asetylaa-tion kohteena alkuperäisessä lajissa. Erityisessä suoritusmuodossa ACS sisältää sekvenssin nro 50 mukaisen sekvenssin. Useilla hiivoilla, kuten Candida albicans on samanlaisia geenejä kuin S. cerevisiaen ACS2, jotka todennäköi-10 simmin eivät ole translaation jälkeisen säätelyn alaisia. Tämä poistaa tarpeen muokata olemassa olevaa geeniä. Erään suoritusmuodon mukaisesti ACS2:ta koodaa polynukleotidi, jolla on sekvenssin nro 51 tai 92 mukainen sekvenssi.
Termi ’’DAT” viittaa diasyyliglyseroli-asyylitransferaasientsyymiin (EC 2.3.1.X). Entsyymi katalysoi reaktiota, jossa asyyliryhmä siirretään 1,2-di-15 asyyliglyseroliin kohtaan sn-3. DAT sisältää sekä asyyli-CoA:diasyyliglyseroli-asyylitransferaasin (DGAT, EC 2.3.1.20) että fosfol ipid i :d iasyyl ig lyseroli-asyylitransferaasin (PDAT). Edullisesti DAT on PDAT.
Termi ’’PDAT” viittaa fosfolipidi:diasyyliglyseroli-asyylitransferaasi-entsyymiin (EC 2.3.1.158). Entsyymi katalysoi reaktiota, jossa asyyliryhmä fos-20 folipidistä siirretään 1,2-diasyyliglyseroliin kohtaan sn-3 asyyli-CoA:sta riippumattomalla mekanismilla. Edullisesti PDAT on sienialkuperää ja edullisemmin lipidiä tuottavasta sienestä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa PDAT on Rhizobus oryzaen PDAT, ja edullisimmin sitä koodaa polynukleotidi, joka sisältää sekvenssin nro 53 tai 93 mukaisen sekvenssin. Edullisesti PDAT sisältää 25 aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 40 %:n identtisyys sekvenssin nro 52 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen fragmentin tai variantin, o Keksinnön erityisen edullisissa suoritusmuodoissa koodattu ent-
<M
£ syymi käsittää aminohapposekvenssin, jolla on vähintään 30 %, 40 %, 50 %, ° 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % tai 100 %:n sekvenssi-identtisyys ° 30 sekvenssin nro 95, 47, 50 tai 52 kanssa, tai sen entsymaattisesti aktiivisen £ fragmentin tai variantin.
co Aminohapposekvenssien identtisyysprosentti voidaan helposti las- oo kea tietokoneella käyttäen BLASTP:n 2.2.23-version ohjelmistoa oletuspara-
O
5 metreillä. Sekvenssien, joilla on tietynprosenttinen identtisyystulos ja positii- ^ 35 visuustulos käyttäen BLASTP:n 2.2.23-version algoritmia, ajatellaan olevan tuon prosenttiosuuden verran identtisiä tai homologisia (Altschul et ai. 1997).
12
On hyvin tunnettua, että yhden tai muutaman aminohapon deleetio, lisäys tai substituutio ei välttämättä muuta entsyymiproteiinin katalyyttisiä ominaisuuksia. Siksi keksintö käsittää myös tiettyjen aminohapposekvenssien variantit ja fragmentit, joilla on vaadittu entsyymiaktiivisuus. Termi ’’variantti”, ku-5 ten tässä on käytetty, viittaa sekvenssiin, jossa on vähäisiä muutoksia aminohapposekvenssissä verrattuna tiettyyn sekvenssiin. Tällainen variantti voi esiintyä luonnollisesti esim. alleelisena varianttina samassa kannassa, lajissa tai suvussa, tai se voidaan tuottaa mutageneesillä tai muulla geenimuokkauksella. Se voi käsittää aminohapposubstituutioita, -deleetioita tai -insertioita, 10 mutta se toimii silti olennaisesti samalla tavalla kuin tietyt entsyymit, erityisesti se säilyttää katalyyttisen toimintonsa entsyyminä.
Tietyn proteiinisekvenssin ’’fragmentti” tarkoittaa tuon sekvenssin osaa, ts. sekvenssiä, joka on katkaistu N- ja/tai C-terminaalisesta päästä. Se voi esimerkiksi olla proteiinin valmis osa, joka käsittää signaalisekvenssin, tai 15 se voi olla valmiin proteiinin vain entsymaattisesti aktiivinen fragmentti.
Termi ’’lipidi” viittaa ryhmään orgaanisia yhdisteitä, jotka ovat suhteellisen tai täysin liukenemattomia veteen, mutta liukoisia polaarittomiin orgaanisiin liuottimiin. Nämä ominaisuudet ovat tulosta pitkistä hiilivetyhännistä, jotka ovat hydrofobisia luonteeltaan. Termi käsittää siten rasvat, öljyt, vahat, 20 rasvahapot, rasvahappojohdannaiset, kuten fosfolipidit, glykolipidit, asyyligly-seridit, kuten monoglyseridit, diglyseridit ja triglyseridit, sekä terpenoidit, kuten karotenoidit ja steroidit.
Termi ’’rasvahappo” viittaa yhdisteeseen, joka on saatavissa kon-densaatiolla malonyyli-koentsyymi A -yksiköistä rasvahapposyntaasijärjestel-25 mällä. Ne voivat olla tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä.
Termi ’’rasvahappojohdannainen” viittaa yhdisteeseen, jossa on ai-5 nakin yksi esteröity rasva-asyyliryhmä. Rasvahappojohdannaisiin sisältyvät
(M
^ esim. fosfolipidit, glykolipidit ja asyyliglyseridit.
° Termi “asyyIiglyseridi” on synonyyminen “asyyliglyserolin” kanssa ja ° 30 viittaa yhdisteeseen, jossa on glyseroliosa yhden tai usean hydroksyyliryhmän £ kanssa esteröity rasvahappoon.
co Termit ’’monoglyseridi” ja ’’monoasyyliglyseroli” viittaavat glyseridiin, jossa yksi rasvahappotähde on esteröity glyserolimolekyyliksi. Rasvahappo-^ tähde monoasyyliglyserolissa voi olla lyhyt- tai pitkäketjuinen rasvahappo kak- ^ 35 soissidosten kanssa tai ilman niitä.
13
Termit “diglyseridi” ja “diasyyliglyseroli” sekä “DAG” viittaavat glyse-ridiin, jossa kaksi rasvahappotähdettä on esteröity glyserolimolekyyliksi. Ras-vahappotähteet diasyyliglyserolissa voivat olla lyhyt- tai pitkäketjuisia rasvahappoja kaksoissidosten kanssa tai ilman niitä.
5 Termit ’’triglyseridi” ja ’’triasyyliglyseroli” sekä “TAG” viittaavat glyse- ridiin, jossa kolme rasvahappotähdettä on esteröity glyserolimolekyyliksi. Ras-vahappotähteet triasyyliglyserolissa voivat olla lyhyt- tai pitkäketjuisia rasvahappoja kaksoissidosten kanssa tai ilman niitä. Triasyyl iglyserol i on pääasyyli-glyseroliryhmä lipidiä tuottavilla sienillä.
10 Termi ”asyyli-CoA” viittaa rasvahappotähteeseen, joka on esteröity
CoA-molekyyliksi. Rasvahappotähteet asyyli-CoA:ssa voivat olla lyhyt- tai pitkäketjuisia rasvahappoja kaksoissidosten kanssa tai ilman niitä.
Termi ’’fosfolipidit” viittaa mihin tahansa lipidiin, joka sisältää diglyse-ridin yhdistettynä fosfaattiryhmään sekä yksinkertaisen orgaanisen molekyylin, 15 kuten koliinin tai etanoliamiinin.
Termi "glykolipidi” viittaa lipidiin, joka on liitetty hiilihydraatin kanssa.
Termi "rasva” viittaa ryhmään orgaanisia yhdisteitä, jotka ovat suhteellisen tai täysin liukenemattomia veteen, mutta liukoisia polaarittomiin orgaanisiin liuottimiin ja jotka ovat kiinteitä normaalissa huoneenlämpötilassa.
20 Termi “öljy” viittaa ryhmään orgaanisia yhdisteitä, jotka ovat suhteel lisen tai täysin liukenemattomia veteen, mutta liukoisia polaarittomiin orgaanisiin liuottimiin ja jotka ovat nestemäisiä normaalissa huoneenlämpötilassa.
Yleensä rasvat ja öljyt ovat glyserolin ja rasvahappojen triestereitä.
Termi ’’vaha” viittaa yhdisteeseen, joka voi sisältää pitkäketjuisten 25 primaaristen alkoholien ja rasvahappojen pitkäketjuisia alkaaneja, estereitä, polyestereitä ja hydroksyyliestereitä.
o Termi ’’terpenoidi” viittaa yhdisteeseen, joka on johdettu hiilivedystä
CVJ
£ isopreeni.
° Termi ’’steroidi” viittaa terpenoidilipidiyhdisteeseen, jossa on steraa- ° 30 niydin ja toiminnallisia lisäryhmiä. Sterolit ovat steroidien erityismuotoja, joissa £ on hydroksyyliryhmä atomissa C-3 ja runko peräisin kolestaanista.
co Termi ’’karotenoidit” viittaa yhdisteeseen, joka kuuluu tetraterpeno-
CO
idien luokkaan. Rakenteellisesti ne ovat polyeeniketjun muodossa, joka joskus ^ päättyy renkaisiin.
CVJ
14
Esillä olevassa keksinnössä sienisolut ovat geneettisesti muokattuja tiettyjen entsyymien ilmentämiseksi. Soluja voidaan muokata geneettisesti lisääntyneiden lipiditasojen tuottamiseksi transformoimalla niitä nukleiinihapoilla, joita on muokattu vähintään yhtä PDC:tä, ALD:tä ja ACS:ää koodaavien nukle-5 iinihappojen ilmentymisen tehostamiseksi, yhdessä nukleiinihapon kanssa, jota on muunnettu DAT:tä koodaavan nukleiinihapon ekspression tehostamiseksi, entsyymien yli-ilmentymisen mahdollistamiseksi. ’’Geneettisesti muokattu” eliö tai solu on eliö tai solu, joka käsittää nukleiinihapon, jonka ekspressiota on muokattu. Se voi olla rekombinantti eliö tai solu tai isäntäeliö tai -solu tai mu-10 tantti.
’’Nukleiinihappo” on makromolekyyli, joka käsittää monomeeristen nukleotidien ketjun, ts. polynukleotidi. Se voi olla esim. DNA, kuten cDNA tai genominen DNA, tai mRNA, ja se voi olla esim. rekombinanttisesti tai synteettisesti tuotettu, kaksi- tai yksijuosteista, joka käsittää sekä sense- että antisen-15 se-juosteet.
’’Rekombinantti” nukleiinihappo viittaa ainakin kahden muutoin erillisen sekvenssin keinotekoisen yhdistelmään, ts. nukleiinihappojen ei-luonnos-taan esiintyvään yhdistelmään.
’’Nukleiinihappo, jonka ilmentymistä on muokattu”, kuten tässä on 20 käytetty, merkitsee nukleiinihappoja, jotka ovat vieraita tai eksogeenisiä isännälle, mikä tarkoittaa, että niitä ei esiinny luonnostaan mainitussa isännässä. Termi sisältää myös nukleiinihapot, jotka ovat endogeenisiä, ts. esiintyvät luonnostaan isännässä, mutta joita tuotetaan epäluonnollisena määränä esim. monina kopioina, tai nukleiinihapot, jotka eroavat sekvenssiltään luonnostaan 25 esiintyvistä nukleiinihapoista, mutta koodaavat samantyyppistä proteiinia. Li-säksi termi sisältää nukleiinihapot, jotka käsittävät ainakin kaksi nukleotidise-5 kvenssiä, jotka eivät esiinny samassa suhteessa toisiinsa luonnossa, kuten
(M
^ esim. endogeenistä proteiinia koodaava sekvenssi, joka on operatiivisesti kyt- ° ketty transkription säätelyelementtiin esim. promoottoriin ja/tai terminaattoriin ° 30 sellaisella tavalla, jota ei esiinny luonnossa. Mainittu promoottori ja/tai ter- £ minaattori voi olla endogeenistä tai eksogeenistä alkuperää. Suuren kopiolu- co vun plasmideja, jotka käsittävät proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin,
CO
pidetään myös nukleiinihappoina, joiden ilmentymistä on muokattu. Edellä ? mainitut ekspression suhteen muokatut nukleiinihapot käsittävät rekombinantit ^ 35 nukleiinihapot, joita tässä kutsutaan myös heterologisiksi nukleiinihapoiksi.
15
Vaihtoehtoisesti ekspression suhteen muokattu nukleiinihappo voi olla mutatoi-tu nukleiinihappo.
Keksinnön eräässä suoritusmuodossa nukleiinihappo, jonka ekspressiota on muokattu, sisältää toisesta eliöstä peräisin olevan eksogeenisen 5 geenin, joka koodaa PDC:tä, ALD:tä, ACS:ää tai DAT:tä. Geenejä, jotka koo-daavat PDC:tä, ALD:tä tai ACS:ää, voidaan saada hiivasta, kuten Saccharo-myces cerevisiae, Candida glabrata, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia stipitis, Zygosaccharomyces rouxii, Issatchenkia terricola, Debaryomyces hansenii, Candida angusta ja 10 Pichia guilliermondii, ja DAT:tä voidaan saada hiivasta tai rihmasienistä, kuten Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Zygosaccharomyces rouxii, Lachancea thermotolerans, Ashbya gossypii, Cryptococcus curvatus, Crypto-coccus albidus, Lipomyces lipofer, Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Varis rowia lipolytica, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporum, Humicola lanuginose, Mortierella alpina, Mortierella vinacea, Mucor circinel-loides, Mucor plumbeus, Penicillium spinulosum, ja Rhizopus oryzae. Toisessa suoritusmuodossa ilmennettävät entsyymigeenit ovat endogeenisiä geenejä, joiden promoottori on korvattu toisella promoottorilla, edullisesti konstitutiivisel-20 la promoottorilla, tai olemassa olevaa promoottoria on muokattu, jotta siitä tulisi konstitutiivinen promoottori.
Proteiinit tai polynukleotidit, jotka ovat ’’johdettuja”, ’’peräisin” tai ’’saatuja” tietystä eliöstä, käsittävät sekä mainitusta eliöstä eristetyt tuotteet että niiden muunnokset. Proteiini, joka on peräisin tietystä eliöstä, voi olla re-25 kombinanttisesti tuotettu tuote, joka on identtinen luonnostaan esiintyvän pro-teiinin kanssa tai sen muunnos. Proteiini voi myös olla muokattu esim. gly-o kosylaatiolla, fosforylaatiolla tai muulla kemiallisella muokkauksella. Tietystä
CVJ
^ eliöstä peräisin olevat tuotteet käsittävät myös tuotteiden mutantit ja luonnolli- ° set variantit, joissa on deletoitu, insertoitu ja/tai substituoitu yksi tai useampi ° 30 nukleiinihappo ja/tai aminohappo.
£ Pyruvaattidehydrogenaasin ohitusreitin geenien minkä tahansa yh- co distelmän ekspressio voidaan liittää DAT:tä koodaavan geenin ekspressioon.
DAT:tä koodaavan geenin ekspressio voidaan esimerkiksi yhdistää ALD:tä ^ koodaavan geenin tai ACS:ää koodaavan geenin tai PDC:tä koodaavan gee- ^ 35 nin ekspressioon. Toisessa suoritusmuodossa sekä ASC:tä että ALD:tä tai se kä PDC:tä että ACS:ää tai PDC:tä ja ALD:tä yli-ilmennetään, ja vielä toisessa 16 kaikkia PDC:tä, ALD:tä ja ACS:ää yli-ilmennetään yhdessä DAT:tä koodaavan geenin kanssa. Keksinnön eräässä spesifisessä suoritusmuodossa S. cere-visiaen ALD:tä koodaavan geenin ALD6 ekspressio on liitetty PDAT:tä koodaavan geenin ekspressioon.
5 Vaihtoehtoisesti PDC:n ekspressio voidaan yhdistää ACS:n ja/tai ALD:n ekspression kanssa aikaansaaden siten yhdistelmät PDC+ALD, PDC+ACS ja PDC+ALD+ACS. Näitä yhdistelmiä voidaan ilmentää ilmentämällä lisäksi DAT:tä koodaavaa geeniä, kuten PDAT, tai ilman sitä.
’’Sienen” ’’sieni” ja ’’sienet”, kuten tässä on käytetty, viittaa hiivaan ja 10 rihmasieniin ts. homeisiin. Geneettisesti muokattuun sienisoluun viitataan myös isäntäsoluna.
Hiivaisäntäsolu voidaan valita esimerkiksi suvuista Cryptococcus, Candida, Galactomyces, Hansenula, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotoru-la, Trichosporon ja Yarrowia. Edullisesti hiivaisäntäsolu valitaan ryhmästä, joka 15 koostuu lajeista Candida sp., Cryptococcus curvatus, Cryptococcus albidus, Galactomyces geotrichum, Hansenula ciferri, Lipomyces lipofer, Lipomyces ssp., Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulans ja Yarrowia lipolytica. Eräässä suoritusmuodossa hiiva valitaan pääjaksosta Basidiomycota, johon sisältyvät 20 Cryptococcus, Rhodotorula ja Rhodosporidium. Edullisimmin se on Cryptococcus curvatus.
Rihmasieni-isäntäsolu voidaan valita suvuista Aspergillus, Cunning-hamella, Fusarium, Glomus, Humicola, Mortierella, Mucor, Penicillium, Pythi-um ja Rhizopus. Edullisesti rihmasieni valitaan ryhmästä, joka koostuu lajeista 25 Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Cuninghamella japonica, Fusarium oxysporum, Glomus caledonius, Humicola lanuginose, o Mortierella isabellina, Mortierella pusilla, Mortierella vinacea, Mucor circinel-
C\J
^ loides, Mucor plumbeus, Mucor ramanniana, Penicillium lilacinum, Penicillium ° spinulosum, Pythium ultimum ja Rhizopus oryzae. Erään suoritusmuodon mu- ° 30 kaisesti rihmasieni kuuluu alajaksoon Mucoromycotina, johon sisältyvät Mucor £ ja Mortierella. Edullisimmin se on Mucor circinelloides.
co Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti sieni-isäntäsolu on lipi- 00 diä tuottava sieni. Termi ’’lipidiä tuottava sieni” viittaa hiivoihin tai rihmasieniin, 5 jotka akkumuloivat vähintään 10 %, 12,5 %, 15 %, 17,5 %, edullisesti vähin- ^ 35 tään 20 % tai jopa vähintään 25 % (paino/paino) biomassastaan lipidinä. Ne voivat jopa akkumuloida vähintään 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % (pai- 17 no/paino) tai enemmän biomassastaan lipideinä. Biomassa mitataan tavallisesti solun kuivapainona (CDW). Lipidiä tuottavia sieniä esiintyy esim. suvuissa Cryptococcus, Candida, Galactomyces, Hanseluna, Lipomyces, Rhodosporidi-um, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Cunninghamella, Fusa-5 rium, Glomus, Humicola, Mortierella, Mucor, Penicillium, Pythium ja Rhizopus, ja erityisesti lajeissa Candida sp., Cryptococcus curvatus, Cryptococcus albi-dus, Galactomyces geotrichum, Hansenula cifern, Lipomyces lipofer, Lipomyces ssp., Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toru-loides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulans, Yarrowia lipolytica, Asper-10 gillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Cuninghamella ja-ponica, Fusarium oxysporum, Glomus caledonius, Humicola lanuginose, Mortierella isabellina, Mortierella pusilla, Mortierella vinacea, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, Mucor ramanniana, Penicillium lilacinum, Penicillium spinu-losum, Pythium ultimum ja Rhizopus oryzae. Eräässä suoritusmuodossa se on 15 Crabtree-negatiivinen lipidiä tuottava hiiva, ja toisessa suoritusmuodossa se on Crabtree-positiivinen rihmasieni. Vielä toisessa suoritusmuodossa rihmasieni on Crabtree-negatiivinen, tai hiiva on Crabtree-positiivinen. ’’Crabtree-positiivinen” eliö on sellainen, joka kykenee tuottamaan etanolia hapen läsnä ollessa, kun taas ’’Crabtree-negatiivinen” eliö ei kykene.
20 Sienisolu voidaan muokata geneettisesti transformoimalla se hete- rologisella nukleiinihapolla, joka käsittää vähintään yhtä PDC:tä, ALD:tä ja ACS:ää koodaavan nukleiinihapon, ja heterologisella nukleiinihapolla, joka käsittää DAT:tä koodaavan nukleiinihapon, operatiivisesti kytkettyinä mainittuja entsyymejä koodaavien geenien ekspression mahdollistamiseksi. DNA:n eris-25 tys, entsymaattinen käsittely ja geneettiset muokkaukset voidaan suorittaa käyttäen standardeja molekyylibiologian menetelmiä, kuten ovat kuvanneet 5 esim. Sambrook ja Russell (2001). Mielenkiinnon kohteena olevien geenien
(M
^ promoottori- ja terminaattorialueet voidaan kloonata esim. mielenkiinnon koh- ° teenä olevasta hiiva- tai rihmasienikannasta polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ° 30 käyttäen geenispesifisiä oligonukleotideja, jotka on suunniteltu perustuen tun- | nettuihin julkaistuihin geenisekvensseihin saman lajin kannoista tai muusta co lajista tai mielenkiinnon kohteena olevan kannan geenisekvensseistä. Gigolo nukleotidit, jotka on suunniteltu perustuen mielenkiinnon kohteena olevan kan- ? nan sekvenssiin, ovat edullisia.
O
C\J
18
Uusia geenifragmentteja hiiva- ja rihmasienilajeista tai kannoista, joilla on tuntemattomat genomisekvenssit, voidaan kloonata PCR:llä käyttämällä degeneratiivisia alukkeita. Termi ’’degeneratiivinen aluke” viittaa samanlaisten syntetisoitujen alukkeiden seoksiin, jotka alukkeet eroavat toisistaan yhdel-5 lä nukleotidilla. Degeneratiiviset alukkeet spesifisten geenifragmenttien kloonaamiseksi halutuista lajeista tai kannoista suunnitellaan perustuen tunnettuihin karakterisoituihin tai oletettuihin geenisekvensseihin.
Alan ammattilainen voi käyttää tunnettuja karakterisoituja geenisekvenssejä templaatteina Blast-haussa muiden karakterisoitujen tai oletettujen 10 geenisekvenssien löytämiseksi. Toinen mahdollisuus on etsiä spesifisiä geenisekvenssejä entsyymien nimillä tietokannoista, jotka sisältävät lajien geno-misekvenssejä eri genomin sekvensointiprojekteista. Tämän tyyppisiä tietokantoja löytyy esimerkiksi, mutta ei poissulkien, laitoksen Broad Institute Fungal Genome Initiative -sekvenssiprojekteista. Spesifisten geenisekvenssien hauis-15 sa lajit, jotka ovat läheistä sukua mielenkiinnon kohteena oleville hiiva- ja rih-masienilajeille, ovat edullisia. Sen jälkeen kun spesifisten geenisekvenssien setti on löydetty, suoritetaan nukleotidisekvenssilinjauksia sopivilla ohjelmilla esim. Clustal W, mikä johtaa konsensussekvenssiin, jota käytetään degenera-tiivisten alukkeiden suunnittelussa. Suunniteltuja degeneratiivisia alukkeita 20 käytetään PCR-reaktiossa niin että mielenkiinnon kohteena olevan hiiva- tai rihmasienikannan DNA on templaattina. Saadut PCR-fragmentit eristetään geeliltä ja sekvensoidaan suoraan tai sen jälkeen, kun ne on kloonattu plasmi-deihin. Havaittuja sekvenssejä käytetään Blast-hauissa sen varmistamiseksi, että on kloonattu oikeat geenifragmentit.
25 Mielenkiinnon kohteena olevan geenin tuntematon promoottori- ja/tai terminaattorialue voidaan kloonata kromosomikävely-menetelmällä. Ter-5 mi ’’kromosomikävely” viittaa kloonien peräkkäiseen eristykseen, jotka kantavat
(M
^ tunnetun geenialueen ja viereisen geenialueen tuntemattoman sekvenssin li- ° mittäisiä sekvenssejä, jotka on tuotettu ligaatiovälitteisellä PCR-monistus- ° 30 menetelmällä (Mueller ja Wold 1989). Suunnitellaan geenispesifisiä oligonuk- £ leotideja, jotka vastaavat mielenkiinnon kohteena olevan geenin tunnettua co sekvenssiä, ja käytetään PCR-reaktioissa linkkerispesifisten oligonukleotidien kanssa. Mielenkiinnon kohteena olevan geenin tunnettu sekvenssi voi olla pe-
O
5 räisin esim. geenifragmentin sekvenssistä, joka on tuotettu PCR-reaktiossa ^ 35 degeneratiivisilla oligoilla, tai geenisekvenssistä, joka on julkaistu sekvenssitie- tokannoissa. Saadut PCR-fragmentit eristetään geeliltä ja sekvensoidaan suo- 19 raan tai sen jälkeen, kun ne on kloonattu plasmideihin. Havaittuja sekvenssejä käytetään Blast-hauissa sen varmistamiseksi, että on kloonattu oikeat geeni-fragmentit. Tarvittaessa kromosomi kävely koetta toistetaan niin monta kertaa, että promoottori- tai terminaattorialueen haluttu pituus on kloonattu. Halutun 5 geenin promoottori- tai terminaattorialueen sekvenssin olemassaolo varmistetaan tavallisilla bioinformatiikan menetelmillä esim. monisekvenssilinjauksella.
Kantaspesifinen geenifragmentti, joka sisältää mielenkiinnon kohteena olevan geenin promoottori- ja/tai terminaattorialueen, voidaan myös kloonata perinteisillä kirjaston seulontamenetelmillä, joita on kuvattu esim. te-10 oksessa Sambrook ja Russell (2001). Oligonukleotidien, joita käytetään PCR-reaktioissa haluttujen promoottori- tai terminaattorialueiden kloonaamiseksi, sekvenssit voivat myös sisältää spesifisten restriktioentsyymien restriktiokohti-en sekvenssejä geenispesifisen sekvenssin lisäksi. PCR-fragmentti, joka sisältää halutun promoottorin tai terminaattorin, kloonataan plasmidiin esim. 15 pBluescript ja sekvensoidaan.
Ekspressiokaseteissa käytetyt promoottorit voivat olla konstitutiivi-sesti ilmentyvien geenien, esim. 3-fosfoglyseraattidehydrogenaasin (PGK), trioosifosfaatti-isomeraasin (TPI) tai enolaasin (ENO) promoottoreja. Vaihtoehtoisesti ekspressiokasetissa käytetty promoottori voi olla geenin, joka ilmentyy 20 spesifisissä viljelyolosuhteissa, promoottori.
’’Ekspressiokasetti”, kuten tässä on käytetty, viittaa nukleiinihappo-konstruktiin, joka käsittää transkription aloitus- tai transkription säätelysek-venssin, esim. promoottorin, joka on operatiivisesti kytketty transkriboitavan proteiinin koodausalueelle, ja edullisesti transkription lopetusalueen. Lisäksi se 25 sopivasti käsittää yhden tai useampia markkerialueita, ts. alueita, jotka koo-daavat valintamarkkeria.
C\J
5 Ilmennettäviä geenejä voidaan kloonata suoraan halutuista lajeista
(M
^ tai kannoista perinteisillä molekyylibiologian menetelmillä esim. käyttämällä ° PCR:ää. Edullisemmin ilmennettävät geenit syntetisoidaan käyttäen kodonien ° 30 suhteen optimoitua nukleotidisekvenssiä, joka perustuu isäntäkannan tunnet- | tuun kodonien käyttöön. Jos isäntäkannan tai isäntälajin kodonien käyttö ei ole co tunnettu, ilmennettävä geeni voidaan optimoida kodonien suhteen perustuen
CO
isäntäkannan läheisen sukulaislajin tunnettuun kodonien käyttöön. Vaihtoeh-° toisesti ilmennettävä geeni voidaan syntetisoida tunnetun aminohappose- ^ 35 kvenssin mukaan kääntämällä aminohapposekvenssi DNA-sekvenssiksi, edul lisesti kodonien suhteen optimoiduksi DNA-sekvenssiksi. Termi ’’kodonien op- 20 timointi” viittaa synteettisen nukleotidisekvenssin, joka koodaa ilmennettäviä geenejä, optimointiin geenituotteen tuotannon tehostamiseksi isäntäkannassa. Kodonien optimointi voi tapahtua korvaamalla alkuperäisen geenin olemassa olevia kodoneja kodoneilla, joita käytetään useammin isäntäkannassa. Kodo-5 nien optimoinnissa voidaan välttää myös sisäisiä TATA-laatikoita, chi-kohtia, ribosomin sitoutumiskohtia, AT-runsaita tai GC-runsaita sekvenssiosia, tois-tosekvenssejä, RNA:n sekundaarirakenteita ja kryptisiä silmukoinnin luovuttaja- ja vastaanottajakohtia. Lisäksi kodonien optimoinnissa voidaan välttää spesifisten restriktioentsyymien restriktiokohtien sekvenssejä. Edullisesti synteti-10 soidussa geenisekvenssissä vältetään CTG-kodonia sen erilaisen koodauksen takia eri sienillä (leusiini tai seriini).
Nukleiinihappo, joka on “degeneroitunut geneettisen koodin tuloksena” tietyksi sekvenssiksi, tarkoittaa, että se sisältää yhden tai useampia eri kodoneja, mutta koodaa samoja aminohappoja. ’’Polynukleotidi”, kuten tässä 15 on käytetty, voi olla yksi- tai kaksijuosteinen polynukleiinihappo. Termi kattaa genomin DNA:n, cDNA:n ja RNA:n.
’’Synteettinen geeni” tai ’’synteettinen nukleotidisekvenssi” on keinotekoisesti suunniteltu geeni tai sekvenssi, joka on syntetisoitu fyysiseksi DNA-sekvenssiksi.
20 Ilmennettävä geeni kloonataan promoottorin ja terminaattorin väliin.
Ilmennettävän geenin ekspressiokasetti, jossa on promoottori ja terminaattori sekä markkerigeeni, voidaan transformoida. Markkerigeeni voi olla oman promoottorinsa ja terminaattorinsa alainen, mutta edullisesti se on toisen lajin toiminnallisen promoottorin ja terminaattorin alainen tai edullisemmin isäntäkan-25 nan toiminnallisen promoottorin ja terminaattorin alainen. Käytettävät markkerit voivat olla antibioottimarkkereita, kuten geenejä hygromysiini-, genetisiini- ja o seruleeniresistensseille tai muu dominoiva markkeri, kuten melibiaasigeeni.
CM
^ Lisäksi voidaan käyttää aminohapposynteesin geenejä markkereina auksotro- ° fisilla sienillä. Ilmennettävä geeni voidaan transformoida hiivaan tai rihmasie- ° 30 neen plasmidina epitooppisten transformanttien tuottamiseksi tai DNA-frag- | menttina, joka sisältää ekspressiokasetin transformanttien tuottamiseksi, joissa co ekspressiokasetti on integroitunut isäntäkannan genomiin.
CO
Ekspressiokasetteja, jotka sisältävät markkerigeenin ja ilmennettä-° vän geenin, voidaan transformoida samassa DNA-fragmentissa tai markkeri- ^ 35 geenin ja ilmennettävän geenin ekspressiokasetit voivat olla erillisissä DNA- fragmenteissa. Transformaatiomenetelmät sisältävät kemialliset, protoplasti-, 21 elektroporaatiomenetelmät. Transformantteja voidaan valita perustuen niiden kykyyn kasvaa alustalla (kiinteä tai nestemäinen), joka sisältää antibiootteja, tai alustalla, josta puuttuu jokin olennainen komponentti esim. aminohappo, tai transformantteja voidaan valita perustuen erilaiseen fenotyyppiin, kuten trans-5 formanttien värireaktio spesifisissä olosuhteissa.
Transformanttien DNA-taso voidaan karakterisoida PCR:llä tai Sout-hern-analyysillä käyttäen perinteisiä molekyylibiologian menetelmiä. Lisäksi ilmennetyn geenin entsyymiaktiivisuuksia voidaan testata, kuten on osoitettu esimerkissä 27 tai kuten on kuvattu esim. julkaisuissa Dahlqvist et ai. 2000 ja 10 Postma et ai. 1989.
Ilmennettävä geeni voi olla endogeeninen geeni, jolloin promoottorialue voidaan korvata konstitutiivisesti ilmentyvän geenin promoottorilla tai geenin, joka ilmentyy spesifisissä viljelyolosuhteissa, promoottorilla. Lisäksi endo-geenisen geenin ekspressiota voidaan tehostaa klassisella mutageneesillä.
15 Esillä olevan keksinnön mukaiset geneettisesti muokatut sienet ky kenevät tuottamaan lisääntyneitä lipidien ja erityisesti triasyyIiglyserolien tasoja. Lisäys voi olla vähintään 1,5-, 3-, 5- tai 10-kertainen lisäys lipidin tai triasyy-liglyserolin pitoisuudessa transformanteissa verrattuna muokkaamattomaan isäntäkantaan viljelyn aikana. Vaihtoehtoisesti se voi olla vähintään 1,5-, 3-, 5-20 tai 10-kertainen lisäys lipidin tai triasyyliglyserolin saannossa käytettyä hiililäh-dettä (esim. glukoosi) kohti transformanteissa verrattuna muokkaamattomaan isäntäkantaan. Se voi myös viitata 1,5-, 3-, 5- tai 10-kertaiseen lisäykseen lipidin tai triasyyliglyserolin tuotantomäärässä (mg/l/h) verrattuna muokkaamattomaan isäntäkantaan.
25 Geneettisesti muokattuja sieniä viljellään alustassa, joka sisältää sopivia hiili- ja typpilähteitä yhdessä muiden valinnaisten aineosien kanssa o kuten hiivauute, peptoni, hivenaineet ja vitamiinit, kuten KH2P04, Na2HP04,
CM
^ MgS04, CaCI2, FeCI3, ZnS04, sitruunahappo, MnS04, CoCI2, CuS04, ° Na2Mo04, FeS04, H3B04, D-biotiini, Ca-pantotenaatti, nikotiinihappo, myoino- ° 30 sitoli, tiamiini, pyridoksiini, p-aminobentsoehappo. Keksintö toimii laajalla C/N- | suhteiden alueella noin 20:stä 103:een mikroaerobisissa (50 ml alustaa 250 cv, ml:n pullossa 100 rpm ravistelulla) ja aerobisissa (50 ml alustaa 250 ml:n pul- 00 lossa 250 rpm ravistelulla tai 1-2 vvm bioreaktoreissa) olosuhteissa viljelyn ? alusta viljelyn loppuun ainakin 8 vuorokauteen asti. Käytetyt isäntäsolut ovat ^ 35 edullisesti sellaisia, että ne eivät kykene vain käyttämään heksooseja kuten glukoosia, mutta myös pentooseja kuten ksyloosia ja arabinoosia tai jopa gly- 22 serolia hiililähteenä. Edullisesti hiililähde on heksoosi- tai pentoosiryhmiä sisältävä materiaali, kuten selluloosa tai hemiselluloosa. Geneettisesti muokattuja isäntäsoluja kasvatetaan edullisesti maatalouden tai teollisuuden jätemateriaa-leilla, esim. selluloosaa tai hemiselluloosaa sisältävillä materiaaleilla, mikä te-5 kee lipidituotannosta taloudellisesti ja ympäristöllisesti suotuisaa.
Viljelyn jälkeen hiiva- tai rihmasienisolut normaalisti erotetaan vilje-lyalustasta. Lipidit otetaan talteen soluista tyypillisesti käyttämällä polaarittomia orgaanisia liuottimia, kuten heksaania. Ennen uuttoa solut voidaan kuivata ja/tai hajottaa. Edullisesti suoritetaan lipidiuutto lipidien saamiseksi, jotka sisäl-10 tävät pääasiassa triasyyliglyserolia (TAG). Lipidifraktio voi myös sisältää monoja diglyseridejä, vapaita rasvahappoja, fosfolipidejä, glykolipidejä ja muita lipidejä.
Saatuja lipidejä, ja erityisesti TAG:tä ja rasvahappoja, voidaan käyttää biopolttoaineiden ja voiteluaineiden valmistamiseksi. Mainittuja lipidejä voi-15 daan käyttää suoraan biopolttoaineena tai voiteluaineena, mutta tavallisesti niitä käsitellään edelleen esim. biodiesel- tai uusiutuvaksi diesel-ja/tai voitelu-aineformulaatioiksi. ’’Biopolttoaine”, kuten tässä on käytetty, viittaa polttoaineeseen, joka on ainakin osittain biologisesti tuotettu.
’’Biodiesel” koostuu oleellisesti rasvahapon metyyliestereistä ja sitä 20 tuotetaan tyypillisesti transesteröinnillä, missä asyyliglyseridit muutetaan rasvahapon metyyliestereiksi. EU-direktiivin 2003/30/EU mukaan biodiesel viittaa kasviöljystä tai eläinöljystä tuotettuun metyyliesteriin, joka on diesellaatuista käytettäväksi biopolttoaineena. Laajemmin biodiesel viittaa diesellaatuisiin pitkä ketjuisiin alkyyliestereihin, kuten metyyli-, etyyli- tai propyyliestereihin kas-25 viöljystä tai eläinrasvasta. Esillä olevassa yhteydessä biodieseliä voidaan myös tuottaa sienien lipideistä.
5 ’’Uusiutuva diesel” viittaa polttoaineeseen, joka on tuotettu eläin-,
(M
£ kasvi- tai sienialkuperää olevien lipidien tai niiden seosten vetykäsittelyllä (hyd- ° rogenointi tai hydraus). Uusiutuvaa dieseliä voidaan tuottaa myös biomassasta ° 30 peräisin olevista vahoista kaasutuksella ja Fischer-Tropsch -synteesillä. Mah- | dollisesti vetykäsittelyn lisäksi voidaan suorittaa isomerointi- tai muita käsittely- oo vaiheita. Vetykäsittelyssä asyyliglyseridit muutetaan vastaaviksi alkaaneiksi (parafiineiksi). Alkaaneja (parafiinejä) voidaan edelleen muokata isomeroinnilla ς tai muilla käsittelyvaihtoehdoilla. Nämä prosessit voivat myös tuottaa hiilivetyjä, ^ 35 jotka ovat sopivia lentopolttoaine- tai lentopetrolisovellutuksia varten.
23 “Voiteluaine” viittaa aineeseen, kuten rasva, lipidi tai öljy, joka vähentää kitkaa, kun sitä käytetään liikkuvien osien pintapäällysteenä. Voiteluaineen kaksi muuta päätehtävää ovat kuumuuden poisto ja epäpuhtauksien liuottaminen. Voiteluaineiden sovellutuksiin sisältyvät, mutta eivät rajoitu, käyttötar-5 koitukset sisäisissä polttomoottoreissa moottoriöljyinä, lisäaineina polttoaineissa, öljykäyttöisissä laitteissa, kuten pumpuissa ja hydraulisissa laitteissa tai erityyppisissä laakereissa. Tyypillisesti voiteluaineet sisältävät 75-100 % pe-rusöljyä ja loppu on lisäaineita. Esillä olevassa keksinnössä ainakin osa perus-öljystä on sienialkuperää. Perusöljyn kuvaamiseksi käytetään viskositeetti-10 indeksiä. Tyypillisesti suuri viskositeetti-indeksi on edullinen.
Voiteluaineita tai ainakin perusöljy voiteluaineita varten voidaan valmistaa samalla tavalla, kuin on kuvattu edellä biopolttoaineita varten. Tavallisesti perusöljyyn lisätään perinteisiä lisäaineita, kuten viskositeetin muokkaajia, antioksidantteja, jähmepisteen muokkaajia jne. voiteluaineen saamiseksi.
15 Seuraavat esimerkit on tarjottu keksinnön havainnollistamiseksi, mutta niiden ei ole tarkoitettu rajoittavan sen piiriä. Käytetyt entsyyminimet perustuvat sekvenssihomologiaan.
Esimerkki 1A: Cryptococcus curvatuksen TEF- (CcTEFI) -promoottori-ja -terminaattorialueen kloonaus 20 Genominen C. curvatuksen TEF-geenin -800 bp:n fragmentti mo nistettiin PCR:llä degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 1 (Yeast TEF1) ja sekvenssinä nro 2 (Yeast TEF4), käyttäen C. curvatuksen (C-01440, VTT:n mikrobikokoelma) genomista DNA:ta templaattina. Degeneroituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin oletetuis-25 ta TEF •/-geeneistä lajeista Ustilago maydis, Candida guilliermondii ja Candida
CM
^ tropicalis. Havaittu genominen fragmentti sekvensoitiin.
^ Genomisia fragmentteja, jotka sisälsivät CcTEF/-promoottorialueen, 9 saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella (Mueller, P.R. ja Wold, B. 1989).
1^.
o Seos linkkeriä, joka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I), ja linkkeriä, | 30 joka on identifioitu sekvenssinä nro 4 (PCR linker II) liitettiin PvuW.Wa pilkottuun n C. curvatuksen genomiseen DNA:han T4 DNA -ligaasilla (New England Bio- ^ Labs). Ligaatioseosten näytteitä käytettiin templaatteina 50 pl:n PCR-reaktioita ° varten, jotka sisälsivät 0,1 μΜ aluketta, joka on identifioitu sekvenssinä nro 3 o ™ (PCR linker I), ja 1 pM aluketta, joka on identifioitu sekvenssinä nro 5 35 (CC TEF2). Reaktioseosta kuumennettiin 94 °C:ssa 3 minuuttia sen jälkeen, kun 2 U Dynazyme EXT oli lisätty. Reaktioille suoritettiin syklit 30 kertaa seu- 24 raavasti: 1 minuutti 94 °C:ssa, 2 minuuttia 60 °C:ssa ja 2 minuuttia 72 °C:ssa, 10 minuutin loppupidennyksen kanssa 72 °C:ssa. Tämän ensimmäisen PCR-monistuksen laimennettua näytettä käytettiin templaattina sisäkkäisiä alukkeita käyttävässä PCR -reaktiossa (50 pl), joka sisälsi 0,05 μΜ aluketta, joka on 5 identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I), ja 0,5 μΜ aluketta, joka on identifioitu sekvenssinä nro 6 (CC_TEF1). Reaktioseosta kuumennettiin 94 °C:ssa 3 minuuttia sen jälkeen, kun 2 U Dynazyme EXT oli lisätty. Reaktioille suoritettiin syklit 30 kertaa seuraavasti: 1 minuutti 94 °C:ssa, 2 minuuttia 60 °C:ssa ja 2 minuuttia 72 °C:ssa, 10 minuutin loppupidennyksen kanssa 72 °C:ssa.
10 -800 bp:n fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset aluk- keet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 7 (CC_TEF6) ja sekvenssinä nro 8 (CC_TEF5), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä PCR-monistuksessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I), ja linkkerin, joka on identifioitu sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa 15 samalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Λ/raUlä pilkottua C. curvatuk-sen DNA:ta. -2000 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
C. curvatuksen TEF1-promoottori PCR-monistettiin käyttäen alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 9 (CC_TEF10) ja sekvenssinä nro 10 (CC_TEF11), sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina. PCR-20 fragmentti pilkottiin SaclUla ja XbaUlä. 1276 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin SaclUla ja XbaUlä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin (Stratage-ne). Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK58. Plasmidi pKK58 sisältää C. curvatuksen TEF1-promoottorin.
Genominen fragmentti, joka sisälsi CcTEFf-terminaattorialueen, 25 saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella C. curvatuksen TEF1-geenispe-sifisillä oligonukleotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 11 (CC_TEF13) o ja sekvenssinä nro 12 (CC_TEF4) yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifi- ^ oitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), ^ kanssa samalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Nru\:\\ä pilkottua C.
° 30 curvatuksen DNA:ta. -1600 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
£ C. curvatuksen TEF1-terminaattori PCR-monistettiin käyttäen aluk- oo keitä, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 13 (CC_TEF7) ja sekvenssinä nro 14, sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pil-^ kottiin Xma\:Ma ja EcoRUIä. 358 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin ^ 35 XmaUla ja EcoRUIä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille 25 annettiin nimi pKK55. Plasmidi pKK55 sisältää C. curvatuksen TEF1-termi-naattorin.
Esimerkki 1B: Cryptococcus curvatuksen TPI- (CcTPII) -promoottori-ja -terminaattorialueen kloonaus 5 Genominen C. curvatuksen TPI1-geenin fragmentti monistettiin PCR:llä genomisesta C. curvatuksen (C-01440, VTT:n mikrobikokoelma) DNA:sta degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 15 (Yeast TPI5) ja sekvenssinä nro 16 (Yeast TPI8). Degeneroituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin TP11-geeneistä lajeista Ustilago 10 maydis ja Cryptococcus neoformans. -800 bp:n genominen fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
Genominen fragmentti, joka sisälsi CcTPII-promoottorialueen, saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TP/f-geenispesifisillä oligonukleoti-deilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 17 (CC_TPI2) ja sekvenssinä nro 15 18 (CC TPI1), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I), ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin EcoRV:llä pilkottua C. curvatuksen DNA:ta. -1300 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
C. curvatuksen TPI1-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä aluk-20 keitä, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 19 (CC_TPI7) ja sekvenssinä nro 20 (CC_TPI_9), sekä C. curvatuksen DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin BamH\:\\ä ja Sbfl:llä. 851 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin Bam-/-/l:llä ja Psfkllä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK63. Plasmidi pKK63 sisältää C. curvatuksen TPI /-promoottorin. 25 Genominen fragmentti, joka sisälsi Cc7P/f-terminaattorialueen,
CM
ς saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TPI1-geenispesifisillä oligonuk- ^ leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 21 (CC_TPI 4) ja sekvenssinä 9 nro 22 (CC_TPI3), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä o nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla taval- | 30 la kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin EcoRV:llä pilkottua C. curvatuksen n DNA:ta. -1200 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
h? C. curvatuksen TP/f-terminaattori PCR-monistettiin käyttämällä 9 alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 23 (CC_TPI5) ja sekvenssinä o w nro 24 (CC_TPI6), sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina. PCR- 35 fragmentti pilkottiin Xbakllä ja BamHUIä. 361 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin Xbakllä ja SamHUIä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle 26 plasmidille annettiin nimi pKK61. Plasmidi pKK61 sisältää C. curvatuksen TPI1-terminaattorin.
Esimerkki 1C: Cryptococcus curvatuksen ENO- (CcENOI) -promoottori-ja -terminaattorialueen kloonaus 5 Genominen C. curvatuksen EN01-geen\n fragmentti monistettiin PCR:llä genomisesta C. curvatuksen (C-01440, VTT:n mikrobikokoelma) DNA:sta degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 25 (YeastEN05) ja sekvenssinä nro 26 (YeastENOIO). Degeneroituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin E/VOf-geeneistä lajeista Ustila-10 go maydis ja Cryptococcus neoformans. -1000 bp:n genominen fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
Genominen fragmentti, joka sisälsi CcE/VOf-promoottorialueen, saatiin Iigaatiovälitteisellä PCR-monistuksella ΕΛ/Of-geenispesifisillä oligonuk-leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 27 (CC_EN02) ja sekvenssinä 15 nro 28 (CC_EN01), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I), ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin PvuW.Wa pilkottua C. curvatuksen DNA:ta.
-600 bp:n fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset aluk-20 keet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 29 (CC_EN05) ja sekvenssinä nro 30 (CC_EN06), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä PCR-monistuk-sessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Sspkllä pilkottua C. curvatuksen DNA:ta. -2000 bp:n PCR-25 fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
CM
^ C. curvatuksen EN01-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä ^ alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 31 (CC_EN09) ja sekvenssinä 9 nro 32 (CC_ENO10), sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina.
o PCR-fragmentti pilkottiin EcoRUIä. 1214 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja | 30 liitettiin EcoRUIä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille w annettiin nimi pKK74. Plasmidi pKK74 sisältää C. curvatuksen EA/Of-promoot- ” torin.
tn 9 Genominen fragmentti, joka sisälsi CcENOI-terminaattorialueen,
O
^ saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella EA/07-geenispesifisillä oligonuk- 35 leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 33 (CC_EN04) ja sekvenssinä nro 34 (CC_EN03), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssi- 27 nä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Nru\:\\ä pilkottua C. curvatuk-sen DNA:ta. -1100 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
C. curvatuksen ΕΛ/07-terminaattori PCR-monistettiin käyttämällä 5 alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 35 (CC_EN07) ja sekvenssinä nro 36 (CC_EN08), sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin HindiIUla. 375 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin HindWV.Wa pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK60. Plasmidi pKK60 sisältää C. curvatuksen EN01-termi-10 naattorin.
Esimerkki 1D: C. curvatuksen GPD- (CcGPDI) -terminaattorialueen kloonaus
Genominen fragmentti, joka sisälsi CcGPDf-terminaattorialueen, saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella GPDf-geenispesifisillä oligonuk-15 leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 37 (CC_GPD3) ja sekvenssinä nro 38 (CC_GPD4), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Sspkllä pilkottua C. curvatuksen DNA:ta. -1800 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin osittain. 20 GPD7-geenispesifiset oligonukleotidit suunniteltiin C. curvatuksen GPD1-geenin (GenBank-talletusnumero AF126158, version numero AF126158.1) sekvenssin mukaan.
C. curvatuksen GPD1-terminaattori PCR-monistettiin käyttämällä alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 39 (CC_GPD6) ja sekvenssinä 25 nro 40 (CC_GPD7), sekä C. curvatuksen genomista DNA:ta templaattina.
CM
^ PCR-fragmentti pilkottiin Xbal:llä ja BamHiillä. 336 bp:n fragmentti eristettiin ^ geeliltä ja liitettiin Xbakllä ja BamFIkllä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin.
CD
9 Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK54. Plasmidi pKK54 sisältää C. curva- 0 tuksen GPDf-terminaattorin.
CC
30 Esimerkki 2A: E. colin hygromysiiniresistenssigeenin kloonaus; plasmi- co din (pKK76) konstruointi, jossa on E. colin hygromysiiniresistenssigeeni o CcTEFf-promoottorin ja Cc7P/7-terminaattorin säätelyn alaisena ° E. colin hygromysiini- {hph) -geeni, joka välittää resistenssiä hygro- mysiini B:lle, PCR-monistettiin käyttäen alukkeita, jotka on identifioitu sekvens-35 sinä nro 41 (Hph 5) ja sekvenssinä nro 42 (Hph 3), sekä plasmidin pRLMEX30 28 (Mach et ai. 1994) DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin SpeUlä. 1048 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin SpeUlä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin ja sekvensoitiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK52.
Plasmidi pKK58 pilkottiin SaclUla ja Sb/Ulä. 1272 bp:n fragmentti 5 eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK52 pilkottiin Sb/Ulä. 1034 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK58 sisältää C. curvatuksen TEF1-promoottorin ja plasmidi pKK61 sisältää C. curvatuksen TP/f-terminaattorin. 1272 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK58, ja 1034 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK52, liitettiin 3285 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilk-10 komalla plasmidi nimeltään pKK61 SaclUla ja SbfUlä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK76. Plasmidi pKK76 sisältää E. colin hygromysiinigeenin C. curvatuksen TEF1-promoottorin ja C. curvatuksen TPI1-terminaattorin säätelyn alaisena.
Esimerkki 2B: E. colin G418-resistenssigeenin kloonaus; plasmidin (pKK67) 15 konstruointi, jossa on E. colin genetisiiniresistenssigeeni CcTEFf-promoottorin ja Cc ΓΡ/f-terminaattorin säätelyn alaisena E. colin G418-resistenssigeeni PCR-monistettiin käyttäen alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 43 (Kan 5) ja sekvenssinä nro 44 (Kan 3), sekä plasmidin pPIC9K (Invitrogen) DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pil-20 kottiin SpeUlä. 838 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin SpeUlä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin ja sekvensoitiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK51.
Plasmidi pKK58 pilkottiin SaclUla ja Sb/Ulä. 1272 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK51 pilkottiin SbfUlä. 824 bp:n fragmentti eristet-25 tiin geeliltä. 1272 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK58, ja 824
CM
^ bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK51, liitettiin 3285 bp:n frag- ^ menttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi nimeltään pKK61 SaclUla ja SbfUlä.
CD
9 Plasmidi pKK58 sisältää C. curvatuksen TEF/-promoottorin ja plasmidi pKK61 o sisältää C. curvatuksen TPI1-terminaattorin. Saadulle plasmidille annettiin nimi | 30 pKK67. Plasmidi pKK67 sisältää E. colin G418-resistenssigeenin C. curvatuk- sen TEFf-promoottorin ja C. curvatuksen TP/f-terminaattorin säätelyn alaise-co na.
LO
o δ cv 29
Esimerkki 2C: S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeenin kloonaus; plas-midin (pKK91) konstruointi, jossa on S. cerevisiaen seruleeniresistenssi-geeni Cc7EF7-promoottorin ja Cc7P/7-terminaattorin säätelyn alaisena S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeeni PCR-monistettiin käyttäen 5 alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 45 (CERR 5) ja sekvenssinä nro 46 (CERR 3), sekä plasmidin pSH47Y DNA:ta templaattina. Plasmidi pSH47Y sisältää seruleeniresistenssigeenin plasmidista pCR1 (Nakazawa et ai. 1993). PCR-fragmentti pilkottiin Sbft\\lä. 1685 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin Psfl:llä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin ja sekvensoitiin. Saadulle 10 plasmidille annettiin nimi pKK80.
Plasmidi pKK80 pilkottiin PsfUlä. 1685 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 4557 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi nimeltään pKK67 Sbf\\Wä. Plasmidi pKK67 sisältää E. colin G418-resistenssigee-nin kytkettynä C. curvatuksen 7EP7-promoottoriin ja C. curvatuksen TEF1-ter-15 minaattoriin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK91. Plasmidi pKK91 sisältää S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeenin C. curvatuksen TEF1 -promoottorin ja C. curvatuksen 7P/7-terminaattorin säätelyn alaisena.
Esimerkki 3A: Plasmidin (pKK81, kuvio 3) konstruointi, joka sisältää hyg-romysiiniresistenssigeenin Cc7EF7-promoottorin ja Cc7P/f-terminaatto-20 rin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcENOI-promoottorin ja Cc7EF7-terminaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi UmALD (Geneart AG, Saksa) sisältää S. cerevisiaen ALD6:ta (sekvenssi nro 47) koodaavan geenin, joka on kodonioptimoitu Ustila-go maydis -hiivan kodoninkäytön (sekvenssi nro 48) mukaisesti, jota reunusta-25 vat Sbfl-restriktiokohdat. Plasmidi RoALD (Geneart AG, Saksa) sisältää S. ce-o revisiaen ALD6:ta (sekvenssi nro 47) koodaavan geenin, joka on kodoniopti-
<M
^ moitu Rhizopus oryzae -rihmasienen kodoninkäytön (sekvenssi nro 49) mukaili sesti, jota reunustavat Sbfl-restriktiokohdat, ja E. colin kanamysiiniresistenssi- ° geenin. Plasmidi UmALD pilkottiin S/7l:llä. 1554 bp:n fragmentti eristettiin geelil-
| 30 tä ja liitettiin 2258 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi RoALD
co Sf/Illä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK50. Plasmidi pKK50 sisältää S.
CO
£5 cerevisiaen ALD6:ta (sekvenssi nro 47) koodaavan geenin, joka on kodoniop- ° timoitu Ustilago maydis -hiivan kodoninkäytön (sekvenssi nro 48) mukaisesti, ^ jota reunustavat Sbfl-restriktiokohdat, ja E. colin kanamysiiniresistenssigeenin.
30
Plasmidi pKK74 pilkottiin EcoRUIä ja SbfUlä. 1204 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK55 pilkottiin EcoRUIä ja SbfUlä. 347 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. 1204 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK74, ja 347 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK55, liitettiin 5 2961 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi nimeltään pKK74 EcoRUIä. Plasmidi pKK74 sisältää C. curvatuksen EN01-promoottorin ja plasmidi pKK55 sisältää C. curvatuksen TEFf-term inaattorin. Saadulle plasmi-dille annettiin nimi pKK77pre.
Plasmidi pKK50 pilkottiin SbfUlä. 1514 bp:n fragmentti eristettiin 10 geeliltä ja liitettiin 4517 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK77pre SbfUlä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK77. Plasmidi pKK77 sisältää S. cerevisiaen ALD6.ta koodaavan geenin CcE/VOf-promoottorin ja CcTEF 1-terminaattorin säätelyn alaisena.
Plasmidi pKK76 pilkottiin EamHUIä ja XmnUlä. 2652 bp:n fragmentti 15 eristettiin geeliltä ja liitettiin 6031 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK77 EamHUIä. Plasmidi pKK76 sisältää E. colin hygromysiiniresis-tenssigeenin CcTEEf-promoottorin ja CcTPH-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK81 (kuvio 3).
Esimerkki 3B. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/81) tuottami-20 nen, jossa on integroituna ALD6:ta koodaava geeni ja hygromysiiniresis-tenssigeeni, transformoimalla villityypin C. curvatus pilkotulla plasmidilla pKK81 (kuvio 3, esim. 3A)
Plasmidi pKK81 pilkottiin Λ/ofUläja PspOMUIä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin villityypin C. curvatus -kannan ATCC 20509 nimeltään Y23 25 transformoimiseksi elektroporaatiolla käyttäen standardia elektroporaatiomene-ς telmää.
^ Transformoituja soluja seulottiin hygromysiiniresistenssin suhteen.
9 Useita hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä.
o Transformanteille, jotka olivat peräisin C. curvatuksen transformaatiosta Noet 30 fkllä ja PspOMUIä leikatulla pKK81:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcENOI-promoottorin ja CcTEFf-terminaattorin ” säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/81-8, Y23/81-51, Y23/81-59, Y23/81-66 ° ja Y23/81-69.
o
(M
31
Esimerkki 4A: Plasmidin (pKK82, kuvio 4) konstruointi, joka sisältää G418-resistenssigeenin CcTEF1-promoottorin ja CcTPH-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcE-N01 -promoottorin ja CcTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena 5 Plasmidi pKK67 pilkottiin PamHUIä ja XmnUlä. 2442 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 6031 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK77 BamHUIä. Plasmidi pKK67 sisältää E. colin G418-resistenssi-geenin CcTEF/-promoottorin ja CcTPH-terminaattorin säätelyn alaisena ja plasmidi pKK77 sisältää S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcENOI-10 promoottorin ja CcTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK82 (kuvio 4).
Esimerkki 4B. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/82) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta koodaava geeni ja G418-resistens-sigeeni, transformoimalla villityypin C. curvatus pilkotulla plasmidilla 15 pKK82 (kuvio 4, esim. 4A)
Plasmidi pKK82 pilkottiin Λ/ofUlä ja PspOMUIä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin villityypin C. curvatus -kannan ATCC 20509 nimeltään Y23 transformoimiseksi elektroporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin G418-resistenssin suhteen. Useita G418-resistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-20 tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin C. curvatuksen transformaatiosta Λ/ofUlä ja PspOMUIä leikatulla pKK82:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcPA/Of-promoottorin ja CcTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/82-1, Y23/82-2, Y23/82-4 ja Y23/82-13.
^ 25 Esimerkki 5A: Plasmidin (pKK86, kuvio 5) konstruointi, joka sisältää hyg- o ^ romysiiniresistenssigeenin CcTEFI-promoottori n ja CcTPIT-term inaatto- o rin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin o Cc TP/f-pro moottori n ja CcENOI-term inaattorin säätelyn alaisena | Plasmidi pKK63 pilkottiin BamHUIä ja Sbfl:llä. 851 bp:n fragmentti m 30 eristettiin geeliltä ja liitettiin 3295 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla h? plasmidi pKK60 SamHUIä ja Sbf\:\\ä. Plasmidi pKK63 sisältää CcTPH-pro- ? moottorin ja plasmidi pKK60 sisältää CcENOI-terminaattorin. Saadulle plasmi- o ^ dille annettiin nimi pKK78pre.
32
Plasmidi UmACS sisältää S. cerevisiaen ACS2:ta (sekvenssi nro 50) koodaavan geenin, joka on kodonioptimoitu Ustilago maydis -hiivan ko-doninkäytön (sekvenssi nro 51) mukaisesti, jota reunustavat Sbfl-restriktio-kohdat. Plasmidi UmACS pilkottiin Sb/Ulä ja DraUlä. 2060 bp:n fragmentti eris-5 tettiin geeliltä ja liitettiin 4146 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK78pre SbfUlä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK78.
Plasmidi pKK76 pilkottiin SamHUIä ja DraUlä. 2652 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 6206 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK78 SamHUIä. Plasmidi pKK76 sisältää E. colin hygromysiiniresis-10 tenssigeenin CcTEFf-promoottorin ja CcTP/·/-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK86 (kuvio 5).
Esimerkki 5B: Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/86) tuottaminen, jossa on integroituna ACS2:ta koodaava geeni ja hygromysiiniresis-tenssigeeni, transformoimalla villityypin C. curvatus pilkotulla plasmidilla 15 pKK86 (kuvio 5, esim. 5A)
Plasmidi pKK86 pilkottiin Λ/ofUläja PspOMUIä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin villityypin C. curvatus -kannan ATCC 20509 nimeltään Y23 transformoimiseksi elektroporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin hygro-mysiiniresistenssin suhteen. Useita hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä ana-20 lysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin C. curvatuksen transformaatiosta Λ/ofUlä ja PspOMUIä leikatulla pKK86:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin CcTPH-promoottorin ja CcENOI-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/86-86, Y23/86-92, Y23/86-93, Y23/86-98 ja Y23/86-100.
^ 25 Esimerkki 6A: Plasmidin (pKK95, kuvio 6) konstruointi, joka sisältää se- ^ ruleeniresistenssigeenin CcTEFf-promoottorin ja CcTPI1-terminaattorin i o säätelyn alaisena sekä R. oryzaen PDAT:tä koodaavan geenin CcTPH- i ^ promoottorin ja CcGPDf-terminaattorin säätelyn alaisena g Plasmidi pKK54 pilkottiin KpnUlä ja Sb/Ulä. 394 bp:n fragmentti
CL
30 eristettiin geeliltä ja liitettiin 3742 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla £2 plasmidi nimeltään pKK63 KpnUlä ja SbfUlä. Plasmidi pKK54 sisältää
LO
o CcGPDf-terminaattorin ja plasmidi pKK63 sisältää CcTPH-promoottorin. Saa- ° dulle plasmidille annettiin nimi pKK93pre. Plasmidi UmPDAT pilkottiin SbfUlä.
1844 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 4136 bp:n fragmenttiin, joka 35 saatiin pilkkomalla plasmidi pKK93pre SbfUlä. Plasmidi UmPDAT sisältää R.
33 oryzaen PDAT:tä (sekvenssi nro 52) koodaavan geenin, joka on kodoniopti-moitu U. maydis -hiivan kodoninkäytön (sekvenssi nro 53) mukaisesti, jota reunustavat Sbfl-restriktiokohdat. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK93.
Plasmidi pKK93 pilkottiin EcoRUIä ja DraUlä. 3029 bp:n fragmentti 5 eristettiin geeliltä ja liitettiin 6242 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK91 EcoRUIä. Plasmidi pKK91 sisältää S. cerevisiaen seruleeni-resistenssigeenin CcTEFf-promoottorin ja Cc7P/f-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK95 (kuvio 6).
Esimerkki 6B. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/95) tuottami-10 nen, jossa on integroituna PDAT:tä koodaava geeni ja seruleeniresis-tenssigeeni, transformoimalla villityypin C. curvatus pilkotulla plasmidilla pKK95 (kuvio 6, esim. 6A)
Plasmidi pKK95 pilkottiin EcoRV:llä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin villityypin C. curvatus -kannan ATCC 20509 nimeltään Y23 transfor-15 moimiseksi elektroporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin seruleeniresis-tenssin suhteen. Useita seruleeniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin C. curvatuksen transformaatiosta EcoRV:llä leikatulla pKK95:llä ja jotka sisälsivät R. oryzae n PDAT:tä koodaavan geenin Cc 7P/f-promoottorin ja CcGPDf-terminaattorin 20 säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/95-87, Y23/95-98, Y23/95-99, Y23/95-104 ja Y23/95-109.
Esimerkki 7A. Plasmidin (pKK85, kuvio 7) konstruointi, joka sisältää hyg-romysiiniresistenssigeenin CcTEFI-promoottorin ja CcTPH-terminaatto-rin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiae n ALD6:ta koodaavan geenin ^ 25 CcE/VOf-promoottorin ja CcTEFf-terminaattorin säätelyn alaisena sekä oi S. cerevisiae n ACS2:ta koodaavan geenin Cc 7P/f-promoottorin ja CcE- i S Λ/Of-terminaattorin säätelyn alaisena o Plasmidi pKK77 pilkottiin EcoRUIä ja Xmn\:\\ä. 3073 bp:n fragmentti g eristettiin geeliltä ja liitettiin 6206 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla 30 plasmidi pKK78 EcoRUIä. Plasmidi pKK77 sisältää S. cerevisiae n ALD6:ta
CO
£2 koodaavan geenin CcEA/Of-promoottorin ja CcTEFf-terminaattorin säätelyn
LO
o alaisena ja plasmidi pKK78 sisältää S. cerevisiae n ACS2:ta koodaavan geenin oj CcTPH-promoottorin ja CcEA/Of-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK84. Plasmidi pKK76 pilkottiin EamHUIä ja 35 XmnUlä. 2652 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 9279 bp:n fragment- 34 tiin, joka saatiin pilkkomalla pKK84 SamHkllä. Plasmidi pKK76 sisältää hygro-mysiiniresistenssigeenin CcTEFf-promoottorin ja CcTP/f-terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK85 (kuvio 7).
Esimerkki 7B. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/85) tuottami-5 nen, jossa on integroituna ALD6:ta koodaavat ja ACS2:ta koodaavat geenit ja hygromysiiniresistenssigeeni, transformoimalla villityypin C. curva-tus pilkotulla plasmidilla pKK85 (kuvio 7, esim. 7A)
Plasmidi pKK85 pilkottiin NotlMä ja PspOMkllä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin villityypin C. curvatus -kannan ATCC 20509 nimeltään Y23 10 transformoimiseksi elektroporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin hygro-mysiiniresistenssin suhteen. Useita hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin C. curvatuksen transformaatiosta A/ofUlä ja PspOMUIä leikatulla pKK85:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcENOI-promoottorin ja 15 CcTEF 1-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin CcTPH-promoottorin ja CcENOI-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/85-119, Y23/85-125, Y23/85-128, Y23/85-129 ja Y23/85-139.
Esimerkki 8. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/81/95) tuotta-20 minen, jossa on integroituna ALD6:ta koodaavat ja PDAT:tä koodaavat geenit sekä hygromysiini-ja seruleeniresistenssigeenit, transformoimalla geneettisesti muokattu kanta Y23/81-51 (esim. 3B) plasmidilla pKK95 (kuvio 6, esim. 6A)
Plasmidi pKK95 pilkottiin EcoRV:llä, ja saatua lineaarista DNA:ta 25 käytettiin geneettisesti muokatun kannan Y23/81-51 transformoimiseksi elekt-^ roporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin seruleeni- ja hygromysiiniresis- o tenssin suhteen. Useita seruleeni-ja hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä ana- o lysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin geneetti- g sesti muokatun kannan Y23/81-51 transformaatiosta EcoRV:llä leikatulla
CL
30 pKK95:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcE-£2 A/Of-promoottorin ja CcTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena sekä R. oryzaen
LO
o PDAT:tä koodaavan geenin CcTPH-promoottorin ja CcGPDf-terminaattorin ° säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/81/95-18 ja Y23/81/95-42.
35
Esimerkki 9. Geneettisesti muokatun C. curvatuksen (Y23/85/95) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta, ACS2:ta ja PDAT:tä koodaavat geenit sekä hygromysiini-ja seruleeniresistenssigeenit, transformoimalla geneettisesti muokattu kanta Y23/85-128 (esim. 7B) plasmidilla pKK95 5 (kuvio 6, esim. 6A)
Plasmidi pKK95 pilkottiin EcoRV:llä, ja saatua lineaarista DNA:ta käytettiin geneettisesti muokatun kannan Y23/85-128 transformoimiseksi elekt-roporaatiolla. Transformoituja soluja seulottiin seruleeni- ja hygromysiiniresis-tenssin suhteen. Useita seruleeni-ja hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä ana-10 lysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin geneettisesti muokatun kannan Y23/85-128 transformaatiosta EcoRV:llä leikatulla pKK95:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin CcE-A/Of-promoottorin ja CcTEFf-terminaattorin säätelyn alaisena, S. cerevisiae n ACS2:ta koodaavan geenin CcTPII-promoottorin ja CcENOI-terminaattorin 15 säätelyn alaisena sekä R. oryzaen PDAT:tä koodaavan geenin CcTPII-promoottorin ja CcGPDf-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet Y23/85/95-4 ja Y23/85/95-68.
Esimerkki 10. Mucor circinelloidesin TPI- (McTPH) -promoottori-ja termi-naattorialueen kloonaus 20 Genominen M. circinelloidesin TPI1-geenin fragmentti monistettiin PCR:llä genomisesta M. circinelloides f. griseocyanuksen (D-82202, VTT:n mikrobikokoelma) DNA:sta degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 54 (Mould TPI1) ja sekvenssinä nro 55 (Mould TPI3). Degeneroituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin TPI1-25 geeneistä lajeista Rhizopus oryzae, Fusarium oxysporum, Aspergillus fumiga-5 tus, A. terreus ja A. nidulans. -400 bp:n genominen fragmentti eristettiin ja
(M
^ sekvensoitiin.
° Genominen fragmentti, joka sisälsi McTPH-promoottorialueen, saa-
Is- ° tiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TP/f-geenispesifisillä oligonukleoti- £ 30 deilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 56 (MC_TPI2) ja sekvenssinä nro co 57 (MC_TPI1), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro
CO
3 (PCR linker I), ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla ? kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Sspkllä pilkottua M. circinelloidesin ^ DNA:ta. -1500 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
36 M. circinelloidesln TPI1-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 58 (MC_TPI7) ja sekvenssinä nro 59 (MC_TPI_8), sekä M. circinelloidesln genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin Psfkllä ja Ba/nHkllä. 1251 bp:n fragmentti eristettiin 5 geeliltä ja liitettiin PsfUlä ja BamHl:llä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK56. Plasmidi pKK56 sisältää M. circinel-loidesln TP/’/-promoottorin.
Genominen fragmentti, joka sisälsi McTPH-terminaattorialueen, saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TP/f-geenispesifisillä oligonuk-10 leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 60 (MC TPI4) ja sekvenssinä nro 61 (MC_TPI3), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Nru\:\\ä pilkottua M. circinelloidesm DNA:ta. -1500 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin osittain.
15 M. circinelloidesm TPI1-terminaattori PCR-monistettiin käyttämällä alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 62 (MC_TPI5) ja sekvenssinä nro 63 (MC_TPI6), sekä M. circinelloidesln genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin Xba\M ja BamHUIä. 347 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin Xba\:\\ä ja BamHUIä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. 20 Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK57. Plasmidi pKK57 sisältää M. circinel-loidesln TP/f-terminaattorin.
Esimerkki 11. Mucor circinelloidesin TEF- (McTEFI) -promoottori-ja terminaattorialueen kloonaus
Genominen M. circinelloidesm TEF1-geenin fragmentti monistettiin 25 PCR:llä genomisesta M. circinelloides f. griseocyanuksen (D-82202, VTT:n
CM
^ mikrobikokoelma) DNA:sta degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu ^ sekvenssinä nro 64 (Mould TEF1) ja sekvenssinä nro 65 (Mould TEF4). De- 9 generoituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin TEF1- o geeneistä lajeista Rhizopus oryzae, Fusarium oxysporum, Aspergillus terreus | 30 ja A. nidulans. -600 bp:n genominen fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
w Genominen fragmentti, joka sisälsi McTEFI-promoottorialueen, saa- ^ tiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TEFf-geenispesifisillä oligonukleoti- ° deilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 66 (MC_TEF2) ja sekvenssinä nro
O
^ 67 (MC_TEF1), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 35 3 (PCR linker I), ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Sspl:llä pilkottua M. circinelloidesin 37 DNA:ta. ~500 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset aluk-keet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 68 (MC_TEF6) ja sekvenssinä nro 69 (MC_TEF5), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä PCR-monistuk-sessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR 5 linker I), ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa sannalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Haelll:lla pilkottua M. circinelloides\n DNA:ta. -1500 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
M. circinelloidesm TEF1-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 70 (MC_TEF9) ja sekvenssinä 10 nro 71 (MC_TEF10), sekä M. circinelloides\n genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin Hind\ll:lla ja Psfkllä, ja 1387 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin HindWY.Wa ja Psfkllä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK64. Plasmidi pKK64 sisältää M. circinel-/o/c/esin TEF1-promoottorin.
15 Genominen fragmentti, joka sisälsi McTEFI-terminaattorialueen, saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella TP/f-geenispesifisillä oligonuk-leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 72 (MC_TEF4) ja sekvenssinä nro 73 (MC_TEF3), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla taval-20 la kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin Sspkllä pilkottua M. circinelloidesln DNA:ta. -1100 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset alukkeet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 74 (MC TEF8) ja sekvenssinä nro 75 (MC TEF7), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä PCR-monis-tuksessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 25 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla ku-ten edellä, paitsi että käytettiin HpaVMä pilkottua M. circinelloides\n DNA:ta.
5 -1200 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
(M
^ M. circinelloidesin TEFf-terminaattori PCR-monistettiin käyttämällä ° alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 76 (MC_TEF11) ja sekvenssinä
Is- ° 30 nro 77 (MC_TEF12), sekä M. circinelloides\r\ genomista DNA:ta templaattina.
| PCR-fragmentti pilkottiin Xmakllä ja EcoRkllä, ja 389 bp:n fragmentti eristettiin co geeliltä ja liitettiin Xmakllä ja EcoRUIä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin.
CO
Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK65. Plasmidi pKK65 sisältää M. circinel- ° loidesln TEFf-terminaattorin.
o C\l 38
Esimerkki 12. Mucor c/rc/ne//o/desin PGK- (McPGKI) -promoottorialueen kloonaus
Genominen M. circinelloides\n PGK1-geenin fragmentti monistettiin PCR:llä genomisesta M. circinelloides f. griseocyanuksen (D-82202, VTT:n 5 mikrobikokoelma) DNA:sta degeneroituneilla alukkeilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 78 (Mould PGK4) ja sekvenssinä nro 79 (Mould PGK2). Degeneroituneet alukkeet suunniteltiin perustuen konsensussekvenssiin PGK1-geeneistä lajeista Rhizopus oryzae, Fusarium oxysporum, Aspergillus fumiga-tus, A. oryzae ja A. nidulans. -250 bp:n genominen fragmentti eristettiin ja 10 sekvensoitiin.
Genominen fragmentti, joka sisälsi McPGKI-promoottorialueen, saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella PGKf-geenispesifisillä oligonuk-leotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 80 (MC_PGK2) ja sekvenssinä nro 81 (MC_PGK1), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssi-15 nä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytettiin SspUlä pilkottua M. circinel-loides\n DNA:ta. -1300 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset alukkeet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 82 (MC_PGK4) ja sekvenssinä nro 83 (MC_PGK3), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä 20 PCR-monistuksessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Hae Ulilla pilkottua M. circinelloidesm DNA:ta. -600 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
M. circinelloidesm PGK1-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä 25 alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 84 (MC_PGK5) ja sekvenssinä ^ nro 85 (MC_PGK6), sekä M. circinelloidesm genomista DNA:ta templaattina.
o PCR-fragmentti pilkottiin SaclUla ja Xbal:llä, ja 1291 bp:n fragmentti eristettiin cd geeliltä ja liitettiin SaclUla ja XbaUlä pilkottuun pBluescript KS -plasmidiin.
0 ^ Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK62. Plasmidi pKK62 sisältää M. circinel- ° 30 loidesm PGKf-promoottorin.
CC
CL
m Esimerkki 13. Mucor circinelloidesin GPD- {McGPDI) -promoottorialueen r? kloonaus
LO
£ Genominen fragmentti, joka sisälsi McGPDI-promoottorialueen, ^ saatiin ligaatiovälitteisellä PCR-monistuksella Mucor circinelloidesm (syn. ra- 35 cemosus) GPDf-geenispesifisillä (GenBank-talletusnumero AJ293012, version 39 numero AJ293012.1) oligonukleotideilla, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 86 (MC_GPD2) ja sekvenssinä nro 87 (MC_GPD1), yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuin esimerkissä 1A, paitsi että käytet-5 tiin EcoRV:llä pilkottua M. circinelloidesln (D-82202, VTT:n mikrobikokoelma) DNA:ta. -500 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin. Sisäkkäiset alukkeet, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 88 (MC_GPD10) ja sekvenssinä nro 89 (MC_GPD9), suunniteltiin ja käytettiin ligaatiovälitteisessä PCR-monis-tuksessa yhdessä oligonukleotidien, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 3 10 (PCR linker I) ja sekvenssinä nro 4 (PCR linker II), kanssa samalla tavalla kuten edellä, paitsi että käytettiin Stu\:Mä pilkottua M. circinelloidesln DNA:ta. -1400 bp:n PCR-fragmentti eristettiin ja sekvensoitiin.
M. circinelloidesln GPD1-promoottori PCR-monistettiin käyttämällä alukkeita, jotka on identifioitu sekvenssinä nro 90 (MC_GPD11) ja sekvenssinä 15 nro 91 (MC_GPD12), sekä M. circinelloidesln genomista DNA:ta templaattina. PCR-fragmentti pilkottiin EcoRkllä ja Hindllklla, ja 1440 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin EcoRkllä ja Hind\\\:\\a pilkottuun pBluescript KS -plas-midiin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK59. Plasmidi pKK59 sisältää M. circinelloidesln GPD1-promoottorin.
20 Esimerkki 14A: E. colin hygromysiiniresistenssigeenin kloonaus; plas-midin (pKK69) konstruointi, jossa on E. colin hygromysiiniresistenssi-geeni McPGKI-promoottorin ja Mc TP/f-terminaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi pKK62 pilkottiin Saclklla ja Sbfkllä. 1286 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK52 pilkottiin Sbf\\Mä. 1034 bp:n fragmentti eris-25 tettiin geeliltä. 1286 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK62, ja
C\J
ς 1034 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK52, liitettiin 3268 bp:n ^ fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK57 Saclklla ja Sbfkllä. Plas- 9 midi pKK52 sisältää E. colin hygromysiiniresistenssigeenin, plasmidi pKK62 o sisältää M. circinelloidesin PGK1-promoottorin ja plasmidi pKK57 sisältää M.
| 30 circinelloidesln TP/f-terminaattorin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK69.
m Plasmidi pKK69 sisältää E. colin hygromysiiniresistenssigeenin M. circinel- £2 loidesln PGK1-promoottorin ja M. circinelloidesln TP/f-terminaattorin säätelyn ° alaisena.
o
(M
40
Esimerkki 14B: S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeenin kloonaus; plas-midin (pKK92) konstruointi, jossa on S. cerevisiaen seruleeniresistenssi-geeni McPGKI-promoottorin ja Mc 7P/f-term inaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi pKK80 pilkottiin PsfLIlä. 1685 bp:n fragmentti eristettiin 5 geeliltä. Plasmidi pKK80 sisältää S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeenin. 1685 bp:n fragmentti liitettiin 4554 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK69 Sb/Lllä. Plasmidi pKK69 sisältää M. circinelloidesin PGK7-pro-moottorin ja M. circinelloidesin TP/f-terminaattorin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK92. Plasmidi pKK92 sisältää S. cerevisiaen seruleeniresistenssi-10 geenin M. circinelloidesin PGK1-promoottorin ja M. circinelloidesin TPI1-termi-naattorin säätelyn alaisena.
Esimerkki 15A. Plasmidin (pKK75, kuvio 8) konstruointi, joka sisältää hygromysiiniresistenssigeenin McPGKI-promoottorin ja McTP/7-termi-naattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ALD6-geenin McTPH-pro-15 moottorin ja Mc7~£Fi-terminaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi pKK56 pilkottiin SamHLIlä ja PsfLIlä. 1251 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi pKK56 sisältää McTPIf-promoottorin. Plasmidi RoALD pilkottiin Sbf\\Mä. 1514 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä. Plasmidi RoALD sisältää S. cerevisiaen ALD6:ta (sekvenssi nro 47) koodaavan geenin, 20 joka on kodonioptimoitu Rhizopus oryzae -rihmasienen kodoninkäytön (sekvenssi nro 49) mukaisesti, jota reunustavat Sbfl-restriktiokohdat. 1251 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK56, ja 1514 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista RoALD, liitettiin 3321 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK65 SamHLIlä ja SbfiMä. Plasmidi pKK65 sisältää Mc-25 TEFf-terminaattorin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK73. Plasmidi o pKK73 sisältää S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin M. circinelloidesin
CM
£ TPI1-promoottorin ja M. circinelloidesin TEF1-terminaattorin säätelyn alaisena.
° Plasmidi pKK69 pilkottiin SamHLIlä ja XmnLIlä. 2652 bp:n fragmentti ° eristettiin geeliltä ja liitettiin 6086 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla | 30 plasmidi pKK73 SamHLIlä. Plasmidi pKK69 sisältää E. colin hygromysiiniresis- oo tenssigeenin M. circinelloidesin PGK1-promoottorin ja M. circinelloidesin TPI1- terminaattorin säätelyn alaisena. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK75 5 (kuvio 8).
CM
41
Esimerkki 15B. Geneettisesti muokatun Mucor circinelloidesin (M22/75) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta koodaava geeni ja hygromy-siiniresistenssigeeni, transformoimalla villityypin M. circinelloides pilkotulla plasmidilla pKK75 (kuvio 8, esim. 15A) 5 Plasmidi pKK75 pilkottiin Kpn\\Wä ja Not\\Wä. 5866 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja käytettiin villityypin M. circinelloides -kannan (D-82202, VTT:n mikrobikokoelma) nimeltään M22 transformoimiseksi käyttäen Mucor-protoplastien transformaatiomenetelmää (Wolff et ai., 2002). Transformoituja soluja seulottiin hygromysiiniresistenssin suhteen. Useita hygromysiiniresis-10 tenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin villityypin M. circinelloides -kannan transformaatiosta Kpnl:llä ja A/ofUlä leikatulla pKK75:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaa-van geenin McTPH-promoottorin ja McTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet M22/75-80 ja M22/75-86.
15 Esimerkki 16A. Plasmidin (pKK94, kuvio 9) konstruointi, joka sisältää hygromysiiniresistenssigeenin McPGKI-promoottorin ja McTP/7-termi-naattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiae n ALD6:ta koodaavan geenin McTPH-promoottorin ja McTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiae n ACS2:ta koodaavan geenin McTEFI-promoottorin ja 20 McTP/i-terminaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi pKK57 pilkottiin Psfkllä. 351 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 4326 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK64 Pst\:Mä. Plasmidi pKK57 sisältää McTP/f-terminaattorin ja plasmidi pKK64 sisältää McTEFI-promoottorin. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK90Pre. 25 Plasmidi RoACS pilkottiin Sbf\:Mä. 2060 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja o liitettiin 4677 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK90Pre
<M
^ Sbflillä. Plasmidi RoACS sisältää S. cerevisiae n ACS2:ta (sekvenssi nro 50) ° koodaavan geenin, joka on kodonioptimoitu Rhizopus oryzae -rihmasienen
Is" ° kodoninkäytön (sekvenssi nro 92) mukaisesti, jota reunustavat Sbfl-restriktio- | 30 kohdat. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK90.
co Plasmidi pKK75 pilkottiin Kpn\\Wä, mitä seurasi ulkonevien 3’-päiden
CO
[£ poisto T4 DNA -polymeraasilla ja kullakin 4:stä dNTP:stä. Kpn\:Mä (tylppäpäi- ? nen) pilkottu plasmidi pKK75 pilkottiin A/ofkllä, ja 5866 bp:n fragmentti eristet- ™ tiin geeliltä. Plasmidi pKK75 sisältää E. colin hygromysiiniresistenssigeenin M.
35 circinelloides\n PGK1-promoottorin ja M. circinelloidesin TP/f-terminaattorin 42 säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin M. circinel-loidesm TPI1-promoottorin ja M. circinelloidesm TEF1-terminaattorin säätelyn alaisena. 5866 bp:n fragmentti, joka oli peräisin plasmidista pKK75, liitettiin 6698 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK90 Sma\:\\ä ja No-5 t\:\\ä. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK94 (kuvio 9).
Esimerkki 16B. Geneettisesti muokatun Mucor circinelloidesin (M22/94) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta ja ACS2:ta koodaavat geenit sekä hygromysiiniresistenssigeeni, transformoimalla villityypin M. circi-nelloides pilkotulla plasmidilla pKK94 (kuvio 9, esim. 16A) 10 Plasmidi pKK94 pilkottiin Kpn\:\\ä ja Sackllä. 9701 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja käytettiin villityypin M. circinelloides -kannan (D-82202, VTT:n mikrobikokoelma) nimeltään M22 transformoimiseksi käyttäen esimerkissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää. Transformoituja soluja seulottiin hygromysiiniresistenssin suhteen. Useita hygromysiiniresistenttejä pesäk-15 keitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin villityypin M. circinelloides -kannan transformaatiosta Kpnl:llä ja Sackllä leikatulla pKK94:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin McTPII-promoottorin ja McTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin McTEFI-promoottorin ja McTPII-termi-20 naattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet M22/94-16 ja M22/94-24.
Esimerkki 17A. Plasmidin (pKK96, kuvio 10) konstruointi, joka sisältää hygromysiinigeenin McPGKI-promoottorin ja McTPII-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin McTEFI-promoottorin ja McTPI1-terminaattorin säätelyn alaisena 25 Plasmidi pKK94 pilkottiin SsrGkllä, ja 9683 bp:n fragmentti eristettiin
O
^ geeliltä ja liitettiin yhteen itsensä kanssa. Saadulle plasmidille annettiin nimi o pKK96 (kuvio 10). Plasmidi pKK96D sisältää S. cerevisiaen ACS2:ta koodaa- o van geenin McTEFI-promoottorin ja McTP/f-terminaattorin säätelyn alaisena.
X
Esimerkki 17B. Geneettisesti muokatun Mucor c/rc/ne//o/desin (M22/96) ^ 30 tuottaminen, jossa on integroituna ACS2:ta koodaava geeni ja hygromy- i^.
g siiniresistenssigeeni, transformoimalla villityypin M. circinelloides pilko- o tulla plasmidilla pKK96 (kuvio 10, esim. 17A)
Plasmidi pKK96 pilkottiin Kpn\\Mä ja Sackllä. 6824 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja käytettiin villityypin M. circinelloides -kannan (D-82202, 43 VTT:n mikrobikokoelma) nimeltään M22 transformoimiseksi käyttäen esimerkissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää. Transformoituja soluja seulottiin hygromysiiniresistenssin suhteen. Useita hygromysiiniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin 5 villityypin M. circinelloides -kannan transformaatiosta KpnUlä ja SacUlä leikatulla pKK96D:llä ja jotka sisälsivät S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin McTEF•/-promoottorin ja McTP/f-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet M22/96-1 ja M22/96-6.
Esimerkki 18A. Plasmidin (pKK98) konstruointi, joka sisältää seruleeni-10 resistenssigeenin McPGKI-promoottorin ja McTPH-terminaattorin säätelyn alaisena sekä R. oryzaen PDAT-geenin McGPDI-promoottorin ja McTEFf-terminaattorin säätelyn alaisena
Plasmidi pKK59 pilkottiin SbfUlä ja XbaUlä. 1467 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 3309 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla 15 plasmidi pKK65 SbfUlä ja XbaUlä. Plasmidi pKK59 sisältää McGPDI-promoottorin ja plasmidi pKK65 sisältää McTEFI- term inaattorin. Saadulle plasmi-dille annettiin nimi pKK88. Plasmidi RoPDAT pilkottiin Sbf\\Mä. 1844 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 4776 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi pKK88 Sbf\\Mä. Plasmidi RoPDAT sisältää R. oryzaen PDAT:tä 20 (sekvenssi nro 52) koodaavan geenin, joka on kodonioptimoitu R. oryzaen ko-doninkäytön (sekvenssi nro 93) mukaisesti, jota reunustavat Sbfl-restriktio-kohdat. Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK97.
Plasmidi pKK97 pilkottiin EcoRUIä. 3659 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja liitettiin 6239 bp:n fragmenttiin, joka saatiin pilkkomalla plasmidi 25 pKK92 EcoRUIä. Plasmidi pKK92 sisältää S. cerevisiaen seruleeniresistenssi-
CM
^ geenin McPGKI-promoottorin ja McTPH-terminaattorin säätelyn alaisena.
^ Saadulle plasmidille annettiin nimi pKK98 (kuvio 11).
CD
0 ^ Esimerkki 18B. Geneettisesti muokatun Mucor circinelloidesin (M22/98) 1 tuottaminen, jossa on integroituna PDAT:tä koodaava geeni ja seruleeni-30 resistenssigeeni, transformoimalla villityypin M. circinelloides pilkotulla eo plasmidilla pKK98 (kuvio 11, esim. 18A) o Plasmidi pKK98 pilkottiin ApaUlä ja SaclUla. 7029 bp:n fragmentti ° eristettiin geeliltä ja käytettiin villityypin M. circinelloides -kannan (D-82202, VTT:n mikrobikokoelma) nimeltään M22 transformoimiseksi käyttäen esimer-35 kissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää. Transformoituja soluja seulot- 44 tiin seruleeniresistenssin suhteen. Useita seruleeniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin villi-tyypin M. circinelloides -kannan transformaatiosta Apa\:Mä ja SaclUla leikatulla pKK98:lla ja jotka sisälsivät R. oryzaen PDAT:tä koodaavan geenin McGPDI -5 promoottorin ja McTEFf-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimi M22/98-16.
Esimerkki 19. Geneettisesti muokatun Mucor c/rc/ne//o/desin (M22/75/98) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta ja PDAT:tä koodaavat geenit sekä hygromysiini- ja seruleeniresistenssigeenit, transformoimalla ge-10 neettisesti muokattu kanta M22/75-86 (esim. 15B) pilkotulla plasmidilla pKK98 (kuvio 11, esim. 18A)
Plasmidi pKK98 pilkottiin ApaUlä ja SaclUla. 7029 bp:n fragmentti eristettiin geeliltä ja käytettiin geneettisesti muokatun kannan M22/75-86 trans-formoimiseksi käyttäen esimerkissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää. 15 Transformoituja soluja seulottiin seruleeniresistenssin suhteen. Useita seruleeniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteille, jotka olivat peräisin rekombinantin M22/75-86 -kannan transformaatiosta ApaUlä ja SaclUla leikatulla pKK98:lla ja jotka sisälsivät R. oryzaen PDAT:tä koodaavan geenin McGPDI-promoottorin ja McTEFI-terminaattorin säätelyn 20 alaisena sekä S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin McTPII-promoottorin ja McTEFFterminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet M22/75/98-7 ja M22/75/98-9.
Esimerkki 20. Geneettisesti muokatun Mucor crrcme//o/desin (M22/94/98) tuottaminen, jossa on integroituna ALD6:ta, ACS2:ta ja PDAT:tä koodaaja 25 vat geenit sekä hygromysiini- ja seruleeniresistenssigeenit, transformoisi maila geneettisesti muokattu kanta M22/94-31 (esim. 16B) pilkotulla plas- § noidilla pKK98 (kuvio 11, esim. 18A) i o Plasmidi pKK98 pilkottiin ApaUlä ja SaclUla. 7029 bp:n fragmentti g eristettiin geeliltä ja käytettiin geneettisesti muokatun kannan M22/94-31 trans- 30 formoimiseksi käyttäen esimerkissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää.
CO
£2 Transformoituja soluja seulottiin seruleeniresistenssin suhteen. Useita seru-
LO
o leeniresistenttejä pesäkkeitä analysoitiin DNA-tasolla PCR:llä. Transformanteil- ° le, jotka olivat peräisin rekombinantin M22/94-31 -kannan transformaatiosta
ApaUlä ja SaclUla leikatulla pKK98:lla ja jotka sisälsivät R. oryzaen PDAT:tä 35 koodaavan geenin McGPDI-promoottorin ja McTEF•/-terminaattorin säätelyn 45 alaisena, S. cerevisiaen ALD6:ta koodaavan geenin McTPII-promoottorin ja McTEFI-terminaattorin säätelyn alaisena sekä S. cerevisiaen ACS2:ta koodaavan geenin McTEFI-promoottorin ja McTPII-terminaattorin säätelyn alaisena, annettiin nimet M22/94/98-19 ja M22/94/98-22.
5 Esimerkki 21. Lipidiuutto sekä kokonaislipidi-ja -triglyseridipitoisuusmit-taukset
Lipidiuuttomenetelmä muunnettiin Folchin et ai., 1957 menetelmästä. 0,5-2 ml soluviljelmää vietiin Eppendorf-putkeen. Näyte sentrifugoitiin ja supernatantti heitettiin pois. Pelletti pantiin nopeasti nestetyppeen ja varastoi-10 tiin -80 °C:ssa. Vaihtoehtoisesti rihmasienisoluja 2-12 ml:n viljelyliemestä otettiin talteen vakuumisuodatuksella lasimikrokuitusuodatinkiekkojen (Whatman, Englanti) läpi. Pesun jälkeen kahdesti tislatulla vedellä biomassa poistettiin suodattimelta käyttäen puhdasta spaattelia ja pantiin 2 ml:n mikrofugiputkiin, jotka pantiin nopeasti nestetyppeen ja varastoitiin -80 °C:ssa. Homogenointi-15 vaiheessa jäädytetty pelletti suspendoitiin 500 pl:aan jääkylmää metanolia, jossa oli 0,1 % BHT:tä (2,6-di-terf-butyyli-4-metyylifenoli) ja homogenoitiin Mixer Mill -homogenisaattorilla 5 mm:n zirkoniumoksidi-ja 3 mm:n yttriumilla stabiloitujen zirkoniumoksidipallojen (Retsch) kanssa 25 Hz 5 minuuttia. Homo-genoinnin jälkeen lisättiin 1000 pl kloroformia ja homogenointi toistettiin. Uu-20 delleen homogenoinnin jälkeen lisättiin 300 pl 20 mM etikkahappoa ja näytettä vorteksoitiin 10 min. Vorteksoinnin jälkeen näytettä sentrifugoitiin 13 000 rpm 5 min huoneenlämpötilassa. Alempi faasi otettiin talteen ja jäljelle jääneeseen faasiin lisättiin 1000 μΙ kloroformia, vorteksoitiin ja sentrifugoitiin uudelleen. Alemmat faasit yhdistettiin ennalta punnittuihin 2 ml:n mikrofugiputkiin ja kui-25 vattiin, minkä jälkeen näytteen kokonaislipidipitoisuus määritettiin gravimetrial-
C\J
5 la. Sitten lipidinäyte liuotettiin uudelleen 1,5 ml:aan kloroformi:metanolia (2:1) + ^ 0,1 % BHT ja varastoitiin -20 °C:ssa. Triasyyliglyserolianalyysiä varten 100- 9 1500 μΙ kloroformi:metanoli-uutettuja lipidejä haihdutettiin ja liuotettiin uudel- o leen 200-1000 pl:aan isopropanolia. Triasyyliglyserolit mitattiin näytteistä ent- | 30 symaattisesti käyttämällä Konelab Triglycerides -kittiä (Thermo Scientific, ^ Suomi) ja Cobas Mira -automaattianalysaattoria (Roche) tai mikrotiitterilevyn £3 lukijaa (Varioskan, Thermo Electron Corporation). Tätä lipidiuutto- sekä koko- 9 naislipidi- ja -triglyseridipitoisuusmittausten menetelmiä käytettiin seuraavissa o ^ esimerkeissä, jollei muutoin ole osoitettu.
46
Esimerkki 22. Kantojen Y23/81-51 ja Y23/81-66 (esim. 3B), Y23/86-88 ja Y23/86-92 (esim. 5B), Y23/95-87 ja Y23/95-109 (esim. 6B) ja Y23/85/95-4 (esim. 9) mikroaerobinen ravistelupullokarakterisointi glukoosialustassa, jonka C/N-suhde on 20 5 Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa viljelyalustaa ’’glukoosi CN20” (pH 5,5, 20 g glukoosia, 0,3 g (NH4)S04, 7,0 g KH2P04, 2,5 g Na2HP04 * 2 H20, 1,5 g MgS04* 7H20, 4,0 g hiivauutetta, 51 mg CaCI2, 8 mg FeCI3* 6 H20 ja 0,1 mg ZnS04* 7 H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin ODeoo-arvoon 0,3 soluilla, joita oli kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi -mal-10 joilla. Viljelmiä ylläpidettiin 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 100 rpm. Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityypin kantaa Y23 käytettiin kontrollina.
Lipidiuutto ja triasyyliglyserolipitoisuuden mittaus suoritettiin, kuten 15 on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin sentrifugoimalla 1 ml viljelmälientä esikuivatuissa, ennalta punnituissa Eppendorf-putkissa. Pesun jälkeen 1 ml:lla tislattua vettä solupellettiä kuivattiin 100 °C:ssa 24 tuntia ja punnittiin uudelleen. HPLC-analyysit sokereille suoritettiin Waters 2690 Separation Module- ja Water System InterBase Module -nestekromatografialla yhdis-20 tettynä Waters 2414 -differentiaalirefraktometrin ja Waters 2487 -duaalisen ab-sorbanssidetektorin kanssa. Nestekromatografiapylväät olivat 100 X 7,8 mm:n Fast Acid Analysis -pylväs yrityksestä BioRad ja 300 X 7,8 mm:n Aminex HPX-87H -pylväs yrityksestä Biorad. Pylväät tasapainotettiin 2,5 mM H2S04:llä vedessä 55 °C:ssa ja näytteet eluoitiin 2,5 mM H2S04:llä vedessä virtausnopeu-25 della 0,5 ml/min. Datan hankinta tehtiin käyttäen Waters Millenium -ohjel-^ mistoa. Tätä HPLC-menetelmää käytettiin kaikissa asianomaisissa esimer- o keissä.
cd 48 tunnin viljelyn jälkeen (taulukko 2A), kun jäljellä oli 4-8 g/l glu- ^ koosia, Y23/81-, Y23/86-, Y23/95- ja Y23/85/95-transformantit tuottivat 12, 22, ° 30 15 ja 24 % enemmän triasyyliglyseroleja suuremmalla tuotolla vastaavasti kuin £ kontrollikanta glukoosialustassa. Triasyyliglyserolisaannot käytettyä glukoosia g kohti olivat myös jopa 10 % paremmat transformanteilla verrattuna kontrolli- g kantaan. Lisäksi Y23/85/95-transformantilla oli 13 % suurempi triasyyliglysero- o lisaanto biomassasta kuin kontrollikannalla (12,9 ja 11,4 % TAG-saanto bio-
CM
35 massasta vastaavasti). Erityisesti 24 tunnin viljelyn jälkeen (taulukko 2B), kannoilla, jotka ilmensivät pelkästään ALD:tä tai ACS:ää, tai ALD:tä ja ACS:ää 47 yhdessä, oli lisääntynyt triasyyliglyserolien tuotanto mitattuna pitoisuutena (g/l) ja saantona biomassaa ja käytettyä glukoosia kohti, ja suurempi tuotto (mg/l/h) verrattuna kontrollikantaan.
Taulukko 2A. Triasyyliglyseroli (TAG) -pitoisuus (g/l), tuotto (mg/l/h) ja 5 saanto (%) käytettyä glukoosia kohti 48 tunnin mikroaerobisen viljelyn jälkeen glukoosialustassa, jossa C/N-suhde on 20
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG mg/l/h (käytetty ___glukoosi-%)__
Kontrolli__0,72__5,88__15,0_ Y23/81 (ALD)__081__090__16,8 Y23/86 (ACS)__088__O00__18,3 Y23/95 (PDAT)__082__002__17,2 Y23/85/95 0,89 6,46 18,5 (ALD+ACS+PDAT) ___
Taulukko 2B. Triasyyliglyseroli (TAG) -pitoisuus (g/l) ja saanto (%) biomassaa (CDW) ja käytettyä glukoosia kohti 24 tunnin mikroaerobisen viljelyn jälkeen glukoosialustassa, jossa C/N-suhde on 20
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG mg/l/h (CDW-%) (käytetty ____glukoosi-%)__
Kontrolli__022__015__4,29__9,1 Y23/81-66 (ALD)__026__009__4J36__10,8 Y23/85-125 0,31 7,01 5,49 12,8
CVI
(ALD+ACS)
(M
ώ Y23/86-86 (ACS) 0,30 6,76 5,26 12,5 o o 10 Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks- g pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyserolipitoisuuksia ja tuotannon nope-
CL
uksia sekä triasyyliglyserolisaantoja käytetystä glukoosista tai kuivapainoa £2 kohti viljelyssä pienillä C/N-suhteilla.
LO
o δ
CM
48
Esimerkki 23. Kantojen Y23/81-8, 51, 59, 66 ja 69 (esim. 3B), Y23/85-119, 125, 128, 129 ja 139 (esim. 7B), Y23/86-86, 92, 93, 98 ja 100 (esim. 5B), Y23/95-99 ja 104 (esim. 6B), Y23/81/95-42 (esim. 8) ja Y23/85/95-4 ja 68 (esim. 9) aerobinen ravistelupullokarakterisointi glukoosialustassa, jonka 5 C/N-suhde on 65
Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa hiivan viljelyalustaa II (pH 5,5, 20 g glukoosia, 0,3 g (NH4)S04, 7,0 g KH2P04, 2,5 g Na2HP04 * 2 H20, 1,5 g MgS04* 7H20, 0,6 g hiivauutetta, 51 mg CaCI2, 8 mg FeCh* 6 H20 ja 0,1 mg ZnS04* 7 H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin OD6oo-10 arvoon 0,3 soluilla, joita oli kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi -maljoilla. Viljelmiä ylläpidettiin 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm. Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityypin kantaa Y23 käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino määritettiin ja HPLC-analyysi suoritettiin, 15 kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja triasyyliglyserolimittaukset kuten on kuvattu esimerkissä 21.
44 tunnin viljelyn jälkeen (taulukko 3A), transformanteilla Y23/81, Y23/85, Y23/86, Y23/95, Y23/81/95 ja Y23/85/95 oli 4, 3, 6, 1, 12 ja 4 % paremmat triasyyliglyserolisaannot käytettyä glukoosia kohti, vastaavasti, kuin 20 kontrollikannalla. Lisäksi transformanteilla Y23/81/95 ja Y23/85/95 oli 7-8 % suurempi triasyyliglyserolisaanto biomassasta kuin kontrollikannalla (42,8, 43,0 ja 40,0 % TAG-saanto [/CDW] vastaavasti). 25 tunnin viljelyn jälkeen (taulukko 3B), kannoilla, jotka ilmensivät pelkästään ALD:tä tai ACS:ää, tai ALD:tä ja ACS:ää yhdessä, oli lisääntynyt triasyyliglyserolien tuotanto mitattuna pitoisuu-25 tena (g/l) ja saantona biomassaa ja käytettyä glukoosia kohti.
Taulukko 3A. Maksimaalinen triasyyliglyseroli (TAG) -saanto (%) käytet-^ tyä glukoosia kohti 44 tunnin viljelyn jälkeen glukoosialustassa, jonka ^ C/N-suhde on 65 co -- 9 Kanta TAG-saanto o__(käytetty glukoosi-%)_ x Kontrolli__16,6_ ^ Y23/81 (ALD)__17,3_
So Y23/85 (ALD+ACS)__17^_ g Y23/86 (ACS)__17J3_ o Y23/95 (PDAT)__16^_ ^ Y23/81/95 (ALD+PDAT)__18J3_ Y23/85/95 (ALD+ACS+PDAT) 17,4 49
Taulukko 3B. Triasyyliglyseroli (TAG) -pitoisuus (g/l) ja saanto (%) biomassaa (CDW) ja käytettyä glukoosia kohti 25 tunnin viljelyn jälkeen glu-koosialustassa, jonka C/N-suhde on 65
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG
(CDW-%) (käytetty mg/l/h ____glukoosi-%)__
Kontrolli__1^1__21J__103__40,5 Y23/81-51, 66 (ALD)__1/15__26A__12,5__46,0 Y23/85-125, 129 (ALD+ACS) 1,14__27\2__13/3__45,4 Y23/86-92, 100 (ACS)_ 1,18 22,4 12,0 47,1 Tämä esimerkki osoittaa, että ÄLD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-5 pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyserolipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyserolisaantoja käytetystä glukoosista tai kuivapainoa kohti.
Esimerkki 24. Kantojen Y23/81-66 (esim. 3B), Y23/85-125 (esim. 7B), Y23/86-92 (esim. 5B), Y23/95-98 (esim. 6B) ja Y23/81/95-18 (esim. 8) aero-10 binen ravistelupullokarakterisointi glukoosialustassa, jonka C/N-suhde on 103
Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa hiivan viljelyalustaa IV (pH 5,5, 20 g glukoosia, 0,15 g (NH4)SC>4, 7,0 g KH2PO4, 2,5 g Na2HPC>4* 2 H20, 1,5 g MgSCV 7H20, 0,45 g hiivauutetta, 51 mg CaCb, 8 mg FeCh* 6 15 H2O ja 0,1 mg ZnS04* 7 H2O litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin ODeoo-arvoon 0,3 soluilla, joita oli kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi -maljoilla. Viljelmiä ylläpidettiin 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm. Näytteitä
CVJ
5 solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin ^ säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityypin kantaa Y23 9 20 käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino määritettiin ja HPLC-analyysi suoritet- o tiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja triasyyliglyserolimittaukset it kuten on kuvattu esimerkissä 21.
CL
n 35 tunnin viljelyn jälkeen, kun glukoosia oli jäljellä 6-8 g/l, transferin mänteillä Y23/81-66, Y23/85-125, Y23/86-92, Y23/95-98 ja Y23/81/95-18 oli 3, ? 25 6, 9, 11 ja 11 % suurempi triasyyliglyserolitiitteri ja tuotto kuin kontrollikannalla ° vastaavasti. Transformanteilla Y23/81-66, Y23/85/125, Y23/86-92, Y23/95-98 ja Y23/81/95-18 oli myös 11, 19, 7, 20 ja 30 % paremmat triasyyl iglysero-lisaannot käytettyä glukoosia kohti vastaavasti kuin kontrollikannalla. Lisäksi 50 Y23/81/95-18:1la oli 24 % suurempi saanto biomassasta kuin kontrollikannalla (49,4 ja 40,0 % TAG-saannot biomassasta vastaavasti).
Taulukko 4. Triasyyliglyseroli (TAG) -pitoisuus (g/l), tuotto (mg/l/h) ja saanto (%) käytettyä glukoosia kohti 35 tunnin viljelyn jälkeen glukoosi-5 alustassa, jossa C/N-suhde on 103
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG mg/l/h (käytetty ___glukoosi-%)__
Kontrolli__2,00__1j^2__57,1 Y23/81-66 (ALD)__2£5__1£^0__58,7 Y23/85-125 (ALD+ACS) 2,11__1^3__60,3 Y23/86-92 (ACS)__2/17__17A__61,9 Y23/95-98 (PDAT)__2^2__19A__63,5 Y23/81 /95-18 2,22 21,1 63,5 (ALD+PDAT)____ Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAΓ-geenien eks-pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyserolipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyserolisaantoa käytetystä glukoosista tai kuivapainoa kohti suurilla C/N-suhteilla.
10 Esimerkki 25. Kantojen M22/75-86 (esim. 15B), M22/96-1 (esim. 17B), M22/94-24 (esim. 16B), M22/75/98-9 (esim. 19) ja M22/94/98-19 (esim. 20) aerobinen ravistelupullokarakterisointi glukoosialustassa, jonka C/N-suhde on 40 ^ Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa homeen C/N 40 -alusti 15 taa (pH 5,5, 20 g glukoosia, 1,4 g hiivauutetta, 2,5 g KH2PO4, 0,3 g (NH4)S04, § 10 mg ZnSCV 7H20, 2 mg CuS04*5H20, 10 mg MnSCU, 0,5 g MgSCV 7 H20, £5 0,1 g CaCI2, 20 mg FeCb* 6H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin 1 x * 107 itiöllä. Viljelmiä ylläpidettiin 25 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm.
Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten
CO
oo 20 otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Mucor circinelloidesm villityypin kantaa o M22 käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino määritettiin 2-24 ml viljelyliemen ^ vakuumisuodatuksella lasimikrokuitusuodatinkiekkojen (Whatman, Englanti) läpi. Pesun jälkeen kahdesti tislatulla vedellä biomassa poistettiin kankaalta käyttäen puhdasta spaattelia ja siirrettiin esikuivattuihin, ennalta punnittuihin 2 51 ml:n mikrofugiputkiin, missä rihmastoja kuivattiin 100°C:ssa 48 tuntia ja punnittiin eksikaattorissa jäähdytyksen jälkeen. HPLC-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto sekä kokonaislipidi- ja triasyyliglyserolimit-taukset kuten on kuvattu esimerkissä 21.
5 46 tunnin viljelyn jälkeen (taulukko 5) transformantit M22/75-86, M22/96-1, M22/94-24, M22/75/98-9 ja M22/94/98-19 tuottivat 21, 9, 18, 91 ja 55 % enemmän triasyyliglyserolia suuremmalla tuotolla kuin kontrolli kanta vastaavasti. Transformantilla M22/75-86, M22/96-1, M22/94-24, M22/75/98-9 ja M22/94/98-19 oli myös 39 (20), 23 (10), 18 (13), 127 (57) ja 80 (25) % suu-10 rempi triasyyliglyserolisaanto käytetystä glukoosista (biomassasta) kuin kont-rollikannalla vastaavasti. Lisäksi transformanteilla M22/75/98-9 ja M22/94/98-19 oli suurempi kokonaislipidipitoisuus (0,93-1,09 g/l) ja tuotto (20-24 mg/l/h), kun saannot biomassasta (26,1-31,4 %) ja käytetystä glukoosista (6,29-7,52 %) kuin kontrollikannalla (0,71 g/l, 15 mg/l/h, 24,6 % ja 4,09 %) vastaa-15 vasti.
Taulukko 5. Triasyyliglyseroli (TAG) ja kokonaislipidipitoisuudet (g/l), tuotot (mg/l/h) ja saannot (%) biomassaa (CDW; solujen kuivapaino) ja käytettyä glukoosia kohti 46 tunnin viljelyn jälkeen glukoosialustassa, jossa C/N-suhde on 40
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____glukoosi-%)__
Kontrolli__033__105__092__7,2 M22/75-86 (ALD)__040__108__067__8,8 M22/96-1 (ACS) 0,36 12,6 2,36 7,9 c\j ------- 5 M22/94-24 0,39 13,0 2,27 8,5 2 (ALD+ACS)_____ ? M22/75/98-9 0,63 18,1 4,35 13,7 ° (ALD+PDAT)_____ | M22/94/98-19 0,51 14,4 3,46 11,1 co (ALD+ACS+PDAT) ____ fe 20 o δ
CM
52
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto Lipidi mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____glukoosi-%)__
Kontrolli__0/71__24,6__4£9__15 M22/75-86 (ALD)__076__26/j__004__17 M22/96-1 (ACS)__070__24^__4J53__15 M22/94-24 0,71 23,5 4,10 15 (ALD+ACS)_____ M22/75/98-9 1,09 31,4 7,52 24 (ALD+PDAT)_____ M22/94/98-19 0,93 26,1 6,29 20 (ALD+ACS+PDAT) ____ Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä glukoosista tai kuivapainoa kohti.
5 Esimerkki 26. Kantojen M22/75-86 (esim. 15B), M22/96-1 (esim. 17B), M22/94-24 (esim. 16B), M22/75/98-9 (esim. 19) ja M22/94/98-19 (esim. 20) aerobinen ravistelupullokarakterisointi glukoosialustassa, jonka C/N-suh-de on 66
Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa homeen C/N 66 -alus-10 taa (pH 5,5, 20 g glukoosia, 1,0 g hiivauutetta, 2,5 g KH2P04, 0,1 g (NH4)S04, 10 mg ZnS04* 7H20, 2 mg CuS04*5H20, 10 mg MnS04, 0,5 g MgS04* 7 H20, 0,1 g CaCI2, 20 mg FeCh* 6H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin 1 ^ * 107 itiöllä. Viljelmiä ylläpidettiin 25 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm.
^ Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa, entsyymiaktiivisuusmittaus-
CD
9 15 ta ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Mucor cir- o cinelloidesm villityypin kantaa M22 käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino £ määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 25 ja HPLC-analyysi suoritettiin, ku- O.
ten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja kokonaislipidi- ja triasyyliglysero-£2 limittaukset kuten on kuvattu esimerkissä 21.
LO
° 20 93 tunnin viljelyn jälkeen, kun glukoosia oli jäljellä 2-6 g/l, transfor- w mäntit M22/75-86, M22/96-1, M22/94-24, M22/75+98-9 ja M22/94+98-19 olivat tuottaneet 34, 30, 45, 186 ja 214 % enemmän triasyyliglyseroleja suuremmalla tuotolla kuin kontrollikanta. Transformanteilla M22/75-86, M22/96-1, M22/94- 53 24, M22/75+98-9 ja M22/94+98-19 oli myös 63 (24), 68 (30), 62 (43), 229 (72) ja 102 (104) % suurempi triasyyliglyserolisaanto käytetystä glukoosista (biomassasta) kuin kontrollikannalla. Lisäksi transformantit tuottivat enemmän lipidejä (0,89-2,29 g/l) suuremmilla tuotoilla (9,6-24,6 mg/l/h) ja suuremmilla 5 saannoilla käytetystä glukoosista (6,90-17,68 %) ja biomassasta (37,2-57,7 %) kuin kontrollikanta (0,71 g/l, 7,6 mg/l/h, 4,82 % ja 30,2 % vastaavasti).
Taulukko 6. Triasyyliglyseroli (TAG) ja kokonaislipidipitoisuudet (g/l), tuotot (mg/l/h) ja saannot (%) biomassaa (CDW; solujen kuivapaino) ja käytettyä glukoosia kohti 93 tunnin viljelyn jälkeen glukoosialustassa, 10 jonka C/N-suhde on 66
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____glukoosi-%)__
Kontrolli__044__106__097__4,7 M22/75-86 (ALD)__059__200__084__6,4 M22/96-1 (ACS)__057__24J__099__6,1 M22/94-24 0,64 26,6 4,82 6,9 (ALD+ACS)_____ M22/75/98-9 1,26 31,9 9,76 13,6 (ALD+PDAT)_____ M22/94/98-19 1,38 37,9 9,00 14,8 (ALD+ACS+PDAT) ____
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto Lipidi mg/l/h (CDW- %) (käytetty
CM
^____glukoosi-%)__ ™ Kontrolli__071__302__08__7,6 o M22/75-86 (ALD)__096__37,2__7β__10,3 £ M22/96-1 (ACS)__089__37J3__7J__9,6 x M22/94-24 0,91 37,6 6,9 9,8 “ (ALD+ACS)_____ M22/75/98-9 2,29 57,7 17,7 24,6 £ (ALD+PDAT)_____ 5 M22/94/98-19 2,00 55,1 13,1 21,5 ^ (ALD+ACS+PDAT) ____ 54 Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyIiglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä glukoosista tai kuivapainoa kohti suurilla C/N-suhteilla.
5 Esimerkki 27. Kantojen Y23/81-51 ja Y23/81-66 (esim. 3B), Y23/85-125 ja Y23/85-128 (esim. 7B), Y23/86-86 ja Y23/86-92 (esim. 5B), Y23/95-87 ja Y23/95-109 (esim. 6B) ja Y23/85/95-4 (esim. 9) mikroaerobinen ravistelu-pullokarakterisointi ksyloosialustassa, jonka C/N-suhde on 20
Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa viljelyalustaa ’’ksyloosi 10 CN20” (pH 5,5, 20 g ksyloosia, 0,3 g (NH4)SC>4, 7,0 g KH2PO4, 2,5 g Na2HPC>4* 2 H2O, 1,5 g MgSCV 7H20, 4,0 g hiivauutetta, 51 mg CaCb, 8 mg FeCh* 6 H2O ja 0,1 mg ZnS04* 7 H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inoku-loitiin ODeoo-arvoon 0,3 soluilla, joita oli kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi -maljoilla. Viljelmiä ylläpidettiin 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 100 rpm. Näyt-15 teitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa, entsyymiaktiivisuusmittausta ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus cur-vatuksen villityypin kantaa Y23 käytettiin kontrollina.
Lipidiuutto ja triasyyliglyserolipitoisuusmittaukset suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin ja HPLC-analyysi 20 suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22.
Viljelyn lopussa otettiin näytteet asetaldehydidehydrogenaasi- ja asetyyli-CoA-syntetaasi -aktiivisuusmittauksia varten. Solut otettiin talteen sen-trifugoimalla ja pestiin kerran 100 mM Tris-HCI:llä pH 7,0. Pestyjä soluja varastoitiin -20 °C:ssa. Jäädytetyt solut sulatettiin ja pestiin kerran 100 mM Tris-25 HCI:llä pH 7,0 ja suspendoitiin 100 mM Tris-HCI pH 7,0, 1 mM DTT -puskuriin,
CM
^ joka sisälsi EDTA-vapaita proteaasi-inhibiittoreita (Roche, Yhdysvallat). Solu- ^ hajotus suoritettiin halkaisijaltaan 0,5 mm:n lasihelmillä (Sigma Chemicals Co, 9 Yhdysvallat) Fast Prep -homogenisaattorissa (Thermo Scientific, Yhdysvallat), o Solujäänteet poistettiin sentrifugoinnilla ja supernatanttia käytettiin entsyymiäkin 30 tiivisuusmittauksissa. Asetaldehydidehydrogenaasi- ja asetyyli-CoA-syntetaasi ^ -aktiivisuusmittaukset suoritettiin Konelab Arena -automaattianalysaattorilla £2 (Thermo Scientific, Suomi). Asetaldehydidehydrogenaasireaktioseos sisälsi
? (loppupitoisuus) 50 mM kaliumfosfaattia pH 7,0, 15 mM pyratsolia, 0,4 mM
^ DTT, 10 mM MgCb, 0,4 mM NADP ja solu-uutetta. Reaktio käynnistettiin 0,1 35 mM asetaldehydillä. NADPH:n muodostumista seurattiin aallonpituudella 340 nm. Yksi yksikkö määritettiin muodostumismääräksi 1 pmol NADPH:ta minuut- 55 tia kohti. Asetyyli-CoA-syntetaasireaktioseos sisälsi (loppupitoisuus) 100 mM Tris-HCI pH 7,5, 10 mM L-malaattia pH 7,5, 0,2 mM koentsyymi A:ta, 8 mM ATP, 1 mM NAD, 10 mM MgCI2, 3 U/ml malaattidehydrogenaasia, 0,4 U/ml sitraattisyntaasia ja solu-uutetta. Reaktio käynnistettiin 100 mM kaliumasetaa-5 tiliä. NADH:n muodostumista seurattiin aallonpituudella 340 nm. Yksi yksikkö määritettiin muodostumismääräksi 1 pmol NADH:ta minuuttia kohti.
24 tunnin viljelyn jälkeen transformantit Y23/81, Y23/85, Y23/86, Y23/95 ja Y23/85/95 tuottivat 13-31 % enemmän triasyyliglyserolia 5-38 % suuremmalla saannolla biomassasta kuin kontrollikanta. Transformanteilla 10 Y23/81, Y23/86, Y23/95 ja Y23/85/95 oli myös 4-12 % suuremmat saannot käytetystä ksyloosista kuin kontrollikannalla. Transformanteilla, joissa ilmentyi ALD:tä (ACS:ää) koodaava geeni, oli 21,5-42,7 (1,5-1,9) kertaa suurempi ALD- (ACS-) -aktiivisuus kuin kontrollikannalla.
Taulukko 7. Triasyyliglyseroli (TAG) -pitoisuus (g/l), tuotto (mg/l/h) ja 15 saannot (%) biomassaa (CDW; solujen kuivapaino) ja käytettyä ksyloosia kohti 24 tunnin mikroaerobisen viljelyn jälkeen ksyloosialustassa, jonka C/N-suhde on 20
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____ksyloosi-%)__
Kontrolli__016__4,33__046__6,8 Y23/81 (ALD)__020__098__061__8,2 Y23/85 (ALD+ACS)__018__4J54__046__7,3 Y23/86 (ACS)__021__033__086__8,9 Y23/95 (PDAT)__020__055__068__8,4 5 Y23/85/95 0,20 5,55 3,72 8,2
(M
£ (ALD+ACS+PDAT) ____ o 1^· o
X
IX
CL
CO
CO
1^· m o δ
(M
56
Taulukko 8. Suhteelliset asetaldehydidehydrogenaasi- (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasi- (ACS) -aktiivisuudet mikroaerobisessa viljelyssä ksyloo-sissa, jossa C/N-suhde on 20, verrattuna kontrollikannan ALD- ja ACS-aktiivisuuksiin
Kanta__ALD__ACS
Kontrolli__1__1 Y23/81 (ALD)__42J__1,2 Y23/85 (ALD+ACS)__27,3__1,9 Y23/86 (ACS)__4^3__1,5 Y23/95 (PDAT)__2^3__1,2 Y23/85/95 (ALD+ACS+PDAT)_ 21,5 1,5 5 Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks- pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyserolipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyserolisaantoja käytetystä ksyloosista tai kuivapainoa kohti pienillä C/N-suhteilla. Lisäksi esimerkki osoittaa, että asetaldehydidehydrogenaasi- (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasi- (ACS) -entsyymit ilmentyvät aktiivi-10 sissa muodoissa.
Esimerkki 28. Kantojen Y23/81-8 ja 59 (esim. 3B), Y23/85-119 ja 128 (esim. 7B), Y23/86-86 ja 92 (esim. 5B), Y23/95-99 ja 109 (esim. 6B), Y23/81/95-18 ja 42 (esim. 8) ja Y23/85/95-4 ja 68 (esim. 9) aerobinen ravistelupulloka-rakterisointi ksyloosialustassa, jonka C/N-suhde on 103 15 Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa hiivan ksyloosiviljely- alustaa IV (pH 5,5, 20 g ksyloosia, 0,15 g (NH4)SC>4, 7,0 g KH2PO4, 2,5 g Na2HP04 * 2 H20, 1,5 g MgSCV 7H20, 0,45 g hiivauutetta, 51 mg CaCb, 8 mg
C\J
5 FeCb* 6 H20 ja 0,1 mg ZnSCV 7 H2O litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inoku- ^ loitiin OD6oo-arvoon 0,3 soluilla, joita oli kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi 9 20 -maljoilla. Viljelmiä ylläpidettiin 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm. Näyt- 0 teitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin 1 säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityypin kantaa Y23 „ käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino määritettiin ja HPLC-analyysi suoritet-
CO
tiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja triasyyliglyserolipitoisuus-° 25 mittaukset kuten on kuvattu esimerkissä 21.
o
(M
57 52 tunnin viljelyn jälkeen transformantit Y23/81, Y23/85, Y23/86, Y23/95, Y23/81/95 ja Y23/85/95 olivat tuottaneet 23, 19, 50, 52, 40 ja 75 % enemmän triasyyliglyserolia kuin kontrollikanta. Transformanteilla Y23/81, Y23/85, Y23/86, Y23/95, Y23/81/95 ja Y23/85/95 oli myös 35, 47, 59, 60, 103 5 ja 111 % suurempi triasyyliglyserolisaanto biomassasta ja 11, 11, 15, 28, 66 ja 63 % suurempi triasyyliglyserolisaanto käytetystä ksyloosista kuin kontrollikan-nalla. Lisäksi transformanteilla Y23/81, Y23/85, Y23/86, Y23/95, Y23/81/95 ja Y23/85/95 oli suurempi lipidipitoisuus (2,40-2,90 g/l) ja tuotto (46-56 mg/l/h) suuremmalla saannolla biomassasta (56,5-78,8 %) kuin kontrollikannalla (2,35 10 g/l, 45 mg/l/h ja 52,2 % vastaavasti). Transformanteilla Y23/81/95 ja Y23/85/95 oli myös suurempi lipidisaanto käytetystä ksyloosista (29,0-31,6 %) kuin kontrollikannalla (25,6 %).
Taulukko 9. Triasyyliglyseroli- (TAG) ja kokonaislipidipitoisuudet (g/l), tuotot (mg/l/h) ja saannot (%) biomassaa (CDW; solujen kuivapaino) kohti 15 52 tunnin viljelyn jälkeen ksyloosialustassa, jonka C/N-suhde on 103. Triasyyliglyserolisaanto (%) käytetystä ksyloosista on myös osoitettu.
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG
(CDW- %) (käytetty mg/l/h ____ksyloosi-%)__
Kontrolli__0J30__13J3__6,52__19,0 Y23/81 (ALD)__0^3__17J)__T23__26,4 Y23/85 (ALD+ACS)__0/79__19J3__7,26__25,0 Y23/86 (ACS)__0^0__21J__7J52__28,5 Y23/95 (PDAT)__0^1__21/3__8/37__28,8 Y23/81/95 (ALD+PDAT) 0,84__27/)__10/3__26,6 Y23/85/95 1,05 28,0 10,7 33,3 cvj (ALD+ACS+PDAT) ____ δ cm ---- to Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidi °___(CDW- %)__(mg/l/h) o Kontrolli__2/35__52/2__45_ £ Y23/81 (ALD)__2JJ0__62/3__56 ^ Y23/85 (ALD+ACS)__2/53__6^9__49 co Y23/86 (ACS)__2J58__60J3__50 g Y23/95 (PDAT)__2^0__56J5__46 5 Y23/81/95 (ALD+PDAT) 2,45__78J3__47_ w Y23/85/95 2,85 76,0 55 (ALD+ACS+PDAT) ___ 58 Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyIiglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja kuivapainoa kohti sekä triasyyliglyserolisaantoja käytetystä ksyloosista suurilla C/N-5 suhteilla.
Esimerkki 29. Kantojen M22/75-80 (esim. 15B), M22/96-6 (esim. 17B), M22/98-16 (esim. 18B), M22/94-16 (esim. 16B), M22/75/98-7 (esim. 19) ja M22/94/98-22 (esim. 20) aerobinen ravistelupullokarakterisointi ksyloosialus-tassa, jonka C/N-suhde on 66
10 Transformantteja viljeltiin erikseen 50 ml:ssa homeen ksyloosi C/N
66 -elatusalustaa (pH 5,5, 20 g ksyloosia, 1,0 g hiivauutetta, 2,5 g KH2P04, 0,1 g (NH4)S04, 10 mg ZnS04* 7H20, 2 mg CuS04*5H20, 10 mg MnS04, 0,5 g MgS04* 7 H20, 0,1 g CaCI2, 20 mg FeCh* 6H20 litraa kohti). Kukin pullo (250 ml) inokuloitiin 1 * 107 itiöllä. Viljelmiä ylläpidettiin 25 °C:n lämpötilassa ravistel-15 Ien 250 rpm. Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa, entsyymiaktii-visuusmittausta ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Mucor circinelloides\n villityypin kantaa M22 käytettiin kontrollina. Solujen kuivapaino määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 25 ja HPLC-analyysi suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto sekä kokonaislipidi- ja tri-20 asyyliglyserolimittaukset kuten on kuvattu esimerkissä 21.
143 tunnin viljelyn jälkeen transformanteilla M22/75-80, M22/96-6, M22/98-16, M22/75/98-7 ja M22/94/98-22 oli suurempi TAG-pitoisuus (0,33-0,48 g/l TAG) verrattuna kontrollikantaan (0,28 g/l TAG). Kaikilla transformanteilla oli myös suurempi TAG-saanto (%) biomassaa kohti (13,71-17,78 %) 25 kuin kontrollikannalla (12,15 %) ja transformanteilla M22/96-6, M22/98-16, M22/75/98-7 ja M22/94/98-22 oli myös suurempi TAG-saanto (%) käytettyä 5 ksyloosia kohti (4,83-6,23 %) kuin kontrollikannalla (3,97 %). Lisäksi transfer ee ^ mänteillä M22/75/98-7 ja M22/94/98-22 oli suurempi lipidipitoisuus (0,79-1,13 ° g/l), tuotto (9,2-10,8 mg/l/h) ja lipidisaannot biomassasta (48,9-55,6 %) ja käy- ° 30 tetystä ksyloosista (17,1-18,3 %) kuin kontrollikannalla (0,92 g/l, 6,4 mg/l/h, | 40,0 % ja 13,0 % vastaavasti).
CO
CO
i^.
LO
o δ cv 59
Taulukko 10. Triasyyliglyseroli- (TAG) ja kokonaislipidipitoisuudet (g/l), tuotot (mg/l/h) ja saannot (%) biomassaa (CDW; solujen kuivapaino) ja käytettyä ksyloosia kohti 143 tunnin viljelyn jälkeen ksyloosialustassa, jonka C/N-suhde on 66
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto TAG mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____ksyloosi-%)__
Kontrolli__028__102__097__1,9 M22/75-80 (ALD)__033__108__045__2,3 M22/96-6 (ACS)__033__103__040__2,3 M22/94-16 0,27 13,7 3,67 1,9 (ALD+ACS)_____ M22/98-16 (PDAT) 0,48__13J__4,83__3,3 M22/75/98-7 0,48 17,8 6,23 3,3 (ALD+PDAT)_____ M22/94/98-22 0,45 16,1 5,31 3,1 (ALD+ACS+PDAT) ____ 5 _____
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto Lipidi mg/l/h (CDW- %) (käytetty ____glukoosi-%)__
Kontrolli__092__400__100__6,4 M22/75-80 (ALD)__000__408__105__7,0 M22/96-6 (ACS)__090__41^5__14J__6,3 M22/94-16 0,82 41,6 11,1 5,7 £! (ALD+ACS)_____ ™ M22/98-16 (PDAT) 1,62__404__IM__11,3 o M22/75/98-7 1,32 48,9 17,1 9,2 £ (ALD+PDAT)_____ £ M22/94/98-22 1,54 55,6 18,3 10,8 (ALD+ACS+PDAT) ____ co I'-- g Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks- o pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia ja tuotannon nopeuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä ksyloosista tai kuivapainoa kohti suurilla C/N-suhteilla.
60
Esimerkki 30. C. curvatus -kantojen, joita on muokattu lisäämällä geenejä, jotka koodaavat ALD:tä ja PDAT:tä (Y23/81/95-18, esim. 8) tai ALD:tä ja PDAT:tä ja ACS:ää (Y23/85/95-4 esim. 9), triasyyliglyseroli- tai lipidituo-tanto suuren solutiheyden viljelmissä, joita kasvatetaan glukoosilla, kun 5 C/N-suhde on 80
Transformantteja (Y23/85/95-4 ja Y23/81/95-18) viljeltiin erikseen Multifors-bioreaktoreissa (maks. työskentelytilavuus 500 ml, Infors HT, Sveitsi) pH 4,0, 30 °C, 500 ml alustassa, joka sisälsi 90-96 g glukoosia, 2,56 g (NH4)2S04, 1,2 g KH2P04, 0,3 g Na2HP04 -2H20, 1,5 g MgS04-7H20, 0,1 g 10 CaCI2-6H20, 5,26 mg sitruunahappo-H20, 5,26 mg ZnS(V7H2C), 0,1 mg MnS04'4H20, 0,5 mg CoCI2-6H20, 0,26 mg CuS04-5H20, 0,1 mg Na2Mo04'2H20, 1,4 mg FeSCV7H20, 0,1 mg H3BO4, 0,05 mg D-biotiinia, 1,0 mg Ca-pantotenaattia, 5,0 mg nikotiinihappoa, 25 mg myoinositolia, 1,0 mg tiamiini-HCI, 1,0 mg pyridoksiini-HCI ja 0,2 mg p-aminobentsoehappoa litraa 15 kohti. pH ylläpidettiin vakiona lisäämällä 1 M KOH tai 1 M H2P04. Viljelmiä sekoitettiin 1000 rpm (2 Rushton-turbiinisiipipyörää) ja ilmastettiin 2 tilavuudella ilmaa viljelmätilavuutta kohti minuuttia kohti (vvm). Clerol FBA 3107 -vaahtoa-misenestoainetta (Cognis, Saint-Fargeau-Ponthierry Cedex Ranska, 1 ml Γ1) lisättiin vaahdon kasaantumisen estämiseksi. Bioreaktoreja inokuloitiin alun 20 OD6oo-arvoon 0,5-4,0 soluilla, joita oli kasvatettu samassa elatusalustassa (korvaten (NH4)2SC>4:n 1,5 g:lla ureaa litraa kohti ja jättäen pois CaCI2-6H20:n) 50 ml:n tilavuuksissa 250 ml:n pulloissa 30 °C:ssa ravistellen 200 rpm 24-42 tuntia. Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityy-25 pin kantaa Y23 käytettiin kontrollina. Triasyyliglyserolisaannon mittaamiseksi cvj glukoosista tai biomassasta jotkut kontrolliviljelmät sisälsivät 58-134 g glukoo- o siä r1.
ώ Lipidiuutto ja triasyyliglyserolipitoisuusmittaukset suoritettiin, kuten
O
^ on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin sentrifugoimalla ° 30 0,5-2,0 ml viljelmälientä esikuivatuissa, ennalta punnituissa 2 ml:n mikrofugi- £ putkissa. Pesun jälkeen kahdesti 1,8 ml:lla tislattua vettä solupellettiä kuivattiin g 100°C:ssa 48 h ja punnittiin eksikaattorissa jäähdytyksen jälkeen. HPLC- g analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22.
5 Taulukko 11 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle
(M
35 ja PDAT:lle, tuotti 23 % enemmän triasyyliglyserolia kuin Y23, 24 % lisäyksellä saannossa kulutetusta glukoosista, kun soluja viljeltiin suureen solutiheyteen 61 bioreaktoriviljelmissä. Transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 15 % enemmän triasyyIiglyserolia kuin Y23, 12 % lisäyksellä saannossa kulutetusta glukoosista.
Taulukko 11. Y23:n ja Y23:n transformanttien, jotka ilmensivät 5 ALD+PDAT tai ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyssä bioreaktoriviljelmässä tuotettu triasyyliglyseroli, kun glukoosi on hiililähteenä ja C/N 80. Data on keskiarvo 2 (transformantista) tai 4-9 (Y23) viljelmästä ± keskiarvon standardipoikkeama. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto ___(kulutettu glukoosi-%) Y23__17,3 ±0,3__18,8 ± 1,0_ Y23/81/95-18 (ALD+PDAT) 21,3 ± 0,8 23,3 ± 1,0 __(23 %)__(24 %)_ Y23/85/95-4 19,9 ±0,1 21,1 ±0,1 (ALD+ACS+PDAT)__(15%)__(12%)_ Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-10 pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyserolipitoisuuksia ja triasyyliglysero-lisaantoja käytetystä glukoosista suuren solutiheyden viljelmissä.
Esimerkki 30. C. curvatus -kantojen, joita on muokattu lisäämällä geenejä, jotka koodaavat ALD:tä ja PDAT:tä (Y23/81/95-18, esim. 8) tai ALD:tä ja PDAT:tä ja ACS:ää (Y23/85/95-4, esim. 9), triasyyliglyseroli- tai lipidituo-15 tanto suuren solutiheyden viljelmissä, joita kasvatetaan ksyloosilla, kun C/N-suhde on 80
Transformantteja (Y23/85/95-4 ja Y23/81/95-18) viljeltiin erikseen ^ Multifors-bioreaktoreissa, kuten on kuvattu esimerkissä 30. Alusta sisälsi 92- i § 11 g ksyloosia litraa kohti glukoosin sijasta. Bioreaktoreja inokuloitiin alun i £ 20 ODeoo-arvoon 17-24 soluilla, joita oli kasvatettu vähätyppisessä alustassa, jos- x sa oli glukoosi hiililähteenä, Multifors-bioreaktoreissa 30 °C:ssa, kuten on ku- cc “ vattu lipidituotantoa varten esimerkissä 30. Vaihtoehtoisesti joitakin Y23-vil- co jelmiä inokuloitiin soluilla, joita oli kasvatettu pulloissa, kuten on kuvattu esi- o merkissä 30, alun ODeoo-arvoon 0,2-0,5. Näytteitä solujen kuivapainomittaus- ° 25 ta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana.
Cryptococcus curvatuksen villityypin kantaa Y23 käytettiin kontrollina.
62
Lipidiuutto ja kokonaislipidi- ja triasyyliglyserolipitoisuusmittaukset suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 30. HPLC-analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22.
5 Taulukko 12 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle ja PDAT:lle, tuotti 7 % enemmän triasyyliglyserolia kuin Y23, 17 % lisäyksellä saannossa kulutetusta ksyloosista ja 3 % lisäyksellä saannossa biomassasta, kun soluja viljeltiin suureen solutiheyteen bioreaktoriviljelmissä. Transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti vain 1 % enemmän tria-10 syylig lyserol ia kuin Y23, mutta sillä oli 13 % lisäys saannossa kulutetusta ksyloosista ja 4 % lisäys saannossa biomassasta.
Taulukko 12. Y23:n ja Y23:n transformanttien, jotka ilmensivät ALD+PDAT tai ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyssä bioreaktoriviljelmässä tuotettu triasyyliglyseroli, kun ksyloosi on hiililähteenä ja C/N 80. Data on 15 keskiarvo 2 (transformantista) tai 4 (Y23) viljelmästä ± keskiarvon stan-dardipoikkeama. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto (CDW- %) (kulutettu ____ksyloosi-%) Y23__17,9 ± 1,4__46,9 ±4,0__17,2 ± 1,2 Y23/81 /95-18 19,1 ± 0,3 48,4 ± 5,7 20,2 ± 0,5 (ALD+PDAT)__{7%)__(3%)__(17%) Y23/85/95-4 18,1 ± 0,3 49,0 ± 3,4 19,5 ± 0,0 (ALD+ACS+PDAT) (1%) (4%) (13%) ^ Taulukko 13 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle o ™ ja PDAT:lle, tuotti 10 % enemmän lipidiä kuin Y23, 21 % lisäyksellä saannossa o kulutetusta ksyloosista ja 2 % lisäyksellä saannossa biomassasta, kun soluja ^ 20 viljeltiin suureen solutiheyteen bioreaktoriviljelmissä. Transformantti, joka sisäl- x si geenit ALD:lle, ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 3 % enemmän lipidiä kuin Y23, 16 ^ % suuremmalla saannolla kulutetusta ksyloosista ja 3 % lisäyksellä saannossa £2 biomassasta.
LO
o δ
CM
63
Taulukko 13. Y23:n ja Y23:n transformanttien, jotka ilmensivät ALD+PDAT tai ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyssä bioreaktoriviljelmässä tuotettu lipidi, kun ksyloosi on hiililähteenä ja C/N 80. Data on keskiarvo 2 (transformantista) tai 4 (Y23) viljelmästä ± keskiarvon standardipoik-5 keama. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto (CDW- %) (kulutettu ____ksyloosi-%) Y23__20,5 ± 1,3__55,9 ± 7,2__19,8 ±2,5 Y23/81/95-18 22,5 ± 0,6 57,0 ± 1,9 23,8 ± 0,8 (ALD+PDAT)__(10 %)__(2_%)__(21 %) Y23/85/95-4 21,2 ± 0,1 57,5 ± 1,0 22,9 ± 0,3 (ALD+ACS+PDAT) (3%) (3%) (16%) Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAΓ-geenien eks-pressio eri yhdistelminä lisäsi triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä ksyloosista tai kuivapainoa kohti suuren solutiheyden viljelmissä.
10 Esimerkki 32. M. circinelloides -kannan, jota on muokattu lisäämällä geenejä, jotka koodaavat ALD:tä ja PDAT:tä ja ACS:ää (M22/94/98-19, esim.
20), triasyyliglyseroli- tai lipidituotanto pH-säädellyissä bioreaktoriviljel-missä, joita kasvatetaan glukoosilla, kun C/N-suhde on 66
Transformanttia (M22/94/98-19) viljeltiin Braun Biostat® CT -bio-15 reaktoreissa (2,5 maks. työskentelytilavuus, B. Braun Biotech International, Sartorius AG, Saksa) pH 5,0, 30°C, 1,0-1,2 I alustassa, joka sisälsi 53 g glu-koosia, 1,57 g (NH^SCU, 2,5 g KH2PO4, 0,2 g MgS04-7H20, 0,1 g ^ CaCl2'6H20, 5,26 mg sitruunahappo-H20, 5,26 mg ZnS04-7H20, 0,1 mg 9 MnS04-4H20, 0,5 mg C0CI26H2O, 0,26 mg CuSCVö^O, 0,1 mg o 20 Na2Mo04-2H20, 1,4 mg FeSC^^O, 0,1 mg H3BO4, 0,005 mg D-biotiinia ja
Ee 0,05 mg tiamiini-HCI litraa kohti. pH pidettiin vakiona lisäämällä 1 M KOH tai 1
CL
M H2PO4. Viljelmiä sekoitettiin 600 rpm (2 Rushton-turbiinisiipipyörää) ja ilmas-£2 tettiin 1 tilavuudella ilmaa viljelmätilavuutta kohti minuuttia kohti (vvm). Pölyin propyleeniglykolia (sekoitettuja molekyylipainoja, jotka sisälsivät Fluka P1200, o cvi 25 Fluka P2000 ja Henkel Performance Chemicals Foamaster suhteessa 4:4; 1, 1 ml Γ1) lisättiin vaahdon kasaantumisen estämiseksi. Bioreaktoreja inokuloitiin alun biomassapitoisuuteen suunnilleen 100 mg I"1 rihmastoilla, joita oli kasva- 64 tettu samassa alustassa seuraavilla muunnoksilla: 15 g glukoosia I'1, tarpeeksi (NH4)2S04 C/N-suhteen 16,2 aikaansaamiseksi, ja lisäksi 4,0 g agaria I'1. Esi-viljelmiä kasvatettiin 50 ml:n tilavuuksissa 250 ml:n pulloissa 30 °C:ssa ravistellen 200 rpm 42-72 tuntia. Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa 5 ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Biomassa erotettiin viljelmän supernatantista suodatuksella vakuumissa. Mucor circinelloide-sin villityypin kantaa M22 käytettiin kontrollina.
Lipidiuutto ja kokonaislipidi- ja triasyyliglyserolipitoisuusmittaukset suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin, 10 kuten on kuvattu esimerkissä 25, paitsi että vakuumisuodatuksessa käytettiin kertakäyttöistä puhdistusliinaa (X-tra, 100 % viskoosinen talouspuhdistusliina, Inex Partners Oy, Helsinki). HPLC-analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 22.
Taulukko 14 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, 15 ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 17 % enemmän triasyyliglyserolia kuin Y23, 8 % lisäyksellä saannossa kulutetusta glukoosista, kun soluja viljeltiin bioreaktorivil-jelmissä.
Taulukko 15. M22:n ja M22:n transformantin, joka ilmensi ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyissä bioreaktoriviljelmissä tuotettu triasyyliglyseroli, kun glu-20 koosi on hiililähteenä ja C/N 60. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto (kulutettu ___glukoosi-%)_ M22__9,8__2T9_ M22/94/98-19 11,5(17%) 23,6 (8 %) (ALD+ACS+PDAT)___ δ
Taulukko 15 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, o ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 44 % enemmän lipidiä kuin M22, 55 % suuremmalla o saannolla kulutetusta glukoosista ja 26 % lisäyksellä lipidisaannossa biomas- sasta, kun soluja viljeltiin bioreaktoriviljelmissä.
CL
CO
CO
l'- in o o
(M
65
Taulukko 15. M22:n ja M22:n transformantin, joka ilmensi ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyissä bioreaktoriviljelmissä tuotettu lipidi, kun glukoosi on hii-lilähteenäja C/N 60. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto ___(CDW- %)__(kulutettu glukoosi- %) M22__10,4__59,4 ± 2,8__19 J_ M22/94/98-19 14,9 (44%) 75,4 ± 3,5 30,5(55%) (ALD+ACS+PDAT) _ (26 %) _ Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDAT-geenien eks-5 pressio lisäsi triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia sekä triasyyliglyse-roli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä glukoosista tai kokonaislipidisaantoa kuivapainoa kohti suuren solutiheyden viljelmissä.
Esimerkki 33. M. circinelloides -kannan, jota on muokattu lisäämällä geenejä, jotka koodaavat ALD:tä ja PDAT:tä ja ACS:ää (M22/94/98-19, esim. 10 20), triasyyliglyseroli- tai lipidituotanto pH-säädellyissä bioreaktoriviljelmissä, joita kasvatetaan ksyloosilla, kun C/N-suhde on 60
Transformanttia (M22/94/98-19) viljeltiin Braun Biostat® CT -bio-reaktoreissa, kuten on kuvattu esimerkissä 32. Alusta sisälsi 44-56 g ksyloosia litraa kohti, glukoosin sijaan viljelmiä täydennettiin 1 g:lla peptonia litraa kohti ja 15 (NhU^SCVpitoisuus vähennettiin 1,12 g:aan litraa kohti. Näytteitä solujen kui-vapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otettiin säännöllisesti viljelyn aikana. Biomassa erotettiin viljelmän supernatantista suodatuksella vakuumissa. Mucor circinelloidesm villityypin kantaa M22 käytettiin kontrollina.
Lipidiuutto ja kokonaislipidi- ja triasyyliglyserolipitoisuusmittaukset 20 suoritettiin, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Solujen kuivapaino määritettiin, ™ kuten on kuvattu esimerkissä 32. HPLC-analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu
CD
9 esimerkissä 22.
o Taulukko 16 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, ir ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 11 % enemmän triasyyliglyserolia kuin M22, 10 %
CL
25 lisäyksellä saannossa kulutetusta ksyloosista ja 9 % lisäyksellä saannossa £2 biomassasta pH-säädellyissä bioreaktoriviljelmissä.
o δ C\l 66
Taulukko 16. M22:n ja M22:n transformantin, joka ilmensi ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyissä bioreaktoriviljelmissä tuotettu triasyyliglyseroli, kun ksy-loosi on hiililähteenä ja C/N 60. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta TAG (g/l) TAG-saanto TAG-saanto ___(CDW- %)__(kulutettu ksyloosi-%) M22__5j6__46,5 ± 2,7__22,9_ M22/94/98-19 6,2 (11 %) 50,9 ± 1,4 25,1 (10 %) (ALD+ACS+PDAT) _ (9 %) _
Taulukko 17 osoittaa, että transformantti, joka sisälsi geenit ALD:lle, 5 ACS:lle ja PDAT:lle, tuotti 24 % enemmän lipidiä kuin M22, ja lipidisaanto biomassasta oli 22 % suurempi kuin M22:ssa, kun rihmastoja kasvatettiin ksyloo-silla. Lipidisaanto kulutetusta ksyloosista lisääntyi 18 %.
Taulukko 17. M22:n ja M22:n transformantin, joka ilmensi ALD+ACS+PDAT, pH-säädellyssä bioreaktoriviljelmässä tuotettu lipidi, kun ksyloosi on hii-10 lilähteenä ja C/N 60. Lisäysprosentti on esitetty sulkeissa.
Kanta Lipidi (g/l) Lipidisaanto Lipidisaanto ___(CDW- %) (kulutettu ksyloosi-%) M22__5£__49,2 ±4,6__24J_ M22/94/98-19 7,1 (22 %) 58,2 ± 0,6 28,7 (19 %) (ALD+ACS+PDAT) _ (18%) _ Tämä esimerkki osoittaa, että ALD6-, ACS2- ja PDA Γ-geenien eks-pressio lisäsi triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidipitoisuuksia sekä triasyyliglyseroli- ja kokonaislipidisaantoja käytetystä ksyloosista tai kuivapainoa kohti suu- ^ ren solutiheyden viljelmissä, o
(M
ώ 15 Esimerkki 34. Plasmidin konstruointi, joka sisältää markkerigeenin endo- ^ geenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena sekä pyruvaat-
O
___ tidekarboksylaasia (PDC) koodaavan geenin endogeenisen promoottorin £ ja terminaattorin säätelyn alaisena co Pyruvaattidekarboksylaasia (PDC) koodaava geeni, kuten PDC1 S.
Is- g 20 cerevisiaesta (sekvenssi nro 94), joka koodaa sekvenssin nro 95 mukaista o aminohapposekvenssiä, optimoidaan kodonien suhteen. Kodonioptimoitu PDC:tä koodaava geeni, jossa on reunustavat Sb/l-restriktiokohdat, pilkotaan Sb/Lllä ja liitetään plasmidiin, joka sisältää endogeenisen promoottorin ja ter- 67 minaattorin, kuten plasmidi pKK77pre. Saatu plasmidi, joka sisältää PDC:tä koodaavan geenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena, linearisoidaan esim. SamHkllä ja liitetään fragmentin kanssa, joka sisältää markkerigeenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alai-5 sena. Tällainen fragmentti voidaan saada esim. pilkkomalla plasmidi pKK67 SamHUIä ja XmnUlä. Saatu plasmidi sisältää PDC:tä koodaavan geenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena sekä markkerigeenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena.
Esimerkki 35. Geneettisesti muokatun kannan tuottaminen, jossa on in-10 tegroituna PDC yhdessä ALD6:ta ja/tai ACS2:ta koodaavien geenien sekä markkerigeenien kanssa, transformoimalla geneettisesti muokattuja kantoja plasmidilla, joka sisältää PDC:tä koodaavan geenin (esim. 34)
Plasmidi, joka sisältää PDC:tä koodaavan geenin (esim. 34), pilkotaan esim. Not\\Wä ja PspOMUIä, ja saatua lineaarista DNA:ta, joka sisältää 15 PDC:tä koodaavan geenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena sekä markkerigeenin endogeenisen promoottorin ja terminaattorin säätelyn alaisena, käytetään transformoimaan esim. geneettisesti muokattu kanta Y23/81-51 (esim. 3B), Y23/86-92 (esim. 5B) tai Y23/85-128 (esim. 7B) elektroporaatiolla tai geneettisesti muokattu kanta M22/75-86 (esim. 15B), 20 M22/96-1 (esim. 17B)tai M22/94-31 (esim. 16B) käyttäen esimerkissä 15B kuvattua transformaatiomenetelmää. Transformoituja soluja seulotaan esim. antibioottiresistenssin suhteen. Useita transformoituja pesäkkeitä analysoidaan DNA-tasolla PCR:llä.
Esimerkki 36. Kantojen, joissa on PDC yhdessä ALD6:ta ja/tai ACS2:ta ^ 25 koodaavien geenien sekä markkerigeenien kanssa, aerobinen ravistelu- c3 pullokarakterisointi glukoosi- tai ksyloosjalustassa eri C/N-suhteilla i o Transformantteja viljellään erikseen 50 ml:n viljelyalustassa, kuten o on kuvattu esimerkeissä 22, 23, 24, 27 tai 28. Kukin pullo (250 ml) inokuloi- daan OD6oo-arvoon 0,3 soluilla, joita on kasvatettu hiiva-peptoni plus glukoosi 30 -maljoilla. Viljelmiä ylläpidetään 30 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm.
CO
£2 Näytteitä solujen kuivapainomittausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten
LO
o otetaan säännöllisesti viljelyn aikana. Cryptococcus curvatuksen villityypin kan- cm taa Y23 käytetään kontrollina. Solujen kuivapaino määritetään ja HPLC-ana- lyysi suoritetaan, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja triasyyliglyse-35 rolimittaukset, kuten on kuvattu esimerkissä 21. Vaihtoehtoisesti transformant- 68 teja viljellään erikseen 50 ml:ssa viljelyalustaa, kuten on kuvattu esimerkeissä 25, 26 tai 29. Kukin pullo (250 ml) inokuloidaan 1 * 107 itiöllä. Viljelmiä ylläpidetään 25 °C:n lämpötilassa ravistellen 250 rpm. Näytteitä solujen kuivapainomit-tausta, lipidiuuttoa ja HPLC-analyysiä varten otetaan säännöllisesti viljelyn ai-5 kana. Mucor circinelloides'\n villityypin kantaa M22 käytetään kontrollina. Solujen kuivapaino määritetään, kuten on kuvattu esimerkissä 25 ja HPLC-analyysi suoritetaan, kuten on kuvattu esimerkissä 22. Lipidiuutto ja triasyyliglyserolimit-taukset, kuten on kuvattu esimerkissä 21.
Transformantit, joissa on PDC yhdessä ALD6:ta ja/tai ACS2:ta koo-10 daavien geenien kanssa, tuottavat enemmän triasyyliglyserolia kuin kontrolli-kanta. Lisäksi transformanteilla, joissa on PDC yhdessä ALD6:ta ja/tai ACS2:ta koodaavan geenin kanssa, on suurempi triasyyliglyserolisaanto käytetystä hiilestä kuin kontrollikannalla.
Käytetyt sekvenssit: 15 Sekvenssit nro 1 ja 2 vastaavat alukkeita YeastTEFI ja YeastTEF4, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TEF-geenin genomisen fragmentin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 3 ja 4 vastaavat alukkeita PCR linker I ja PCR linker II, vastaavasti, joita käytetään kromosomikävelykokeissa.
20 Sekvenssit nro 5, 6, 7 ja 8 vastaavat alukkeita CC_TEF2, CC TEF1, CC TEF6 ja CC_TEF5 vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TEF-promoottorialueen genomisten fragmenttien eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 9 ja 10 vastaavat alukkeita CC_TEF10 ja 25 CC_TEF11, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TEF-geen\n promoot-
C\J
ς torin eristämiseksi.
^ Sekvenssit nro 11 ja 12 vastaavat alukkeita CC TEF3 ja CC TEF4, 9 vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TEF-terminaattorialueen genomi- ci sen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
| 30 Sekvenssit nro 13 ja 14 vastaavat alukkeita CC_TEF7 ja CC_TEF8, n vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TEF-geenin terminaattorin eristä- ” miseksi.
ID
9 Sekvenssit nro 15 ja 16 vastaavat alukkeita Yeast TPI5 ja Yeast
O
^ TPI8, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen 7P/-geenin genomisen frag- 1 mentin eristämiseksi.
69
Sekvenssit nro 17 ja 18 vastaavat alukkeita CC_TPI2 ja CC_TPI1, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TPI-promoottorialueen genomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 19 ja 20 vastaavat alukkeita CC_TPI7 ja CC_TPI9, 5 vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen 7P/-geenin promoottorin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 21 ja 22 vastaavat alukkeita CC_TPI4 ja CC_TPI3, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen TPI-terminaattorialueen genomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
10 Sekvenssit nro 23 ja 24 vastaavat alukkeita CC_TPI5 ja CC_TPI6, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen 7P/-geenin terminaattorin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 25 ja 26 vastaavat alukkeita YeastEN05 ja YeastE-NO10, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen ENO-geenin genomisen 15 fragmentin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 27, 28, 29 ja 30 vastaavat alukkeita CC_EN02, CC EN01, CC_EN05 ja CC EN06, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen ENO-promoottorialueen genomisten fragmenttien eristämiseksi kromosomi kävely kokeissa.
20 Sekvenssit nro 31 ja 32 vastaavat alukkeita CC_EN09 ja CC_ENO10, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen ENO-geenin promoottorin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 33 ja 34 vastaavat alukkeita CC_EN04 ja CC_EN03, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen ENO-terminaattori-25 alueen genomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 35 ja 36 vastaavat alukkeita CC EN07 ja 5 CC_EN08, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen ENO-geenin terminaat- ^ torin eristämiseksi.
° Sekvenssit nro 37 ja 38 vastaavat alukkeita CC_GPD3 ja ° 30 CC_GPD4, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen GPD-terminaattori- £ alueen genomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
co Sekvenssit nro 39 ja 40 vastaavat alukkeita CC GPD6 ja CO — CC_GPD7, vastaavasti, joita käytetään C. curvatuksen GPD-geenin terminaat-^ torin eristämiseksi.
^ 35 Sekvenssit nro 41 ja 42 vastaavat alukkeita Hph 5 ja Hph 3, vastaa vasti, joita käytetään E. colin hygromysiinigeenin eristämiseksi.
70
Sekvenssit nro 43 ja 44 vastaavat alukkeita Kan 5 ja Kan 3, vastaavasti, joita käytetään E. colin G418-resistenssigeenin eristämiseksi.
Sekvenssit nro 45 ja 46 vastaavat alukkeita CERR 5 ja CERR 3, vastaavasti, joita käytetään S. cerevisiaen seruleeniresistenssigeenin eristämi-5 seksi.
Sekvenssi nro 47 vastaa S. cerevisiae n ALD6-geeri\r\, jonka Gen-Bank-talletusnumero on AAB68304 (version numero AAB68304.1), aminohapposekvenssiä.
Sekvenssi nro 48 vastaa S. cerevisiaen ALD6-proteiinia koodaavaa 10 DNA:ta, joka on kodonioptimoitu Ustilago maydis -sienen kodoninkäytön mukaisesti.
Sekvenssi nro 49 vastaa S. cerevisiae n ALD6-proteiinia koodaavaa DNA:ta, joka on kodonioptimoitu Rhizopus oryzae -rihmasienen kodoninkäytön mukaisesti.
15 Sekvenssi nro 50 vastaa S. cerevisiae n ACS2-geenin, jonka Gen-
Bank-talletusnumero on CAA97725 (version numero CAA97725.1), aminohapposekvenssiä.
Sekvenssi nro 51 vastaa S. cerevisiae n ACS2-proteiinia koodaavaa DNA:ta, joka on kodonioptimoitu Ustilago maydis -sienen kodoninkäytön mu-20 kaisesti.
Sekvenssi nro 52 vastaa Rhizopus oryzae n PDA 7-geenin aminohapposekvenssiä, jota koodaa geeni, jonka paikkanumero on RO3G_07851.3 laitoksen Broad Institute Rhizopus oryzae -tietokannassa.
Sekvenssi nro 53 vastaa Rhizopus oryzae n PDAT-proteiinia koo-25 daavaa DNA:ta, joka on kodonioptimoitu Ustilago maydis -sienen kodoninkäytön mukaisesti.
C\l o Sekvenssit nro 54 ja 55 vastaavat alukkeita Mould TPI1 ja mould cv ^ TPI3, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesm 7P/-geenin genomisen ° fragmentin eristämiseksi.
Is" ° 30 Sekvenssit nro 56 ja 57 vastaavat alukkeita MC_TPI2 ja MC_TPI1, | vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesm TPI-promoottorialueen ge- oo nomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 58 ja 59 vastaavat alukkeita MC_TPI7 ja MC_TPI8, ^ vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloides'\r\ 7P/-geenin promoottorin ^ 35 kloonaamiseksi.
71
Sekvenssit nro 60 ja 61 vastaavat alukkeita MC_TPI4 ja MC_TPI3, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloides\n TPI-terminaattorialueen ge-nomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 62 ja 63 vastaavat alukkeita MC_TPI5 ja MC_TPI6, 5 vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloides\n 7P/-geenin terminaattorin kloonaamiseksi.
Sekvenssit nro 64 ja 65 vastaavat alukkeita Mould TEF1 ja Mould TEF4, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesm TEF-geenin genomi-sen fragmentin eristämiseksi.
10 Sekvenssit nro 66, 67, 68 ja 69 vastaavat alukkeita MC_TEF2, MC_TEF1, MC_TEF6 ja MC_TEF5, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinel-loides'\n TEF-promoottorialueen genomisten fragmenttien eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 70 ja 71 vastaavat alukkeita MC_TEF9 ja 15 MC_TEF10, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesln TEF-geenin promoottorin kloonaamiseksi.
Sekvenssit nro 72, 73, 74 ja 75 vastaavat alukkeita MC_TEF4, MC_TEF3, MC_TEF8 ja MC_TEF7, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinel-loides\r\ TEF-terminaattorialueen genomisten fragmenttien eristämiseksi kro-20 mosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 76 ja 77 vastaavat alukkeita MC TEF11 ja MC_TEF12, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloides\n TEF-geenin terminaattorin kloonaamiseksi.
Sekvenssit nro 78 ja 79 vastaavat alukkeita Mould PGK4 ja Mould 25 PGK2, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesm PGK-geenin genomi-sen fragmentin eristämiseksi.
o Sekvenssit nro 80, 81, 82 ja 83 vastaavat alukkeita MC_PGK2,
CM
^ MC_PGK1, MC_PGK4 ja MC_PGK3, vastaavasti, joita käytetään Mucor cir- ° cinelloides\n PGK-promoottorialueen genomisten fragmenttien eristämiseksi
Is- ° 30 kromosomikävelykokeissa.
| Sekvenssit nro 84 ja 85 vastaavat alukkeita MC_PGK5 ja co MC PGK6, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloidesm PGK-geenin pro- 00 moottorin kloonaamiseksi.
? Sekvenssit nro 86, 87, 88 ja 89 vastaavat alukkeita MC_GPD2, ^ 35 MC_GPD1, MC_GPD10 ja MC_GPD9, vastaavasti, joita käytetään Mucor cir- 72 cinelloides\n GPD-promoottorialueen genomisen fragmentin eristämiseksi kromosomikävelykokeissa.
Sekvenssit nro 90 ja 91 vastaavat alukkeita MC_GPD11 ja MC_GPD12, vastaavasti, joita käytetään Mucor circinelloides\n GPD-geenin 5 promoottorin kloonaamiseksi.
Sekvenssi nro 92 vastaa S. cerevisiaen ACS2-proteiinia koodaavaa DNA:ta, joka on kodon ioptimoitu Rhizopus oryzae -sienen kodon in käytön mukaisesti.
Sekvenssi nro 93 vastaa Rhizopus oryzae n PDAT-proteiinia koo-10 daavaa DNA:ta, joka on kodonioptimoitu Rhizopus oryzae -sienen kodoninkäy-tön mukaisesti.
Sekvenssi nro 94 vastaa S. cerevisiaen PDC1 -proteiinia koodaavaa DNA:ta, jonka GenBank-talletusnumero on X77316 (version numero X77316.1).
15 Sekvenssi nro 95 vastaa S. cerevisiaen PDC1-geen\n, jonka Gen
Bank-talletusnumero on CAA54522 (version numero CAA54522.1), aminohapposekvenssiä.
C\J
δ
(M
i
CD
O
h-· o
X
IX
CL
CO
CO
r^ m o δ
(M

Claims (22)

1. Geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, joka sisältää: a) vähintään yhden nukleiinihapon, joka koodaa entsyymin, joka va-5 Iitaan ryhmästä, joka koostuu pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetalde- hydidehydrogenaasista (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja jonka ekspressio on muokattu mainitun enstyymin yli-ilmentämiseksi, ja b) nukleiinihapon, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroliasyyli-transferaasi (DAT), ja jonka ekspressio on muokattu mainitun entsyymin yli- 10 ilmentämiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, jossa ALD on sytosolinen ALD.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, jossa ALD on sienen ALD, edullisesti Saccharomyces cere- 15 ws/aeALD6.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, jossa ACS:n koodaava nukleiinihappo on geeni, joka ei ole glukoosirepression alla tai sen geenituote ei ole translaation jälkeisen säätelyn kohteena.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, jossa ACS on sienen ACS, edullisesti Saccharomyces cere-visiae ACS2.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, jossa DAT on fosfolipidi:d iasyyl iglyserol iasyyl itransferaasi 25 (PDAT).
^ 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä δ tuottava sienisolu, jossa DAT on sienen DAT.
£ 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä O ^ tuottava sienisolu, jossa DAT on sienestä Rhizopus oryzae. ° 30
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä X E£ tuottava sienisolu, jossa DAT on fosfolipidi:d iasyyl iglyserol iasyyl itransferaasi m (PDAT), jolla on vähintään 40 %:n sekvenssi-identtisyys sekvenssille nro 52, tai sen entsymaattisesti aktiivinen fragmentti tai variantti, o
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä ^ 35 tuottava sienisolu, joka on lipidiä tuottava hiivasolu tai lipidiä tuottava rihma- sienisolu.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, joka on valittu suvuista Cryptococcus, Candida, Galactomy-ces, Hansenula, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon ja Yarrowia.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, joka on valittu ryhmästä Candida sp., Cryptococcus curva-tus, Cryptococcus albidus, Galactomyces geotrichum, Hansenula ciferri, Lipomyces lipofer, Lipomyces ssp., Lipomyces starkeyi, Lipomyces tetrasporus, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulans ja 1 o Yarrowia lipolytica.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, joka on rihmasieni, joka on valittu suvuista Aspergillus, Cunninghamella, Fusarium, Glomus, Humicola, Mortierella, Mucor, Penicillium, Pythium ja Rhizopus.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu, joka on valittu ryhmästä Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Cuninghamella japonica, Fusarium oxysporum, Glomus caledonius, Humicola lanuginose, Mortierella isabellina, Mortierella pusilla, Mortierella vinacea, Mucor circinelloides, Mucor plumbeus, Mucor ra-20 manniana, Penicillium lilacinum, Penicillium spinulosum, Pythium ultimum ja Rhizopus oryzae.
15. Menetelmä lipidien tuottamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa viljellään jonkin patenttivaatimuksen 1 -14 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu alustassa, joka sisältää hiili- ja typpilähteet, 25 ja otetaan talteen muodostuneet lipidit.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa tuotetaan C\J o asyyliglyseroleja sisältäviä lipidejä. CM
^ 17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, jossa tuotetaan ° triasyyliglyseroleja (TAG) sisältäviä lipidejä. n. ° 30
18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, jossa hiililähde | on aines, joka sisältää heksoosi- tai pentoosiryhmiä. cv,
19. Menetelmä biopolttoaineiden tai voiteluaineiden tuottamiseksi, CO joka menetelmä käsittää vaiheet joissa viljellään jonkin patenttivaatimuksen 2 1-14 mukainen geneettisesti muokattu lipidiä tuottava sienisolu alustassa, jo- ^ 35 ka sisältää hiili- ja typpilähteet, ja otetaan talteen muodostuneet lipidit, ja mah- dollisesti mainitut lipidit esteröidään biodieselin tai voiteluaineen saamiseksi, tai hydrogenoidaan lipidit uusiutuvan dieselin tai voiteluaineen saamiseksi.
20. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukaisen sie-nisolun valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa lipidiä tuotta- 5 va sienisolu transformoidaan a) nukleiinihapolla, joka on muokattu yli-ilmentämään vähintään yhtä nukleiinihappoa, joka koodaa entsyymin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetaldehydidehyrogenaasista (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja 10 b) nukleiinihapolla, joka on muokattu yli-ilmentämään nukleiinihap poa, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroliasyylitransferaasi (DAT).
21. Ekspressiokasetti, joka käsittää a) nukleiinihapon, joka on muokattu yli-ilmentämään vähintään yhtä nukleiinihappoa, joka koodaa entsyymin, joka valitaan ryhmästä, joka koostuu 15 pyruvaattidekarboksylaasista (PDC), asetaldehydidehyrogenaasista (ALD) ja asetyyli-CoA-syntetaasista (ACS), ja b) nukleiinihapon, joka on muokattu yli-ilmentämään nukleiinihappoa, joka koodaa entsyymin diasyyliglyseroliasyylitransferaasi (DAT).
22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukaisen geneettisesti muo- 20 katun lipidiä tuottavan solun käyttö lipidien, biopolttoaineiden, biodieselin, uusiutuvan dieselin tai voiteluaineiden tuottoon. C\J δ CM CD o o X cc CL CO CO LO o δ CM
FI20105733A 2010-06-24 2010-06-24 Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa FI122886B (fi)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20105733A FI122886B (fi) 2010-06-24 2010-06-24 Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa
PCT/FI2011/050594 WO2011161317A2 (en) 2010-06-24 2011-06-21 Genetically modified fungi and their use in lipid production
SG2012094389A SG186431A1 (en) 2010-06-24 2011-06-21 Genetically modified fungi and their use in lipid production
EP11738253.1A EP2585588A2 (en) 2010-06-24 2011-06-21 Genetically modified fungi and their use in lipid production
US13/806,281 US9518276B2 (en) 2010-06-24 2011-06-21 Genetically modified fungi and their use in lipid production
US15/374,811 US20170088842A1 (en) 2010-06-24 2016-12-09 Genetically modified fungi and their use in lipid production

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20105733A FI122886B (fi) 2010-06-24 2010-06-24 Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa
FI20105733 2010-06-24

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI20105733A0 FI20105733A0 (fi) 2010-06-24
FI20105733A FI20105733A (fi) 2011-12-25
FI122886B true FI122886B (fi) 2012-08-31

Family

ID=42308185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20105733A FI122886B (fi) 2010-06-24 2010-06-24 Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa

Country Status (5)

Country Link
US (2) US9518276B2 (fi)
EP (1) EP2585588A2 (fi)
FI (1) FI122886B (fi)
SG (1) SG186431A1 (fi)
WO (1) WO2011161317A2 (fi)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101577134B1 (ko) * 2014-05-09 2015-12-14 씨제이제일제당 (주) 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법
US10081821B2 (en) 2014-09-08 2018-09-25 Temasek Life Sciences Laboratory Limited Methods for efficient production of polyunsaturated fatty acids (PUFA) in Rhodosporidium and Rhodotorula species
US10662448B2 (en) 2016-10-17 2020-05-26 Xylome Corporation Compositions and methods for producing lipids and other biomaterials from grain ethanol stillage and stillage derivatives
CN111471599A (zh) * 2020-05-04 2020-07-31 上海聚茂塑胶制品有限公司 一种生物柴油及其制备工艺
CN112941119B (zh) * 2021-01-22 2022-08-30 江南大学 一种提高酿酒酵母工程菌脂肪酸乙酯产量的方法
CN116606868B (zh) * 2023-05-12 2024-04-16 昆明理工大学 一种乙酰CoA合成酶基因RkACS2及其应用

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1268749C (zh) 1998-06-26 2006-08-09 爱阿华州立大学研究机构 用于改变植物中酶和乙酰辅酶a水平的材料和方法
BR0009510A (pt) 1999-04-01 2002-04-23 Basf Plant Science Gmbh Enzima, sequência de nucleotìdeos, construção de gene, vetor, organismo ou célula transgênica, processo para a produção de triacilglicerol, triacilgliceróis, e, uso de uma sequência de nucleotìdeos
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
DE102004052115A1 (de) 2004-10-26 2006-04-27 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Mikroorganismen zur Herstellung von Fettsäureestern, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20090053797A1 (en) 2005-08-19 2009-02-26 Yoichiro Shiba Genetically modified host cells and use of same for producing isoprenoid compounds
EP2157170B1 (en) 2006-05-19 2014-01-15 LS9, Inc. Production of fatty acids and derivatives thereof
WO2008130372A2 (en) * 2006-09-28 2008-10-30 Microbia, Inc. Production of sterols in oleaginous yeast and fungi
US20100062505A1 (en) 2006-12-21 2010-03-11 Gevo, Inc. Butanol production by metabolically engineered yeast
CN101765661B (zh) 2007-06-01 2014-08-06 索拉兹米公司 在微生物中生产油
US20090064567A1 (en) 2007-09-12 2009-03-12 Martek Biosciences Corporation Biological oils and production and uses Thereof
AU2009231810A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Kuehnle Agrosystems, Inc. Nuclear based expression of genes for production of biofuels and process co-products in algae
EP2294193A4 (en) 2008-04-10 2012-11-28 Dsm Ip Assets Bv PRODUCTION OF CAROTENOIDS IN YEAST AND OLEAGINOUS FUNGI
US8003365B2 (en) 2008-12-11 2011-08-23 Bio Architecture Lab, Inc. Biosynthesis of commodity chemicals
CN101892092A (zh) 2009-05-20 2010-11-24 湖北汇特生物医药技术有限公司 一种重组藻类体内生产生物柴油的方法
US20110189743A1 (en) 2009-10-06 2011-08-04 Bio Architecture Lab, Inc. Microbial systems for producing commodity chemicals

Also Published As

Publication number Publication date
US20170088842A1 (en) 2017-03-30
WO2011161317A3 (en) 2012-02-23
US20130102042A1 (en) 2013-04-25
FI20105733A (fi) 2011-12-25
FI20105733A0 (fi) 2010-06-24
WO2011161317A2 (en) 2011-12-29
US9518276B2 (en) 2016-12-13
EP2585588A2 (en) 2013-05-01
SG186431A1 (en) 2013-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11162119B2 (en) Methods and products for production of wax esters
US10006065B2 (en) Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
CN108271383B (zh) 真菌细胞和生产非常长链脂肪酸衍生产物的方法
US20170088842A1 (en) Genetically modified fungi and their use in lipid production
Beopoulos et al. An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact on biotechnological processes
EP2768954B1 (en) Engineered microbes and methods for microbial oil production
JP2015500009A (ja) Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ脂質経路遺伝子を含む遺伝子操作された微生物株
CN103080305B (zh) 酵母由木质纤维素和甘油生产生物柴油
US11168340B2 (en) Compositions and methods for producing lipids and other biomaterials from grain ethanol stillage and stillage derivatives
Koivuranta et al. Enhanced triacylglycerol production with genetically modified Trichosporon oleaginosus
US20220213513A1 (en) Production of cannabinoids
US20230407314A1 (en) Anaerobic co-production of essential amino acids, alcohols and lipids from molasses, hydrolysed starch and lignocellulose
WO2022232444A1 (en) Genetically modified yeast cells and methods of use for increased lipid yield
CA2982734A1 (en) Compositions and methods for producing lipids and other biomaterials from grain ethanol stillage and stillage derivatives
Tsai Production of preferable high-oleic acid yeast
Zolet et al. Evolutionary view of acyl-CoA diacylglycerol acyltransferase (DGAT), a key enzyme in neutral lipid biosynthesis
WO2016162605A1 (en) Enhanced diacid production with genetically modified micro-organisms

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 122886

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B

MM Patent lapsed