CN101765661B - 在微生物中生产油 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于在微生物中生产油、燃料、油类化学品和其他化合物的方法和组合物。具体地，本发明提供了带油的微生物以及这类微生物的低成本培养方法。本发明还提供了含有外源基因的微生物细胞，所述外源基因编码例如脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。本发明还包含制造运输燃料例如可再生柴油、生物柴油和可再生喷气式发动机燃料的方法。

Description

在微生物中生产油
与相关申请交叉引用
本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：2007年6月1日提交的No：60/941,581；2007年7月10日提交的No：60/959,174；2007年8月27日提交的No：60/968,291；和2008年1月28日提交的No：61/024,069，所述临时专利申请的公开内容为了所有目的整体并入本文作为参考。
发明领域
本公开涉及油、燃料的生产，和由微生物制成的油类化学品(oleochemicals)。具体地，本公开涉及带油的微生物，包括微藻、酵母和真菌，并且涉及培养这类微生物的方法，所述微生物用于生产在工业中使用或者用作能量或食物来源的有用化合物，包括脂质、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇和烷烃。本发明的微生物可以被选择或遗传改造，以适用于本文所述的本发明方法或其他方面。
发明背景
化石燃料是埋藏的有机材料的可燃性地质沉积物的通用术语，其由腐朽的植物和动物形成，所述腐朽的植物和动物通过在数亿年间暴露于地壳中的热和压力而被转化为原油、煤、天然气或重油。
在通常的对话中，化石燃料(也称作矿物燃料)与其他含烃的自然资源例如煤、油和天然气作为同义词使用。化石燃料的利用使得能够进行大规模的工业发展并大幅取代水驱动的磨，以及燃烧木头或泥炭用于取暖。化石燃料是有限的、不可再生的资源。
发电时，通常使用来自化石燃料燃烧的能量驱动涡轮。较早的世代通常使用燃料燃烧产生的蒸汽使涡轮旋转，但是在较新的发电厂中，通过燃料燃烧产生的气体直接转动燃气涡轮(gas turbine)。随着20世纪和21世纪的全球现代化，对来自化石燃料(特别是得自油的汽油)的能量的渴求是主要的地区冲突和全球冲突的原因之一。
人类对化石燃料的燃烧是二氧化碳排放的最大来源，二氧化碳是允许辐射强迫(radiative forcing)并促进全球变暖的温室气体之一。在美国，多于90％的温室气体排放来自于化石燃料的燃烧。另外，产生了其他气体污染物，例如一氧化氮、二氧化硫、挥发性有机化合物(VOC)和重金属。
人类活动主要通过从化石燃料燃烧释放二氧化碳提高温室气体水平，但是其他气体例如甲烷不能忽略。由于人类活动，例如导致更高二氧化碳浓度的化石燃料燃烧和滥伐，若干种温室气体的浓度随时间提高。根据全球变暖的假说，来自工业和农业的温室气体在最近观察到的全球变暖中起主要作用。
全球经济造成的增加的能量需求也为碳氢化合物的成本带来递增的压力。除能量以外，包括塑料和化学品制造商在内的许多工业严重依赖于碳氢化合物作为制造过程原料的可用性。对目前供应来源的成本划算的替代方式能够帮助缓和对能量和这些原料成本的增加的压力。
发明概述
在一个方面中，本发明提供了微生物，所述微生物在多个实施方案中可包括含有外源基因的微藻细胞，产油酵母(oleaginous yeast)，或真菌，所述外源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶、多糖降解酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白(ACP)。微生物(例如微藻细胞)可例如选自表1。在具体的实施方案中，细胞是小球藻属(Chlorella)的物种，例如Chlorellafusca、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、Chlorella kessleri、小球藻(Chlorella vulgaris)、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana或椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。在一些实施方案中，微生物是选自弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、Cryptococcusterricolus、假丝酵母(Candida sp.)、油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)、Endomycopsis vernalis、红酵母(Rhodotorulaglutinis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)和解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)的产油酵母。还在其他实施方案中，微生物是选自以下的真菌：被孢霉属(Mortierella)的物种，葡酒色被孢霉(Mortierrla vinacea)、高山被孢霉(Mortierella alpine))、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、土曲霉(Aspergillusterreus)、薄青霉(Pennicillium iilacinum)、Hensenulo属的物种、毛壳(Chaetomium)属的物种、枝孢(Cladosporium)属的物种、畸枝霉属(Malbranchea)属的物种、根霉(Rhizopus)属的物种和腐霉(Pythium)属的物种。在其他实施方案中，本发明包括烃修饰酶在细菌宿主例如大肠杆菌(E.Coli)中的表达，和生产可再生柴油的Bacilla方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中(i)微生物将其干细胞重量的至少10％作为脂质累积，和(ii)所述固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维素材料、蔗糖、糖蜜、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任一组合，(b)从培养的微生物中分离脂质组分，和(c)对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应，产生直链烷烃，从而产生可再生的柴油。
在另一方面中，本发明涉及根据上文所述方法制造的液态烃组合物，其中所述组合物符合ASTM D975规范。
在另一方面中，本发明涉及生产喷气式发动机燃料(jet fuel)的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)在存在固定的碳源时培养微生物群体，其中(i)所述微生物将其干细胞重量的至少10％作为脂质累积，和(ii)所述固定的碳源选自甘油、解聚合的纤维素材料、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐及前述的任一组合，(b)从培养的微生物中分离脂质组分，(c)对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应，产生直链烷烃，(d)裂化所述直链烷烃从而产生喷气式发动机燃料。
在另一方面中，本发明涉及根据上文所述方法产生的液态烃组合物，其中所述组合物符合ASTM D1655规范。
在另一方面中，本发明涉及微藻或酵母细胞，所述微藻或酵母细胞已被遗传改造和/或选择，从而与相同物种的野生型细胞相比以改变的水平表达脂质途径酶。在一些情况下，当两种细胞均在相同条件下生长时，与野生型细胞相比所述细胞产生更多脂质。在一些情况下，细胞已被遗传改造和/或选择，从而与野生型细胞相比以更高的水平表达脂质途径酶。在一些情况下，脂质途径酶选自丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3磷酸酯酰基转移酶。在一些情况下，细胞已被遗传改造和/或选择为以低于野生型细胞的水平表达脂质途径酶。在其中细胞以更低水平表达脂质途径酶的至少一个实施方案中，脂质途径酶包括柠檬酸合酶。
在一些实施方案中，上文所述微藻或酵母细胞已被遗传改造和/或选择为与野生型细胞相比以改变的水平表达脂肪酸合成的总体调节子，从而与野生型细胞相比改变了多种脂肪酸合成基因的表达水平。在一些情况下，脂质途径酶包括修饰脂肪酸的酶。在一些情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶和甘油脂去饱和酶。
在另一方面中，本发明涉及含有一种或多种外源基因的产油微生物，其中所述外源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白。在一些情况下，微生物是原壳小球藻、微小小球藻(Chlorella minutissima)、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻或小球藻属物种(Chlorella sp.)。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。在一个实施方案中，外源基因与启动子处于有效连接中，所述启动子是应答刺激可诱导型或阻抑型。在一些情况下，刺激选自外源提供的小分子、热、冷和光。在一些情况下，外源基因在细胞区室中表达。在一些实施方案中，细胞区室选自叶绿体和线粒体。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酸酰基-ACP硫酯酶。在一些情况下，外源基因编码的硫酯酶催化从酰基载体蛋白(ACP)上切割8-18碳脂肪酸。在一些情况下，外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割10到14碳脂肪酸。在一个实施方案中，外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶。在一些情况下，外源基因编码的还原酶催化20到30-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况下，外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况下，外源基因编码的还原酶催化10到14-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一个实施方案中，外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。
在一个实施方案中，外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶。在一些情况下，外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛。在一个实施方案中，外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二醛。
在至少一个实施方案中，本发明的微生物还含有一种或多种外源的蔗糖利用基因。
在另一方面中，本发明涉及含有两种外源基因的微生物，其中第一外源基因编码脂肪酰基-ACP硫酯酶，第二外源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶和酰基载体蛋白。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。在一些情况下，两个外源基因各自处于与启动子的有效连接中，所述启动子是应答刺激可诱导的。在一些情况下，各个启动子是应答相同刺激可诱导的。
在一个实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸。在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶，所述酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇。在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割10到14-碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化10到14-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，所述酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛。
在一些实施方案中，第二外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且微生物还含有编码脂肪醛脱羰基酶的第三外源基因。在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8-18碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的脂肪醛，并且第三外源基因编码的脱羰基酶催化8到18-碳脂肪醛转化成为相应的烷，其中所述硫酯酶、还原酶和脱羰基酶作用于相同的碳链长度。
在一些实施方案中，第二外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的酰基载体蛋白。
在一些实施方案中，第二外源基因编码酰基载体蛋白，并且微生物还含有编码选自脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶的蛋白质的第三外源基因。在一些情况下，第三外源基因编码脂肪酰基-CoA还原酶，并且所述微生物还含有编码脂肪醛脱羰基酶的第四外源基因。
在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养微生物群体，其中所述微生物含有(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，和(ii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶的第二外源基因，并且微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸，通过进一步加工得到脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA/醛还原酶催化酰基-CoA还原成为醇。
在微生物群体中生产分子的方法的一个实施方案中，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的微生物的另一物种。在一些情况下，培养基含有甘油。在一些情况下，甘油是酯交换过程的副产物。在一些情况下，培养基含有甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂甘油和至少一种其他的固定碳源。在本发明的一些培养方法中，在不存在至少一种其他的固定碳源时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。
在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可诱导的。在一些情况下，该方法还包括提供第一刺激，并且在存在第一刺激时将微生物群体孵育第一段时间以产生醇。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物的水性生物量中提取醇。
在一些实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割10到14-碳脂肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化10到14碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的伯醇，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一个实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割12-碳脂肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化12-碳脂肪酰基-CoA还原成为十二烷醇。在一些情况下，微生物还含有编码酰基载体蛋白的第三外源基因。在一些实施方案中，第三外源基因编码与脂肪酰基-ACP硫酯酶天然共表达的酰基载体蛋白。
在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产脂质分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养微生物群体，其中微生物含有(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的第一外源基因，和(ii)编码脂肪酰基-CoA还原酶的第二外源基因，并且其中微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸，通过进一步加工得到脂肪酰基-CoA，并且脂肪酰基-CoA还原酶催化酰基-CoA还原成为醛。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorellasorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微生物物种。
在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可诱导的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育第一段时间以产生醛。在一个实施方案中，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物量中提取醛。
在一些实施方案中，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸，并且第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛，其中所述硫酯酶和还原酶作用于相同的碳链长度。在一些情况下，微生物还含有编码脂肪醛脱羰基酶的第三外源基因，所述脂肪醛脱羰基酶催化醛转化成为烷烃。
在一些情况下，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可诱导的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育第一段时间以产生烷。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物量中提取烷。
在一些情况下，第一外源基因编码的硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸，第二外源基因编码的还原酶催化8到18-碳脂肪酰基-CoA还原成为相应的醛，并且第三外源基因编码的脱羰基酶催化8到18-碳醛转化成为相应的烷，其中所述硫酯酶、还原酶和脱羰基酶作用于相同的碳链长度。在一些实施方案中，微生物还含有编码酰基载体蛋白的第三外源基因。在一些情况下，第三外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的酰基载体蛋白。在一些情况下，微生物还含有编码脂肪醛脱羰基酶的第四外源基因，所述脂肪醛脱羰基酶催化醛转化成为烷。
在一些方法中，培养基含有甘油。在一个实施方案中，甘油是酯交换过程的副产物。在一些情况下，培养基含有甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定碳源时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。
在另一方面中，本发明涉及在微生物群体中生产具有特定碳链长度的脂肪酸分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括在培养基中培养生产脂质的微生物群体，其中微生物含有编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因，所述酶具有对碳链长度特异的活性，并且其中微生物合成与酰基载体蛋白(ACP)连接的脂肪酸，并且当脂肪酸被合成至特定的碳链长度时硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸。在一些情况下，微生物是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的其他微生物物种。
在一些实施方案中，外源基因与启动子有效连接，所述启动子是应答第一刺激可诱导的，并且该方法还包括提供第一刺激，并在存在第一刺激时将微生物群体孵育一段时间。在一些情况下，该方法还包括从包含培养基和微生物群体的水性生物量中提取脂肪酸。
在一些情况下，微生物还含有编码酰基载体蛋白的第二外源基因。在一些实施方案中，第二外源基因编码天然地与脂肪酰基-ACP硫酯酶共表达的酰基载体蛋白。在一个实施方案中，酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割8到18-碳脂肪酸。
在一些情况下，培养基含有甘油。在一个实施方案中，甘油是酯交换过程的副产物。在一些实施方案中，培养基含有甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源是蔗糖。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂甘油和至少一种其他的固定碳源。在一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定碳源时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。
在另一方面中，本发明涉及含有外源基因的微藻细胞，其中外源基因编码选自以下的蛋白质：脂肪酶、蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、果糖激酶或多糖降解酶。在一些情况下，细胞是微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微藻物种。
在一些情况下，外源基因与启动子有效连接。在一些情况下，启动子是应答刺激的诱导型或阻抑型启动子。在多种实施方案中，刺激选自外源提供的小分子、热、冷和光。在一些情况下，外源基因在细胞区室中表达。在一些实施方案中，细胞区室选自叶绿体和线粒体。
在一些情况下，基因编码与选自表9的脂肪酶具有至少70％氨基酸同一性的脂肪酶。在一个实施方案中，脂肪酶是novozym-435。在一个实施方案中，多糖降解酶对小球藻病毒而言是内源的。
在另一方面中，本发明涉及含有两个外源基因的微藻细胞，其中第一外源基因编码脂肪酶，第二外源基因编码多糖降解酶。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答刺激的诱导型启动子。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答相同刺激的诱导型启动子。在一些情况下，外源基因各自与启动子有效连接，所述启动子是应答至少一种刺激诱导型启动子，所述刺激不诱导另一种启动子。
在另一方面中，本发明涉及在微生物中制造脂质分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)将微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间，其中微生物含有(i)编码脂肪酶的外源基因，和/或(ii)编码多糖降解酶的外源基因，其中外源基因与应答刺激的诱导型启动子有效连接，(b)提供刺激，和(c)在存在刺激时将微生物孵育第二段时间。
在另一方面中，本发明涉及在微生物中制造脂质分子的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)将生产脂质的微生物培养足以提高细胞密度的第一段时间，(b)提供与微生物直接接触时能够感染并裂解微生物的病毒，和(c)将微生物孵育第二段时间，产生裂解的水性生物量。在一个实施方案中，该方法还包括从裂解的水性生物量中提取脂质分子。
在另一方面中，本发明涉及含有外源基因的微藻细胞，其中外源基因编码脂质途径酶的辅因子，或编码参与辅因子合成的蛋白质。
在另一方面中，本发明涉及培养生产脂质的微生物的方法。在一个实施方案中，该方法包括在存在足量的一种或多种脂质途径酶的辅因子时培养微生物，使得提高微生物脂质产量超过不存在所述一种或多种辅因子时的微生物脂质产量。在一些情况下，一种或多种辅因子是一种或多种脂质途径酶所需的维生素。在一个实施方案中，一种或多种辅因子是生物素。在一些情况下，通过在培养物中包含下述微生物提供一种或多种辅因子，所述微生物已被遗传改造为生产一种或多种辅因子。
在另一方面中，本发明涉及发酵微生物的方法，包括对微生物提供包含葡萄糖和木糖的混合物作为能源。在一个实施方案中，混合物还包含木质素。在一个实施方案中，混合物还包含至少一种糠醛种类。在一些情况下，混合物是解聚的纤维素材料。在一些情况下，混合物还包含至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，混合物包含蔗糖转化酶。
在一些情况下，微生物选自Bracteococcus minor、椭圆小球藻、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、Chlorella ovalis、原壳小球藻、Chlorella saccharophila、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、小球藻、Parachlorella kessleri、Prototheca moriformis和Pseudochlorella aquatica。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微生物物种。在一些情况下，微生物已被遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰酶或蔗糖利用酶的外源基因。
在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法，包括在包含原料的培养基中培养微藻，所述原料包含至少一种选自纤维素材料、5-碳糖、6-碳糖和乙酸盐的碳底物。在一些情况下，碳底物是葡萄糖，微藻是选自小球藻属、Parach lorella、Pseudochlorella、Bracteococcus、原壁菌属(Prototheca)和栅藻属(Scenedesmus)的属。在一些情况下，碳底物是木糖，微藻是选自小球藻属、Pseudochlorella和原壁菌属的属。在一些情况下，碳底物是蔗糖，微藻是选自小球藻属和Bracteococcus的属。在一些情况下，碳底物是果糖，微藻是选自小球藻属、Parachlorella、原壁菌属和栅藻属的属。在一些情况下，碳底物是阿拉伯糖，微藻是小球藻属物种。在一些情况下，碳底物是甘露糖，微藻是选自小球藻属、Parachlorella、Bracteococcus、原壁菌属和栅藻属的属。在一些情况下，碳底物是半乳糖，微藻是选自Bracteococcus、Parachlorella、小球藻属、Pseudochlorella、Bracteococcus和原壁菌属的属。在一些情况下，碳底物是乙酸盐，微藻是选自小球藻属、Parachlorella和原壁菌属的属。
在一个实施方案中，培养基还含有至少一种蔗糖利用酶。在一些情况下，微藻已被遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰酶或蔗糖利用酶的外源基因。在一些情况下，培养基含有蔗糖转化酶。
在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法，包括在解聚纤维素材料的存在下放置大量微藻细胞。在一些情况下，在存在额外的固定碳源时培养微藻，所述固定碳源选自甘油、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、乙酸盐和前述的任一组合。在一个实施方案中，在存在至少一种蔗糖利用酶时培养微藻。
在一些情况下，微藻选自Bracteococcus属的物种、小球藻属的物种、Parachlorella属的物种、原壁菌属的物种，或Pseudochlorella属的物种。在一些情况下，微藻选自Bracteococcus minor、椭圆小球藻、Chlorellakessleri、Chlorella luteoviridis、Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、Chlorella ovalis、原壳小球藻、Chlorella saccharophila、Chlorellasorokiniana、小球藻属物种、小球藻、Parachlorella kessleri、Protothecamoriformis和Pseudochlorella aquatica。在其他情况下，微藻是本文所述的另一微藻物种。
在一些实施方案中，微藻已被遗传改造为表达编码至少一种脂质修饰酶、烃修饰酶或蔗糖利用酶的外源基因。在一个实施方案中，至少一种蔗糖利用酶是蔗糖转化酶。在一些情况下，至少一种脂质修饰酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶和甘油-3磷酸酰基转移酶。在一些情况下，至少一种烃修饰酶选自脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和酰基载体蛋白。
在另一方面中，本发明涉及培养生产脂质的微生物的方法，该方法包括在存在乙酸和不存在固定氮源时培养微生物。在一些情况下，在存在足量乙酸时培养微生物，使得提高微生物脂质产量超过不存在乙酸时的微生物脂质产量，其中两种培养之间培养条件在其他方面相同。
在另一方面中，本发明涉及包含微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养基包含葡萄糖、木糖和选自木质素和糠醛种类的分子。在一些情况下，微生物选自Bracteococcus minor、椭圆小球藻、Chlorella kessleri、Chlorella luteoviridis、Bracteococcus medionucleatus、微小小球藻、Chlorellaovalis、原壳小球藻、Chlorella sacch arophila、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、小球藻、Parachlorella kessleri、Prototheca moriformis和Pseudochlorella aquatica。在其他情况下，微生物是本文所述的另一微生物物种。
在另一方面中，本发明涉及培养微藻的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)提供能够进行异养生长的微藻，(b)将微藻置于生长培养基中，其中所述生长培养基包含解聚的纤维素材料，和(c)将微藻孵育足以允许细胞生长的一段时间。
在另一方面中，本发明涉及生物柴油制造方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)在第一微生物培养物中培养生产脂质的微生物，(b)从第一微生物培养物生产的生物量中回收脂质，(c)对脂质进行酯交换，产生脂肪酸酯和甘油，和(d)将甘油添加至第二微生物培养物中。在一些情况下，第一和第二微生物培养物是相同微生物物种的培养物。在一些情况下，第二微生物培养物包含选自以下的微生物：Parachlorella kessleri、原壳小球藻、Bracteococcus medionucleatus、Prototheca moriformis、微小小球藻、小球藻属物种和Chlorella sorokiniana。在其他情况下，第二微生物培养物包含本文所述的另一微生物物种。
在另一方面中，本发明涉及发酵方法，包括在存在甘油和至少一种其他的固定碳源时培养微生物。在一些情况下，以预定的比例对微生物同时提供甘油和至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵开始时对微生物提供所有的甘油和所有的至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在发酵过程中以预定的速率对微生物饲喂所有的甘油和至少一种其他的固定碳源。在该方法的一个实施方案中，在不存在至少一种其他的固定碳源时，在第一段时间中对微生物提供甘油，在第一段时间结束时提供至少一种其他的固定碳源，并且在存在至少一种其他的固定碳源时将微生物培养第二段时间。在一个实施方案中，在第二段时间期间以预定的速率对微生物饲喂至少一种其他的固定碳源。在一些情况下，在第一段时间结束时对微生物提供所有的至少一种其他的固定碳源。在该方法的一个实施方案中，在不存在甘油时，在第一段时间中对微生物提供至少一种其他的固定碳源，在第一段时间结束时提供甘油，并且在存在甘油时将微生物培养第二段时间。在一个实施方案中，甘油是酯交换过程的副产物。在一个实施方案中，甘油是经过酸化的。在另一实施方案中，甘油是未经酸化的。在一些情况下，至少一种其他的固定碳源是葡萄糖。在一些情况下，至少一种其他的固定碳源是解聚的纤维素材料。在一个实施方案中，至少一种其他的固定碳源是蔗糖。
在另一方面中，本发明涉及包含微生物群体、甘油和至少一种糖的发酵罐，所述糖选自木糖、葡萄糖和蔗糖。在一个实施方案中，甘油是脂质酯交换过程的副产物。在一些情况下，微生物选自Parachlorella kessleri、原壳小球藻、Bracteococcus medionucleatus、Prototheca moriformis、微小小球藻、小球藻属物种和Chlorella sorokiniana。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。
在另一方面中，本发明涉及发酵微生物的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供来自酯交换过程的副产物甘油作为固定碳能量的唯一来源。在一个实施方案中，不对微生物提供光能量。在另一实施方案中，对微生物提供光能量。在一些情况下，微生物选自Parachlorella kessleri、原壳小球藻、Bracteococcus medion ucleatus、Prototh eca moriformis、微小小球藻、小球藻属物种和Chlorella sorokiniana。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。
在另一方面中，本发明涉及含有外源蔗糖利用基因的微生物。在一个实施方案中，基因编码蔗糖转运蛋白。在一个实施方案中，基因编码蔗糖转化酶。在一个实施方案中，基因编码果糖激酶。在一些情况下，微生物选自微小小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种或原壳小球藻。在其他情况下，微生物是本文所述的另一物种。
在另一方面中，本发明涉及原壳小球藻、Chlorella emersonii或微小小球藻物种的细胞，其中所述细胞含有外源基因。在一些情况下，外源基因编码选自以下的蛋白质：蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、脂质修饰酶、烃修饰酶和果糖激酶。在一些实施方案中，蛋白质是被分泌进细胞外间隙的蔗糖转化酶。在一些实施方案中，蛋白质是靶向细胞质的蔗糖转化酶。
在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养基包含(i)蔗糖和(ii)蔗糖转化酶。
在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养基包含(i)糖蜜和(ii)蔗糖转化酶。
在另一方面中，本发明涉及含有微生物群体和培养基的微生物培养物，所述培养基包含(i)蔗糖、(ii)木质素和(iii)蔗糖转化酶。
在上文所述的多种微生物培养物中，微生物含有至少一种外源蔗糖利用基因。在一些实施方案中，蔗糖利用基因编码蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡糖激酶或果糖激酶。在一个实施方案中，蔗糖转化酶是微生物群体表达的外源蔗糖转化酶基因编码的可分泌的蔗糖转化酶。在一些情况下，微生物含有至少一种编码脂质途径酶或烃修饰酶的外源基因。
在另一方面中，本发明涉及核酸，所述核酸包含编码蔗糖利用基因的cDNA，和编码赋予抗生素潮霉素或抗生素G418抗性的蛋白质。
在上述多种方法、组合物、细胞、微生物、微生物培养物、发酵罐等等的实施方案中，除非另有说明，微生物可以是微藻、产油酵母、真菌或细菌。在一些情况下，微生物选自表1中所列的微藻。在一些情况下，微生物是小球藻属的物种。在一些情况下，微生物选自Chlorella anitrata、Chlorella antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorellacapsulata、Chlorella desiccata、椭圆小球藻、Chlorella emersonii、Chlorellafusca、Chlorella fusca var.vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorellainfusionum、Chlorella infusionum var.Actophila、Chlorella infusionum var.Auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella luteovividis、Chlorella luteoviridisvar.aureoviridis、Chlorella luteoviridis var.Lutescens、Chlorella miniata、微小小球藻、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、原壳小球藻、Chlorellaregularis、Chlorella regularis var.minima、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorella reisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorellasaccharophila var.ellipsoidea、海水小球藻(Chlorella salina)、Chlorellasimplex、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、小球藻、小球藻、Chlorellavulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.airidis、Chlorella vulgaris var.vulgaris、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis、Chlorella xanthella和Chlorella zofingiensis。在一些情况下，微生物是选自以下的产油酵母：弯曲隐球菌、Cryptococcus terricolus、假丝酵母(Candida sp.)、油脂酵母、产油油脂酵母、Endomycopsis vernalis、红酵母、瘦弱红酵母和解脂亚罗酵母。在一些情况下，微生物是选自以下的真菌：被孢霉属的物种、葡酒色被孢霉、高山被孢霉、德巴利腐霉、卷枝毛霉、赭曲霉、土曲霉、薄青霉、Hensenulo属的物种、毛壳属的物种、枝孢属的物种、畸枝霉属的物种、根霉属的物种和腐霉属的物种。
在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种外源蔗糖利用基因。在一些情况下，蔗糖利用基因编码蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶、己糖激酶、葡糖激酶或果糖激酶。
在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种编码脂质途径酶的外源基因。在一些情况下，脂质途径酶选自硬脂酰-ACP去饱和酶、甘油脂去饱和酶、丙酮酸脱氢酶、乙酰-CoA羧化酶、酰基载体蛋白和甘油-3磷酸酰基转移酶。
在上述多个实施方案中，微生物可含有至少一种编码烃修饰酶的外源基因。在一些情况下，烃修饰酶选自脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶和/或酰基载体蛋白。
可以将上述多种实施方案中任一两个或多个组合在一起，产生包括在本发明范围内的其他实施方案。
附图概述
图1展示了在存在多种类型甘油(含或不含额外的葡萄糖)时培养时，每升多种小球藻属物种和菌株的干细胞重量。
图2展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，每升多种小球藻属物种和菌株的干细胞重量。
图3展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，多种小球藻属物种和菌株的培养物的相对脂质浓度。
图4展示了在存在多种类型甘油(含或不含额外的葡萄糖)时培养时，多种小球藻属物种和菌株的培养物的脂质浓度。
图5展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，两种小球藻属物种和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质，其中甘油在葡萄糖之后顺序添加。
图6展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，两种小球藻属物种和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质。
图7展示了在存在2％葡萄糖和1％葡萄糖+1％试剂级甘油时培养时，多种小球藻属物种和菌株的培养物的相对脂质浓度。
图8展示了在存在葡萄糖(含或不含试剂级甘油)时培养时，多种小球藻属物种和菌株的作为干细胞重量百分比的脂质，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
图9展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，多种小球藻属物种和菌株培养物的相对脂质浓度，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
图10展示了在存在多种类型甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，每升多种小球藻属物种和菌株的干细胞重量，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
图11(a)展示了在存在葡萄糖、试剂级甘油、未酸化的生物柴油副产物甘油、以及甘油和葡萄糖的组合时培养时，钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的作为干细胞重量百分比的脂质。
图11(b)展示了在存在多种类型的甘油和存在甘油与葡萄糖的组合时培养时，Navicula pelliculosa的作为干细胞重量百分比的脂质。
图12(a)展示了在存在多种类型的甘油和存在甘油与葡萄糖的组合时培养时，被甲栅藻(Scenedesmus armatus)的作为干细胞重量百分比的脂质。
图12(b)展示了在存在多种类型甘油和存在生物柴油副产物甘油与葡萄糖的组合时培养时，每升被甲栅藻的干细胞重量。
图13展示了在存在多种类型甘油和存在未酸化的生物柴油副产物甘油与葡萄糖的组合时培养时，每升Navicula pelliculosa的干细胞重量。
图14展示了在存在酸化和未酸化的生物柴油副产物甘油(含额外的葡萄糖)时培养时，每升被甲栅藻和Navicula pelliculosa的干细胞重量，其中甘油与葡萄糖顺序添加或组合添加。
图15展示了与单独的木糖或葡萄糖相比，木糖和葡萄糖的组合对小球藻属生长的协同效应。
图16展示了含有外源基因的原壳小球藻转化体的基因分型。
图17展示了原壳小球藻的密码子选择。
图18展示了盐生杜氏藻(D.salina)和蛋白核小球藻的密码子选择。
图19展示了(a)试剂级甘油；(b)未酸化的生物柴油副产物甘油；和(c)酸化的生物柴油副产物甘油，其均用于实施例中所述的实验中。
图20展示了原壳小球藻在葡萄糖和果糖上的生长。
图21展示了Chlorella fusca在1％蔗糖上的生长。
图22展示了Chlorella kessleri在1％蔗糖上的生长。
图23展示了在存在葡萄糖、蔗糖或若干糖蜜样品(称作BS1、BS2和HTM)之一时，在存在或不存在蔗糖转化酶时培养时，每升原壳小球藻的干细胞重量。
图24展示了在存在葡萄糖、蔗糖或若干糖蜜样品(称作BS1、BS2和HTM)之一时，在存在或不存在蔗糖转化酶时培养时，通过相对细胞密度测量的原壳小球藻的生长。
图25展示了酵母转化酶(SUC2)的多种质粒构建体的图解，所述构建体具有三种不同的启动子(称作CMV、CV和HUP1)以及用于亚克隆的限制性位点。
图26展示了在黑暗中于蔗糖上选择的含有外源蔗糖转化酶基因的原壳小球藻转化体的基因分型。
图27展示了用下述基因转化的原壳小球藻细胞的基因分型，所述基因编码来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的分泌型蔗糖转化酶。
图28展示了用下述基因转化的微小小球藻和Chlorella emersonii细胞的基因分型，所述基因编码来自酿酒酵母的分泌型蔗糖转化酶。
图29图解了气相色谱，所述气相色谱通过分析根据本发明方法产生并在实施例27中描述的可再生柴油产物获得。
图30图解了根据本发明的方法产生并在实施例27中描述的可再生柴油产物的沸点分布曲线。
发明详述
I.定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义。以下的参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton et al.，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology(第2版.1994)；The Cambridge Dictionary of Scienceand Technology(Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等(编辑)，Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham，The HarperCollins Dictionary of Biology(1991)。除非另有说明，在本文中使用时，以下术语具有归属于它们的含义。
关于核酸使用时，“在微藻中有活性”是指在微藻中有功能的核酸。例如，用于驱动抗生素抗性基因的启动子在微藻中有活性，所述抗生素抗性基因对转基因微藻赋予抗生素抗性。在微藻中有活性的启动子的例子是对某些藻类物种而言内源性的启动子，和存在于植物病毒中的启动子。
“酰基载体蛋白”或“ACP”是一种蛋白质，其在脂肪酸合成期间作为硫酯在4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远侧巯基上与延长的酰基链结合，并且包含脂肪酸合酶复合体的组件。涉及与脂肪酰基-ACP硫酯酶结合的酰基载体蛋白时，短语“天然地共表达”表示ACP和硫酯酶天然地在它们来源的组织或生物中共表达，例如因为编码这两种酶的基因处于共同调节序列的控制下，或者因为它们应答相同的刺激而表达。
“酰基-CoA分子”或“酰基-CoA”是下述分子，其在辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺部分的远侧巯基上包含通过硫酯键与辅酶A共价结合的酰基部分。
“无菌的”表示培养物或生物不被其他活生物污染。
“生物柴油”是生物生产的、适合在柴油引擎中用作燃料的脂肪酸烷基酯。
术语“生物量”表示通过细胞的生长和/或繁殖产生的材料。生物量可含有细胞和/或细胞内含物以及细胞外材料。细胞外材料包括但不仅限于细胞分泌的化合物。
“生物反应器”表示其中培养细胞的封闭容器(enclosure)或部分封闭的容器，所述细胞任选地在悬浮液中培养。
在本文中使用时，“催化剂”表示能够方便或促进反应物到产物的化学反应而不成为产物一部分的物质，例如分子或大分子复合物。因此，催化剂提高反应的速率，之后催化剂可作用于另一反应物，形成产物。催化剂通常降低反应所需的总体活化能，使得反应进展更快或者在更低的温度下进行。因此，可以更快地达到反应平衡。催化剂的例子包括酶(其为生物催化剂)、热(其为非生物催化剂)和石油精炼过程中使用的金属催化剂。
“纤维素材料”表示纤维素消化的产物，包括葡萄糖和木糖，并任选地包括其他化合物例如二糖、寡糖、木质素、糠醛和其他化合物。纤维素材料来源的非限制性例子包括甘蔗渣、甜菜浆、玉米秆、木片、锯屑和柳枝稷。
术语“共同培养”或其变型表示相同的生物反应器中存在两种或更多类型的细胞。两种或更多类型的细胞可以均为微生物，例如微藻，或者可以是具有不同细胞类型的培养的微藻细胞。培养条件可以是促进两种或更多细胞类型生长和/或繁殖的条件，或者促进两种或更多细胞中一种或一亚类的生长和/或增殖同时维持剩余部分细胞生长的条件。
术语“辅因子”在本文中用于表示酶发挥其酶活性所需的、除底物外的任一分子。
在本文中使用时，“互补DNA”(“cDNA”)是mRNA的DNA表述，通常通过信使RNA(mRNA)的反转录或扩增(例如通过聚合酶链式反应(“PCR”))获得。
术语“培养的”及其变型表示通过使用有意的培养条件，有意地加强一种或多种细胞的生长(提高细胞尺寸、细胞内含物和/或细胞活性)和/或繁殖(通过有丝分裂提高细胞数)。生长和繁殖二者的组合可以称作增殖。一种或多种细胞可以是微生物细胞，例如微藻细胞。有意的条件的例子包括使用确定成分培养基(具有已知的特征，例如pH、离子强度和碳源)、特定的温度、氧张力、二氧化碳水平和在生物反应器中的生长。该术语不涉及天然的或者没有直接人工干预的微生物的生长或繁殖，例如生物的天然生长，所述生物最终变为化石，产生地质学原油。
在本文中使用时，术语“细胞溶解”表示低渗环境中的细胞裂解。细胞溶解由朝向细胞内的过量渗透作用或水的移动引起(水分过多)。细胞不能够承受内部水的渗透压，因此爆裂。
在本文中使用时，术语“表达载体”或“表达构建体”表示重组或合成产生的核酸构建体，其具有一系列特定的核酸元件，所述元件允许在宿主细胞中转录具体的核酸。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包含与启动子有效连接的待转录的核酸。
“外源基因”表示被转化进细胞中的核酸。经转化的细胞可表示可以向其中引入额外的外源基因的重组细胞。外源基因可以来自相对于被转化的细胞而言不同的物种(并因此是异源的)，或者来自相同的物种(并因此是同源的)。在同源基因的情况下，其相对于基因的内源拷贝而言占据了细胞基因组中不同的位置。外源基因可以以多于一个拷贝存在于细胞中。外源基因可以作为基因组的插入物或者作为附加体分子而在细胞中维持。
“外源提供的”描述了被提供给细胞培养物的培养基的分子。
在本文中使用时，“脂肪酰基-ACP硫酯酶”是在脂质合成期间催化从酰基载体蛋白(ACP)上切割脂肪酸的酶。
在本文中使用时，“脂肪酰基-CoA/醛还原酶”是催化酰基-CoA分子还原成为伯醇的酶。
在本文中使用时，“脂肪酰基-CoA还原酶”是催化酰基-CoA分子还原成为醛的酶。
在本文中使用时，“脂肪醛脱羰基酶”是催化脂肪醛转化成为烷的酶。
在本文中使用时，“脂肪醛还原酶”是催化醛还原成为伯醇的酶。
“固定碳源”表示在室温和压强下为固体或液体形式的含碳分子，优选地为有机分子。
在本文中使用时，“真菌”表示异养型生物，其特征是来自真菌界的甲壳质细胞壁。
“匀浆”表示被物理破裂的生物量。
在本文中使用时，“烃”表示：(a)仅含有氢和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成线性、分支、环状或部分环状的主链，氢原子与所述主链结合；或(b)仅主要含有氢和碳原子、并且可以通过一到四个化学反应被转化为仅含有氢和碳原子的分子。后者的非限制性例子包括在一个碳原子和一个氢原子之间含有氧原子从而形成醇分子的烃，以及含有单个氧原子的醛。用于将醇还原为仅含碳原子和氢原子的烃的方法是公知的。烃的另一例子是酯，其中有机基团代替含氧酸中的氢原子(或多于一个氢原子)。烃化合物的分子结构从最简单的甲烷形式(CH4)(天然气的组分)到非常重和非常复杂的形式(例如一些分子，例如原油、石油和沥青中存在的沥青质)变化。烃可以是气体、液体或固体形式，或这些形式的任一组合，并可在主链中相邻碳原子之间具有一个或多个双键或三键。因此，该术语包括线性、分支、环状或部分环状的烷、烯、脂质和石蜡。例子包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷、三油精(triolein)和鲨烯。
“烃修饰酶”是指改变烃共价结构的酶。烃修饰酶的例子包括脂肪酶、脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶和脂肪醛脱羰基酶。烃修饰酶的酶活性产生的化合物在本文中可与烃或脂质互换，所述化合物包括脂肪酸、醇、醛、烷或来自其中的其他化合物。
术语“氢∶碳比例”是指以原子比原子为基础，分子中氢原子与碳原子的比例。该比例可用于表示烃分子中碳原子和氢原子的数量。例如，具有最高比例的烃为甲烷CH4(4∶1)。
“疏水级分”是指与水性相相比，在疏水相中更易溶的材料的部分或级分。疏水级分在水中基本不溶，并且通常是非极性的。
在本文中使用时，短语“提高脂质产量”是指通过例如提高每升培养物的细胞干重，提高构成脂质的细胞百分比，或提高每单位时间每升培养物体积的总体脂质量，提高微生物培养物的生产力。
“诱导型启动子”是应答具体的刺激，介导有效连接的基因转录的启动子。
在本文中使用时，“有效连接”是指两条序列，例如控制序列(通常为启动子)和所连接的序列之间的功能性连接。如果启动子能够介导基因的转录，则启动子与外源基因有效连接。
术语“原位”表示“在适当的地方(in place)”或“在其原始的位置”。例如，培养物可含有分泌催化剂的第一微藻和分泌底物的第二微生物，其中第一和第二细胞类型生产具体化学反应在共培养物中原位发生所需要的组分，而不需要将材料进一步分离或加工。
“养分的限制浓度(limiting concentration)”是指培养物中限制所培养的生物繁殖的浓度。“养分的非限制浓度(non-limiting concentration)”是指在给定的培养周期期间支持最大繁殖的浓度。因此，与养分是非限制性时相比，存在限制浓度的养分时，在给定的培养周期期间生产的细胞数更低。当养分以高于支持最大繁殖的浓度存在时，称作培养物中养分“过量”。
在本文中使用时，“脂肪酶”是催化不溶于水的脂质底物中酯键水解的水溶性酶。脂肪酶催化脂质水解为甘油和脂肪酸。
在本文中使用，“脂质途径酶”是在脂质代谢中起作用的任一酶，所述脂质代谢即脂质合成、修饰或降解之任一种。该术语包括化学修饰脂质的蛋白质以及载体蛋白。
“脂质”是一类烃，其在非极性溶剂(例如醚和氯仿)中可溶，并且在水中相对或完全不溶。脂质分子具有这些特性是因为它们主要由天然疏水的长烃尾组成。脂质的例子包括脂肪酸(饱和和不饱和)；甘油酯或甘油脂(例如甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯或中性脂肪，和磷酸甘油酯或甘油磷酸脂)；非甘油酯(nonglycerides)(鞘脂类，包括胆固醇和类固醇激素的甾醇脂质，包括萜类的异戊烯醇脂质，脂肪醇，蜡和聚酮化合物)；和复合脂质衍生物(与糖连接的脂质，或糖脂，和与蛋白质连接的脂质)。“脂肪”是称作“三酰基甘油酯”的脂质亚类。
在本文中使用时，术语“裂解物”是指含有裂解的细胞内含物的溶液。
在本文中使用时，术语“裂解(名词)”是指生物的质膜和任选的细胞壁的破裂，所述破裂足以释放至少一些细胞内内含物，其通常通过破坏细胞完整性的机械、病毒或渗透机制实现。
在本文中使用时，术语“裂解(动词)”表示破坏生物或细胞的细胞膜并任选地破坏细胞壁，所述破坏足以释放至少一些细胞内内含物。
“微藻”表示含有叶绿体并任选地能够进行光合作用的真核微生物，或能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性光能自养生物，以及能够在完全没有固定碳源时生存的异养生物。微藻可表示在细胞分裂后与姐妹细胞分开的单细胞生物如衣藻属(Chlamydomonas)，也可以表示微生物例如团藻属(Volvox)，其为两种不同细胞类型的简单的多细胞光合微生物。“微藻”也可以表示细胞例如小球藻属和杜氏藻属(Dunaliella)。“微藻”还包括显示细胞-细胞黏着的其他微生物光合生物，例如阿格藻属(Agmenellum)、鱼腥藻属(Anabaena)和桑葚藻属(Pyrobotrys)。“微藻”还包括丧失了进行光合作用的能力的专性异养微生物，例如某些甲藻藻类物种。
术语“微生物”在本文中表示微观的单细胞生物。
在本文中使用时，“产油酵母”表示下述酵母，其天然能够将其干细胞重量的多于10％作为脂质累积，或者由于遗传改造而能够将其干细胞重量的多于10％作为脂质累积。产油酵母包括生物例如解脂亚罗酵母，以及经改造的酵母菌株，例如被改造为将其干细胞重量的多于10％作为脂质累积的酿酒酵母。
在本文中使用时，术语“渗透休克”是指在渗透压突然降低后细胞在溶液中的破裂。有时诱导渗透休克，从而将这类细胞的细胞组分释放进溶液中。
“光生物反应器”是指下述容器，至少其部分是部分透明的或部分开放的，从而允许光通过，其中培养一种或多种微藻细胞。光生物反应器可以是闭合的，如在聚乙烯袋或锥形瓶的情况下，或者可以是对环境开放的，如在露天池塘的情况下。
在本文中使用时，“多糖降解酶”表示能够催化任一多糖的水解或解聚的任一酶。例如，纤维素酶催化纤维素的水解。
“多糖”(也称作“聚糖”)是由通过糖苷键连接在一起的单糖组成的碳水化合物。纤维素是多糖的一个例子，其组成某些植物细胞壁。可以通过酶将纤维素解聚，得到单糖例如木糖和葡萄糖，以及更大的二糖和寡糖。
在生物反应器的语境中，“口”表示生物反应器上的开口，其允许材料例如气体、液体和细胞的输入和输出。口通常与从光生物反应器导出的管道连接。
“启动子”被定义为指导核酸转录的一组核酸控制序列。在本文中使用时，启动子包含接近转录起点的必需核酸序列，例如在聚合酶II型启动子的情况下，包含TATA元件。启动子还任选地含有远端增强子或阻抑子元件，其可处于距离转录起点多达数千碱基对处。
在本文中涉及例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组的”表示通过引入外源核酸或蛋白质或改变天然的核酸或蛋白质修饰细胞、核酸、蛋白质或载体，或者细胞来自于如此被修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达该细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因，或者表达否则异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。术语“重组核酸”在本文中表示核酸，其一般通过核酸的操作，例如使用聚合酶和内切核酸酶最初体外形成，为天然不存在的形式。藉此实现了不同序列的有效连接。因此就本发明的目的而言，通过连接通常不相连的DNA分子而体外形成的线性形式的分离的核酸或表达载体均被认为是重组的。应当理解，一旦制备了重组核酸并将其再次引入宿主细胞或生物中，则其会非重组地复制，即使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，一旦重组生产了这类核酸，尽管其随后非重组地复制，但是就本发明的目的而言仍然认为其是重组的。类似地，“重组蛋白质”是使用重组技术制造的蛋白质，即通过表达如上文所述的重组核苷酸而制造的蛋白质。
在本文中使用时，术语“可再生的柴油”是指通过脂质的氢化和脱氧生产的烷烃(例如C：10:0、C12:0、C：14:0、C16:0和C18:0)。
在本文中使用时，术语“声波破碎”是指通过使用声波能量破坏生物材料，例如细胞的方法。
“糠醛种类”是指2-呋喃甲醛(2-Furancarboxaldehyde)或其衍生物，所述衍生物保留相同的基本结构特征。
在本文中使用时，“秸杆”表示在收获谷粒后剩余的干燥的农作物茎和叶。
“蔗糖利用基因”是这样的基因，所述基因表达时有助于细胞利用蔗糖作为能源的能力。蔗糖利用基因编码的蛋白质在本文中称作“蔗糖利用酶”，并且包括蔗糖转运蛋白、蔗糖转化酶和己糖激酶，例如葡萄糖激酶和果糖激酶。
“废水”是水样废弃物，其通常包含洗涤水、洗衣废弃物、粪便、尿和其他液体或半液体废弃物。其包含一些形式的市政废弃物以及经二级处理的污水。
为了进行序列比较来测定核苷酸或氨基酸同一性百分比，通常使用一条序列作为参照序列，将测试序列与之比较。使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机中，在需要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法以指定的程序参数为基础，计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。
用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目检(一般见上文Ausubel等)进行。
适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的另一个示例算法是BLAST算法，其描述于Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中。公众可通过国家生物信息学中心(网址www.ncbi.nlm.nih.gov)获得用于进行BLAST分析的软件。该算法涉及：首先通过在查询序列中鉴定长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSPs)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或者满足一些正值的阈值评分T。T是指邻域字评分阈值(上文Altschul等)。这些初始邻域字命中发挥种子的作用启动搜索，以寻找含有它们的更长的HSP。然后该字命中沿着每条序列在两个方向上延伸，远至能够提高累积比对评分。对核苷酸序列而言，累积评分使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算。对氨基酸序列而言，使用评分矩阵计算累积评分。在以下情况下停止每个方向上字命中的延伸：累积比对评分比其达到的最大值降低数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积评分达到或低于零；或达到任一序列的末端。为了鉴定核酸或多肽是否在本发明的范围内，BLAST程序的默认参数是合适的。BLASTN程序(对核苷酸序列而言)使用11的字长(W)，10的期望(E)，M＝5，N＝-4和两条链的比较作为默认值。对氨基酸序列而言，BLASTP程序使用3的字长(W)，10的期望(E)和BLOSUM62评分矩阵作为默认值。TBLATN程序(使用核苷酸序列的蛋白质序列)使用3的字长(W)，10的期望(E)和BLOSUM 62评分矩阵作为默认值。(见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。
除了计算百分比序列同一性以外，BLAST算法还进行两条序列之间相似性的统计学分析(见例如Karlin&Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间随机发生匹配的概率的指征。例如，如果测试核酸与参照核酸的比较中的最小总和概率少于约0.1，更优选地少于约0.01，最优选地少于约0.001时，则核酸被认为与参照序列相似。
II.概述
本发明部分以下述观点为基础：某些微生物能够被用于经济和大量地生产油、燃料，和其他烃或脂质组合物，以用于运输燃料、石油化学工业和/或食品和化妆品工业，以及其他应用中。合适的微生物包括微藻、产油酵母和真菌。用于本发明的微藻的一个优选的属是生产脂质的微藻小球藻属。脂质的酯交换产生可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。其他酶方法和化学方法可被定制为产生脂肪酸、醛、醇、烷烃和烯烃。本申请描述了对多种微生物物种和菌株(包括小球藻属和类似的微生物)进行遗传修饰以提供具有下述特征的生物的方法，所述特征促进适用于转化成为油、燃料和油类化学品(oleochemicals)的脂质的生产。在一些应用中，生产可再生的柴油、喷气式发动机燃料或其他烃类化合物。本申请还描述了为了提高的生产力和提高的脂质产量和/或更经济地生产本文所述组合物而培养微藻的方法。
在具体的实施方案中，本申请描述了用一种或多种外源基因对微藻菌株进行遗传改造。例如，可以将生产高水平的适用于生物柴油的三酰甘油(TAGs)的微藻改造为表达脂肪酶，所述脂肪酶能够促进微藻TAG的酯交换。可以使用诱导型启动子任选地表达脂肪酶，从而可以将细胞在发酵罐中首先培养至想要的密度，然后收获，之后通过诱导启动子来表达脂肪酶，任选地在足量醇的存在下表达脂肪酶，以驱动TAG转化成为脂肪酸酯。
一些微藻脂质被隔离在细胞膜和细胞的其他非水性部分中。因此，为了提高酯交换反应的产率，将细胞裂解从而提高脂肪酶对脂质的可及性会是有益的。细胞破裂可以例如通过添加加压蒸汽机械地进行，或通过使用裂解微藻细胞的病毒、表达在细胞中产生裂解蛋白质的基因、或用裂解微藻细胞的试剂处理培养物进行。为了细胞破裂对微藻的蒸汽处理描述于例如美国专利6,750,048中。
本文还公开了对生产高水平TAG的微藻进行遗传改造，从而表达裂解微藻细胞的基因，例如来自裂解病毒的基因。该基因可使用诱导型启动子表达，从而可以将细胞在发酵罐中首先培养至想要的密度，然后收获，之后通过启动子的诱导表达该基因，以裂解细胞。例如可以表达编码多糖降解酶的基因，从而裂解细胞。
任选地，脂肪酶可以在细胞内区室中表达，在那里其保持与大部分微藻脂质分离直至酯交换。通常，优选在从制备物中基本去除水和/或添加过量醇之后进行酯交换。在酯交换中脂肪酶能够使用水以及醇作为底物。使用水时，脂质与羟基部分缀合产生极性脂肪酸而不是酯。使用醇例如甲醇时，脂质与甲基缀合，产生非极性脂肪酸酯，所述非极性脂肪酸酯通常是运输燃料所优选的。为了在条件适合酯交换生产脂肪酸酯之前限制脂肪酶与微藻脂质的接触，可以使脂肪酶例如在叶绿体、线粒体或其他细胞器中表达。该区室化的表达导致脂肪酶与大部分细胞脂质隔绝，直至细胞破裂。
在其他具体的实施方案中，本申请描述了用一种或多种外源基因遗传改造微藻、产油酵母、细菌或真菌的菌株，以生产多种烃类化合物。例如，可以将天然或者通过遗传修饰生产高水平脂质的微藻改造(或进一步改造)为表达外源脂肪酰基-ACP硫酯酶，所述酶能够在脂质合成期间促进从酰基载体蛋白(ACP)上切割脂肪酸。这些脂肪酸可以被回收，或者通过细胞内的进一步酶加工产生其他烃类化合物。任选地，脂肪酰基-ACP硫酯酶可以从与诱导型启动子有效连接的基因表达，和/或可以在细胞内区室中表达。
脂肪酰基-ACP硫酯酶可以根据其对(在脂肪酸合成期间)延长的具有特定碳链长度的脂肪酸的特异性来选择。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可对范围从8到34个碳原子，优选地从8到18个碳原子，最优选地10到14个碳原子的碳链长度具有特异性。最优选的是对具有12个碳原子的脂肪酸的特异性。
本发明还提供了经遗传改造的微藻菌株，其表达一种或多种外源基因，所述外源基因例如为脂肪酶和裂解酶，例如编码多糖降解酶的基因。可使用诱导型启动子表达一种或两种基因，所述诱导型启动子允许控制这些基因表达的相对时间选择，从而增强脂质产率和向脂肪酸酯的转化。本发明还提供了用于将生产脂质的微生物改造为代谢蔗糖的载体和方法，代谢蔗糖是一种有利的性状，因为它允许经改造的细胞将甘蔗或其他原料转化为适用于生产油、燃料、油类化学品等等的脂质。
在其他实施方案中，本发明提供了遗传改造的微生物(例如微藻、产油酵母、细菌或真菌)菌株，其表达两种或更多外源基因，例如脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶，它们的组合作用产生醇产物。本发明还提供了外源基因的其他组合，包括但不限于，脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白，用于产生长度特异性脂肪酸，或脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA还原酶，用于产生醛。本发明还提供了脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合，用于产生烷烃或烯烃。可以使用诱导型启动子表达一种或多种外源基因。
本发明还提供了微藻的修饰，例如用于对微藻提供想要的生长特征和/或用于增强产生的脂质量和/或品质。例如，可以将微藻改造为提高进入脂质途径的碳通量和/或修饰脂质途径从而有益地改变细胞产生的脂质的比例或特性。
本申请公开了微藻的遗传改造菌株，其表达两种或更多外源基因，一种编码固定碳源(例如蔗糖)的转运蛋白，第二种编码蔗糖转化酶。与可通过先前已知的生物烃生产方法获得的制造成本相比，得到的可发酵的生物以更低的制造成本生产烃。上述两种外源基因的插入可以与定向诱变和/或随机诱变对多糖生物合成的破坏组合，这将驱动甚至更大的碳通量进入烃生产。食性转化(trophic conversion)、为了改变烃生产而改造、和用外源酶处理，这三者各自或者组合地改变了微生物所生产的烃组合物。该改变可以是生产的烃量、生产的一种或多种烃种类相对于其他烃的量和/或微生物中生产的烃种类类型的改变。例如，可以将微藻改造为生产更大量和/或更高百分比的TAG。
III.生产油或生产脂质的微生物
可以使用生产合适的脂质或烃的任一物种的生物，尽管优选天然生产高水平的合适脂质或烃的微生物。微生物对烃的生产由Metzger等，ApplMicrobiol Biotechnol(2005)66：486-496和A Look Back at the U.S.Department of Energy’s Aquatic Species Program：Biodiesel from Algae，NREL/TP-580-24190，John Sheehan，Terri Dunahay，John Benemann andPaul Roessler(1998)综述。
除了用于生产油、燃料和油类化学品的合适脂质或烃的生产以外，影响本发明中使用的微生物选择的考虑还包括：(1)作为细胞重量百分比的高脂质含量；(2)容易生长；(3)容易遗传改造；和(4)容易进行生物量加工。在具体的实施方案中，野生型或经遗传修饰的微生物产生至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％或更多为脂质的细胞。优选的生物(在不存在光时在糖上)异养生长，或者能够使用例如本文公开的方法被改造为异养生长。转化的容易性和选择标记和在微生物中有功能的组成型和/或诱导型启动子可得性，使得易于进行遗传改造。加工考虑可包括例如裂解细胞的有效手段的可用性。
A.藻类
在本发明的一个实施方案中，微生物是微藻。根据本发明的方法可以使用的微藻的非限制性例子展示于表1中。
表1.微藻的例子。
东方曲壳藻(Achnanthes orientalis)、阿格藻属(Agmenellum)、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformislinea、Amphora coffeiformis punctata、Amphora coffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphoradelicatissima capitata、双眉藻属物种(Amphora sp.)、鱼腥藻属(Anabaena)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、镰形纤维藻(Ankistrodesmusfalcatus)、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、Botryococcus sudeticus、Bracteococcus minor、Bracteococcus medion ucleatus、四鞭藻属(Carteria)、纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muellri)、Chaetoceros muelleri subsalsum、角毛藻属物种(Chaetoceros sp.)、Chlorella anitrata、Chlorella antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、椭圆小球藻、Chlorella emersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var.
vacuolata、Chlorella glucotropha、Chlorella infusionum、Chlorellainfusionum var.Actophila、Chlorella infusionum var.Auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorella lobophora(菌株SAG 37.88)、Chlorellaluteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorellaluteoviridis var.Lutescens、Chlorella miniata、微小小球藻、Chlorellamutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella ovalis、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、原壳小球藻(包括UTEX株1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25中任一种)、Chlorella protothecoides var.acidicola、Chlorella regularis、Chlorellaregularis var.minima、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorellareisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var.ellipsoidea、海水小球藻、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、小球藻属物种、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、普通小球藻、Chlorella vulgaris f.tertia、Chlorellavulgaris var.autotrophica、Chlorella vulgaris var.viridis、Chlorellavulgaris var.vulgaris、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis、Chlorella xanthella、Chlorellazofingiensis、Chlorella trebouxioides、普通小球藻、水溪绿球藻(Chlorococcum infusionum)、绿球藻属物种(Chlorococcum sp.)、绿梭藻属(Chlorogonium)、蓝隐藻属物种(Chroomonas sp.)、金球藻属物种(Chrysosphaera sp.)、球钙板藻属物种(Cricosphaera sp.)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、隐藻属物种(Cryptomonas sp.)、Cyclotellacryptica、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)、小环藻属物种(Cyclotella sp.)、杜氏藻属物种、巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)、Dunaliella bioculata、Dunaliella gtanulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、巴夫杜氏藻(Dunaliella parva)、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、Dunaliellaterricola、Dunaliella tertiolecta、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、
Dunaliella tertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、裸藻属(Euglena)、被刺藻属物种(Franceia sp.)、克罗脆杆藻(Fragilaria crotonensis)、脆杆藻属物种(Fragilaria sp.)、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、等鞭金藻大溪地株(Isochrysis aff.galbana)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微芒藻属(Micractinium)、微芒藻属(UTEX LB2614)、细小单针藻(Monoraphidium minutum)、单针藻属物种(Monoraphidium sp.)、Nannochloris sp.、微拟球藻(Nannochloropsissalina)、Nannochloropsis sp.、适意舟形藻(Navicula acceptata)、Navicula biskanterae、Navicula pseudotenelloides、Naviculapelliculosa、Navicula saprophila、舟形藻属物种(Navicula sp.)、Nephrochloris sp.、肾爿藻属物种(Nephroselmis sp.)、Nitschiacommunis、亚历山大菱形藻(Nitzschia alexandrina)、普通菱形藻(Nitzschia communis)、细端菱形藻(Nitzschia dissipata)、碎片菱形藻(Nitzschia frustulum)、汉氏菱形藻(Nitzschia hantxschiana)、Nitzschiainconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、微小菱形藻(Nitzschia pusilla)、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusillamonoensis、Nitzschia quadrangular、菱形藻属物种(Nitzschia sp.)、棕鞭藻属物种(Ochromonas sp.)、小形卵囊藻(Oocystis parva)、Oocystispusilla、卵囊藻属物种(Oocystis sp.)、淡水颤藻(Oscillatoris limnetica)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、较短颤藻(Oscillatoria subbrevis)、Parachlorella kessleri、Pascheria acidophila、巴夫藻属物种(Pavlovasp.)、Phagus、席藻属(Phormidium)、扁藻属物种(Platymonas sp.)、Pleurochrysis carterae、Pleurochrysis dentate、颗石藻属物种(Pleurochrysis sp.)、魏氏原壁菌(Prototheca wickerhamii)、Protothecastagnora、Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis、饶氏原壁菌(Prototheca zopfii)、Pseudochlorella aquatica、Pyramimonas sp.、桑椹藻属(Pyrobotrys)、不透明红球菌(Rhodococcus opacus)、Sarcinoid
chrysophyte、被甲栅藻、Schizochytrium、水绵属(Spirogyra)、钝顶螺旋藻、裂丝藻属物种(Stichococcus sp.)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、四角藻属(Tetraedron)、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)和Viridiellafridericiana
1.小球藻属
在本发明的一个优选的实施方案中，微生物属于小球藻属，优选地为原壳小球藻、椭圆小球藻、微小小球藻或Chlorella emersonii。
小球藻属是单细胞绿藻的一个属，其属于绿藻门(Chlorophyta)。其形状是球形，直径约2到10μm，并且没有鞭毛。小球藻属的一些物种天然是异养的。
小球藻属，尤其是原壳小球藻，是用于本发明的优选的微生物，因为其有高的脂质组成，尤其是高的适用于生物柴油的长链脂质组成。另外，该微藻异养生长，并且能够如本文的实施例中所述被遗传改造。
在本发明的一个优选的实施方案中，用于表达转基因的微生物属于小球藻属，优选地为原壳小球藻、微小小球藻或Chlorella emersonii。转基因在例如小球藻属中表达的例子可见于文献中(见例如Current Microbiology第35卷(1997)，第356-362页；Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.2000Jul；16(4)：443-6；Current Microbiology第38卷(1999)，第335-341卷；ApplMicrobiol Biotechnol(2006)72：197-205；Marine Biotechnology 4，63-73，2002；Current Genetics 39：5，365-370(2001)；Plant Cell Reports 18：9，778-780，(1999)；Biologia Plantarium 42(2)：209-216，(1999)；Plant Pathol.J21(1)：13-20，(2005))。还见本文的实施例。其他生产脂质的微藻也可以被改造，包括原核的微藻(见Kalscheuer等，Applied Microbiology andBiotechnology，第52卷，第4期/October，1999)。
2.小球藻属物种的鉴定
可以通过扩增基因组的某些靶区域，鉴定用于本发明中的小球藻属物种。例如，可以通过使用引物对细胞核和/或叶绿体DNA的扩增和测序，和使用基因组任一区域的方法，例如使用Wu等，Bot.Bull.Acad.Sin.(2001)42：115-121 Identification of Chlorella spp.isolates using ribosomalDNA sequences中所述的方法，实现对特异的小球藻属物种或菌株的鉴定。本领域技术人员可以使用公认的系统进化分析方法，例如核糖体内部转录间隔区(ITS1和ITS2 rDNA)、18S rRNA和其他保守的基因组区域的扩增和测序，来鉴定小球藻属物种以及能够使用本文公开的方法的其他生产烃和脂质的生物。藻类的鉴定和分类方法的例子也参见例如Genetics，2005Aug；170(4)：160110和RNA，2005 Apr；11(4)：361-4。
B.产油酵母
在本发明的一个实施方案中，微生物是产油酵母。根据本发明可以使用的产油酵母的非限制性例子可见于表2中。
表2.产油酵母的例子。
弯曲隐球菌、Cryptococcus terricolus、假丝酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母、Endomycopsis vernalis、胶红类酵母菌、瘦弱红酵母和解脂亚罗酵母
C.其他真菌
在本发明的一个实施方案中，微生物是真菌。根据本发明可以使用的真菌的非限制性例子可见于表3中。
表3.真菌的例子。
被孢霉属、葡酒色被孢霉、高山被孢霉、德巴利腐霉、卷枝毛霉、赭曲霉、土曲霉、薄青霉、Hensenulo、毛壳、枝孢、Malbranchea、根霉和腐霉
D.细菌
在本发明的一个实施方案中，微生物是细菌。
在细菌例如大肠杆菌中表达外源基因的例子是公知的；参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等(第3版，2001，ColdSpring Harbor Press)。
IV.培养微生物的方法
为了进行遗传操作和为了随后生产烃(例如脂质、脂肪酸、醛、醇和烷)的两个目的，培养微生物。前一种类型的培养小规模进行，并且至少最初在初始微生物能够生长的条件下进行。例如，如果初始微生物是光自养生物，则初始培养在存在光时进行。如果微生物被演化或改造为不依赖于光生长，则可以改变培养条件。用于烃生产目的的培养通常大规模进行。优选存在固定碳源。培养物也可以在一些时间或所有时间中暴露于光。
微藻可以在液体培养基中培养。培养物可以包含在生物反应器中。任选地，生物反应器不允许光进入。或者微藻也可以在光生物反应器中进行，所述光生物反应器含有固定碳源并且允许光到达细胞。然而与在暗中培养细胞相比，将微藻细胞暴露于光会加速生长，甚至在存在细胞转运并利用的固定碳源(即兼养生长)时也是如此。可以操纵培养条件参数以优化总烃生产、生产的烃种类的组合和/或烃种类的生产。在一些情况下，优选在暗中培养细胞，例如当使用不允许光到达细胞的极大(40,000升及以上)发酵罐时。
微藻培养基通常含有组分例如固定氮源、微量元素，任选地含有用于维持pH的缓冲液和磷酸盐。其他组分可包括固定碳源例如乙酸盐或葡萄糖，和盐例如氯化钠，尤其是对海水微藻而言。微量元素的例子包括锌、硼、钴、铜、锰和钼，例如其形式分别为ZnCl2、H3BO3、CoCl2·6H2O、CuCl2·2H2O、MnCl2·4H2O和(NH4)6Mo7O24·4H2O。
对于能够在固定碳源上生长的生物而言，固定碳源可以是例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡萄糖胺、甘油、弗罗里多苷(floridoside)和/或葡糖醛酸。可以通过至少约50μM、至少约100μM、至少约500μM、至少约5mM、至少约50mM和至少约500mM的至少一种或多种外源提供的固定碳源，提供一种或多种固定碳源。一些微藻物种能够在没有光时通过利用固定碳源例如葡萄糖或乙酸盐而生长。这类生长已知为异养生长。例如对原壳小球藻而言，异养生长导致大量生产生物量并在细胞中累积大量脂质含量。
一些微生物天然地在固定碳源上生长或者能够被改造成这样，所述固定碳源是异源化合物来源，例如市政废弃物、经二级处理的污水、废水和固定碳和其他养分例如硫酸盐、磷酸盐和硝酸盐的其他来源。污水组分在烃的生产中发挥养分来源的作用，并且培养物提供了廉价的烃来源。
也可以操纵其他培养参数例如培养基的pH、微量元素的身份和浓度和其他培养基组分。
A.光合生长
微藻可以在存在光时生长。可以操纵到达微藻细胞培养物的光子数量，以及其他参数例如波长谱和每天的暗：光小时比例。也可以在自然光中以及自然光和人造光的同时组合和/或交替组合中培养微藻。例如，小球藻属的微藻可以白天在自然光下，夜间在人造光下培养。
可以操纵光生物反应器的气体含量来培养微生物，如微藻。光生物反应器的部分可含有气体而不是液体。可以使用进气口将气体泵入光生物反应器中。可以将任一气体泵入光生物反应器中，包括空气、空气/CO2混合物、惰性气体例如氩等等。可以操纵气体进入光生物反应器的速率。增加流入光生物反应器的气体提高了微藻培养物的浊度。将气体输送进光生物反应器的舱口的放置也能够影响在给定的气体流速下培养物的浊度。可以调控空气/CO2混合物，产生对具体生物的最大生长而言最优的CO2量。在光照下，微藻例如在3％CO2/97％空气中比100％空气中生长的显著更快。3％CO2/97％空气约为空气中存在的CO2的100倍。例如，可以将约99.75％空气：0.25％CO2、约99.5％空气：0.5％CO2、约99.0％空气：1.00％CO2、约98.0％空气：2.0％CO2、约97.0％空气：3.0％CO2、约96.0％空气：4.0％CO2和约95.00％空气：5.0％CO2的空气：CO2混合物注入生物反应器或光生物反应器中。
也可以使用下述设备对微藻培养物进行混合物，所述设备例如旋转叶片和叶轮、培养物的摇动、搅拌棒、注入加压气体和其他设备。
光生物反应器可以具有允许气体、固体、半固体和液体进入含微藻的舱室的舱口。舱口通常与管道或者其他输送物质的手段连接。例如，气体舱口将气体输送进培养物中。将气体泵入光生物反应器能够发挥对细胞饲喂CO2与其他气体和对培养物通气两种功能，从而产生浊度。气体舱口的数量和位置改变时，培养物的浊度量随之改变。例如，气体舱口可以被置于圆筒状聚乙烯袋的底部。CO2被添加进空气中并鼓泡进光生物反应器中时，微藻生长得更快。例如，向含有丛粒藻属(Botryococcus)细胞的光生物反应器中注入5％CO2：95％空气的混合物(见例如J Agric Food Chem.2006 Jun 28；54(13)：4593-9；J Biosci Bioeng.1999；87(6)：811-5；and J NatProd.2003 Jun；66(6)：772-8)。
光生物反应器可以暴露于一种或多种光源，通过射到光生物反应器表面上的光为微藻提供光作为能源。优选地，光源提供足够细胞生长，但是不足以引起氧化损伤或引起光抑制应答的强度。在一些情况下，光源具有模拟或大致模拟太阳范围的波长范围。在其他情况下，使用不同的波长范围。光生物反应器可以被置于户外，或置于温室或允许阳光达到表面的其他设施中。对丛粒藻属物种而言优选的光子强度在25和500μE m-2s-1之间(见例如Photosynth Res.2005 Jun；84(1-3)：21-7)。
光生物反应器优选地具有一个或多个允许培养基进入的舱口。不必须仅一种物质进入或离开舱口。例如，舱口可用于将培养基输入光生物反应器中，然后之后可用于取样、气体输入、气体输出或其他目的。在一些情况下，在培养开始时用培养基填充光生物反应器，并且在接种培养物后不再注入培养基。换句话说，在水性培养基中将微藻生物量培养一段时间，其间微藻繁殖并且数量增加；然而在整段时间段中，水性培养基量不流过光生物反应器。因此，在一些实施方案中，接种后水性培养基不流经光生物反应器。
在其他情况下，在微藻繁殖并数量增长的整个时间段中，培养基可以流过光生物反应器。在一些实施方案中，在接种之后、细胞达到想要的密度之前将培养基注入光生物反应器中。换句话说，直到达到想要的微藻数量的增加时，才为了所述微藻的繁殖维持气体输入和培养基输入的湍流模式。
光生物反应器优选地具有一个或多个允许气体输入的舱口。气体可以发挥提供养分例如CO2以及在培养基中提供湍流的两种功能。可以如下实现湍流：将气体输入舱口置于水性培养基水平以下，从而进入光生物反应器的气体鼓泡至培养基的表面。一个或多个气体输出舱口允许气体逃逸，从而防止光生物反应器中的压强积累。优选地，气体输出舱口产生“单向”阀门，其阻止污染性微生物进入光生物反应器。在一些情况下，将细胞在光生物反应器中培养一段时间，期间微藻繁殖并且数量增加，然而并不在整个时间段中维持气体输入引起的、主要贯穿培养基的、具有湍流漩涡的湍流模式。在其他情况下，可以在微藻繁殖并且数量增加的整段时间内，维持气体输入引起的、主要贯穿培养基的、具有湍流漩涡的湍流模式。在一些情况下，不在微藻繁殖并且数量增长的时间段中维持光生物反应器规模与漩涡规模之间比例的预定范围。在其他情况下，可以维持这样的范围。
光生物反应器优选地具有至少一个可用于对培养物取样的舱口。优选地，取样舱口可以重复使用而不改变、危及培养物的无菌性质。取样舱口可以构造为允许终止和启始样品流的阀门或其他设施。或者，取样舱口可以允许连续取样。光生物反应器优选地具有至少一个允许接种培养物的舱口。这样的舱口也可以用于其他目的，例如培养基或气体输入。
B.异养生长
作为如上所述微生物光合生长的备选方案，一些微生物可以在异养生长条件下培养，其中固定碳源提供用于生长和脂质累积的能量。
在根据本发明的一种异养培养方法中，可以使用粗制或部分纯化的生物柴油，或作为脂质酯交换副产物而生产的纯化的甘油作为发酵例如生产脂质的微生物培养物的原料。因此，本发明包括在第一微生物培养物中培养微生物(例如微藻)；从培养物中回收微生物脂质；如上文所述对微生物脂质进行酯交换，产生脂肪酸酯和甘油；和将甘油添加进第二微生物培养物中作为原料。第一和第二微生物培养物可以，但不必须是相同微生物的培养物。需要时，可以设计连续体系，从而可以将用从培养物中回收的脂质生产的甘油补回相同的培养物中。
本发明提供了显著改进的培养参数，涉及甘油用于发酵多个属的真核和原核微生物的用途，所述微生物包括小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属(Spirulina)。如实施例所例证的，极端分叉的进化谱系微生物，包括小球藻属、舟形藻属、栅藻属和螺旋藻属以及多种不同小球藻属物种和株系的培养物不仅在纯化的试剂级甘油上非常良好地生长，而且在来自生物柴油酯交换的经酸化或未经酸化的甘油副产物上也非常良好地生长。在一些情况下，微藻例如小球藻属株系在存在甘油时比存在葡萄糖时更快地进行细胞分裂。在这些情况下，两阶段的生长方法会促进生产脂质的效率，所述方法中首先对细胞饲喂甘油从而迅速提高细胞密度，然后喂饲葡萄糖从而累积脂质。当补回生产过程中时，酯交换过程的甘油副产物的使用提供了显著的经济优点。同样提供了其他饲喂方法，例如饲喂甘油和葡萄糖的混合物。饲喂这类混合物也具有相同的经济益处。另外，本发明提供了对微藻饲喂替代性糖的方法，例如饲喂与甘油进行多种组合的蔗糖。本文中已针对来自极端分叉的进化谱系微生物(包括原核生物和真核生物)证明了本发明提供的这些益处，证明了本发明用于微生物发酵的效用。
用于原壳小球藻生长和繁殖的标准方法是已知的(见例如Miao和Wu，J.Biotechnology，2004，11：85-93和Miao和Wu，Biosource Technology(2006)97：841-846)。本发明还提供了小球藻属的新的生长条件。例如，小球藻属的多个物种和物种中的多种株系可以在存在甘油时生长，所述甘油包括来自生物柴油酯交换的甘油副产物。
为了生产烃，优选大量培养或发酵细胞，包括本文所述的本发明的重组细胞。培养物可以处于大的液体体积中，例如处于悬浮培养物中。其他例子包括用细胞的小量培养开始，所述小量培养与细胞生长和繁殖以及烃生产组合，扩展为大的生物量。可以使用生物反应器或钢发酵罐来容纳大的培养体积。与生产啤酒和/或葡萄酒时使用的发酵罐类似的发酵罐是合适的，乙醇生产中使用的极大的发酵罐同样合适。
提供了在发酵罐中培养的适当养分来源。这些包括原材料例如以下的一种或多种：固定碳源例如葡萄糖、玉米淀粉、解聚的纤维质材料、蔗糖、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清或糖蜜；脂肪来源，例如脂肪或植物油；氮源，例如蛋白质、大豆粉、玉米浸出液(cornsteep liquor)、氨(纯氨或盐形式)、硝酸盐、或分子氮；和磷源，例如磷酸盐。另外，发酵罐允许控制培养条件，例如温度、pH、氧张力和二氧化碳水平。任选地，可以将气态组分例如氧或氮鼓泡通过液体培养基。其他淀粉(葡萄糖)来源为例如小麦、马铃薯、水稻和高粱。其他碳源包括工艺物流(process streams)例如工业级甘油，黑液，有机酸例如乙酸，和糖蜜。碳源也可以作为混合物提供，例如蔗糖和解聚的甜菜浆的混合物。
可以使用发酵罐，允许细胞经历其生长周期的多个时期。例如，可以将生产烃的细胞的接种物引入培养基中，之后在细胞开始生长之前有一个滞后期(延滞期)。延滞期后，生长速率稳步提高并进入对数期或指数期。由于养分的减少和/或毒性物质的增加，指数期之后是缓慢生长。在该缓慢生长期之后，生长停止，细胞进入稳定期或稳态，这取决于对细胞提供的具体环境。
本文公开的细胞对烃的生产可在对数期或之后发生，包括稳定期，其中提供养分或者仍然可获得养分，从而允许在没有细胞分裂的情况下继续烃生产。
优选地，使用本文所述和本领域已知的条件培养的微生物包含按重量计至少约20％的脂质，优选按重量计至少约40％，更优选按重量计至少约50％，最优选按重量计至少约60％。
一个惊人的发现是，与在等量试剂级甘油中相比，多种小球藻属物种和小球藻属物种内的多种株系在存在来自酯交换的甘油副产物时更好地生长。来自酯交换的甘油副产物除了甘油以外通常还含有残余的甲醇和其他污染物。例如，图1-6例证了与在纯净的试剂级甘油上生长时相比，原壳小球藻和Chlorella kessleri的菌株显示在来自脂质酯交换反应的经酸化和未经酸化的甘油副产物上具有更好的生产力。与等量试剂级甘油中相比，其他微生物例如栅藻属和舟形藻属微藻也能在存在来自酯交换的甘油副产物时表现更好。
每升的干细胞重量：图1例证了与纯净甘油上相比，生物柴油甘油副产物上的干细胞重量更高，并且当细胞在甘油自身或者与葡萄糖组合的甘油上生长时，这一趋势仍然适用。图2显示小球藻属的其他株系具有相同的趋势。图12(b)例证了与纯试剂级甘油上相比，在经酸化或未经酸化的生物柴油副产物甘油上被甲栅藻的每升干细胞重量更高。图13例证了与纯试剂级甘油上相比，在未经酸化的生物柴油副产物甘油上Naviculapelliculosa的每升干细胞重量更高。
每升液体含量：图3和4例证了对多种小球藻属物种和小球藻属物种内的多种株系而言，与存在等浓度的纯试剂级甘油时培养相比，在存在生物柴油甘油副产物时培养细胞时每升脂质水平更高。
脂质作为细胞重量的百分比：图5和6例证了与在存在等浓度的纯试剂级甘油时培养时相比，在存在生物柴油甘油副产物时培养时，多种小球藻属的物种和小球藻属物种内的多种株系将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。图11例证了与存在等浓度的纯试剂级甘油时培养时相比，在存在生物柴油甘油副产物时培养时，钝顶螺旋藻和Navicula pelliculosa二者均将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。图12(a)例证了与存在等浓度的纯试剂级甘油时培养时相比，在存在生物柴油甘油副产物时培养时，被甲栅藻能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。
另一惊人的结果是与仅存在葡萄糖时相比，在存在甘油和葡萄糖的混合物时，多种微生物物种，包括微藻例如小球藻属和小球藻属物种内的多种株系，以及其他微藻例如栅藻属、舟形藻属和螺旋藻属，显示更好的作为生物柴油生产者的特征。
每升脂质含量：图7例证了与存在2％葡萄糖时相比，存在1％甘油/1％葡萄糖时小球藻属的每升培养物能够累积更高水平的脂质。
每升干细胞重量：图12(b)例证了与存在2％葡萄糖时相比，在存在1％生物柴油副产物甘油/1％葡萄糖时培养时，被甲栅藻的每升干细胞重量更高。图13例证了与存在2％葡萄糖时相比，在存在1％生物柴油副产物甘油/1％葡萄糖时培养时，Navicula pelliculosa的每升干细胞重量更高。
脂质作为细胞重量的百分比：图8例证了与仅存在葡萄糖时培养时相比，在存在等浓度(重量百分比)的甘油和葡萄糖混合物时培养时，小球藻属能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。图11(a)例证了与仅存在葡萄糖时培养时相比，在存在等浓度(重量百分比)的生物柴油副产物甘油和葡萄糖的混合物时培养时，钝顶螺旋藻能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。图11(b)例证了与仅存在葡萄糖时培养时相比，在存在等浓度(重量百分比)的试剂级甘油和葡萄糖的混合物以及生物柴油副产物甘油和葡萄糖的混合物时培养时，Navicula pelliculosa能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。图12(b)例证了与仅存在葡萄糖时培养时相比，在存在等浓度(重量百分比)的生物柴油副产物甘油和葡萄糖的混合物时培养时，被甲栅藻能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。
一个额外并且出乎意料的发现是，向微生物中相继添加甘油和葡萄糖而不是甘油和葡萄糖的单批次混合物能够产生额外的产率增益，所述微生物包括微藻，例如小球藻属、栅藻属和舟形藻属。在存在生物柴油甘油副产物和试剂级甘油二者时，检验了多种小球藻属物种和小球藻属物种内的多种株系的这一属性。
脂质作为细胞重量的百分比：图8例证了与在实验开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起添加相比，在第一段时间中向培养物中添加甘油之后添加葡萄糖并持续培养第二段时间时，小球藻属能够将更高百分比的干细胞重量作为脂质累积。
每升脂质含量：图9显示与在实验开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起添加相比，将甘油和葡萄糖相继添加时小球藻属的每升培养物显示更高的脂质水平。在使用经酸化的生物柴油副产物甘油、未经酸化的生物柴油副产物甘油或试剂级甘油时也观察到这一趋势。
每升的干细胞重量：图10例证了与在实验开始时将相同量的甘油和葡萄糖一起添加相比，将甘油和葡萄糖相继添加时，两种不同物种的小球藻属的四种不同株系的每升培养物累积更高的干细胞重量。在使用经酸化的生物柴油副产物甘油、未经酸化的生物柴油副产物甘油或试剂级甘油时也观察到这一趋势。图14(a)和(b)例证了与在发酵开始时添加相同量的甘油和葡萄糖相比，在第一段时间中仅向培养物中添加生物柴油副产物甘油之后添加葡萄糖时，被甲栅藻和Navicula pelliculosa均能够显示每升干细胞重量的提高。
通过生物柴油副产物的使用和碳源的时间分离，改进了微生物脂质生产中生产力的三种不同的标记物(每升干细胞重量，每升液体克数，和干细胞重量作为脂质的百分比)。因此，本发明提供了在来自进化树的高度分支区域的多种微生物物种中，在单位时间内产生更高量脂质的新方法，所述微生物包括原核生物和真核生物。本文公开的使用甘油制造脂质和烃的方法不限于微藻，也可以用于能够利用甘油作为能源的任一微生物。
在根据本发明的一个备选的异养生长方法中，可以使用解聚的纤维质生物量作为原料培养微生物。纤维质生物量(例如秸秆，例如玉米秸秆)是廉价并且容易获得的；然而，使用这一材料作为酵母原料的尝试失败了。具体地，发现这类原料对酵母生长是抑制性的，并且酵母不能使用由纤维质材料生产的5-碳糖(例如来自半纤维素的木糖)。相比，微藻能够在经加工的纤维质材料上生长。因此，本发明提供了在存在纤维质材料和/或5-碳糖时培养微藻的方法。
纤维质材料一般包括：
组分 干重百分比
纤维素 40-60％
半纤维素 20-40％
木质素 10-30％
合适的纤维质材料包括来自草本和木本能源作物以及农作物的残余物，即没有与主要的食品或纤维产品一起从田地中取走的植物部分，主要是茎和叶。例子包括农业废弃物，例如甘蔗渣、谷壳、玉米纤维(包括茎、叶、外壳和穗轴)、麦秸、稻草、甜菜浆、柑橘浆、柑橘皮；林业废弃物例如阔叶木和针叶木间苗(thinnings)，和来自木材加工的阔叶木和针叶木残余物；木材废弃物例如锯木厂废弃物(木片、锯屑)和纸浆厂废弃物；城市废弃物例如市政固体废弃物的纸级分，城市木材废弃物和城市绿地废弃物，例如市政剪草废弃物；和木材建筑废弃物。另外的纤维材料包括专门的纤维作物，例如柳枝稷、杂交杨木和芒(miscanthus)，纤维甘蔗(fiber cane)和纤维高粱(fiber sorghum)。由这类材料生产的五碳糖包括木糖。
本文中令人惊奇地展示，与在单独的葡萄糖或木糖任一上培养时相比，小球藻属的一些物种在葡萄糖和木糖的组合上培养时显示更高的生产力水平。这一协同效应提供了显著的优点，因为其允许在木糖和葡萄糖的组合例如纤维质材料上培养小球藻属，并展示于图15中。
在根据本发明的另一备选异养生长方法中，使用例如由甘蔗或甜菜生产的蔗糖作为原料，所述方法自身可任选地与上文所述的方法组合。如下题为“微生物改造”的部分中更详细描述的，可以通过将微生物如小球藻属改造为利用蔗糖作为碳源，促进脂质生产或使其更加有效率。例如，蔗糖转运蛋白和蔗糖转化酶的表达允许小球藻属将蔗糖从培养基中转运进细胞中，并水解蔗糖得到葡萄糖和果糖。任选地，在内源己糖激酶活性不足以进行果糖最大磷酸化的情况下，同样可以表达果糖激酶。合适的果糖转运蛋白的例子是Genbank检索号CAD91334、CAB92307和CAA53390。合适的蔗糖转化酶的例子是Genbank检索号CAB95010、NP_012104和CAA06839。合适的果糖激酶的例子是Genbank检索号P26984、P26420和CAA43322。可以如本文所述设计编码一个或多个这类基因的用于转化包括小球藻属的微藻的载体。
蔗糖转化酶的分泌可以消除对下述转运蛋白表达的需要，所述转运蛋白能够将蔗糖转运进细胞中。这是因为分泌的转化酶催化蔗糖分子转化成为葡萄糖分子和果糖分子，这两种分子可以被本文公开的微生物转运和利用。例如，带有分泌信号(例如SEQ ID NO：15(来自酵母)、SEQ ID NO：16(来自高等植物)、SEQ ID NO：17(真核生物的共有分泌信号)和SEQ IDNO：18(来自高等植物的信号序列和真核生物的共有信号序列的组合)的分泌信号)的蔗糖转化酶(例如SEQ ID NO：14)的表达在细胞外产生转化酶活性。在小球藻属中有活性的分泌信号的例子见Hawkins等，CurrentMicrobiology第38卷(1999)，第335-341页。如通过本文公开的遗传改造方法所实现的，这类蛋白质的表达允许已经能够利用细胞外葡萄糖作为能源的细胞利用蔗糖作为细胞外能源。在细胞例如原壳小球藻、微小小球藻和Chlorella emersonii中，转化酶的分泌能够提供使用蔗糖作为有效、廉价的能源所必需的唯一催化活性，所述细胞在本文中被证明既能够使用细胞外果糖又能够使用细胞外葡萄糖作为能源。
例如，如图26中所示，可以用处于下述三种启动子之一调控下的蔗糖转化酶基因改造原壳小球藻，所述三种启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子(CMV)、小球藻病毒启动子(CV)或小球藻HUP1启动子(HUP1)。该实施例中使用的蔗糖转化酶基因包含对酿酒酵母SUC2基因的修饰，从而针对原壳小球藻优化密码子使用。优化的基因的cDNA和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：19。转化中使用的质粒构建体的图解展示于图25中。例如本文中所述的分泌型蔗糖转化酶的表达允许使用糖蜜、甘蔗汁和其他含蔗糖的原料用于细胞发酵。
类似地，图27和28显示用处于CMV启动子控制下的来自酿酒酵母的蔗糖转化酶基因分别转化原壳小球藻和微小小球藻和Chlorellaemersonii的结果。
如实施例中进一步详细描述的，通过向原壳小球藻的培养基中添加转化酶，阐述了表达外源分泌型蔗糖转化酶的微生物的生长潜能。图23和24阐述了惊人的结果：小球藻属细胞在来自甘蔗加工的废弃糖蜜上与它们在纯试剂级葡萄糖上生长得同样好；甘蔗加工的该低价值废弃产物的使用能够在烃和其他油的生产中提供显著的成本节约。糖蜜含有毒害许多微生物并且妨碍它们生长的木质素和其他纤维素废弃产物，然而发现小球藻属细胞在存在这类毒素时茁壮生长。图23-24显示与存在或不存在细胞外蔗糖转化酶时在葡萄糖或蔗糖上的生长相比，细胞在三种独特的糖蜜来源(称作BS1、BS2和HTM)上的生长。
或者，也可以在表达蔗糖转运蛋白的细胞中，以及表达任一碳水化合物转运蛋白的细胞中细胞内表达蔗糖转化酶，所述转运蛋白允许蔗糖进入细胞。
如实施例12中所述，将外来基因转化进原壳小球藻中并在其中表达。可以使用相同或相似的方法和载体设计，实现蔗糖利用基因的表达。
可以使用生物反应器用于异源生长方法中。应当理解，在本文所述的异养生长方法中使用固定碳源时，使光合生长方法中的细胞能够获得光所做的准备不是必需的。
本文所述的工艺条件和异养生长方法的特定例子可以以任一合适的方式组合，从而促进微生物生长和脂质生产的效率。另外，本发明包括对微生物例如微藻进行选择和/或遗传改造，从而生产甚至更适合在上述方法中使用的微生物。例如，下述微生物在本发明的范围内，所述微生物具有利用上述任一原料的更强能力，获得提高的增殖和/或脂质(例如脂肪酸)生产。
C.兼养生长
兼养生长是细胞利用光和固定碳源二者作为生长和生产烃的能源。兼养生长可以在光生物反应器中进行。微藻可以在用不同类型的透明或半透明材料制成的闭合的光生物反应器中培养和维持。这类材料可包括外壳，玻璃外壳，用例如聚乙烯的物质制成的袋子，透明或半透明管道和其他材料。微藻可以在开放的光生物反应器例如水沟池(racewaypond)、沉降池和其他非闭合的容器中培养和维持。
D.生长培养基
根据本发明的方法有用的微生物存在于全世界的多种位置和环境中。由于它们与其他物种的隔离和导致的进化趋异，所以用于最适生长和脂质和/或烃组分产生的具体生长培养基难以预测。在一些情况下，某些微生物株系可能不能够在特定的生长培养基上生长，因为存在一些抑制性组分或者缺乏具体微生物株系所需的一些必需的营养需求。
一般可以从多种来源获得固体和液体生长培养基，制备适用于多种微生物株系的具体培养基的说明可以例如在http://www.utex.org/在线获得，该网址由得克萨斯大学奥斯汀分校(University of Texas at Austin)为其藻类培养物中心(culture collection of algae(UTEX))维护。例如，多种淡水和盐水培养基包括下表4中显示的培养基。
表4.示范性的藻类培养基
淡水培养基 盐水培养基
1/2 CHEV硅藻培养基 1％F/2
1/3 CHEV硅藻培养基 1/2富集的海水培养基
1/5 CHEV硅藻培养基 1/2 Erdschreiber培养基
1∶1 DYIII/PEA+Gr+ 1/2土壤+海水培养基
2/3 CHEV硅藻培养基 1/3土壤+海水培养基
2X CHEV硅藻培养基 1/4 ERD
Ag硅藻培养基 1/4土壤+海水培养基
Allen培养基 1/5土壤+海水培养基
BG11-1培养基 2/3富集的海水培养基
Bold 1NV培养基 20％Allen+80％ERD
Bold 3N培养基 2X Erdschreiber′s培养基
丛粒藻培养基 2X土壤+海水培养基
Bristol培养基 5％F/2培养基
CHEV硅藻培养基 5/3土壤+海水琼脂培养基
Chu′s培养基 人造海水培养基
CR1硅藻培养基 BG11-1+.36％NaCl培养基
CR1+硅藻培养基 BG11-1+1％NaCl培养基
CR1-S硅藻培养基 Bold 1NV∶Erdshreiber(1∶1)
氰化物培养基 Bold 1NV∶Erdshreiber(4∶1)
Cyanophycean培养基 Bristol-NaCl培养基
Desmid培养基 Dasycladales海水培养基
DYIII培养基 富集的海水培养基
裸藻属培养基 Erdschreiber′s培养基
HEPES培养基 ES/10富集的海水培养基
J培养基 ES/2富集的海水培养基
麦芽培养基 ES/4富集的海水培养基
MES培养基 F/2培养基
改良的Bold 3N培养基 F/2+NH4
改良的COMBO培养基 LDM培养基
N/20培养基 改良的2 X CHEV
棕鞭藻属培养基 改良的2 X CHEV+土壤
P49培养基 改良的人造海水培养基
Polytomella培养基 改良的CHEV
Proteose培养基 Porphridium培养基
雪生藻类培养基 土壤+海水培养基
土壤提取物培养基 SS硅藻培养基
土壤水：BAR培养基
土壤水：GR-培养基
土壤水：GR-/NH4培养基
土壤水：GR+培养基
土壤水：GR+/NH4培养基
土壤水：PEA培养基
土壤水：泥炭培养基
土壤水：VT培养基
螺旋藻属培养基
Tap培养基
Trebouxia培养基
Volvocacean培养基
Volvocacean-3N培养基
团藻属培养基
团藻属-葡萄糖培养基
Waris培养基
Waris+土壤提取物培养基
在一个具体的例子中，适用于培养原壳小球藻(UTEX 31)的培养基包括Proteose培养基。该培养基适用于纯性培养物，并且可以通过向1升Bristol培养基中添加1 g proteose蛋白胨制备1L体积的培养基(pH～6.8)。Bristol培养基在水溶液中包含2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM、1.29mM KH2PO4和1.43mM NaCl。对1.5％琼脂糖培养基而言，可以向1L溶液中添加15 g琼脂。将溶液加盖并高压灭菌，然后在使用前储存于冷藏温度下。
可以通过咨询上文给出的URL，或者通过咨询其他保藏微生物培养物的组织例如SAG、CCAP或CCALA，容易地确定本发明的方法使用的其他合适培养基。SAG是指哥廷根大学的藻类培养物保藏中心(CultureCollection of Algae atthe University of德国)，CCAP是指苏格兰海洋科学协会管理的藻类和原生动物培养物保藏中心(Scotland，英国)，CCALA是指植物学研究所(Institute of Botany)的藻类实验室培养物保藏中心(捷克共和国)。
E.提高脂质产率
可以调节工艺条件，以提高适用于具体用途的脂质产率和/或降低生产成本。例如，在某些实施方案中，在存在限制性浓度的一种或多种养分例如碳和/或氮、磷或硫时培养微生物(例如微藻)，同时提供过量的固定碳源例如葡萄糖。氮限制倾向于提高微生物脂质产率超过过量提供氮时培养物中的微生物脂质产率。在具体的实施方案中，脂质产率的提高至少约：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％。可以在存在限制量的养分时，将微生物培养总培养周期的一部分，或者培养整个周期。在具体的实施方案中，在总培养周期期间，养分浓度在限制性浓度和非限制性浓度之间至少循环两次。
为了提高脂质产率，可以在用于生产脂质的微生物(例如微藻)的原料中使用乙酸。乙酸直接补入启始脂肪酸合成的代谢点(例如乙酰-CoA)中；从而在培养物中提供乙酸能够提高脂肪酸生产。通常，在存在下述量的乙酸时培养微生物，所述量足够提高微生物脂质产率和/或微生物脂肪酸产率，尤其是超过无乙酸时的微生物脂质(例如脂肪酸)产率。
在另一实施方案中，通过在存在脂质途径酶(例如脂肪酸合成酶)的一种或两种辅因子时培养生产脂质的微生物(例如微藻)，来提高脂质产率。一般而言，辅因子的浓度足以提高微生物脂质(例如脂肪酸)产率超过无辅因子时的微生物脂质产率。在一个具体的实施方案中，通过在培养物中包含下述微生物(例如微藻)来对培养物提供辅因子，所述微生物含有编码辅因子的外源基因。或者可以通过包含下述微生物(例如微藻)来对培养物提供辅因子，所述微生物含有编码参与辅因子合成的蛋白质的外源基因。在某些实施方案中，合适的辅因子包括脂质途径酶所需的任一维生素，例如生物素、泛酸。编码适用于本发明的辅因子或者参与这类辅因子合成的基因是公知的，并且可以使用例如上文所述的构建体和技术引入微生物(例如微藻)中。
V.脂质途径改造
在本发明的一些实施方案中，修饰本发明的微生物以改变所生产的脂质的特性和/或比例，和/或提高流入脂质的碳通量。该途径可以被进一步修饰或者可选择地修饰，以改变通过脂质的酶促加工生产的多种烃分子的特性和/或比例。
A.改变生产的脂质或烃的特性或比例
在微藻的情况下，一些野生型细胞已经具有良好的生长特征，但是不生产想要的脂质类型或脂质量。例子包括桑椹藻属、席藻属、阿格藻属、四鞭藻属、鳞孔藻属、桑椹藻属、菱形藻属、鳞孔藻属、鱼腥藻属、裸藻属、水绵属、绿球藻属、四角藻属、颤藻属、Phagus和绿梭藻属，其具有在城市下水道或废水中生长的生长特征。这类细胞以及小球藻属和其他微生物物种，能够被改造为具有改进的脂质生产特征。想要的特征包括优化每单位体积和/或每单位时间的脂质产率，碳链长度(例如用于需要烃原料的生物柴油生产或工业应用)，减少双键或三键数，任选地减至零，去除或消除环和环状结构，和提高具体脂质种类或不同脂质的群体的氢∶碳比例。另外，生产适当烃的微藻也可以被改造为具有甚至更想要的烃输出。这类微藻的例子包括小球藻属的物种。
1.调节控制脂肪酸合成中分支点的酶
在具体的实施方案中，可以将一种或多种下述关键酶上调或下调来改进脂质生产，所述关键酶控制代谢成脂肪酸的合成中的分支点。可以例如通过用下述表达构建体转化细胞来实现上调，所述表达构建体中例如使用提高转录的强启动子和/或增强子元件来表达编码目的酶的基因。这类构建体可包含选择标记从而能对下述转化体进行选择，所述转化体导致构建体的扩增和编码的酶表达水平的提高。根据本发明方法适用于上调的酶的例子包括丙酮酸脱氢酶，该酶在将丙酮酸转化为乙酰-CoA中起作用(例子包括Genbank检索号NP_415392；AAA53047；Q1XDM1；和CAF05587，其中一些来自微藻)。丙酮酸脱氢酶的上调能够提高乙酰-CoA的生产，从而提高脂肪酸合成。乙酰-CoA羧化酶催化脂肪酸合成中的初始步骤。因此可以上调该酶来提高脂肪酸的生产(例子包括Genbank检索号BAA94752；AAA75528；AAA81471；YP_537052；YP_536879；NP_045833；和BAA57908，其中一些来自微藻)。也可以通过上调酰基载体蛋白(ACP)提高脂肪酸生产，所述酰基载体蛋白在脂肪酸合成期间载有延伸的酰基链(例子包括Genbank检索号A0T0F8；P51280；NP_849041；YP_874433，其中一些来自微藻)。甘油-3-磷酸酰基转移酶催化脂肪酸合成的限速步骤。该酶的上调能够提高脂肪酸生产(例如包括Genbank检索号：AAA74319；AAA33122；AAA37647；P44857；和ABO94442，其中一些来自微藻)。前述蛋白质是在包括小球藻属的物种在内的微藻中表达的候选者。
可以使用例如反义、催化性RNA/DNA、RNA干扰(RNAi)、“敲除”、“击倒”或其他诱变技术实现目的酶的下调。也可以使用胞内抗体(intrabody)抑制酶表达/功能。适合根据本发明的方法下调的酶的例子包括柠檬酸合酶，其消耗作为三羧酸(TCA)循环的一部分的乙酰-CoA。柠檬酸合酶的下调可强迫更多的乙酰-CoA进入脂肪酸合成途径。
2.调控脂肪酸合成基因的全局调节子
全局调节子调控脂肪酸生物合成途径的基因表达。因此，适当时可以上调或下调脂肪酸合成的一种或多种全局调节子，以分别抑制或增强多种脂肪酸合成基因的表达，并最终提高脂质生产。例子包括甾醇调节元件结合蛋白(SREBPs)，例如SREBP-1a和SREBP-1c(例子见Genbank检索号NP_035610和Q9WTN3)。可以例如如上文所述上调或下调全局调节子，从而调节控制点酶。
3.调节烃修饰酶
本发明的方法还包括用一种或多种编码烃修饰酶的基因转化细胞，所述烃修饰酶例如为脂肪酰基-ACP硫酯酶(例子与检索号见表5)、脂肪酰基-CoA/醛还原酶(例子与检索号见表6)、脂肪酰基-CoA还原酶(例子与检索号见表7)、脂肪醛脱羰基酶(例子与检索号见表8)、脂肪醛还原酶或鲨烯合酶基因(见GenBank检索号AF205791)。在一些实施方案中，可以将编码脂肪酰基-ACP硫酯酶和天然共表达的酰基载体蛋白的基因转化进细胞中，任选地与一种或多种编码其他烃修饰酶的基因一起转化。在其他实施方案中，ACP和脂肪酰基-ACP硫酯酶彼此间可具有亲和力，这使得在本发明的微生物和方法中一起使用时带来优点，与它们在具体的组织或生物中天然共表达或不共表达无关。因此，本发明既考虑天然共表达的这些酶对，又考虑共享彼此间相互作用的亲和力的酶对，从而促进从ACP上切割长度特异性的碳链。
在其他实施方案中，可以将编码去饱和酶的外源基因与一种或多种编码其他烃修饰酶的基因共同转化进细胞中，从而提供对烃饱和度的修饰。例如，硬脂酰-ACP去饱和酶(见例如GenBank检索号AAF15308；ABM45911；和AAY86086)催化硬脂酰基-ACP转化成为油酰基-ACP。该基因的上调能够提高细胞生产的单不饱和脂肪酸的比例；而其下调能够降低单不饱和脂肪酸的比例。类似地，可以控制一种或多种甘油脂去饱和酶的表达，以改变不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例，所述酶为例如ω-6脂肪酸去饱和酶、ω-3脂肪酸去饱和酶或ω-6-油酸去饱和酶。在一些实施方案中，可以根据碳链长度选择去饱和酶，使得去饱和酶能够在特定碳长度的底物内或具有特定范围内碳长度的底物内进行位置特异性修饰。
在具体的实施方案中，将本发明的微生物遗传改造为表达一种或多种选自以下的外源基因：脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA/醛还原酶、脂肪酰基-CoA还原酶、脂肪醛还原酶、脂肪醛脱羰基酶或天然共表达的酰基载体蛋白。合适的表达方法在上文关于脂肪酶基因的表达方面描述，包括诱导型表达和区室化表达，以及其他方法。
不旨在受任一具体理论或细胞机制束缚，在脂质合成期间，脂肪酰基-ACP硫酯酶从酰基载体蛋白(ACP)上切割脂肪酸。通过进一步的酶加工，切割的脂肪酸随后与辅酶组合，产生酰基-CoA分子。该酰基-CoA是脂肪酰基-CoA还原酶生产醛的酶活性的底物，以及脂肪酰基-CoA/醛还原酶生产醇的酶活性的底物。通过上文确定的脂肪酰基-CoA还原酶的作用生产的醛是脂肪醛还原酶生产醇或脂肪醛脱羰基酶生产烷烃或烯烃的进一步酶活性的底物。
上文所述的酶具有作用于下述底物的特异性，所属底物含有特定数量的碳原子。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可具有从ACP上切割具有12个碳原子的脂肪酸的特异性。在一些实施方案中，ACP和长度特异性硫酯酶彼此可具有亲和力，这使得它们尤其适合用作组合(例如外源ACP和硫酯酶基因可以在它们来源的具体组织或生物中共表达)。因此在多个实施方案中，微生物可含有编码下述蛋白质的外源基因，所属蛋白质具有与底物中含有的碳原子数量相关的用于催化酶活性的特异性(例如从ACP上切割脂肪酸，将酰基-CoA还原为醛或醇，或将醛转化为烷)。在多个实施方案中，酶特异性可以为针对下述底物，所述底物为具有8到34个碳原子，优选8到18个碳原子，更优选10到14个碳原子。最优选的特异性是针对具有12个碳原子的底物。在其他实施方案中，特异性可以针对20到30个碳原子。
适用于本发明的微生物和方法的脂肪酰基-ACP硫酯酶包括但不限于表5中所列的脂肪酰基-ACP硫酯酶。
表5.脂肪酰基-ACP硫酯酶和GenBank检索号。
加州月桂(Umbellularia californica)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49001)
樟(Cinnamomum camphora)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q39473)加州月桂脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q41635)肉豆蔻(Myristica fragrans)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71729)肉豆蔻脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB71730)油棕榈(Elaeis guineensis)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABD83939)油棕榈脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAD42220)抱头毛白杨(Populus tomentosa)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABC47311)拟南芥(Arabidopsis thalian)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#NP_172327)拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA85387)拟南芥脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA85388)陆地棉(Gossypium hirsutum)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q9SQI3)披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAA54060)Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC72882)Cuphea calophylla subsp.mesostemon脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABB71581)披针叶萼距花(Cuphea lanceolata)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAC19933)油棕榈脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAL15645)Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#Q39513)陆地棉脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAD01982)葡萄(Vitis vinifera)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#CAN81819)
倒捻子(Garcinia mangostan)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAB51525)芥菜(Brassica juncea)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABI18986)Madhuca longifolia脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAX51637)欧洲油菜(Brassica napus)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#ABH11710)稻(Oryza sativa)(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#EAY86877)稻(粳稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#NP_001068400)稻(籼稻栽培种)脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#EAY99617)Cuphea hookeriana脂肪酰基-ACP硫酯酶(GenBank#AAC49269)
适用于本发明的微生物和方法的脂肪酰基-CoA/醛还原酶包括但不限于表6中所列的脂肪酰基-Coa/醛还原酶。
表6.按照GenBank检索号排列的脂肪酰基-CoA/醛还原酶。
AAC45217、YP_047869、BAB85476、YP_001086217、YP_580344、YP_001280274、YP_264583、YP_436109、YP_959769、ZP_01736962、ZP_01900335、ZP_01892096、ZP_01103974、ZP_01915077、YP_924106、YP_130411、ZP_01222731、YP_550815、YP_983712、YP_001019688、YP_524762、YP_856798、ZP_01115500、YP_001141848、NP_336047、NP_216059、YP_882409、YP_706156、YP_001136150、YP_952365、ZP_01221833、YP_130076、NP_567936、AAR88762、ABK28586、NP_197634、CAD30694、NP_001063962、BAD46254、NP_001030809、EAZ10132、EAZ43639、EAZ07989、NP_001062488、CAB88537、NP_001052541、CAH66597、CAE02214、CAH66590、CAB88538、EAZ39844、AAZ06658、CAA68190、CAA52019和BAC84377
适用于本发明的微生物和方法的脂肪酰基-CoA还原酶包括但不限于表7中所列的脂肪酰基-CoA还原酶。
表7.按照GenBank检索号排列的脂肪酰基-CoA还原酶。
NP_187805、ABO14927、NP_001049083、CAN83375、NP_191229、EAZ42242、EAZ06453、CAD30696、BAD31814、NP_190040、AAD38039、CAD30692、CAN81280、NP_197642、NP_190041、AAL15288和NP_190042
适用于本发明的微生物和方法的脂肪醛脱羰基酶包括但不限于表8中所列的脂肪醛脱羰基酶。
表8.按照GenBank检索号排列的脂肪醛脱羰基酶。
NP_850932、ABN07985、CAN60676、AAC23640、CAA65199、AAC24373、CAE03390、ABD28319、NP_181306、EAZ31322、CAN63491、EAY94825、EAY86731、CAL55686、XP_001420263、EAZ23849、NP_200588、NP_001063227、CAN83072、AAR90847和AAR97643
天然共表达的脂肪酰基-ACP硫酯酶和酰基载体蛋白的组合适用于本发明的微生物和方法。
烃修饰酶的额外的例子包括下述氨基酸序列，所述氨基酸序列在以下任一美国专利中包含或引用，或由其中包含或引用的核酸序列编码：6,610,527；6,451,576；6,429,014；6,342,380；6,265,639；6,194,185；6,114,160；6,083,731；6,043,072；5,994,114；5,891,697；5,871,988；6,265,639，并进一步用GenBank检索号描述：AAO18435；ZP_00513891；Q38710；AAK60613；AAK60610；AAK60611；NP_113747；CAB75874；AAK60612；AAF20201；BAA11024；AF205791；和CAA03710。
用于本发明的微生物和方法的其他合适酶包括下述酶，所述酶与表5-8中所列蛋白质之一具有至少70％的氨基酸同一性，并且显示相应的想要的酶活性(例如从酰基载体蛋白上切割脂肪酸，将酰基-CoA还原为醛或醇，或将醛转化为烷烃)。在额外的实施方案中，酶活性存在于与上述序列之一具有至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或至少约99％的同一性的序列中，所述序列均并入本文作为参考，就好像完整给出一样。
上述烃修饰酶可用于从微生物(例如微藻、产油酵母或真菌)或微生物群体中生产多种烃，其中脂肪酰基-ACP硫酯酶在脂质合成期间从酰基载体蛋白(ACP)上切割脂肪酸。通过进一步的酶加工，切割的脂肪酸随后与辅酶组合，产生酰基-CoA分子。该酰基-CoA是脂肪酰基-CoA还原酶生产醛的酶活性的底物，以及脂肪酰基-CoA/醛还原酶生产醇的酶活性的底物。通过上文确定的脂肪酰基-CoA还原酶的作用生产的醛是脂肪醛还原酶生产醇或脂肪醛脱羰基酶生产烷或烯烃的进一步酶活性的底物。
烃修饰酶具有作用于下述底物的特异性，所述底物含有特定数量的碳原子。例如，脂肪酰基-ACP硫酯酶可具有从ACP上切割具有12个碳原子的脂肪酸的特异性。因此，在多个实施方案中，微生物可含有编码下述蛋白质的外源基因，所述蛋白质具有与底物中含有的碳原子数量相关的用于催化酶活性的特异性(例如从ACP上切割脂肪酸，将酰基-CoA还原为醛或醇，或将醛转化为烷)。在多个实施方案中，酶特异性可以针对下述底物，所述底物具有8到34个碳原子，优选具有8到18个碳原子，更优选10到14个碳原子。最优选的特异性是针对具有12个碳原子的底物。在其他实施方案中，特异性可以针对20到30个碳原子。
在一些实施方案中，通过本文所述方法产生的脂肪酸或相应的伯醇、醛、烷或烯烃含有至少约8个，至少约10个，至少约12个，至少约14个，至少约16个，至少约18个，至少约20个，至少约22个，至少约24个，至少约26个，至少约28个，至少约30个，至少约32个或至少约34个碳原子或更多。用于生产生物柴油、可再生柴油或喷气式发动机燃料的优选的脂肪酸或用于工业应用的相应伯醇、醛、烷和烯烃含有至少约8个碳原子或更多。在某些实施方案中，上述脂肪酸以及其他相应的烃分子是饱和的(无碳-碳双键或三键)；单不饱和的(单个双键)；多不饱和的(两个或更多个双键)；线性的(非环状)；和/或其结构中具有很少分支或不具有分支。
通过选择待表达的外源基因的希望的组合，可以定制微生物生产的产物，然后可以从水性生物量中提取所述产物。例如，微生物可含有：(i)编码脂肪酰基-ACP硫酯酶的外源基因；和任选地含有(ii)天然共表达的酰基载体蛋白或以其他方式对脂肪酰基-ACP硫酯酶具有亲和力(或相反)的酰基载体蛋白；和任选地含有(iii)编码脂肪酰基-CoA/醛还原酶或脂肪酰基-CoA还原酶的外源基因；和任选地含有(iv)编码脂肪醛还原酶或脂肪醛脱羰基酶的外源基因。如下文所述培养时，微生物合成与ACP连接的脂肪酸，并且脂肪酰基-ACP硫酯酶催化从ACP上切割脂肪酸，通过进一步的酶加工得到脂肪酰基-CoA分子。存在脂肪酰基-CoA/醛还原酶时，其催化酰基-CoA还原成为醇。类似地，存在脂肪酰基-CoA还原酶时，其催化酰基-CoA还原成为醛。在编码脂肪酰基-CoA还原酶的外源基因存在并且被表达以得到醛产物的这些实施方案中，第三外源基因编码的脂肪醛还原酶催化醛还原成为醇。类似地，存在脂肪醛脱羰基酶时，其催化醛转化成为烷或烯。
编码这类酶的基因可得自已知显示出显著的脂质生产的细胞，例如原壳小球藻。可以将已知在脂质生产中发挥作用的基因个别地转化进受体细胞中，所述基因为例如编码使双键饱和的酶的基因。然而，为了实践本发明，不必须进行需要哪些基因的先验假设。可以将含有不同基因的DNA文库转化进受体细胞中，所述不同基因例如为来自良好的脂质生产生物的cDNA。cDNA优选与在微藻中有活性的启动子有效连接。通过文库转化的不同受体微藻细胞接收来自文库的不同基因。通过本领域已知的筛选方法，例如烃分析的HPLC、气相层析和质谱方法(这类分析的例子见Biomassand Bioenergy第6卷第4部第269-274页(1994)；Experientia 38；47-49(1982)；和Phytochemistry 65(2004)3159-3165)鉴定具有改进的脂质生产的转化体。然后用原始文库对这些转化体进行进一步转化和/或任选地进行品种间杂交(interbred)，产生具有改进的脂质生产的另一轮生物。使整个生物进化以获得想要的特性的一般步骤描述于例如US 6,716,631中。这类方法需要例如将DNA片段文库引入大量细胞中，从而至少这些片段之一与细胞基因组或附加体中的区段经历重组，产生经修饰的细胞。然后筛选经修饰的细胞，得到朝向获得想要的功能这一方向进化的经修饰的细胞。用于转化的载体和方法与关于脂肪酶基因的表达所讨论的载体和方法类似。
另外，可以使用消减文库(subtractive libraries)鉴定下述基因，所述基因的转录在不同的条件下被诱导，所述条件特别是培养用于生产生物柴油或者用于生产适合用作工业应用的原料的烃的微生物的条件。消减文库含有反映两种不同样品之间差异的核苷酸序列。这类文库通过下述方案制备，所述方案包括使来自每种样品的多核苷酸群体(例如mRNA、cDNA、扩增的序列)变性和杂交的步骤。两种样品共有的序列杂交并被去除，留下在样品之间有差异的序列。通过这一方式，可以鉴定在具体条件下被诱导的序列。这一技术可用于例如鉴定下述基因，所述基因适用于提高脂质(例如脂肪酸)生产，尤其适用于在任一想要的培养条件下提高脂质生产。消减杂交技术也可以用于鉴定适用于本发明的表达构建体的启动子，例如诱导型启动子。
因此，例如可以从自养(光下，无固定碳源)或异养(暗中，存在固定碳源)生长的微生物培养物制备消减文库。具体地，异养基因可以在存在固定碳源的暗培养期间诱导，并且因此可存在于下述文库中，所述文库通过从来自暗异养细胞的序列中减去来自自养细胞的序列而产生。也可以从下述培养物制备消减文库，所述培养物中添加了具体的碳底物例如葡萄糖来鉴定在代谢底物中起作用的基因。可以使用下述消减文库鉴定控制细胞分裂(烃累积生产相对)的基因，所述消减文库从存在过量氮以及有限氮时培养的培养物制备。从添加了脂质(例如脂肪酸)的培养物制备消减文库可以帮助鉴定下述基因，所述基因的过表达提高脂肪酸生产。更特定地，向能够利用添加的脂肪酸的细胞培养物中添加脂肪酸会导致脂肪酸合成基因的下调，从而下调脂肪酸生产。一种或多种这类基因的过表达会具有相反的作用。
B.进入脂质途径的增加的碳通量
一些微藻生产大量的非脂质代谢产物，例如多糖。因为多糖的生物合成能够利用细胞可用的总代谢能量的大部分，所以诱变生产脂质的细胞之后筛选降低或消除的多糖生产产生下述新株系，所述新株系能够生产更高的脂质产率。
苯酚：硫酸实验检测碳水化合物(见Hellebust，Handbook ofPhycological Methods，Cambridge University Press，1978；和Cuesta G.，等，J Microbiol Methods.2003 Jan；52(1)：69-73)。1，6二甲基亚甲蓝实验检测阴离子多糖。(见例如Braz J Med Biol Res.1999 May；32(5)：545-50；ClinChem.1986 Nov；32(11)：2073-6)。
也可以通过例如HPLC、大小排除层析和阴离子交换层析的方法分析多糖(见例如Prosky L，Asp N，Schweizer TF，DeVries JW&Furda I(1988)Determination of insoluble，soluble and total dietary fiber in food and foodproducts：Interlaboratory study.Journal of the Association of OfficialAnalytical Chemists 71，1017±1023；Int J Biol Macromol.2003Nov；33(1-3)：9-18)。也可以使用凝胶电泳检测多糖(见例如Anal Biochem.2003 Oct 15；321(2)：174-82；Anal Biochem.2002 Jan 1；300(1)：53-68)。
也可以通过例如HPLC、大小排除层析和阴离子交换层析的方法分析多糖(见例如Prosky L，Asp N，Schweizer TF，DeVries JW&Furda I(1988)Determination of insoluble，soluble and total dietary fiber in food and foodproducts：Interlaboratory study.Journal of the Association of OfficialAnalytical Chemists 71，1017±1023；Int J Biol Macromol.2003Nov；33(1-3)：9-18)。也可以使用凝胶电泳检测多糖(见例如Anal Biochem.2003 Oct 15；321(2)：174-82；Anal Biochem.2002 Jan 1；300(1)：53-68)。
VI.回收脂质和烃的方法
可以通过任一便利的手段收获或者以其他方式收集本发明的细胞生产的烃(例如脂质、脂肪酸、醛、醇和烷)。例如，可以将从细胞中分泌的烃离心，从而将疏水层中的烃与水性层中的污染物分离，并任选地与离心后作为沉淀物的任一固体材料分离。可以在离心之前或之后用蛋白酶处理含有细胞或细胞级分的材料，降解污染性蛋白质。在一些情况下，污染性的蛋白质与烃或烃前体结合，可能是共价结合，所述前体在去除蛋白质后形成烃。在其他情况下，烃分子在也含有蛋白质的制备物中。可以向含有蛋白质的烃制备物中添加蛋白酶，从而降解蛋白质，例如可以使用来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶(SigmaAldrich产品目录号P5147)。消化后，优选地从残余的蛋白质、肽片段和氨基酸中纯化烃。该纯化可以通过例如上文所列的方法完成，所述方法例如为离心和过滤。
也可以如下从活的微藻细胞体内提取细胞外的烃(所述细胞随后被返回生物反应器中)：在其他方面无菌的环境中，将细胞暴露于无毒的提取溶剂中，然后将活细胞与提取溶剂的疏水级分和烃分离，其中将分离的活细胞随后返回培养物容器例如不锈钢发酵罐或光生物反应器中(见Biotechnol Bioeng.2004 Dec 5；88(5)：593-600和Biotechnol Bioeng.2004Mar 5；85(5)：475-81)。
也可以通过全细胞提取来分离烃。首先如题为“裂解细胞”的部分中所述使细胞破裂，然后可以例如通过使用如上所述的离心，从全细胞量中收集细胞内的烃和与细胞膜/细胞壁结合的烃以及细胞外的烃。
可以获得多种方法，用于从上述方法生产的细胞裂解物中分离烃和脂质。例如，可以用疏水溶剂例如己烷提取烃(见Frenz等1989，EnzymeMicrob.Technol.，11：717)。也可以使用液化(见例如Sawayama等1999，Biomass and Bioenergy 17：33-39和Inoue等1993，Biomass Bioenergy6(4)：269-274)；油液化(见例如Minowa等1995，Fuel 74(12)：1735-1738)；和超临界CO2提取(见例如Mendes等2003，Inorganica Chimica Acta356：328-334)来提取烃。
Miao和Wu描述了从原壳小球藻的培养物中回收微藻脂质的方案，其中通过离心收获细胞，用蒸馏水冲洗细胞并通过冷冻干燥干燥细胞。在研钵中粉碎得到的细胞粉末，然后用正己烷提取。Miao和Wu，BiosourceTechnology(2006)97：841-846。
A.裂解细胞
在一些实施方案中，将微生物细胞裂解后提取微生物中生产的细胞内脂质和烃。提取后，可以将脂质和/或烃进一步精制，产生油、燃料或油类化学品。
完成培养后，可以将微生物从发酵液中分离。任选地，通过离心实现分离，产生浓缩的糊。离心不从微生物中去除显著量的细胞内水分，并且不是干燥步骤。然后可以用洗涤溶液(例如DI水)冲洗生物量，除去发酵液和碎片。任选地，也可以在细胞破裂前干燥经过洗涤的微生物生物量(烘箱干燥、冻干等)。或者可以在发酵完成时裂解细胞而不与一些或所有发酵液分离。例如，裂解细胞时，细胞与细胞外液体的比例可以是1∶1 v∶v。
可以裂解含有脂质和/或烃的微生物，产生裂解物。如本文所详述的，可以通过任一便利的手段实现裂解微生物的步骤(也称作细胞裂解)，所述手段包括热诱导的裂解，添加碱，添加酸，使用酶例如蛋白酶和多糖降解酶例如淀粉酶，使用超声，机械裂解，使用渗透压休克，用裂解病毒感染和/或表达一种或多种裂解基因。进行裂解释放微生物生产的细胞内分子。用于裂解微生物的这些方法每种都可以作为单一的方法使用，或者同时或相继地组合使用。
可以通过显微镜分析观察细胞破裂的程度。使用本文所述的一种或多种方法，通常观察到多于70％的细胞破坏。优选细胞破坏大于80％，更优选大于90％，最优选约100％。
在具体的实施方案中，在生长后裂解微生物，从而例如提高细胞脂质和/或烃对提取或进一步加工的暴露。可以调整脂肪酶表达(例如通过诱导型表达)或细胞裂解的时间，从而优化脂质和/或烃的产率。下文描述了多种裂解技术。这些技术可以个别或组合地使用。
1.热诱导的裂解
在本发明的一个优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括加热含有微生物的细胞悬浮液。在该实施方案中，加热含有微生物的发酵液(或从发酵液中分离的微生物悬浮液)，直到微生物即微生物的细胞壁和膜降解或破裂。通常使用的温度至少为50℃。使用更高的温度进行更有效的细胞裂解，例如至少30℃，至少60℃，至少70℃，至少80℃，至少90℃，至少100℃，至少110℃，至少120℃，至少130℃或更高。
通过热处理裂解细胞可以通过将微生物煮沸进行。或者可以在高压灭菌器中进行热处理(不煮沸)。可以将经过热处理的裂解物冷却用于进一步处理。
也可以通过蒸汽处理，即通过添加加压的蒸汽进行细胞破裂。用于细胞破裂的微藻蒸汽处理描述于例如美国专利号6,750,048中。
2.使用碱裂解
在本发明的另一个优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬浮液中添加碱。
碱应当足够强到水解使用的微生物的至少一部分蛋白质性化合物。适用于溶解蛋白质的碱是化学领域已知的。适用于本发明方法中的示范性碱包括但不限于锂、钠、钾、钙的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐及其混合物。一种优选的碱是KOH。用于细胞破裂的微藻碱处理描述于例如美国专利号6,750,048中。
3.酸裂解
在本发明的另一优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括向含有微生物的细胞悬浮液中添加酸。酸裂解可以使用浓度10-500mN或优选40-160nM的酸进行。酸裂解优选地在高于室温下进行(例如在40-160°，优选50-130°的温度下)。对适中温度(例如室温到100℃，尤其是室温到65℃)而言，可以有用地将酸处理与超声或其他细胞破裂方法组合。
4.使用酶裂解细胞
在本发明的又一个优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括通过使用酶来裂解微生物。用于裂解微生物的优选的酶是蛋白酶和多糖降解酶，例如半纤维素酶(例如来自黑曲霉的半纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#H2125)、果胶酶(例如来自根霉属物种的果胶酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#P2401)、Mannaway 4.0 L(Novozymes)、纤维素酶(例如来自绿色木霉的纤维素酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#C9422)和崩溃酶(例如来自担子菌纲物种(Basidiomycetes sp.)的崩溃酶；Sigma Aldrich，St.Louis，MO；#D9515)。
a)纤维素酶
在本发明的一个优选的实施方案中，用于裂解微生物的纤维素酶是多糖降解酶，其任选地来自小球藻属或小球藻属病毒。
b)蛋白酶
可以使用蛋白酶裂解微生物，所述蛋白酶例如灰色链霉菌蛋白酶，糜蛋白酶，蛋白酶K，Degradation of Polylactide by Commercial Proteases，Oda Yet al.，Journal of Polymers and the Environment，第8卷，Number 1，January 2000，第29-32(4)页中所列的蛋白酶和其他蛋白酶。可以使用的其他蛋白酶包括Alcalase 2.4 FG(Novozymes)和Flavourzyme 100 L(Novozymes)。
c)组合
也可以使用蛋白酶和多糖降解酶的任一组合，包括前述蛋白酶和多糖降解酶的任一组合。
5.使用超声裂解细胞
在本发明的另一个优选的实施方案中，通过使用超声，即声波破碎进行裂解微生物的步骤。因此，也可以用高频声波裂解细胞。声波可以电学方法产生并通过金属尖端(metallic tip)传播至适当浓缩的细胞悬浮液。该声波破碎(或超声处理)基于在细胞悬浮液中空腔的产生而破坏细胞完整性。
6.机械裂解
在本发明的另一个优选的实施方案中，通过机械裂解进行裂解微生物的步骤。可以将细胞机械裂解并任选地匀浆，以便于烃(例如脂质)收集。例如，可以使用压强破裂器将含有细胞的浆液抽吸通过节流孔阀(restrictedorifice valve)。应用高压(高达1500巴)，随后通过输出喷嘴瞬间膨胀。细胞破裂通过三种不同的机制完成：阀门上的冲击，孔中的高液体剪切力，和排放时的突然压力下降，引起细胞爆裂。该方法释放细胞内分子。
或者可以使用球磨机。在球磨机中，将悬浮液中的细胞与小的磨粒例如珠子一起搅动。细胞由于剪切力、珠子之间的研磨和与珠子的碰撞而破裂。珠子破坏细胞，释放细胞内含物。也可以通过剪切力使细胞破裂，例如使用搅拌(例如使用高速或韦林搅拌器)、弗氏压碎器或甚至在弱细胞壁的情况下通过离心使细胞破裂。
7.通过渗透压休克(细胞溶解)来裂解细胞
在本发明的另一个优选的实施方案中，通过应用渗透压休克进行裂解微生物的步骤。
8.用裂解性病毒感染
在本发明的一个优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括用裂解性病毒感染微生物。已知适用于本发明的裂解微生物的多种病毒，并且针对具体微生物选择和使用具体的裂解性病毒属于本领域的技术水平内。
例如，绿草履虫-小球藻(paramecium bursaria chlorella)病毒(PBCV-1)是一类(藻类DNA病毒科(Phycodnaviridae)，绿藻病毒属(Chlorovirus))巨大的二十面体的形成噬斑的双链DNA病毒，该病毒在某些单细胞、真核小球藻属样绿藻中复制并将其裂解。因此，可以通过用合适的小球藻病毒感染培养物，裂解任一易感的微藻。用小球藻属病毒感染小球藻属物种的方法是已知的。见例如Adv.Virus Res.2006；66：293-336；Virology，1999Apr 25；257(1)：15-23；Virology，2004 Jan 5；318(1)：214-23；Nucleic AcidsSymp.Ser.2000；(44)：161-2；J.Virol.2006 Mar；80(5)：2437-44；和Annu.Rev.Microbiol.1999；53：447-94。
9.自溶(表达裂解性基因)
在本发明的另一个优选的实施方案中，裂解微生物的步骤包括自溶。在这一实施方案中，将根据本发明的微生物遗传改造为生产裂解性蛋白质，所述蛋白质会裂解微生物。可以使用诱导型启动子表达该裂解性基因，从而可以首先将细胞在发酵罐中培养至想要的密度，然后诱导启动子表达裂解性基因来裂解细胞。在一个实施方案中，裂解性基因编码多糖降解酶。
在某些其他实施方案中，裂解性基因是来自裂解性病毒的基因。因此，可以在小球藻属例如原壳小球藻的藻类细胞中表达例如来自小球藻属病毒的裂解性基因。
在本文中关于脂肪酶基因的表达描述了合适的表达方法。优选地使用诱导型启动子完成裂解性基因的表达，所述启动子为例如在微藻中有活性的由刺激诱导的启动子，所述刺激例如为小分子、光、热的存在和其他刺激。来自小球藻属病毒的裂解性基因是已知的。例如参见Virology 260，308-315(1999)；FEMS Microbiology Letters 180(1999)45-53；Virology 263，376-387(1999)；和Virology 230，361-368(1997)。
B.提取脂质和烃
可以通过用有机溶剂提取回收本发明的微生物产生的脂质和烃。在一些情况下，优选的有机溶剂是己烷。通常将有机溶剂直接添加进裂解物中，而不事先分离裂解物组分。在一个实施方案中，将通过一种或多种上述方法产生的裂解物与有机溶剂接触一段时间，所述时间足以允许脂质和/或烃与有机溶剂形成溶液。在一些情况下，可以随后将溶液进一步精制，以回收特定的想要的脂质或烃组分。己烷提取方法是本领域公知的。
VII.加工脂质和烃的方法
A.酶修饰
可以通过使用一种或多种如上文所述的酶(包括脂肪酶)，修饰本文所述的细胞生产的烃(例如脂质、脂肪酸、醛、醇和烷)。当烃处于细胞的细胞外环境中时，可以在下述条件下向该环境中添加一种或多种酶，所述条件中酶修饰烃或者完成其从烃前体的合成。或者可以在添加一种或多种催化剂例如酶之前，将烃从细胞材料中部分或完全分离。这类催化剂是外源添加的，并且它们的活性在细胞外或体外发生。
B.热修饰和其他催化修饰
可以通过常规手段，将本文所述的通过细胞体内生产或经过酶体外修饰的烃任选地进一步加工。加工可以包括“裂化”以减小尺寸，并进而提高烃分子的氢∶碳比例。催化裂化和热裂化的方法是烃和甘油三酯油加工中常规使用的。催化方法涉及催化剂例如固体酸催化剂的使用。催化剂可以是二氧化硅-氧化铝或沸石，其导致碳-碳键的异裂(heterolytic breakage)或不对称断裂，得到碳阳离子和氢化物阴离子。这些反应性中间产物随后经历重排或与另一烃的氢化物传递。反应因此可以再生中间产物，得到自我增长链机制。也可以加工烃，减少其中的碳-碳双键或三键数量，任选地减少至零。也可以加工烃，去除或消除其中的环或环状结构。也可以加工烃，以提高氢∶碳比例。这可包括氢的加成(“氢化”)和/或将烃“裂化”为更小的烃。
热学方法涉及使用提高的温度和压强减小烃尺寸。可以使用约800℃的提高的温度和约700kPa的压强。这些条件产生“轻的”烃分子，同时也通过缩合产生相对缺乏氢的更重的烃分子，所述术语“轻的”有时用于表示富含氢的烃分子(通过光子通量区分)。该方法提供均裂或对称断裂并产生烯，所述烯可以任选地如上文所述酶促饱和。
催化方法和热学方法在烃加工和油精炼的工厂中是标准的。因此，可以通过常规手段收集并加工或精制通过本文所述的细胞生产的烃。对微藻生产的烃进行加氢裂化的报道见Hillen等(Biotechnology andBioengineering，Vol.XXIV：193-205(1982))。在备选的实施方案中，用另一催化剂处理该级分，所述催化剂例如有机化合物、热和/或无机化合物。为了将脂质加工为生物柴油，如本文第IV部分中所述使用酯交换方法。
通过本发明的方法生产的烃适用于多种工业应用。例如，直链烷基苯磺酸(LAS)的生产使用一般包含10-14个碳原子链的烃，所述LAS是几乎所有类型洗涤剂和清洁制剂中使用的阴离子表面活性剂。见例如美国专利号：6,946,430；5,506,201；6,692,730；6,268,517；6,020,509；6,140,302；5,080,848；和5,567,359。表面活性剂例如LAS可用于个人护理组合物和洗涤剂，例如美国专利号：5,942,479；6,086,903；5,833,999；6,468,955；and6,407,044中所述的个人护理组合物和洗涤剂的生产中。
VIII.生产适用于柴油机运输工具和喷气式发动机的燃料的方法
对生物起源的烃组分在燃料(例如生物柴油、可再生柴油和喷气式发动机燃料)中的使用存在越来越高的兴趣，因为能够获得并且期望使用可再生的生物原材料，所述可再生的生物原材料能够代替来自化石燃料的原材料。对于从生物材料生产烃组分的方法存在紧迫的需求。本发明通过提供用于生产生物柴油、可再生柴油和喷气式发动机燃料的方法满足了这一需求，所述方法使用本文所述方法产生的脂质作为生物材料生产生物柴油、可再生柴油和喷气式发动机燃料。
传统的柴油燃料是富含石蜡烃的石油馏出液。它们的沸腾范围宽达370 °F到780 °F，这适用于在压缩燃烧发动机例如柴油发动机车辆中燃烧。The American Society of Testing and Materials(ASTM)根据沸腾范围与其他燃料特性例如十六烷值、浊点、闪点、粘度、苯胺点、硫含量、水含量、灰分含量、铜条腐蚀和残炭值的许可范围一起，建立了柴油级别。从技术上讲，可以将来自生物量或者以其他方式满足适当的ASTM规格的任一烃馏出液材料定义为柴油燃料(ASTM D975)、喷气式发动机燃料(ASTMD1655)或生物柴油(ASTM D6751)。
提取后，可以对从本文所述的微生物生物量中回收的脂质和/或烃组分进行化学处理，以生产用于柴油车辆和喷气式发动机的燃料。
A.生物柴油
生物柴油是一种液体，其颜色取决于生产原料而在金色和深棕色之间变化。其实践中不与水混溶，具有高沸点和低蒸汽压。生物柴油是指用于柴油发动机车辆的与柴油等同加工的燃料。生物柴油是生物可降解并且无毒的。生物柴油相对于传统柴油燃料的一个额外的益处是更低的发动机磨损。
通常，生物柴油包含C14-C18烷基酯。多种方法将如本文所述生产和分离的生物量或脂质转化为柴油燃料。生产生物柴油的一种优选的方法是如本文所述通过脂质的酯交换进行。用作生物柴油的一种优选的烷基酯是甲酯或乙酯。
在大部分现代柴油发动机车辆中，通过本文所述的方法生产的生物柴油可以单独使用，或者以任一浓度与常规柴油燃料掺合使用。与常规柴油燃料(石油柴油)掺合时，可存在从约0.1％到约99.9％的生物柴油。世界上大部分地区使用“B”因数体系来说明任一燃料混合物中生物柴油的量。例如，含有20％生物柴油的燃料被标记为B20。纯生物柴油称作B100。
生物柴油也可以用作家用锅炉或商业锅炉中的加热燃料。现有的燃油锅炉可含有橡胶部分，并且需要转化以使用生物柴油。转化方法通常是相对简单的，所述方法涉及将橡胶部分更换为合成部分，因为生物柴油是强溶剂。由于生物柴油的强溶剂能力，燃烧生物柴油会提高锅炉的效率。
生物柴油可用作柴油制剂中的添加剂，以提高纯超低硫柴油(ULSD)燃料的润滑性，这是有利的，因为其实质上不含硫。
生物柴油是比石油柴油更好的溶剂，并可用于分解先前使用石油柴油的车辆的燃料管道中的残余沉积物。
1.生物柴油的生产
可以通过富含油的生物量中含有的甘油三酯的酯交换生产生物柴油。因此，在本发明的另一方面中，提供了生产生物柴油的方法。在一个优选的实施方案中，生产生物柴油的方法包括步骤：(a)使用本文公开的方法培养含有脂质的微生物，(b)裂解含有脂质的微生物，产生裂解物，(c)从裂解的微生物中分离脂质，和(d)对脂质组合物进行酯交换，从而生产生物柴油。
上文已描述了用于培养微生物、裂解微生物产生裂解物、在包含有机溶剂的培养基中处理裂解物以形成异源混合物和将处理过的裂解物分离进脂质组合物中的方法，并且所述方法也可以在生产生物柴油的方法中使用。
可以对脂质组合物进行酯交换，得到可用作生物柴油的长链脂肪酸酯。优选的酯交换反应在下文概述，并且包括碱催化的酯交换和使用重组脂肪酶的酯交换。
在碱催化的酯交换方法中，在存在碱性催化剂时将甘油三酯与醇例如甲醇或乙醇反应，所述碱性催化剂通常为氢氧化钾。该反应形成甲酯和乙酯，和作为副产物的丙三醇(甘油)。
a).一般的化学方法
动物和植物油脂通常由甘油三酯组成，所述甘油三酯是游离脂肪酸与三元醇甘油的酯。在酯交换中，用短链醇例如甲醇或乙醇置换甘油三酯(TAG)中的甘油。典型的反应流程图如下：
在该流程图中，用碱将醇脱质子化，使其成为更强的亲核体。通常，大幅过量(多达50倍)地使用乙醇或甲醇。正常时，该反应会非常缓慢地进行或完全不进行。可以使用热以及酸或碱帮助反应更迅速地进行。酯交换反应不消耗酸或碱，所以它们不是反应物而是催化剂。使用碱催化的技术生产了几乎所有的生物柴油，因为这一技术仅需要低温和压强，并且得到超过98％的转化率(条件是起始油的水分和脂肪酸含量低)。
b).使用重组脂肪酶
已使用酶例如脂肪酶代替碱实验地进行了酯交换反应。脂肪酶催化的酯交换可以例如在室温和80℃之间的温度下，大于1∶1，优选约3∶1的TAG：低级醇摩尔比下进行。
适用于酯交换的脂肪酶包括但不限于表9中所列的脂肪酶。适用于酯交换的脂肪酶的其他例子见例如美国专利号4,798,793；4,940,8455,156,963；5,342,768；5,776,741和WO89/01032。
表9.适用于酯交换的脂肪酶。
黑曲霉脂肪酶ABG73614、南极洲假丝酵母(CandidaAntarctica)脂肪酶B(novozym-435)CAA83122、Candida cylindracea脂肪酶AAR24090、溶脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶(脂肪酶L；Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.)、皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶(例如，脂肪酶-OF；Meito Sangyo Co.，Ltd.)、米黑毛霉(Mucor miehei)脂肪酶(Lipozyme IM 20)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)脂肪酶AAA25882、日本根霉(Rhizopusjaponicas)脂肪酶(Lilipase A-10FG)Q7M4U7_1、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶B34959、稻根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶(Lipase F)AAF32408、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)脂肪酶(SM Enzyme)ABI13521、Thermomyces lanuginosa脂肪酶
CAB58509、脂肪酶P(Nagase ChemteX Corporation)和脂肪酶QLM(Meito Sangyo Co.，Ltd.，Nagoya，Japan)
使用脂肪酶生产适用于生物柴油的脂肪酸酯的一个挑战是脂肪酶的价格比强碱方法使用的氢氧化钠(NaOH)的价格高得多。通过使用可以循环使用的固定化脂肪酶解决了这一挑战。然而，固定化脂肪酶必须在再循环最小循环数之后保持其活性，以允许基于脂肪酶的方法在生产成本方面与强碱方法竞争。通过酯交换中通常使用的低级醇，使固定的脂肪酶中毒。美国专利号6,398,707(Wu等2008年6月4日公开)描述了增强固定的脂肪酶活性并再生活性降低的固定脂肪酶的方法。
在具体的实施方案中，在下述相同微生物中表达重组脂肪酶，所述微生物生产所述脂肪酶所作用的脂质。合适的重组脂肪酶包括下述脂肪酶，其列于上表9中和/或具有上表9中所列的GenBank检索号，或者是与上表9中所列脂肪酶之一具有至少70％氨基酸同一性并且显示脂肪酶活性的多肽。在另外的实施方案中，酶活性存在于下述序列中，所述序列与上述序列之一具有至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约99％的同一性，所述序列均并入本文作为参考，就好像被完全公开一样。编码脂肪酶和选择标记的DNA优选是密码子优化的cDNA。为了在微藻中表达将基因再编码的方法描述于美国专利7,135,290中。
2.标准
生物柴油的通用国际标准是EN 14214。ASTM D6751是美国和加拿大引用的最常用的生物柴油标准。德国使用DIN EN 14214，英国要求与BSEN 14214相容。
测定产物是否符合这些标准的基本工业测试通常包括气相层析、HPLC和其他。满足品质标准的生物柴油是非常无毒的，其毒性等级(LD50)大于50mL/kg。
B.可再生柴油
可再生柴油包含烷，例如C16:0和C18:0，并因此可与生物柴油区别开。高品质的可再生柴油符合ASTM D975标准。
本发明的方法生产的脂质能够用作生产可再生柴油的原料。因此，在本发明的另一方面中，提供了用于生产可再生柴油的方法。可以通过至少三种过程生产可再生柴油：热液处理(加氢处理)；氢化处理；和间接液化。这些过程产生非酯馏出液。在这些过程期间，如本文所述生产和分离的甘油三酯被转化为烷。
在一个优选的实施方案中，用于制备可再生柴油的方法包括(a)使用本文公开的方法培养含有脂质的微生物，(b)裂解微生物以产生裂解物，(c)从裂解的微生物中分离脂质，和(d)对脂质脱氧和加氢处理以产生烷，从而生产可再生柴油。可以通过使用有机溶剂例如己烷从微生物生物量中提取，或者通过其他方法例如美国专利5,928,696中所述方法，获得适用于制造可再生柴油的脂质。
在一些方法中，首先对微生物脂质进行裂化以及加氢处理，分别用于减少碳链长度和饱和双键。然后对材料异构化连同加氢处理。然后可以通过蒸馏去除石脑油(naptha)级分，随后通过额外的蒸馏使柴油燃料中想要的组分蒸发和蒸馏以满足D975标准，同时留下比为了满足D975标准所期望的更重的组分。化学修饰油的加氢处理、加氢裂化、脱氧和异构化方法是本领域公知的，所述油包括甘油三酯油。见例如欧洲专利申请EP1741768(A1)；EP1741767(A1)；EP1682466(A1)；EP1640437(A1)；EP1681337(A1)；EP1795576(A1)；和美国专利7,238,277；6,630,066；6,596,155；6,977,322；7,041,866；6,217,746；5,885,440；6,881,873。
1.加氢处理
在生产可再生柴油的方法的一个优选的实施方案中，通过脂质组合物的加氢处理来处理脂质，产生烷。在热液处理中，通常在提高的温度和压强下使生物量在水中反应，形成油和残余固体。转化温度通常为300°F到660°F，压强是足以保持水基本上为液体的压强：100到170个标准大气压(atm)。反应时间在15到30分钟的数量级上。反应完成后，将有机物与水分离。从而生产了适用于柴油的馏出液。
2.氢化处理
可以通过传统的氢化处理技术从脂肪酸生产可再生的柴油，称作“绿色柴油”。含甘油三酯的油可以作为石油的共同补料或者作为专用的补料进行氢化处理。产物是符合ASTM D975规格的柴油燃料。因此，在用于生产可再生柴油的方法的另一个优选的实施方案中，通过对脂质组合物的氢化处理进行脂质组合物的处理，产生烷。
在制造可再生柴油的一些方法中，处理甘油三酯的第一步是氢化处理使双键饱和，然后在提高的温度下存在氢和催化剂时脱氧。在一些方法中，氢化和脱氧在同一反应中发生。在其他方法中，脱氧在氢化之前发生。然后任选地进行异构化，所述异构化也在存在氢和催化剂时进行。优选通过蒸馏去除石脑油组分。例如见美国专利5,475,160(甘油三酯的氢化)；5,091,116(脱氧、氢化并去除气体)；6,391,815(氢化)；和5,888,947(异构化)。
石油精炼器通过用氢处理补料，使用氢化处理去除杂质。氢化处理转化温度通常为300°F到700°F。压强通常为40到100atm。反应时间通常在10到60分钟的数量级上。
使用固体催化剂提高某些反应速率，改进对某些产物的选择性，和优化氢消耗。
加氢处理和氢化处理最终导致补料的分子量的减小。在含甘油三酯的油的情况下，在氢化处理的条件下，甘油三酯分子被还原为四种烃分子：丙烷分子和通常在C8到C18范围内的三种更重的烃分子。
3.间接液化
可以通过两步骤的过程从任一形式的生物量生产传统的超低硫柴油。首先将生物量转化为合成气，其为富含氢和一氧化碳的气态混合物。然后将合成气催化转化为液体。通常，使用Fischer-Tropsch(FT)合成完成液体的生产。该技术适用于煤、天然气和重油。因此，在用于生产可再生柴油的方法的另一个优选的实施方案中，处理脂质组合物产生烷是通过脂质组合物的间接液化进行的。
C.喷气式发动机燃料
2006年美国一年使用的喷气式发动机燃料约为210亿加仑(约800亿升)。航空燃料从澄清到淡黄色。最常见的燃料是归类为航空A-1的不含铅/基于石蜡油的燃料，其根据一组国际标准化规格生产。航空燃料是大量不同烃的混合物，所述烃可能多达一千或更多。它们的尺寸范围(分子量或碳数量)受产物需求例如凝固点或发烟点的限制。Kerosone-型航空燃料(包括Jet A和Jet A-1)具有约8和16个碳数量之间的碳数量分布。宽馏分(wide-cut)或石脑油型航空燃料(包括Jet B)通常具有约5和15个碳之间的碳数量分布。
两种航空燃料(Jet A和jet B)均可含有多种添加剂。有用的添加剂包括但不限于抗氧化剂、抗静电剂、腐蚀抑制剂和燃料体系结冰抑制剂(FSII)。抗氧化剂预防胶质化，并通常基于烷基化的酚，例如AO-30、AO-31或AO-37。抗静电剂驱散静电并预防起火花。含有二壬基萘磺酸(DINNSA)作为活性成分的Stadis 450是一个例子。腐蚀抑制剂例如DCI-4A被用于民用和军用燃料，DCI-6A被用于军用燃料。FSII剂包括例如Di-EGME。
一种溶液将藻类燃料与现有喷气式发动机燃料掺合。本发明提供了这样的溶液。通过本发明方法生产的脂质可以用作生产喷气式发动机燃料的原料。因此，在本发明的另一个方面中，提供了用于生产喷气式发动机燃料的方法。本文中提供了从通过本发明的方法生产的脂质中生产喷气式发动机燃料的两种方法：流体催化裂化(FCC)和加氢脱氧(Hydrodeoxygenation，HDO)。
1.流体催化裂化
流体催化裂化(FCC)是用于从重质石油馏分生产烯烃，特别是丙烯的一种方法。据文献报道，可以使用FCC加工植物油例如芸苔油，得到可用作汽油燃料的烃流。
可以将通过本发明的方法生产的脂质转化为烯烃。该过程涉及将生产的脂质流过FCC区并收集由烯烃组成的产物流，所述产物可用作喷气式发动机燃料。在裂化条件下将生产的脂质与裂化催化剂接触，提供包含烯烃和烃的可用作喷气式发动机燃料的产物流。
在一个优选的实施方案中，用于生产喷气式发动机燃料的方法包括(a)使用本文公开的方法培养含脂质的微生物，(b)裂解含脂质的微生物，产生裂解物，(c)从裂解物中分离脂质，和(d)处理脂质组合物，从而生产喷气式发动机燃料。
在生产喷气式发动机燃料的方法的一个优选的实施方案中，可以将脂质组合物流过流体催化裂化区，所述方法在一个实施方案中可包括在裂化条件下将脂质组合物与裂化催化剂接触，提供包含C2-C5烯烃的产物流。
在这一方法的某些实施方案中，期望去除脂质组合物中可能存在的任一污染物。因此，在将脂质组合物流过流体催化裂化区之前，预处理脂质组合物。预处理可涉及将脂质组合物与离子交换树脂接触。离子交换树脂是酸性离子交换树脂，例如AmberlystTM-15，并可在脂质组合物向上或向下流过的反应器中用作床体。其他预处理可包括通过将脂质组合物与酸接触的温和酸冲洗，所述酸例如为硫酸、乙酸、硝酸或盐酸。通常在室温和大气压下用稀释的酸溶液完成接触。
将任选地经过预处理的脂质组合物流过FCC区，在所述区域中烃(hydrocarbonaceous)组分被裂化为烯烃。通过将脂质组合物在反应区中与催化剂接触完成催化裂化，所述催化剂由细分的微粒材料组成。与加氢裂化相对，该反应是催化裂化，并且在不添加氢或消耗氢时进行。随着裂化反应的进行，催化剂上沉积了大量焦炭。通过在再生区中燃烧来自催化剂的焦炭，在高温下使催化剂再生。将本文中称作“焦化催化剂”的含焦炭催化剂持续地从反应区运输至再生区使其再生，并替换为来自再生区的基本不含焦炭的经过再生的催化剂。通过多种气流使催化剂颗粒流态化，允许催化剂在反应区和再生区之间运输。在流态化的催化剂流中裂化烃(例如本文所述的脂质组合物)的方法，将催化剂在反应区和再生区之间运输的方法，和在再生器中燃烧焦炭的方法是FCC方法领域中技术人员所公知的。示范性的FCC应用和适用于裂化脂质组合物产生C2-C5烯烃的催化剂描述于美国专利号6,538,169、7,288,685中，所述专利通过参考整体并入。
在一个实施方案中，裂化本发明的脂质组合物发生在FCC区的提升器(riser)部分或抬升器(lift)部分中。通过喷嘴将脂质组合物引入提升器中，导致脂质组合物的迅速汽化。在接触催化剂之前，脂质组合物通常会具有约149℃到约316℃(300°F到600°F)的温度。催化剂从掺合容器中流至提升器，在提升器中与脂质组合物接触约2秒或更少的时间。
然后通过出口从提升器顶部释放经过掺合的催化剂和经过反应的脂质组合物，并分离成为经过裂化的含烯烃的产物蒸汽流，和一组被大量焦炭覆盖的催化剂颗粒，通常称作“焦化的催化剂”。在最小化脂质组合物和催化剂的接触时间的努力中，可以使用分离器的任一排列例如漩涡臂(swirlarm)排列，从产物流中快速去除焦化的催化剂，所述接触时间可促进想要的产物进一步转化为不想要的其他产物。分离器例如漩涡臂分离器位于炉室的上部，提馏区(stripping zone)位于炉室的下部。通过漩涡臂排列分离的催化剂掉入提馏区中。经过裂化的产物蒸汽流通过与旋流器(cyclones)连接的管道排出炉室，所述产物包含经裂化的烃和一些催化剂，所述烃包括轻烯烃。旋流器从产物蒸汽流中去除剩余的催化剂颗粒，将颗粒浓度降至非常低的水平。产物蒸汽流随后排出分离管的顶部。通过旋流器分离的催化剂返回分离管中，然后返回提馏区。提馏区通过与气流的对向流(counter-current flow)接触，从催化剂的表面上去除吸附的烃。
低的烃分压发挥有助于轻烯烃的生产。因此，将提升器压强设定为约172到241kPa(25到35psia)，烃分压约为35到172kPa(5到25psia)，优选的烃分压约为69到138kPa(10到20psia)。该相对低的烃分压通过使用气流作为稀释剂达到下述程度来实现，所述程度为稀释剂占脂质组合物的10到55wt-％，优选占脂质组合物的约15wt-％。可以使用其他稀释剂例如干气来达到等同的烃分压。
提升器出口处经过裂化的物流的温度应为约510℃到621℃(950°F到1150°F)。然而，高于566℃(1050°F)的提升器出口温度产生更多的干气和更多的烯烃。然而，低于566℃(1050°F)的提升器出口温度产生更少的乙烯和丙烯。因此，优选在约566℃到约630℃的优选温度、约138kPa到约240kPa(20到35psia)的优选压强下进行FCC过程。用于该过程的另一条件是催化剂与脂质组合物的比例，其可以从约5到约20变化，优选地从约10到约15变化。
在用于生产喷气式发动机燃料的方法的一个实施方案中，将脂质组合物引入FCC反应器的抬升部分中。抬升部分中的温度应当非常热，其范围从约700℃(1292°F)到约760℃(1400°F)，催化剂与脂质组合物的比例为约100到约150。预期将脂质组合物引入抬升器部分中会产生可观量的丙烯和乙烯。
可以通过气相层析、HPLC等分析产生的气态和液态烃产物。
2.加氢脱氧
在使用如本文所述生产的脂质组合物或脂质生产喷气式发动机燃料的方法的另一个实施方案中，通过称作加氢脱氧(HDO)的过程破坏脂质组合物或脂质的结构。
HDO表示借助于氢去除氧，也就是说，去除氧同时破坏材料的结构。将烯烃双键氢化并去除任一硫和氮化合物。硫去除称作加氢脱硫(HDS)。预处理和原材料(脂质组合物或脂质)的纯度有助于催化剂的使用寿命。
通常在HDO/HDS步骤中，将氢与原料(脂质组合物或脂质)混合，然后使混合物作为单相或两相原料，作为并向流通过催化剂床。HDO/MDS步骤后，分离产物级分并使其经过单独的异构化反应器。用于生物原材料的异构化反应器作为并向流反应器描述于文献中(FI 100 248)。
也可以如下进行通过氢化烃补料(例如本文的脂质组合物或脂质)生产燃料的过程：将脂质组合物或脂质作为并向流与氢气一起通过第一氢化区，之后通过将氢气作为相对于烃流出物的对向流经过第二氢化区，在第二氢化区中进一步氢化烃流出物。适用于裂化脂质组合物产生C2-C5烯烃的示范性HDO应用和催化剂描述于例如美国专利号7,232,935中，所述专利完整并入本文作为参考。
通常在加氢脱氧步骤中，分解生物组分(例如本文的脂质组合物或脂质)的结构，去除氧、氮、磷和硫化合物和轻烃，并氢化烯键。在该过程的第二步骤中，即所谓的异构化步骤中，进行异构化从而使烃链分支并改进石蜡在低温下的性能。
在第一步骤中，即裂化过程的HDO步骤中，将要氢化的氢气和本文的脂质组合物或脂质作为并向流或对向流经过HDO催化床体系，所述催化床体系包含一种或多种催化床，优选包含1-3种催化床。HDO步骤通常以并向流方式进行。在包含两种或更多催化床的HDO催化床体系的情况下，可以使用对向流原则操作一种或多种床。
在HDO步骤中，压强在20和150巴之间变化，优选在50和100巴之间变化，温度在200℃和500℃之间变化，优选在300-400℃的范围内。
在HDO步骤中，可以使用下述已知氢化催化剂，其含有来自周期表VII族和/或VIB族的金属。优选氢化催化剂是受支持的Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，支持物为氧化铝和/或二氧化硅。通常使用NiMo/Al2O3和CoMo/Al2O3催化剂。
在HDO步骤之前，可以任选地在更温和的条件下通过预氢化处理本文的脂质组合物或脂质，进而避免双键的副反应。在存在预氢化催化剂时，50-400℃的温度下和1-200巴的氢压强下，优选在150和250℃之间的温度下和10和100巴之间的氢压强下进行这类预氢化。催化剂可含有来自周期表的VIII和/或VIB族金属。优选预氢化催化剂是受支持的Pd、Pt、Ni、NiMo或CoMo催化剂，支持物为氧化铝和/或二氧化硅。
冷却来自HDO步骤的含氢气流，然后从中去除一氧化碳、二氧化碳、氮、磷和硫化合物、气态轻烃和其他杂质。压缩后使纯化的氢或再循环的氢返回第一催化剂床和/或催化剂床之间，以弥补取出的气流。从压缩的液体中除去水分。使液体经过第一催化剂床或催化剂床之间。
在HDO步骤后，对产物进行异构化步骤。对这一过程而言重要的是在烃与异构化催化剂接触之前，尽可能完全地去除杂质。异构化步骤包括任选的提馏步骤，其中可以通过用水蒸气或者合适的气体提馏来纯化来自HDO步骤的反应产物，所述合适的气体例如为轻烃、氮或氢。任选的提馏步骤在异构化催化剂上游的单元中以对向流方式进行，所述单元中气体和液体彼此接触，或者在实际的异构化反应器之前，在利用对向流原理的独立的提馏单元中进行。
提馏步骤后，使氢气和经过氢化的本文的脂质组合物或脂质，和任选地使正石蜡混合物经过反应性异构化单元，所述单元包含一种或若干种催化剂床。异构化步骤的催化剂床可以通过并向或对向流的方式运作。
对该过程而言重要的是，对异构化步骤应用对向流原则。在异构化步骤中，这通过以对向方式进行任选的提馏步骤或异构化反应步骤或二者而完成。
异构化步骤和HDO步骤可以在相同的压力容器中或单独的压力容器中进行。与HDO和异构化步骤一样，任选的预氢化可以在单独的压力容器中进行，或者在相同的压力容器中进行。
在异构化步骤中，压强在20到150巴的范围内变化，优选在20-100巴的范围内变化，温度在200和500℃之间，优选在300和400℃之间。
在异构化步骤中，可以使用本领域已知的异构化催化剂。合适的异构化催化剂含有分子筛和/或来自VII族的金属和/或运载体。优选异构化催化剂含有SAPO-11或SAPO41或ZSM-22或ZSM-23或镁碱沸石和Pt、Pd或Ni和Al2O3或SiO2。典型的异构化催化剂为例如Pt/SAPO-11/Al2O3、Pt/ZSM-22/Al2O3、Pt/ZSM-23/Al2O3和Pt/SAPO-11/SiO2。
作为产物，获得适合用作柴油燃料或其组分的生物起源的高品质烃组分，所述烃组分的密度、十六烷值和低温性能是极佳的。
IX.微生物改造
如上文所述，在本发明的某些实施方案中，期望遗传修饰微生物，以增强微生物的脂质生产、修饰微生物产生的组分的特性或比例，或改进或提供在多种原料材料上从头生长特征。小球藻属，尤其是原壳小球藻、微小小球藻、Chlorella sorokiniana、椭圆小球藻、小球藻属物种和Chlorellaemersonii是用于本文所述的遗传改造方法中的优选的微生物，尽管可以使用其他小球藻属物种以及微生物的其他变种。
可以使用从天然来源分离的片段，通过克隆技术生产启动子、cDNA和3’UTR以及载体的其他元件(见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook等，第3版，2001，Cold Spring Harbor Press；和美国专利4,683,202)。或者，可以使用已知方法合成产生元件(见例如Gene.1995Oct 16；164(1)：49-53)。
A.针对表达的密码子优化
编码要在微生物中表达的多肽的DNA优选是密码子优化的Cdna，所述多肽例如为脂肪酶或选择标记。为了在微藻中表达而对基因再编码的方法描述于美国专利7,135,290中。可以在例如GenBank的密码子选择数据库中获得密码子优化的其他信息。作为非限制性的例子，表10、11和12中分别展示了蛋白核小球藻、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)和原壳小球藻中的密码子选择。
表10.蛋白核小球藻中的密码子使用
Phe UUU 39(0.82) Ser UCU 50(1.04)UUC 56(1.18) UCC 60(1.25)Leu UUA 10(0.20) UCA 6(0.96)UUG 46(0.91) UCG 43(0.89)Tyr UAU 15(0.59) Cys UGU 46(0.77)UAC 36(1.41) UGC 73(1.23)ter UAA 9(0.00) ter UGA 43(0.00)ter UAG 15(0.00) Trp UGG 69(1.00)Leu CUU 49(0.97) Pro CCU 80(0.98)CUC 73(1.45) CCC 88(1.08)CUA 22(0.44) CCA 93(1.14)CUG 103(2.04) CCG 65(0.80)His CAU 50(0.88) Arg CGU 39(0.76)CAC 3(1.12) CGC 63(1.23)G1n CAA 59(0.84) CGA 46(0.90)CAG 2(1.16) CGG 47(0.92)Ile AUU 24(0.69) Thr ACU 32(0.67)AUC 61(1.76) ACC 76(1.60)AUA 19(0.55) ACA 41(0.86)Met AUG 42(1.00) ACG 41(0.86)Asn AAU 26(0.75) Ser AGU 23(0.48)AAC 3(1.25) AGC 67(1.39)Lys AAA 32(0.54) Arg AGA 51(1.00)AAG 86(1.46) AGG 61(1.19)Val GUU 36(0.75) Ala GCU 57(0.79)GUC 54(1.13) GCC 97(1.34)GUA 30(0.63) GCA 89(1.23)GUG 71(1.49) GCG 47(0.65)Asp GAU 60(0.95) Gly GGU 3 5(0.60)GAC 66(1.05) GGC 78(1.33)Glu GAA 41(0.68) GGA 54(0.92)GAG 80(1.32) GGG 67(1.15)
表11.盐生杜氏藻中优选的密码子使用
TTC (Phe) TAC (Tyr) TGC (Cys) TAA (终止)TGG (Trp) CCC (Pro) CAC (His) CGC (Arg)CTG (Leu) CAG (Gln) ATC (Ile) ACC (Thr)AAC (Asn) AGC (Ser) ATG (Met) AAG (Lys)GCC (Ala) GAC (Asp) GGC (Gly) GTG (Val)
GAG (Glu)
表12.原壳小球藻中优选的密码子使用
TTC(Phe) TAC(Tyr) TGC(Cys) TGA(终止)TGG(Trp) CCC(Pro) CAC(His) CGC(Arg)CTG(Leu) CAG(Gln) ATC(Ile) ACC(Thr)GAC(Asp) TCC(Ser) ATG(Met) AAG(Lys)GCC(Ala) AAC(Asn) GGC(Gly) GTG(Val)GAG(Glu)
B.启动子
许多启动子在微藻中有活性，包括对被转化的藻类而言内源的启动子，以及对被转化的藻类而言不是内源的启动子(即来自其他藻类的启动子，来自高等植物的启动子，和来自植物病毒或藻类病毒的启动子)。在微藻中有活性的外源和/或内源启动子，和在微藻中有功能的抗生素抗性基因由例如以下描述：Curr Microbiol.1997 Dec；35(6)：356-62(小球藻)；MarBiotechnol(NY).2002 Jan；4(1)：63-73(椭圆小球藻)；Mol Gen Genet.1996Oct16；252(5)：572-9(三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum))；Plant MolBiol.1996 Apr；31(1)：1-12(团藻(Volvox carteri)；Proc Natl Acad Sci U S A.1994 Nov 22；91(24)：11562-6(团藻)；Falciatore A，Casotti R，Leblanc C，Abrescia C，Bowler C，PMID：10383998，1999 May；1(3)：239-251(Laboratory of Molecular Plant Biology，Stazione Zoologica，VillaComunale，I-80121 Naples，意大利)(三角褐指藻和威氏海链藻)；PlantPhysiol.2002 May；129(1)：7-12.(紫球藻属物种(Porphyridium sp.))；ProcNatl Acad Sci U S A.2003 Jan 21；100(2)：438-42.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhaidtii)；Proc Natl Acad Sci U S A.1990Feb；87(3)：1228-32.(莱茵衣藻)；Nucleic Acids Res.1992 Jun25；20(12)：2959-65；Mar Biotechnol(NY).2002 Jan；4(1)：63-73(小球藻属)；Biochem Mol Biol Int.1995 Aug；36(5)：1025-35(莱茵衣藻)；J Microbiol.2005 Aug；43(4)：361-5(杜氏藻属)；Yi Chuan Xue Bao.2005Apr；32(4)：424-33(杜氏藻属)；Mar Biotechnol(NY).1999May；1(3)：239-251.(海链藻属(Thalassiosira)和Phaedactylum)；Koksharova，Appl Microbiol Biotechnol 2002 Feb；58(2)：123-37(多种物种)；Mol Genet Genomics.2004 Feb；271(1)：50-9(Thermosynechococcuselongates)；J.Bacteriol.(2000)，182，211-215；FEMS Microbiol Lett.2003Apr 25；221(2)：155-9；Plant Physiol.1994 Jun；105(2)：635-41；Plant MolBiol.1995 Dec；29(5)：897-907(聚球藻属PCC 7942)；Mar Pollut Bull.2002；45(1-12)：163-7(鱼腥藻属PCC 7120)；Proc Natl Acad Sci U S A.1984Mar；81(5)：1561-5(鱼腥藻属(多种株系))；Proc Natl Acad Sci U S A.2001Mar 27；98(7)：4243-8(集胞藻属(Synechocystis))；Wirth，Mol Gen Genet1989 Mar；216(1)：175-7(多种物种)；Mol Microbiol，2002Jun；44(6)：1517-31和Plasmid，1993 Sep；30(2)：90-105(Fremyelladiplosiphon)；Hall等(1993)Gene 124：75-81(莱茵衣藻)；Gruber等(1991).Current Micro.22：15-20；Jarvis等(1991)Current Genet.19：317-322(小球藻属)；其他启动子也见美国专利6,027,900的表1。
用于表达外源基因的启动子可以是天然与该基因相连的启动子，或者可以是异源基因。一些启动子在多于一种微藻物种中有活性。其他启动子是物种特异性的。优选的启动子包括下述启动子，例如来自莱茵衣藻的RBCS2和病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CMV)和小球藻属病毒，所述启动子显示在多种微藻物种中有活性(见例如Plant Cell Rep.2005Mar；23(10-11)：727-35；J Microbiol.2005 Aug；43(4)：361-5；Mar Biotechnol(NY).2002 Jan；4(1)：63-73)。在其他实施方案中，可以使用丛粒藻属苹果酸脱氢酶启动子，这样的核酸包含SEQ ID NO：3的任一部分，或者可以使用莱茵衣藻RBCS2启动子(SEQ ID NO：4)。任选地，使用含有这些序列的至少10、20、30、40、50或60或更多个核苷酸的启动子。对小球藻属的物种而言为内源的优选的启动子是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
适用于在小球藻属中表达外源基因的优选的启动子列于本申请的序列表中，例如小球藻属HUP1基因(SEQ ID NO：1)的启动子和椭圆小球藻硝酸还原酶启动子(SEQ ID NO：2)。也可以使用小球藻属病毒启动子在小球藻属中表达基因，例如美国专利6,395,965的SEQ ID NOs：1-7。在小球藻属中有活性的其他启动子可见于例如Biochem Biophys Res Commun.1994 Oct 14；204(1)：187-94；Plant Mol Biol.1994 Oct；26(1)：85-93；Virology.2004 Aug 15；326(1)：150-9；和Virology.2004 Jan 5；318(1)：214-23中。
C.选择标记
可以在适用于转化小球藻属的转基因构建体中使用多种选择标记中的任一种。合适的选择标记的例子包括硝酸还原酶基因，潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)、新霉素磷酸转移酶基因，和赋予腐草霉素抗性的ble基因。测定微藻对抗生素的敏感性的方法是公知的。例如Mol Gen Genet.1996 Oct16；252(5)：572-9。
更特别地，Dawson等(1997)，Current Microbiology 35：356-362(完整并入本文作为参考)描述了来自小球藻的硝酸还原酶(NR)基因作为NR-缺陷型Chlorella sorokiniana突变体的选择标记的用途。Kim等(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73(完整并入本文作为参考)描述了HPT基因作为用于转化Chorella ellipsoidea的选择标记的用途。Huang等(2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.72：197-205(完整并入本文作为参考)报道了Sh ble作为用于小球藻(Chlorella sp.)DT的选择标记的用途。
D.诱导型表达
本发明还提供了诱导型启动子表达目的基因的用途。具体地，使用这样的诱导型启动子表达脂肪酶基因允许在微生物生长后(必要时在调节条件后)产生脂肪酶，从而增强酯交换，例如在细胞破裂后，降低反应混合物的水含量和/或添加足量的醇，以驱动TAG转化成为脂肪酸酯。
可用于本发明的诱导型启动子包括应答刺激而介导有效连接的基因转录的启动子，所述刺激为例如外源提供的小分子(例如葡萄糖，如SEQ IDNO：1中)、温度(热或冷)、光等。合适的启动子能够活化基本沉默的基因的转录，或者上调、优选大幅上调以低水平转录的有效连接的基因的转录。在后一情况下，脂肪酶的转录水平优选不显著干扰表达它的微生物的生长。
转基因在小球藻属中的表达可以通过启动子诱导型地进行，所述启动子例如驱动小球藻属己糖转运蛋白基因的启动子(SEQ ID NO：1)。该启动子由培养基中葡萄糖的存在强烈活化。
E.两个或更多外源基因的表达
另外，经遗传改造的微生物例如微藻可包含并表达两种或更多外源基因，例如脂肪酶和裂解性基因，例如编码多糖降解酶的基因。可以使用诱导型启动子表达一种或两种基因，所述启动子允许待控制的这些基因表达的相对时间选择，以增强脂质产率和转化成为脂肪酸酯。两种或更多外源基因的表达可处于相同的诱导型启动子的控制下，或处于不同诱导型启动子的控制下。在后一情况下，可以在第一段时间中诱导第一外源基因的表达(期间可以诱导或不诱导第二外源基因的表达)，并且可以在第二段时间中诱导第二外源基因的表达(期间可以诱导或不诱导第一外源基因的表达)。本文中提供了改造生产脂质的微生物使其代谢蔗糖的载体和方法，代谢蔗糖是有利的性状，因为其允许经改造的细胞将甘蔗原料转化为脂质。
本文还提供了经遗传修饰的微生物株系(例如微藻、产油酵母、细菌或真菌)，其表达两种或更多外源基因，例如脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA/醛还原酶，所述酶的组合作用产生醇产物。还提供了外源基因的其他组合来生产醛，所述外源基因包括但不限于，脂肪酰基-ACP硫酯酶和脂肪酰基-CoA还原酶。另外，该申请提供了脂肪酰基-ACP硫酯酶、脂肪酰基-CoA还原酶和脂肪醛脱羰基酶的组合来生产烷。可以使用诱导型启动子表达一种或多种外源基因。
适用于本发明的其他修饰的例子包括遗传修饰微藻株系，以表达两种或更多外源基因，一种编码固定碳源(例如蔗糖)的转运蛋白，第二种编码蔗糖转化酶。与通过先前已知的生物烃生产方法可以获得的相比，得到的可发酵生物以更低的制造成本生产烃。上述两种外源基因的插入可以与通过定向诱变和/或随机诱变对多糖生物合成的破坏组合，所述组合驱动更大的碳通量进入烃生产。营养型转化、改变烃生产的改造和用外源酶处理这三者单独或组合改变微生物生产的烃组成。所述改变可以是生产的烃量，生产的一种或多种烃物类相对于其他烃的量，和/或微生物中生产的烃物类的类型的改变。例如，可以将微藻改造为生产更高量和/或百分比的TAG。
F.区室化的表达
本发明还提供了目的基因的区室化的表达。具体地，在具体的实施方案中，将脂肪酶的表达靶向一个或多个细胞区室可以是有利的，在所述区室中，脂肪酶与大部分细胞脂质隔离，直至酯交换反应开始。用于靶向的优选的细胞器为叶绿体、线粒体和内质网。
1.在叶绿体中表达
在本发明的一个实施方案中，多肽在微生物中的表达被靶向至叶绿体。将异源基因的表达靶向叶绿体的方法是已知的，并可以在本发明中使用。将外源基因产物靶向叶绿体中的方法描述于Shrier等，EMBO J.(1985)4：25 32。转运肽将核基因产物易位进入叶绿体中的用途也见Tomai等Gen.Biol.Chem.(1988)263：15104 15109和美国专利号4,940,835。用于指导蛋白质转运至叶绿体的方法也在Kenauf TIBTECH(1987)5：40 47中综述。对小球藻属而言内源的叶绿体靶向序列是已知的，例如小球藻属核基因组中的基因，其编码被靶向叶绿体的蛋白质；见例如GenBank检索号AY646197和AF499684。
Wageningen UR-Plant Research International出售IMPACTVECTOR1.4载体，所述载体使用菊花(Chrysanthemummorifolium)小亚基蛋白质的分泌信号将异源蛋白质递送进叶绿体基质(细胞质)环境中，穿梭经过双层膜体系。将该蛋白质与成熟的rubisco蛋白质的前11个氨基酸融合，从而允许信号肽的适当加工(Wong等，PlantMolecular Biology 20：81-93(1992))。信号肽含有来自RbcS基因的天然内含子。
在另一种途径中，将叶绿体基因组遗传改造为表达异源蛋白质。描述了用包被外来DNA的高速钨微粒轰击受体细胞对莱茵衣藻(绿藻)的叶绿体进行稳定转化。见例如Boynton等，Science(1988)240：1534 1538；Blowers等Plant Cell(1989)1：123 132和Debuchy等，EMBO J.(1989)8：2803 2809。使用钨微粒的转化技术由Klein等，Nature(London)(1987)7：7073描述。用于植物和微藻的其他叶绿体转化方法是已知的。见例如美国专利5,693,507；6,680,426；和Plant Physiol.2002 May；129(1)：7-12；和PlantBiotechnol J.2007 May；5(3)：402-12。
如美国专利号6,320,101中所述(2001年11月20日公开，Kaplan等；其并入本文作为参考)，可以对细胞进行化学处理，从而将每个细胞的叶绿体数降至约为1。然后可以通过粒子轰击将异源核酸引入细胞中，目的是将至少一个异源核酸分子引入叶绿体中。选择异源核酸，使得其能够通过同源重组被整合到叶绿体的基因组中，所述同源重组可以通过叶绿体固有的酶容易地实现。为此，异源核酸除了包含目的基因以外，还包含至少一种来自于染色体基因组的核酸序列。另外，异源核酸通常包含选择标记。涉及该技术的其他细节见美国专利号4,945,050和5,693,507，它们并入本文作为参考。因此，可以通过叶绿体的蛋白质表达体系产生多肽。
美国专利号7,135,620(2006年11月14日公开，Daniell等；并入本文作为参考)描述了叶绿体表达载体和相关方法。表达盒是DNA构建体，其包含编码序列和适当的控制序列从而提供编码序列在叶绿体中的适当表达。典型的表达盒包含以下组件：来自微生物基因或叶绿体基因例如psbA的5’非翻译区，其将提供编码目的多肽的DNA序列在叶绿体中的转录和翻译；编码目的多肽的DNA序列；和翻译和转录终止区，例如叶绿体基因的3’反向重复区，其能够稳定被引入的基因的RNA，从而增强外来基因表达。该盒可任选地包含抗生素抗性基因。
通常，表达盒侧翼是用于插入合适基因组中的便利的限制性位点。表达盒侧翼可以是来自叶绿体DNA的DNA序列，以便于将表达盒稳定整合进叶绿体基因组中，尤其是通过同源重组整合。或者，表达盒可以保持不整合，在这种情况下，表达盒通常包含叶绿体复制起点，所述复制起点能够提供异源DNA在叶绿体中的复制。
表达盒一般含有来自能够在叶绿体中表达的基因的启动子区。启动子区可含有可得自叶绿体基因(例如来自菠菜或豌豆的psbA基因)的启动子，或来自玉米的rbcL和atpB启动子区和Rrna启动子。启动子的例子描述于Hanley-Bowdoin和Chua，TIBS(1987)12：67 70；Mullet等，PlantMolec Biol.(1985)4：39 54；Hanley-Bowdoin(1986)PhD.Dissertation，theRockefeller University；Krebbers等，Nucleic Acids Res.(1982)10：49855002；Zurawaki等，Nucleic Acids Res.(1981)9：3251 3270；和Zurawski等，Proc.Nat′l Acad Sci.U.S.A.(1982)79：7699 7703中。可以如下鉴定其他启动子并评价藉此鉴定的启动子的相对强度：将目的启动子置于无启动子的标记基因的5’处，并且观察其相对于相对强的叶绿体启动子——例如来自psbA基因的启动子获得的转录的有效性。也可以通过多种技术中的任一技术增强异源基因表达的效率。这些技术包括使用串联插入异源基因5’的多个启动子，例如双psbA启动子，增强子序列的添加等等。
可以使用在小球藻属叶绿体中有活性的多种启动子在小球藻属叶绿体中表达外源基因，例如存在于GenBank检索号NC_001865(小球藻叶绿体，全基因组)中的启动子。
期望提供异源基因的诱导型表达时，表达盒中可包含含有下述序列的诱导型启动子和/或5’非翻译区，所述序列提供转录和/或翻译(3’端)水平上的调节。例如，5’非翻译区可以来自其中表达可以受光调控的基因。类似地，可以使用3’反向重复区稳定异源基因的RNA。可以通过应答具体的目的刺激时增强的表达和无刺激时低表达或无表达来鉴定诱导型基因。例如，当用光辐照期间发生增强的表达，而低光或无光时发生大幅降低的表达或无表达时，可以鉴定光诱导型基因。来自绿色微藻的光调节的启动子是已知的(见例如Mol Genet Genomics.2005 Dec；274(6)：625-36)。
使用的终止区应当首先是方便的终止区，因为终止区似乎在叶绿体和细菌中是相对可互换的。终止区可以是转录起始区固有的，可以是目的DNA序列固有的，或者可得自另一来源。见例如Chen和Orozco，NucleicAcids Res.(1988)16：8411。
可以通过多种方法中的任一方法将表达盒转化进目的植物细胞中。这些方法包括例如生物射弹方法(见例如Sanford，Trends In Biotech.(1988)6：299 302，美国专利号4,945,050；电穿孔(Fromm等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.(USA)(1985)82：5824 5828)；使用激光束，微注射或能够将DNA引入叶绿体中的任一其他方法。
适用于微生物例如微藻的叶绿体表达载体的其他描述见美国专利号7,081,567(Xue等，2006年7月25日公开)；6,680,426(Daniell等，2004年1月20日公开)；和5,693,507(Daniell等，1997年12月2日公开)。
可以使用叶绿体靶向信号将小球藻属核基因组中表达的蛋白质靶向叶绿体。小球藻属内源的叶绿体靶向序列是已知的，例如小球藻属核基因组中编码被靶向叶绿体的蛋白质的基因；见例如GenBank检索号AY646197和AF499684。也可以通过将基因直接插入叶绿体基因组中，在小球藻属叶绿体中表达蛋白质。叶绿体转化通常通过同源重组发生，并且可以在用于创建靶向载体的叶绿体基因组序列已知时进行(见例如小球藻属叶绿体的全基因组序列；Genbank检索号NC_001865)。叶绿体转化的细节见本文先前的部分。
2.在线粒体中表达
在本发明的另一个实施方案中，多肽在微生物中的表达被靶向至线粒体。用于将外来基因产物靶向进线粒体中的方法(Boutry等Nature(London)(1987)328：340 342)已经描述，包括在绿色微藻中的方法(见例如Mol Gen Genet.1993 Jan；236(2-3)：235-44)。
例如，编码合适分泌信号的表达载体能够将异源蛋白质靶向至线粒体。来自Wageningen UR-Plant Research International的IMPACTVECTOR1.5载体使用酵母CoxIV分泌信号，所述CoxIV分泌信号显示将蛋白质递送进线粒体基质中。将蛋白质与酵母CoxIV蛋白质的前4个氨基酸融合，从而允许信号肽的正确加工(Kohler等Plant J 11：613-621(1997))。其他线粒体靶向序列是已知的，包括在绿色微藻中有功能的靶向序列。例如，见FEBS Lett.1990 Jan 29；260(2)：165-8；和J BiolChem.2002 Feb 22；277(8)：6051-8。
可以使用线粒体靶向信号，将小球藻属的核基因组中表达的蛋白质靶向至线粒体中。线粒体蛋白质靶向和转化的细节见本文先前的部分。
3.在内质网中表达
在本发明的另一个实施方案中，多肽在微生物中的表达被靶向至内质网。表达载体中包含适当的保留信号(retention signal)或分选信号(sortingsignal)确保蛋白质保留在内质网(ER)中并且不进入下游高尔基体。例如，来自Wageningen UR-Plant Research International的IMPACTVECTOR1.3载体含有公知的KDEL保留或分选信号。使用该载体时，ER保留具有实际的优点，因为据报道其将表达水平提高5倍或更多。这种情况的主要原因似乎是ER比细胞质含有更低浓度和/或不同的蛋白酶，所述蛋白酶负责所表达的蛋白质的翻译后降解。在绿色微藻中有功能的ER保留信号是已知的。例如，见Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Apr26；102(17)：6225-30。
G.转化
可以通过任一合适的技术转化细胞，所述技术包括例如生物射弹、电穿孔、玻璃珠转化和碳化硅颈须转化(silicon carbide whiskertransformation)。见例如本文的实施例。
本发明中可以使用将转基因引入小球藻属中的任一便利的技术。Dawson等(1997)(上文)描述了使用微粒轰击将来自小球藻的硝酸还原酶(NR)基因引入NR-缺陷的Chlorella sorokiniana突变体中，得到稳定的转化体。简言之，用质粒包被0.4微米的钨珠；将3 X 107 C.sorokiniana细胞涂布在非选择性琼脂平板的中心三分之一中，并用PDS-1000/HeBiolistic Particle体系(Bio-Rad)轰击。
将转基因引入小球藻中的一种优选的方法是Kim等(2002)，Mar.Biotechnol.4：63-73描述的方法。Kim报道了使用CaCl2和聚乙二醇(PEG)转化椭圆小球藻原生质体。具体地，通过将椭圆小球藻细胞培养至1-2 X108/Ml的密度，制备原生质体。如下回收并冲洗细胞：在1600g下离心5分钟并重悬于5Ml磷酸盐缓冲液(Ph 6.0)中，所述磷酸盐缓冲液含有0.6M山梨糖醇、0.6M甘露醇、4％(重量/体积)纤维素(Calbiochem)、2％(重量/体积)浸渍物(Calbiochem)和50单位果胶酶(Sigma)。在黑暗中轻柔摇动下，将细胞悬浮液在25℃下孵育16小时。通过在400g下离心5分钟回收得到的原生质体。将沉淀物轻柔地重悬于5Ml含0.6M山梨糖醇和0.6M甘露醇的f/2培养基中，并在400g下离心5分钟。将该沉淀物重悬于1Ml含50mMCaCl2的0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液中。然后将5mg转基因DNA与25μg小牛胸腺DNA(Sigma)一起，添加进0.4Ml中107-108原生质体中。室温下15分钟后，添加200μL PNC(40％聚乙二醇4000，0.8MNaCl，50Mm CaCl2)，并在室温下轻柔混合30分钟。之后添加0.6Ml补充了0.6M山梨糖醇/甘露醇溶液、1％酵母提取物和1％葡萄糖的f/2培养基，并将转化的细胞于25℃暗中孵育12小时，用于细胞壁再生。使用Huang等(2007)(上文)的类似方法将编码汞还原酶的转基因引入小球藻(Chlorella sp.)DT中。
也使用电穿孔转化小球藻属。如Maruyama等(2004)，BiotechnologyTechniques 8：821-826(通过引用整体并入本文)所报道的，使用这一技术将转基因引入用静止期细胞制备的Chlorella saccharophila c-211-1a原生质体中。在600和900V/cm之间的电场强度和400ms左右的脉冲持续时间下观察到引入的质粒的瞬时表达，其中明确了对70-kDa FITC-葡聚糖的高膜通透性。
在小球藻属中表达转基因的例子可参见文献(例如CurrentMicrobiology第35卷(1997)，第356-362页；Sheng Wu Gong Cheng XueBao.2000 Jul；16(4)：443-6；Current Microbiology第38卷(1999)，第335-341页；Appl Microbiol Biotechnol(2006)72：197-205；MarineBiotechnology 4，63-73，2002；Current Genetics 39：5，365-370(2001)；PlantCell Reports 18：9，778-780，(1999)；Biologia Plantarium 42(2)：209-216，(1999)；Plant Pathol.J 21(1)：13-20，(2005))。还参见本文的实施例。
在产油酵母(例如解脂亚罗酵母)中表达转基因的例子可参见文献(见例如Bordes等，J Microbiol Methods，Jun 27(2007))。在真菌(例如高山被孢霉、卷枝毛霉和赭曲霉)中表达转基因的例子也可以参见文献(见例如Microbiology，Jul；153(Pt.7)：2013-25(2007)；Mol Genet Genomics，Jun；271(5)：595-602(2004)；Curr Genet，Mar；21(3)：215-23(1992)；CurrentMicrobiology，30(2)：83-86(1995)；Sakuradani，NISR Research Grant，″Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producingMicroorganisms″(2004)；和PCT/JP2004/012021)。在细菌例如大肠杆菌中表达外源基因的例子是公知的；见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Sambrook等，第3版，2001，Cold Spring Harbor Press。
可以通过本领域技术人员熟悉的已知技术制备用于转化根据本发明的微生物的载体。用于转化多种小球藻属物种的构建体的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：25。在一个实施方案中，设计用于在微生物例如微藻中表达脂肪酶基因的示范性载体含有编码脂肪酶的基因，所述基因与在微藻中有活性的启动子有效连接。或者，如果载体不含有与目的基因有效连接的启动子，则可以将该基因转化进细胞中，使其在载体整合点上与内源启动子有效连接。已经证实无启动子的转化方法可以在微藻中工作(见例如PlantJournal 14：4，(1998)，第441-447页)。载体也可含有编码下述蛋白质的第二基因，所述蛋白质例如赋予对抗生素或除草剂的抗性，即选择标记。任选地，一种或两种基因后有含有多聚腺苷酸化信号的3′非翻译序列。编码两种基因的表达盒可以在载体中物理相连，或者位于分离的载体上。也可以使用微藻的共转化，其中不同的载体分子被同时用于转化细胞(见例如Protist 2004 Dec；155(4)：381-93)。可以在缺乏抗性盒的细胞不会生长的条件下，基于存在抗生素或其他选择标记时生长的能力，任选地选择转化的细胞。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请和出版物，均通过引用整体并入本文，无论之前是否明确地并入。引用本文提到的出版物，目的是为了描述和公开可用于本发明中的试剂、方法和概念。本文的内容不应解释为承认这些参考文献是与本文所述的本发明相关的现有技术。
尽管本发明已关于其特定的实施方案进行描述，但是应当明白其能够被进一步修饰。本申请旨在覆盖一般遵循本发明原则的本发明的任何变更、使用或改造，并且包括这类来自本公开的偏离，这属于本发明所属领域范围内的已知或惯用实践，并且可适用于上文公开的关键特性。
X.实施例
提供以下实施例用于阐述而非限制要求保护的发明。
实施例1
测试来自得克萨斯大学培养物中心(University of Texas culturecollection)的小球藻属株系在甘油和葡萄糖上的生长。培养以下的小球藻属物种：Chlorella kessleri(株系263、397、398、2228)；Chlorella sorokiniana(株系1663、1665、1669、1671、1810)；Chlorella saccharophila(2911；2469)；原壳小球藻(31、249、250、264)。将每种株系从固体培养基上接种进25ml液体基础培养基(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mMCaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)中，并在75μEm-2s-1的光强度下于27℃摇动培养72小时。使用这些培养物将每种株系接种进24-孔平板中，达到每ml 1x105个细胞的最终密度，所述平板含有2ml(a)仅基础培养基；(b)基础培养基加0.1％葡萄糖；和(c)基础培养基加0.5％试剂级甘油(EM Science，目录号GX0185-6)。将平板置于黑暗中并在27℃下摇动培养72小时。将三种条件下培养的每个株系的样品以蒸馏水1.9∶1稀释，并在Molecular DevicesSpectraMax 340PC中读出600nm的吸光度。与仅基础培养基相比，所有株系均显示出在葡萄糖和甘油存在下生长。
实施例2
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#2(株系264)和Chlorellakessleri#1(株系398)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持。修改的培养基每升由以下组成(g/L)：0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4、0.025gCaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O和2g酵母提取物。来自生物柴油生产的甘油废料(酸化的甘油(AG)和未经酸化的甘油(NAG))得自ImperialWestern Products(Selma，CA，USA)。“纯的”和“试剂级”甘油来自EMScience(Merck KGA的一个分支机构)，目录号GX0185-6。
实验设计和生长测量：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油
2.+1％经酸化的甘油
3.+1％未经酸化的甘油
4.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
5.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430 rpm摇动。开始生长72小时后，向4、5和6号样品中加入1％(w/v)葡萄糖并再培养24小时。为了测量细胞干重，在Eppendorf5415C离心机中以5000rpm离心5分钟对1ml每种培养物进行沉淀。除去上清液后，将细胞沉淀冷冻在-80℃，并在实验室规模的冷冻干燥机(Labconco，MO，USA)中冻干。结果示于图1。
实施例3
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)和Chlorellakessleri#2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和生长测量：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430 rpm摇动。96小时后，通过细胞干重来测量细胞生长(见实施例2)。结果于图2。
实施例4
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)、#4(株系31)和Chlorellakessleri#2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至含有不同甘油(纯的、酸化的或未经酸化的)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。96小时后，测量脂质含量。为了测量细胞中的脂质含量，收集100μl培养物并以等体积的培养基洗涤一次。向每个管中加入5μl洗涤后的细胞和200μl 18 M硫酸。将管在水浴中以90℃孵育30分钟，向管中加入1ml磷酸-香草醛试剂，在37℃下孵育15分钟。为了制备磷酸-香草醛试剂，向20ml水中加入0.12g香草醛，并用85％磷酸将体积调整至100ml。在玻璃比色皿中读出530nm的吸光度，参照管含有5μl水作为样品。结果示于图3。
实施例5
株系和培养基：原壳小球藻#2(株系264)和Chlorella kessleri#1(株系398)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油
2.+1％未经酸化的甘油
3.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
4.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至含有不同甘油(纯的或未经酸化的)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，向3和4号样品中加入1％葡萄糖并再培养24小时。测量所有样品中的脂质含量(见实施例4)。还测量600nm的光密度，以检查非特异性吸收，并将其从OD 530nm中减去，以计算脂质含量。由1至10μg溶于氯仿的三油精获得参考曲线。结果示于图4。
实施例6
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)和Chlorella kessleri#2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
2.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
3.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至含有不同甘油(纯的、酸化的或未经酸化的)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，加入1％葡萄糖并再培养24小时。在全部样品中测量细胞干重和脂质含量(见实施例2和5)。通过脂质总重除以细胞干重来计算脂质百分比。结果示于图5。
实施例7
株系和培养基：原壳小球藻#2(株系264)和Chlorella kessleri#1(株系398)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
2.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至含有1％纯甘油或1％未经酸化的甘油的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，加入1％葡萄糖并再培养24小时。在全部样品中测量细胞干重和脂质含量(见实施例1和4)。通过脂质总重除以细胞干重来计算脂质百分比。结果示于图6。
实施例8
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#4(株系31)和Chlorellakessleri#2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+2％葡萄糖
2.+1％甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长96小时后，测量脂质含量(见实施例5)。结果示于图7。
实施例9
株系和培养基：原壳小球藻#3(株系249)、#4(株系31)和Chlorellakessleri#1(株系398)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+2％葡萄糖
2.+1％甘油+1％葡萄糖
3.+1％甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，向3号培养基中加入1％(w/v)葡萄糖并再培养24小时。在全部样品中测量细胞干重和脂质含量(见实施例2和5)。通过脂质总重除以细胞干重来计算脂质百分比。结果示于图8。
实施例10
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)和Chlorellakessleri#2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
3.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
4.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，向2、4和6号培养基中加入1％(w/v)葡萄糖并再培养24小时。在全部样品中测量脂质含量(见实施例4)。结果示于图9。
实施例11
株系和培养基：原壳小球藻#1(株系250)、#3(株系249)、#4(株系31)和Chlorella kessleri #2(株系397)得自德克萨斯大学藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例2)。
实验设计和脂质测定：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.+1％纯甘油+1％葡萄糖
2.+1％纯甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
3.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
4.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，向2、4和6号培养基中加入1％(w/v)葡萄糖并再培养24小时。在全部样品中测量细胞干重(见实施例2)。结果示于图10。
实施例12
载体构建
将BamHI-SacII片段克隆进pBluescript的BamHI和SacII位点中，称为pHyg，所述片段含有CMV启动子、潮霉素抗性cDNA和CMV 3’UTR(SEQ ID NO：5，pCAMBIA1380载体的子序列，Cambia，Canberra，Australia)。
小球藻属的生物射弹转化
根据生产商的方案，制备来自Seachell Technology的S550d金载体。将线性化的pHyg质粒(20μg)与50μl结合缓冲液和60μl(30mg)S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，将混合物在冰中再孵育1分钟。涡旋后，通过在Eppendorf5415C微型离心机中以10000rpm离心10秒钟来沉淀包裹有DNA的颗粒。将金沉淀物用500μl冷100％乙醇洗涤一次，在离心机中稍离心沉淀，并重悬于50μl冰预冷的乙醇中。快速超声处理(1至2秒)后，立即将10μl包裹有DNA的颗粒转移至载体膜上。
在旋转式摇床上，在75μmol光子m-2 sec-1持续光照下将原壳小球藻培养物(德克萨斯大学培养物中心250)培养在培养基中(2g/L酵母提取物、2.94mM NaNO3、0.17mM CaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.4mMK2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.43mM NaCl)，直至细胞密度达到2×106个细胞/ml。收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于50μl培养基中。将1×107个细胞涂到非选择性培养基平板的中间三分之一。用PDS-1000/HeBiolistic Particle Delivery系统(Bio-Rad)对细胞进行轰击。使用爆破盘(1100和1350psi)，将平板置于筛选/大载体装置下方9和12cm处。使细胞在25℃复原12至24小时。复原后，用橡胶刮片将细胞从平板上刮下，与100μl培养基混合并涂到含有潮霉素的平板上(200μg/ml)。在25℃下孵育7-10天后，在来自1100和1350psi爆破盘以及9和12cm距离的平板上可见代表转化细胞的集落。挑取集落并点到选择性琼脂平板上进行第二轮选择。
通过电穿孔转化小球藻
在旋转式摇床上，在75μmol光子m-2 sec-1持续光照下将原壳小球藻培养物培养在培养基中，直至细胞密度达到2×106个细胞/ml。收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于含有50 mM蔗糖的tris-磷酸缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.0；1mM磷酸钾)中至4×108个细胞/ml的密度。将约250μl细胞悬液(1×108个细胞)置于4mm缺口的一次性电穿孔杯中。向细胞悬液中加入5μg线性化的pHyg质粒DNA和200μg载体DNA(剪切的鲑精DNA)。接着将电穿孔杯在16℃水浴中孵育10分钟。接着使用Gene PulserII(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔设备，以25μF(电穿孔中不使用分流电阻)的电容向杯施加电脉冲(1100V/cm)。接着将杯在室温下孵育5分钟，其后将细胞悬液转移至50ml培养基，并在旋转式摇床上摇动2天。复原后，低速离心收获细胞，重悬于培养基中，并以低密度接种到补充有200μg/ml潮霉素的平板上。将平板在75μmol光子m-2sec-1持续光照下孵育。转化体集落在1-2周内出现。挑取集落并点到选择性琼脂平板上进行第二轮选择。
基因分型
将在第二轮选择中存活的一部分集落以小体积培养并收获。通过涡旋将约5-10uL体积的沉淀重悬于50uL 10mM NaEDTA中并在100℃孵育10分钟。然后将管短暂涡旋并超声处理10秒，接着以12000×g离心1分钟。在50uL PCR反应物中使用2uL上清液作为模板。用于基因分型的引物为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。PCR条件如下：95℃5分钟×1个循环；95℃30秒-58℃30秒-72℃1分30秒×35个循环；72℃10分钟×1个循环。在来自生物射弹法的10个集落中的6个以及单电穿孔法的一个集落中发现了预计的992bp片段。所有泳道中均存在大小较小的非特异性条带。结果示于图16。为证实扩增出的992bp片段的身份，从凝胶上切下两个生物射弹条带和电穿孔条带并单独测序。全部三个条带的序列均与预计的992bp片段一致。(DNA序列梯：All Purpose Hi-DNA序列梯目录号BN2050)。
实施例13
株系和培养基：(a)钝顶螺旋藻(UTEX 2340)和(b)Naviculapelliculosa(UTEX 667)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。螺旋藻的原种培养物在螺旋藻培养基中维持，Navicula在土壤提取物培养基(SEM)中维持。螺旋藻培养基由162mM NaHCO3、38mMNa2CO3、1.9mM K2HPO4、29mM NaNO3、5.75mM K2SO4、17.1mMNaCl、0.8mM MgSO4·7H2O、0.25mM CaCl2·2H2O、2mM Na2EDTA、0.36mM FeCl3·6H2O、0.21mM MnCl2·4H2O、0.037mM ZnCl2、0.0085mMCoCl2·6H2O、0.017mM NaMoO4·2H2O、0.78μM CuSO4·5H2O、0.15μMZnSO4·7H2O、10μM H3BO3和0.001mM维生素B12组成。土壤提取物培养基由2.94mM NaNO3、0.17mMCaCl2·2H2O、0.3mM MgSO4·7H2O、0.43mM K2HPO4、1.29mM KH2PO4、0.43mM NaCl和土壤提取物组成。来自生物柴油生产的甘油废料(酸化的甘油(AG)和未经酸化的甘油(NAG))得自Imperial Western Products(Selma，CA，USA)。
实验设计和生长测量：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
(a)
7.螺旋藻培养基+2％葡萄糖
8.螺旋藻培养基+2％试剂级甘油
9.螺旋藻培养基+2％未经酸化的甘油
10.螺旋藻培养基+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
(b)
1.SEM+2％葡萄糖
2.SEM+2％试剂级甘油
3.SEM+1％试剂级甘油+1％葡萄糖
4.SEM+2％经酸化的甘油
5.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.SEM+2％未经酸化的甘油
7.SEM+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将每种株系接种至不同培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。96小时后，测量脂质含量。为了测量细胞中的脂质含量，收集100μl培养物并以等体积的培养基洗涤一次。向每个管中加入5μl洗涤后的细胞和200μl 18M硫酸。将管在水浴中以90℃孵育30分钟，向管中加入1ml磷酸-香草醛试剂，在37℃下孵育15分钟。为了制备磷酸-香草醛试剂，向20ml水中加入0.12g香草醛，并用85％磷酸将体积调整至100ml。在玻璃比色皿中读出530nm的吸光度，参照管含有5μl水作为样品。由1至10μg溶于氯仿的三油精获得参考曲线。
为了测量细胞干重，以5000rpm离心5分钟对0.5ml每种培养物进行沉淀。除去上清液后，将细胞沉淀冷冻在-80℃，并在Freeze Dry系统(Labconco，MO，USA)中干燥过夜。将总脂质量除以干细胞重量计算脂质百分比。结果示于图11。
实施例14
株系和培养基：被甲栅藻(UTEX 2552)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持。修改的培养基每升由以下组成(g/L)：0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4、0.025g CaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O和2g酵母提取物。
实验设计和生长和脂质测量：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
(a)，(b)
1.+2％葡萄糖
2.+2％甘油
3.+2％经酸化的甘油
4.+2％未经酸化的甘油
5.+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将被甲栅藻(UTEX 2552)接种至不同培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。96小时后，通过细胞干重测量细胞生长，并通过磷光体-香草醛测定来测量脂质含量(见实施例13)。用总脂质量除以细胞干重来计算脂质百分比。结果示于图12。
实施例15
株系和培养基：Navicula pelliculosa(UTEX 667)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在土壤提取物培养基中维持(见实施例13)。
实验设计和生长测量：对每个生长条件而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.SEM+2％葡萄糖
2.SEM+2％甘油
3.SEM+2％经酸化的甘油
4.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
5.SEM+2％未经酸化的甘油
6.SEM+1％未经酸化的甘油+1％葡萄糖
以5×105个细胞/ml的浓度将Navicula pelliculosa(UTEX 667)接种至含有葡萄糖或不同甘油(纯的、酸化的或未经酸化的)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。96小时后，通过细胞干重测量细胞生长(见实施例13)。结果示于图13。
实施例16
株系和培养基：被甲栅藻(UTEX 2552)和Navicula pelliculosa(UTEX 667)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。被甲栅藻原种培养物在修改的培养基中维持，Navicula pelliculosa在土壤提取物培养基中维持(见实施例1)。
实验设计和生长测量：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
被甲栅藻
5.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
6.+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
Navicula pelliculosa
1.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖
2.SEM+1％经酸化的甘油+1％葡萄糖(72小时后加入)
以5×105个细胞/ml的浓度接种每种株系。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。开始生长72小时后，向2号样品中加入1％葡萄糖并再培养24小时。通过细胞干重测量细胞生长(见实施例13)。结果示于图14。
实施例17
株系和培养基：原壳小球藻(UTEX 31)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例1)。
实验设计：对每个株系而言，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
4.
5.+0.5％葡萄糖
6.+0.5％木糖
7.+0.25％葡萄糖+0.25％木糖
以3×105个细胞/ml的浓度接种原壳小球藻#4(UTEX 31)至含有不同糖(葡萄糖，或木糖)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。生长72小时后，通过对每个培养物进行细胞计数来测量细胞生长。结果示于图15。
实施例18
原壳小球藻株系#1、#3和#4得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持(见实施例1)。对于每种条件，在24孔板中准备1ml以下不同的培养基。
1.
2.+1％葡萄糖
3.+1％果糖
以1×106个细胞/ml的浓度将每种株系接种在含有不同的糖(葡萄糖或果糖)的培养基中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动。生长96小时后，通过对每个培养物进行细胞计数来测量细胞生长。结果示于图20。
实施例19
在蔗糖上培养小球藻
材料和方法：将原壳小球藻(UTEX 249)接种到3个50ml瓶中，其中装有含有1％蔗糖的培养基(2.94mM NaNO3、0.428mM K2HPO4、1.28mM KH2PO4、0.427mM NaCl、0.17mM CaCl2-2H2O、0.3mMMgSO4-7H2O、蛋白胨1g/L)，至细胞终浓度为4×105个细胞/ml。向两个培养物中加入0.01U/ml和0.05U/ml的转化酶(Sigma#I4504)。全部三个培养物均在黑暗中以150rpm摇动培养约60小时。
结果：在黑暗中摇动约60小时后，对全部三个培养物进行最终细胞计数。对照瓶达到4.4x105个细胞/ml，而0.01U/ml和0.05U/ml的瓶分别达到1×108和3×108个细胞密度。在实验结束时通过显微镜分析检查每个瓶的污染，结果全部干净。
实施例20
在蔗糖上培养小球藻株系
以1×106个细胞/ml将Chlorella kessleri((a)UTEX 397和(b)UTEX398)和Chlorella fusca((a)UTEX 251和(b)UTEX 1801)的培养物从自养液体培养基接种到50ml瓶中的10ml+1％蔗糖培养基中。还以相同的密度将对照培养物接种在仅培养基中。将培养物在28℃下在黑暗中以250rpm摇动培养7天，在这个时间点通过血细胞计数器测量细胞密度。如图21-22所示，将在蔗糖上培养的全部四个株系与起始细胞密度和仅的对照进行比较。
实施例21
在含有蔗糖转化酶的糖蜜上培养原壳小球藻
制备用于接种的小球藻细胞：用来自固体平板的接种物起始10ml小球藻液体培养物。将培养物在光照下在26℃培养约2天。使用750nm光度计(OD)和测定细胞干重来测量生长。
制备糖蜜和糖原液：如表13所示，用葡萄糖、蔗糖和甘蔗制糖的商业化加工中获得的三种不同糖蜜样品(标为BS1、BS2和HTM)制备5％原液。证实所有原液的pH为6-6.6，将原液高压灭菌。
表13.糖蜜和糖原液
制备转化酶溶液：通过在10ml蒸馏水中重构1mg400U/mg转化酶(Sigma)来制备40单位/ml的转化酶原液。
实验条件和设置：制备10ml培养物，各由基础培养基中1％最终糖蜜/糖浓度、0.05单位/ml转化酶和1.0×106个细胞/ml原壳小球藻组成。培养物编号如下：(1)仅培养基的对照；(2)1％HTM；(3)1％BS1；(4)1％BS2；(5)1％葡萄糖；和(6)1％蔗糖。还准备相似的对照组而不加入转化酶。将培养物在28℃下以250rpm在黑暗中培养5天。
结果：在黑暗中将各个原料孵育5天后评估原壳小球藻细胞的生长。如图23-24所示，细胞可在蔗糖转化酶存在下在糖蜜上生长，与在纯试剂级葡萄糖上生长的产率相当。
实施例22
将原壳小球藻遗传改造成表达外源蔗糖转化酶
株系和培养基：原壳小球藻(UTEX 250)得自得克萨斯大学的藻类培养物中心(Austin，TX，USA)。原种培养物在修改的培养基中维持。修改的培养基每升由以下组成(g/L)：0.25g NaNO3、0.09g K2HPO4、0.175g KH2PO4、0.025g CaCl2·2H2O、0.075g MgSO4·7H2O和2g酵母提取物。
质粒构建：为了在原壳小球藻中表达分泌形式的转化酶，将酿酒酵母SUC2基因置于三种不同启动子控制下：花椰菜花叶病毒35S启动子(CMV)、小球藻病毒启动子(NC-1A)和小球藻HUP1启动子。合成酵母SUC2基因以适应对原壳小球藻优化的密码子选择，并包括指导转化酶胞外分泌的信号序列。在pBluescript KS+中构建每个构建体，并使用特异性引物通过PCR扩增向每个启动子、转化酶基因和CMV 3’UTR中分别引入EcoRI/AscI、AscI/XhoI和XhoI/BamHI位点。对纯化的PCR产物依次进行克隆。最终构建体示于图25。
转化原壳小球藻：在旋转式摇床上，在75μmol光子m-2sec-1持续光照下将原壳小球藻培养物培养在修改的培养基中，直至细胞密度达到6×106个细胞/ml。
为进行生物射弹转化，根据生产商的方案，制备来自SeachellTechnology的S550d金载体。简言之，将通过BsaI线性化的构建体(20μg)与50μl结合缓冲液和60μl(30mg)S550d金载体混合，并在冰上孵育1分钟。加入沉淀缓冲液(100μl)，将混合物在冰上再孵育1分钟。温和涡旋后，通过在Eppendorf 5415C微型离心机中以10000rpm离心10秒钟来沉淀包裹有DNA的颗粒。将金沉淀物用500μl冷100％乙醇洗涤一次，在离心机中短暂离心沉淀，并重悬于50μl冰预冷的乙醇中。短暂超声处理(1至2秒)后，立即将10μl包裹有DNA的颗粒转移至载体膜上。收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于50μl培养基中(1×107个细胞)，涂到非选择性培养基平板的中间三分之一。用PDS-1000/He BiolisticParticle Delivery系统(Bio-Rad)对细胞进行轰击。使用爆破盘(1100和1350psi)，将平板置于筛选/大载体装置下方9和12cm处。使细胞在25℃复原12至24小时。复原后，用橡胶刮片将细胞从平板上刮下，与100μl培养基混合并涂到含有1％蔗糖的修改的平板上。在25℃下在黑暗中孵育7-10天后，在平板上可见代表转化细胞的集落。
为通过电穿孔进行转化，收获细胞，用无菌蒸馏水洗涤一次，重悬于含有50mM蔗糖的tris-磷酸缓冲液(20m M Tris-HCl，pH 7.0；1mM磷酸钾)中，至4×108个细胞/ml的密度。将约250μl细胞悬液(1×108个细胞)置于4mm缺口的一次性电穿孔杯中。向细胞悬液中加入5μg线性化的pHyg质粒DNA和200μg载体DNA(剪切的鲑精DNA)。接着将电穿孔杯在16℃冰水浴中孵育10分钟。接着使用Gene Pulser II(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)电穿孔设备，以25μF(电穿孔中不使用分流电阻)的电容向杯施加电脉冲(1100V/cm)。接着将杯在室温下孵育5分钟，其后将细胞悬液转移至50ml修改的培养基，并在旋转式摇床上摇动2天。复原后，低速离心(4000rpm)收获细胞，重悬于修改的培养基中，并以低密度接种到含有1％蔗糖的修改的平板上。在黑暗中以25℃孵育7-10天后，在平板上可见代表转化细胞的集落。
筛选转化体和基因分型：从黑暗培养的含有1％蔗糖的修饰平板上挑取集落，并将大致等量的细胞转移至含有1％修改的液体培养基和1％蔗糖的24孔板中。将培养物保持在黑暗中并通过来自Labnet(Berkshire，UK)的有轨摇床以430rpm摇动5天。
为了证实存在引入小球藻转化体的转化酶基因，分离每个转化体的DNA并用基因特异性引物组进行扩增(CMV构建体：正向引物(CAACCACGTCTTCAAAGCAA)(SEQ ID NO：6)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：9)，CV构建体：正向引物(TTGTCGGAATGTCATATCAA)(SEQ ID NO：10)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：11)，HUP1构建体：正向引物(AACGCCTTTGTACAACTGCA)(SEQ ID NO：12)/反向引物(TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA)(SEQ ID NO：13))。为进行快速DNA分离，将一定体积的细胞(大小为约5-10uL)重悬于50uL 10mM Na-EDTA中。将细胞悬液在100℃孵育10分钟，并超声处理10秒。12000g离心1分钟后，将3uL上清液用于PCR反应。PCR扩增在DNA热循环仪(Perkin-Elmer GeneAmp 9600)中进行。根据生产商的说明，反应混合物(50uL)含有3uL提取的DNA、上述各种引物各100pmol、200uM dNTP、0.5单位Taq DNA聚合酶(NEB)和Taq DNA聚合酶缓冲液。DNA的变性在第一个循环中在95℃进行5分钟，然后是30秒。引物退火和延伸反应分别是58℃进行30秒和72℃进行1分钟。接着使PCR产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上显现。图26显示了使用上述基因特异性引物鉴定的原壳小球藻转化体的PCR基因分型结果。箭头显示PCR产物的预计大小，星号代表来自每个显示PCR产物与预计大小匹配的转化体的DNA样品(V：仅载体；WT：野生型))。
在液体培养基中培养：在黑暗中培养5天后，基因分型阳性转化体显示在黑暗中在基本液体培养基+1％蔗糖上生长，而野生型细胞显示在黑暗中在相同培养基上不生长。
实施例23
用来自酿酒酵母的分泌型转化酶转化藻类株系
分泌型转化酶：从头合成作为1599 bp Asc I-Xho片段的编码分泌型蔗糖转化酶的基因(Gen Bank检索号NP_012104，来自酿酒酵母)，然后亚克隆进pUC19衍生物中，该衍生物具有花椰菜花叶病毒35s启动子和3’UTR，分别作为EcoR I/Asc I和Xho/Sac I盒。
培养藻类细胞：用于这些实验的培养基是液体基本培养基(见实施例1)和固体基本培养基(+1.5％琼脂糖)，其含有1％终浓度蔗糖或葡萄糖(如指定)形式的固定碳。用于本实验的株系在不存在额外固定碳来源的情况下在黑暗中在基本培养基上不生长。将物种从平板上刮下，并在28℃下在黑暗中培养。挑取单个集落并用于接种含有1％葡萄糖的500mL液体基本培养基，并在黑暗中培养至对数中期，每天测量细胞数。之前已对以下每个株系测试其在黑暗中以蔗糖为惟一碳源时的生长，并显示不生长，因此选择用于用分泌型转化酶转化：(1)原壳小球藻(UTEX 31)；(2)微小小球藻(UTEX 2341)；和(3)Chlorella emersonii(CCAP 211/15)。
通过微粒轰击转化藻类细胞：将足量的培养物离心以得到约1-5×108个完整细胞。将所得沉淀以未加入固定碳源的基本培养基进行洗涤。再次离心细胞并将沉淀重悬于体积足以得到5×107至2×108个细胞/ml的基本培养基中。接着将250-1000μl细胞平板接种到补充有1％蔗糖的固体基本培养基上，并在无菌通风厨中在平板上干燥。根据生产商的推荐(SeashellTechnology，La Jolla，CA)将质粒DNA沉积在金颗粒上。使用BioRad PDSHe-1000颗粒递送系统，使用1350psi爆破盘进行转化，大载体装置设置成距离爆破盘支架9cm。转化后，将平板在28℃下在黑暗中孵育。所有株系均产生多个转化体集落。未转化转化酶插入片段但其他方面均以相同方式制备的对照平板不含有集落。
分析原壳小球藻转化体：如下从原壳小球藻野生型细胞和转化体集落中提取基因组DNA：将细胞重悬于100ul提取缓冲液(87.5mM Tris Cl，pH8.0，50mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.0，0.25％SDS)中并在60℃下孵育30分钟，间或进行倒置混合。为进行PCR，将样品在20mM Tris Cl，pH 8.0中以1∶100稀释。
以提取自WT、转化体的基因组DNA和质粒DNA进行基因分型。将样品对标记基因进行基因分型。在该基因分型PCR中使用引物2383(5’CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC 3’)(SEQ ID NO：20)和2279(5’CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3’)(SEQ IDNO：21)。使用的PCR模式如下：94℃变性5分钟；94℃-30秒，60℃-30秒，72℃-3分钟的30个循环；72℃-5分钟。从阳性对照(质粒)和两种原壳小球藻(UTEX 31)转化体中扩增出了相同大小的条带，如图27所示。
分析微小小球藻和Chlorella emersonii转化体：如下从小球藻WT和转化体中提取基因组DNA：将细胞重悬于100ul提取缓冲液(87.5mM TrisCl，pH 8.0，50mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.0，0.25％SDS)中并在60℃下孵育30分钟，间或进行倒置混合。为进行PCR，将样品在20mM Tris Cl，pH 8.0中以1∶100稀释。以提取自WT、转化体的基因组DNA和质粒DNA进行基因分型。将样品对标记基因进行基因分型。引物2336(5’GTGGCCATATGGACTTACAA 3’)(SEQ ID NO：22)和2279(5’CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG 3’)(SEQ ID NO：21)命名为引物组2(预计产物为1215bp)，而引物2465(5’CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG3’)(SEQ ID NO：23)和2470(5’CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG 3’)(SEQ IDNO：24)命名为引物组4(预计产物为1442bp)。使用的PCR模式如下：94℃变性2分钟；94℃-30秒，60℃-30秒，72℃-1分钟的29个循环；72℃-5分钟。使用含有分泌型转化酶的质粒对照作为PCR对照。图28显示用编码分泌型转化酶的基因转化微小小球藻(UTEX 2341)和Chlorellaemersonii(CCAP 211/15)种的微藻。
转化酶构建体的序列对应于SEQ ID NO：25。
实施例24
在以纤维素酶制备的纤维素原料上比较藻类株系与酿酒酵母的生长 株系和培养条件：本研究中使用的藻类株系在下表14中列出，在含有外源提供纤维素材料(在一些情况下有葡萄糖形式的额外的固定碳源)的培养基中培养。本研究中使用24种藻类株系，包括5个不同的属，包括小球藻属的11个不同种，两种Parachlorella和原壁菌属，以及Bracteococcus和Pseudochlorella各一种。将酿酒酵母(株系PJ-69-4A)培养在YPD培养基中(每升：10g细菌用酵母提取物，20g细菌用蛋白胨和20g葡萄糖)。藻类和酵母都在28℃下在黑暗中培养。这些株系在黑暗中在不存在纤维素材料或其他额外的固定碳的情况下在培养基上不生长或生长极慢。
通过酶促解聚处理从纤维素材料中释放葡萄糖：通过将玉米秸秆在1.4％硫酸溶液中煮并将所得浆体再水化，由National Renewable EnergyLaboratory(Golden，CO)制备破碎湿的破碎的玉米秸秆材料。使用MettlerToledo湿度分析仪，测得湿玉米秸秆的干固体为24％。将100g湿样品重悬于去离子水中至420ml终体积，并用10N NaOH将pH调至4.8。以4％终浓度加入CelluclastTM(Novozymes)(一种纤维素酶)，并将所得浆体在50℃下摇动孵育72小时。接着用NaOH将该材料的pH调至7.5(忽略体积改变)，通过0.22um滤膜过滤除菌并保存于-20℃。保留样品用于如下述使用Sigma的己糖基础试剂盒测定葡萄糖浓度。
测量通过对湿玉米秸秆进行纤维素酶处理释放的葡萄糖浓度：使用Sigma葡萄糖测定试剂#G3293测定葡萄糖浓度。将如上述处理的样品稀释400倍，并向反应物中加入40μl。测得该玉米秸秆纤维素制备物含有约23g/L葡萄糖。
表14.在纤维素原料上培养的藻类株系
属/种 来源/命名
Bracteococcus minor UTEX 66
椭圆小球藻 SAG 2141
Chlorella kessleri UTEX 1808
Chlorella kessleri UTEX 397
Chlorella emersonii CCAP 211/15
Chlorella luteoviridis SAG 2133
Chlorella luteoviridis SAG 2198
Chlorella luteoviridis SAG 2214
Chlorella luteoviridis UTEX 22
Bracteococcus medionucleatus UTEX 1244
微小小球藻 CCALA 20024
微小小球藻 UTEX 2341
Chlorella ovalis CCAP 211/21A
原壳小球藻 CCAP 211/8d
原壳小球藻 UTEX 250
Chlorella saccharophila UTEX 2911
Chlorella sorokiniana UTEX 1230
小球藻属物种 SAG 241.80
小球藻 CCAP 211/11C
Parachlorella kessleri SAG 12.80
Parachlorella kessleri SAG 27.87
Prototheca moriformis UTEX 1441
Prototheca moriformis UTEX 1434
Pseudochlorella aquatica SAG 2149
在表14中以及在本文中使用时，UTEX指得克萨斯大学(Austin，Texas，USA)的藻类培养物中心，SAG指大学(Germany)的藻类培养物中心，CCAP指Scottish Association for MarineScience(Scotland，United Kingdom)管理的藻类和原生动物培养物中心，CCALA指Institute of Botany(Czech Republic)藻类实验室的培养物中心。
测定在纤维素材料上的生长：酶处理并将纤维素糖化成葡萄糖、木糖和其他单糖后，将上述制备的材料分别在培养基或YPD培养基上作为培养24种藻类株系或酿酒酵母的原料进行评估。通过加入不同量的纯葡萄糖和/或解聚纤维素材料，将培养基制成葡萄糖终浓度为23g/L(通过对玉米秸秆进行纤维水解处理而产生的葡萄糖终浓度)，用于培养酿酒酵母的YPD也是如此。包括了多种浓度的纤维素材料，在每种培养基中提供23g/L葡萄糖的0、12.5、25、50和100％，其组分如下表15所示。向24孔板的孔中加入1ml合适的培养基。在28℃下在YPD中异养培养的酿酒酵母作为酵母细胞的接种物(20u1)。通过在含有20g/L葡萄糖的培养基中兼养培养的藻类细胞来制备24种藻类株系的20ul接种物。
表15.纤维素原料制备物
表15显示了修改成含有或YPD培养基组分的解聚玉米秸秆的体积，所述组分分别加入或YPD培养基中，以获得含有所示百分比纤维素的培养基。在全部情况中均将培养基制成含有23g/L的葡萄糖终浓度。加入20μl指数中期培养酵母或藻类细胞之前的培养基体积为1ml。在28℃下，将细胞在黑暗中在不同浓度纤维素原料上摇动(300rpm)孵育2天。通过在UV分光光度计中测量750nm的吸收来评估生长。出人意料的是，全部株系都在以Celluclast制备的纤维素材料上生长，包括其中100％的可发酵糖都来源于纤维素的培养基条件。
实施例25
在以Accellerase 1000 TM 和Celluclast TM 制备的多种纤维素原料上培养 24种藻类株系和酿酒酵母
株系和培养条件：本实施例中使用的藻类株系在表14(上文)中列出，在培养基+额外的(解聚纤维素材料和/或纯葡萄糖形式)固定碳中培养。酿酒酵母(株系PJ69-4a)在YPD培养基+额外的(解聚纤维素材料和/或纯葡萄糖形式)固定碳中培养。藻类和酵母都在28℃下在黑暗中培养。
通过酶促解聚处理从纤维素材料中释放葡萄糖：通过将玉米秸秆在1.4％硫酸溶液中孵育并将所得浆体再水化，由National Renewable EnergyLaboratory(Golden，CO)制备湿润的破碎玉米秸秆材料。还利用与玉米秸秆相同的方法，由National Renewable Energy Laboratory(Golden，CO)制备柳枝稷。通过果胶酶处理产生的甜菜浆来自Frederick，MD的Atlantic Biomass，Inc.。使用Mettler Toledo湿度分析仪，测得湿玉米秸秆中干固体为24％，柳枝稷中为26％，甜菜浆中为3.5％。将100g玉米秸秆或柳枝稷湿样品重悬于去离子水中至420ml终体积，并用10N NaOH将pH调至4.8。对于甜菜浆，将8.8g干固体在去离子水中溶至350ml，并用10N NaOH将pH调至4.8。对于所有原料，以0.25ml酶/g干生物量的比例加入Accellerase 1000TM(Genencor)(一种纤维素酶复合物)。将样品在50℃下摇动孵育72小时(110rpm)。接着用NaOH将该材料的pH调至7.5(忽略体积改变)，通过0.22um滤膜过滤除菌并用于下述生长实验中。保留样品用于如下述使用Sigma的基于己糖激酶的试剂盒测定葡萄糖浓度。还如之前的实施例所述用CelluclastTM(Novozymes)(一种纤维素酶)制备同一组纤维素原料。
测定以Accellerase 1000处理的多种纤维素原料的葡萄糖浓度：使用Sigma Glucose Assay Reagent#G3293测定葡萄糖浓度。将上述处理的样品稀释400倍，并向反应中加入40ul。测得来自玉米秸秆、柳枝稷和甜菜浆的纤维素制备物分别含有约23.6、17.1和13.7g/L葡萄糖。
测定在纤维素材料上的生长：将纤维素酶促解聚成葡萄糖、木糖和其他单糖后，将上述制备的材料分别在培养基或YPD培养基中对作为培养表14中24种藻类株系或酿酒酵母的原料进行评估。将培养基设计成含有恒定浓度的葡萄糖，而同时改变来自玉米秸秆、柳枝稷或甜菜浆的纤维素材料的量。第一组培养基和YPD培养基含有23.6g/L纯葡萄糖，而第二组培养基含有解聚的玉米秸秆、柳枝稷和甜菜浆，各含有23.6g/L葡萄糖。向柳枝稷和甜菜浆培养基中补充6.5和9.9g/L纯葡萄糖，以在全部纤维素培养基中将葡萄糖归一化成23.6g/L。向24孔板的孔中加入1ml合适的培养基。在28℃下在YPD中异样培养的酿酒酵母作为酵母细胞的接种物(20ul)。通过在含有20g/L葡萄糖的培养基中兼养培养的藻类细胞来制备24种藻类株系的20ul接种物。全部细胞都在黑暗中在不同浓度纤维素材料上28℃下摇动(300rpm)孵育2天。通过在UV分光光度计中测量750nm的吸光度来评估生长。出人意料的是，全部藻类株系都在以Accellerase 1000TM或CelluclastTM制备的玉米秸秆、柳枝稷和甜菜浆上生长，包括其中100％的可发酵糖都来源于纤维素的培养基条件。没有任一纤维素原料与解聚酶的组合使酿酒酵母的生长性能超过等量的纯葡萄糖，表明纤维素材料中对酵母生长的抑制剂对发酵的生产力产生重大影响。超过100％纯葡萄糖的藻类株系、解聚酶和原料(具有100％纤维素来源单糖)的组合示于表16。
表16.藻类、酶和原料的组合
原料和解聚酶 属/种 来源/命名
玉米秸秆/celluclastTM Bracteococcus minor UTEX 66
甜菜浆/accelleraseTM 椭圆小球藻 SAG 2141
柳枝稷/accelleraseTM Chlorella kessleri UTEX 252
甜菜浆/accelleraseTM Chlorella kessleri UTEX 397
柳枝稷/accelleraseTM Chlorella luteoviridis SAG 2133
甜菜浆/accelleraseTM Chlorella luteoviridis SAG 2133
柳枝稷/accelleraseTM Chlorella luteoviridis UTEX 22
甜菜浆/accelleraseTM Chlorella luteoviridis UTEX 22
玉米秸秆/accelleraseTM Chlorella luteoviridis UTEX 22
甜菜浆/accelleraseTM 原壳小球藻 UTEX 250
甜菜浆/accelleraseTM 小球藻属物种 SAG 241.80
甜菜浆/accelleraseTM Parachlorella kessleri SAG 12.80
柳枝稷/accelleraseTM Prototheca moriformis UTEX 1441
甜菜浆/accelleraseTM Prototheca moriformis UTEX 1441
玉米秸秆/accelleraseTM Prototheca moriformis UTEX 1441
玉米秸秆/celluclastTM Prototheca moriformis UTEX 1441
玉米秸秆/accelleraseTM Prototheca moriformis UTEX 1434
甜菜浆/accelleraseTM Pseudochlorella aquatica SAG 2149
实施例26
碳利用筛选
株系和培养条件：以下文所述多种微藻株系的种子培养物开始作为24孔板中的1ml液体培养物，在光照下自养培养48小时，以约350rpm搅动。将平板中加入1.5％基于琼脂糖的固体培养基，其含有1％的葡萄糖、甘油、木糖、蔗糖、果糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或乙酸作为单一固定碳源。对于每个株系，将来自自养24孔板的5μl培养物点到固体培养基上。将平板在28℃下在黑暗中孵育7天，并检查其生长，与不含额外固定碳的对照平板进行比较。观察测试的每个物种在每个原料上的生长，如下表17所示。这些株系在黑暗中在不存在额外的固定碳的情况下在培养基上不生长或生长极慢。
表17.在多种固定碳原料上培养的藻类物种
固定碳源 属/种 来源/命名
葡萄糖 原壳小球藻 UTEX 250
葡萄糖 Chlorella kessleri UTEX 397
葡萄糖 Chlorella sorokiniana UTEX 2805
葡萄糖 Parachlorella kessleri SAG 12.80
葡萄糖 Pseudochlorella aquatica SAG 2149
葡萄糖 Chlorella reisiglii CCAP 11/8
葡萄糖 Bracteococcus medionucleatus UTEX 1244
葡萄糖 Prototheca stagnora UTEX 1442
葡萄糖 Prototheca moriformis UTEX 1434
葡萄糖 Prototheca moriformis UTEX 1435
葡萄糖 Scenedesmus rubescens CCAP 232/1
甘油 Parachlorella kessleri SAG 12.80
甘油 原壳小球藻 CCAP 211/8d
甘油 Bracteococcus medionucleatus UTEX 1244
甘油 Prototheca moriformis UTEX 288
甘油 Prototheca moriformis UTEX 1435
甘油 微小小球藻 UTEX 2341
甘油 小球藻属物种 CCAP 211/61
甘油 Chlorella sorokiniana UTEX 1663
木糖 Chlorella luteoviridis SAG 2133
木糖 椭圆小球藻 SAG 2141
木糖 Pseudochlorella aquatica SAG 2149
木糖 小球藻属物种 CCAP 211/75
木糖 Prototheca moriformis UTEX 1441
木糖 Protothca moriformis UTEX 1435
蔗糖 Chlorella staccharophila UTEX 2469
蔗糖 Chlorella luteoviridis UTEX 22
蔗糖 小球藻属物种 UTEX EE102
蔗糖 Chlorella luteoviridis SAG 2198
蔗糖 Bracteococcus medionucleatus UTEX 1244
蔗糖 微小小球藻 CCALA 20024
果糖 Chlorella kessleri UTEX 398
果糖 Chlorella trebouxiodes SAG 3.95
果糖 Parachlorella kessleri SAG 27.87
果糖 Chlorella luteoviridis SAG 2214
果糖 原壳小球藻 UTEX 31
果糖 原壳小球藻 UTEX 250
果糖 Chlorella reisiglii CCAP 11/8
果糖 原壳小球藻 CCAP 211/8d
果糖 Prototheca moriformis UTEX 1435
果糖 Scenedesmus rubescens CCAP 232/1
阿拉伯糖 小球藻属物种 CCAP 211/75
甘露糖 Chlorella kessleri UTEX 263
甘露糖 Chlorella saccharophila UTEX 2911
甘露糖 Parachlorella kessleri SAG 12.80
甘露糖 小球藻属物种 SAG 241.80
甘露糖 Chlorella angustoellipsoidea SAG 265
甘露糖 椭圆小球藻 SAG 2141
甘露糖 原壳小球藻 UTEX 250
甘露糖 Chlorella emersonii CCAP 211/15
甘露糖 Bracteococcus minor UTEX 66
甘露糖 Prototheca stagnora UTEX 1442
甘露糖 Prototheca moriformis UTEX 1439
甘露糖 Chlorella cf.minutissima CCALA 20024
甘露糖 Scenedesmus rubescens CCAP 232/1
半乳糖 Bracteococcus minor UTEX 66
半乳糖 Parachlorella kessleri SAG 14.82
半乳糖 Parachlorella beijerinckii SAG 2046
半乳糖 原壳小球藻 UTEX 25
半乳糖 Chlorella sorokiniana UTEX 1602
半乳糖 Parachlorella kessleri SAG 12.80
半乳糖 Pseudochlorella aquatica SAG 2149
半乳糖 Chlorella luteoviridis SAG 2214
半乳糖 椭圆小球藻 CCAP 211/42
半乳糖 椭圆小球藻 CCAP 211/50
半乳糖 原壳小球藻 UTEX 250
半乳糖 原壳小球藻 UTEX 264
半乳糖 Bracteococcus medionucleatus UTEX 1244
半乳糖 Prototheca moriformis UTEX 1439
半乳糖 Prototheca moriformis UTEX 1441
半乳糖 Chlorella kessleri CCALA 252
乙酸盐 Chlorella sorokiniana UTEX 1230
乙酸盐 Chlorella sorokiniana UTEX 1810
乙酸盐 Chlorella luteoviridis UTEX 22
乙酸盐 Parachlorella kessleri SAG 12.80
乙酸盐 Parachlorella kessleri SAG 27.87
乙酸盐 小球藻属物种 SAG 241.80
乙酸盐 Chlorella luteoviridis SAG 2214
乙酸盐 原壳小球藻 UTEX 31
乙酸盐 原壳小球藻 UTEX 411
乙酸盐 椭圆小球藻 CCAP 211/42
乙酸盐 Chlorella ovalis CCAP 211/21A
乙酸盐 原壳小球藻 CCAP 211/8d
乙酸盐 Prototheca stagnora UTEX 1442
乙酸盐 原壳小球藻 UTEX 250
乙酸盐 Chlorella sorokiniana CCALA 260
乙酸盐 小球藻 CCAP 211/79
乙酸盐 Parachlorella kessleri SAG 14.82
实施例27
生产可再生柴油
细胞生产：使用F-Tank批量的原壳小球藻(UTEX 250)(约1,200加仑)产生用于提取加工的生物量。该批量(#ZA07126)允许运行100小时而将葡萄糖水平控制在16g/L，其后终止玉米糖浆补料。2小时后残留葡萄糖水平降至＜0g/L。这得到的最终时间为102小时。最终培养液体积为1120加仑。过程中污染检查和最终培养液样品的彻底分析均未显示任何污染迹象。将发酵液离心并转鼓式干燥。将转鼓式干燥的细胞重悬于己烷中，并以约1000巴匀浆。接着使用标准方案进行己烷提取，测定所得藻类甘油三酯油中无残留己烷。
生产可再生柴油：藻类甘油三酯油的脂质谱为约3％C18:0、71％C18:1、15％C18:2、1％C18:3、8％C16:0和2％其他组分。首先对油进行加氢裂化，约20％产量作为水和气体失去。然后进行加氢异构化，约10％产量作为气体失去。然后进行第一次蒸馏以除去石油脑馏分，剩下期望的产物。在该第一次蒸馏中约20％的材料作为石油脑失去。接着在足以除去满足ASTM D975标准所需馏分但留下不满足D975蒸馏的90％点的底层馏分的温度下进行第二次蒸馏。约30％的材料留在第二次蒸馏的底部馏分中。接着将所得材料对全部ASTM D975规范进行测试。
图29和30分别显示通过本发明方法产生的最终可再生柴油产品的气相色谱和沸点分布曲线。表18显示所得可再生柴油产品的沸点分布，表19显示对最终产品满足ASTM D975规范的分析结果。
表18.可再生柴油产物的沸点分布。
回收量 BP 回收量 BP 回收量 BP 回收量 BP
％ ℃ ％ ℃ ％ ℃ ％ ℃
IBP 150.4 26.0 261.8 52.0 303.8 78.0 315.8
1.0 163.6 27.0 264.6 53.0 304.4 79.0 316.4
2.0 173.4 28.0 266.2 54.0 304.8 80.0 317.0
3.0 175.2 29.0 268.2 55.0 305.2 81.0 317.6
4.0 188.0 30.0 271.0 56.0 305.6 82.0 318.4
5.0 194.8 31.0 272.4 57.0 306.0 83.0 319.0
6.0 196.6 32.0 273.4 58.0 306.4 84.0 319.6
7.0 197.8 33.0 276.2 59.0 306.6 85.0 320.2
8.0 207.4 34.0 280.0 60.0 307.0 86.0 320.8
9.0 210.0 35.0 282.4 61.0 307.4 87.0 321.2
10.0 214.4 36.0 285.2 62.0 307.6 88.0 321.8
11.0 216.6 37.0 287.8 63.0 308.0 89.0 322.2
12.0 217.6 38.0 289.6 64.0 308.4 90.0 322.4
13.0 221.4 39.0 291.8 65.0 308.8 91.0 322.8
14.0 227.6 40.0 294.2 66.0 309.2 92.0 323.2
15.0 229.8 41.0 295.8 67.0 309.6 93.0 324.4
16.0 233.2 42.0 296.8 68.0 310.2 94.0 326.8
17.0 235.8 43.0 297.6 69.0 310.6 95.0 329.4
18.0 236.8 44.0 298.4 70.0 311.2 96.0 333.6
19.0 240.2 45.0 299.2 71.0 311.6 97.0 339.4
20.0 245.6 46.0 299.8 72.0 312.2 98.0 346.2
21.0 248.0 47.0 300.6 73.0 313.0 99.0 362.8
22.0 250.2 48.0 301.2 74.0 313.6 FBP 401.4
23.0 253.6 49.0 302.0 75.0 314.2
24.0 255.2 50.0 302.6 76.0 314.8
25.0 256.8 51.0 303.2 77.0 315.4
表19.使用D975规范对可再生柴油产物的分析报告。
方法编号 测试描述 结果 单位
D93A 闪点(PMCC) 70 ℃
D2709 水和沉积物 0 体积％
D86 蒸馏90％(回收的) 301.0/573.9 ℃/°F
D445 40.0℃(104.0°F)下的运动学粘度 2.868 mm2/秒
D482 灰 ＜0.001 wt％
D5453 硫 2.4 ppm
D130 在50℃下铜腐蚀3小时 1b
D613 十六烷数量＊＊＊ ＞65
D976 计算的十六烷指数 71.2
D2500 浊点 -3 ℃
D524 Ramsbottom 10％碳残留 0.02 Wt％
D97 倾点 -3 ℃
D2274 40小时测试的总不溶物(氧化 4.0 mg/100mL
稳定性)＊＊＊
D4052 15℃(59.0°F)下的密度 793.8 kg/m3
D4176-1 目检的外观(实验室) 澄清明亮-通过 视觉
D4176-1 目检的外观(实验室) 无水-通过 视觉
D4176-1 目检的外观(实验室) 颗粒物-通过 视觉
D1500 ASTM颜色 L0.5
D664 酸数量 ＜0.10 mg KOH/g
D6079 润滑性(磨损痕) 405 μm
序列
SEQ ID NO：1
来自小球藻的HUP启动子(GenBank检索号X55349的子序列)：
gatcagacgggcctgacctgcgagataatcaagtgctcgtaggcaaccaactcagcagctgcttggtgttgggtctgcaggatagtgtt
gcagggccccaaggacagcaggggaacttacaccttgtccccgacccagttttatggagtgcattgcctcaagagcctagccggagc
gctaggctacatacttgccgcaccggtatgaggggatatagtactcgcactgcgctgtctagtgagatgggcagtgctgcccataaac
aactggctgctcagccatttgttggcggaccattctgggggggccagcaatgcctgactttcgggtagggtgaaaactgaacaaagac
taccaaaacagaatttcttcctccttggaggtaagcgcaggccggcccgcctgcgcccacatggcgctccgaacacctccatagctgt
aagggcgcaaacatggccggactgttgtcagcactctttcatggccatacaaggtcatgtcgagattagtgctgagtaagacactatca
ccccatgttcgattgaagccgtgacttcatgccaacctgcccctgggcgtagcagacgtatgccatcatgaccactagccgacatgcg
ctgtcttttgccaccaaaacaactggtacaccgctcgaagtcgtgccgcacacctccgggagtgagtccggcgactcctccccggcg
ggccgcggccctacctgggtagggtcgccatacgcccacgaccaaacgacgcaggaggggattggggtagggaatcccaaccag
cctaaccaagacggcacctataataataggtggggggactaacagccctatatcgcaagctttgggtgcctatcttgagaagcacgag
ttggagtggctgtgtacggtcgaccctaaggtgggtgtgccgcagcctgaaacaaagcgtctagcagctgcttctataatgtgtcagcc
gttgtgtttcagttatattgtatgctattgtttgttcgtgctagggtggcgcaggcccacctactgtggcgggccattggttggtgcttgaatt
gcctcaccatctaaggtctgaacgctcactcaaacgcctttgtacaactgcagaactttccttggcgctgcaactacagtgtgcaaacca
gcacatagcactcccttacatcacccagcagtacaaca
SEQ ID NO：2
来自AY307383的椭圆小球藻硝酸还原酶启动子：
cgctgcgcaccagggccgccagctcgctgatgtcgctccaaatgcggtcccccgattttttgttcttcatcttctccaccttggtggccttc
ttggccagggccttcagctgcatgcgcacagaccgttgagctcctgatcagcatcctcaggaggccctttgacaagcaagcccctgtg
caagcccattcacggggtaccagtggtgctgaggtagatgggtttgaaaaggattgctcggtcgattgctgctcatggaattggcatgt
gcatgcatgttcacaatatgccaccaggctttggagcaagagagcatgaatgccttcaggcaggttgaaagttcctgggggtgaagag
gcagggccgaggattggaggaggaaagcatcaagtcgtcgctcatgctcatgttttcagtcagagtttgccaagctcacaggagcag
agacaagactggctgctcaggtgttgcatcgtgtgtgtggtgggggggggggggttaatacggtacgaaatgcacttggaattcccac
ctcatgccagcggacccacatgcttgaattcgaggcctgtggggtgagaaatgctcactctgccctcgttgctgaggtacttcaggccg
ctgagctcaaagtcgatgccctgctcgtctatcagggcctgcacctctgggctgaccggctcagcctccttcgcgggcatggagtagg
cgccggcagcgttcatgtccgggcccagggcagcggtggtgccataaatgtcggtgatggtggggaggggggccgtcgccacacc
attgccgttgctggctgacgcatgcacatgtggcctggctggcaccggcagcactggtctccagccagccagcaagtggctgttcag
gaaagcggccatgttgttggtccctgcgcatgtaattccccagatcaaaggagggaacagcttggatttgatgtagtgcccaaccgga
ctgaatgtgcgatggcaggtccctttgagtctcccgaattactagcagggcactgtgacctaacgcagcatgccaaccgcaaaaaaat
gattgacagaaaatgaagcggtgtgtcaatatttgctgtatttattcgttttaatcagcaaccaagttcgaaacgcaactatcgtggtgatca
agtgaacctcatcagacttacctcgttcggcaaggaaacggaggcaccaaatccaattgatattatcgcttgccaagctagagctgat
ctttgggaaaccaactgccagacagtggactgtgatggagtgccccgagtggtggagcctcttcgattcggttagtcattactaacgtg
aaccctcagtgaagggaccatcagaccagaaagaccagatctcctcctcgacaccgagagagtgttgcggcagtaggacgacaag
SEQ ID NO：3
布朗葡萄藻苹果酸脱氢酶5’UTR：
aattggaaaccccgcgcaagaccgggttgtttggccgcctgaccggaaagggggggcctgtcccgaagggggtctatctcttgggg
gatgtcgggcgcggaaagtcgatgttgatggacctcttcttcgaccatgtcggggtcgaggccaagagccgcgtccatttcgccgagt
tcatgatggaggtgaatgaccgcatcgccaccgaacgcgccaagaagcgggcgaccgatcgcccccgtcgctgcagcccttgccg
aggaagtccggctgctggcgttcgacgagatgatggtgacgaacagcccggacgcgatgatcctgtcgcggctgttcaccgcgctg
atcgaggcgggggtgacgatcgtcaccacctccaaccggccgcccagggatctctataagaacgggctcaaccgcgagcatttcct
gcccttcatcgcgctgatcgaggcgcggctggacgtgctggcgctgaacggcccgaccgactatcggcgcgaccggctggggcg
gctggacacgtggttggtgcccaatggccccaaggcgacgattaccttgtcggcggcgttcttccgcctgaccgactatccggtcgag
gatgccgcgcatgtgccctctgaggacctgaaggtgggcgggcgcgtgctgaatgtccccaaggcgctgaagggcgtcgcggtctt
ctcgttcaagcggttgtgcggcgaagcgcggggggcggcggactatctggcggtcgcgcggggcttccacaccgtcatcctggtcg
gaatccccaagctgggggcggagaaccgcaacgaggcggggcgcttcgtccagctgatcgacgcgctctacgaacataaggtcaa
gctgctcgccgcagccgatgccagcccgccgaactctatgaaaccggcgacggccggttcgagtttgagcgcagatcagccggttg
gaagagatgcgctccgaggattatctggcccaaggccatggctcggaggggccttgatcaggccttaatgcacttcgcaaccattatc
gtttaaaatcttaaactctgtggaataacggttccccgacgccgcaatacacgtacgtccactacggagtaggattgga
SEQ ID NO：4
衣藻RBCS2启动子：
cgcttagaagatttcgataaggcgccagaaggagcgcagccaaaccaggatgatgtttgatggggtatttgagcacttgcaacccttat
ccggaagccccctggcccacaaaggctaggcgccaatgcaagcagttcgcatgcagcccctggagcggtgccctcctgataaacc
ggccagggggcctatgttctttacttttttacaagagaagtcactcaacatcttaaacggtcttaagaagtctatccgg
SEQ ID NO：5
来自pCAMBIA的CMV-Hyg-CMV BamHI-SacII盒：
ggatccccgggaattcggcgcgccgggcccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctca
gaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatca
aaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgaca
gtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgat
gtgataacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttc
aacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtgg
cacctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccaccc
acgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatg
acgcacaatcccactatccttcgcaagaccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctct
ctacaaatctatctctctcgagctttcgcagatcccggggggcaatgagatatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaa
gtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggag
ggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctccc
gattccggaagtgcttgacattggggagtttagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacc
tgcctgaaaccgaactgcccgctgttctacaaccggtcgcggaggctatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcg
ggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcact
ggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaa
gtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgag
gcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctactt
cgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccacgactccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttg
gttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtaca
caaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactc
gtccgagggcaaagaaatagagtagatgccgaccggatctgtcgatcgacaagctcgagtttctccataataatgtgtgagtagttccc
agataagggaattagggttcctatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatc
aataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaattcggcgttaattcagtacattaaaaacgtcc
gcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttgtttacaccacaatatatcctgccaccagccagccaacagctccccgaccggcagct
cggcacaaaatcaccactcgatacaggcagcccatcagtccgggacggcgtcagcgggagagccgttgtaaggcggcagactttg
ctcatgttaccgatgctattcggaagaacggcaactaagctgccgggtttgaaacacggatgatctcgcggagggtagcatgttgattg
taacgatgacagagcgttgctgcctgtgatcaccgcgg
SEQ ID NO：6
caaccacgtcttcaaagcaa
SEQ ID NO：7
agcaatcgcgcatatgaaat
SEQ ID NO：8
ATGCTTCTTCAGGCCTTTCTTTTTCTTCTTGCTGGTTTTGCTGCCAAGATCAGCGCC
TCTATGACGAACGAAACCTCGGATAGACCACTTGTGCACTTTACACCAAACAAG
GGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACGAAAAAGATGCCAAGTGG
CATCTGTACTTTCAATACAACCCGAACGATACTGTCTGGGGGACGCCATTGTTTT
GGGGCCACGCCACGTCCGACGACCTGACCAATTGGGAGGACCAACCAATAGCTA
TCGCTCCGAAGAGGAACGACTCCGGAGCATTCTCGGGTTCCATGGTGGTTGACTA
CAACAATACTTCCGGCTTTTTCAACGATACCATTGACCCGAGACAACGCTGCGTG
GCCATATGGACTTACAACACACCGGAGTCCGAGGAGCAGTACATCTCGTATAGC
CTGGACGGTGGATACACTTTTACAGAGTATCAGAAGAACCCTGTGCTTGCTGCAA
ATTCGACTCAGTTCCGAGATCCGAAGGTCTTTTGGTACGAGCCCTCGCAGAAGTG
GATCATGACAGCGGCAAAGTCACAGGACTACAAGATCGAAATTTACTCGTCTGA
CGACCTTAAATCCTGGAAGCTCGAATCCGCGTTCGCAAACGAGGGCTTTCTCGGC
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AAGTCCTACTGGGTGATGTTTATTTCCATTAATCCAGGAGCACCGGCAGGAGGTT
CTTTTAATCAGTACTTCGTCGGAAGCTTTAACGGAACTCATTTCGAGGCATTTGAT
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GGAGTATTCCGCATTCGTTCCTACAAACCCTTGGAGGTCCTCCATGTCGCTCGTG
AGGAAATTCTCTCTCAACACTGAGTACCAGGCCAACCCGGAAACCGAACTCATA
AACCTGAAAGCCGAACCGATCCTGAACATTAGCAACGCTGGCCCCTGGAGCCGG
TTTGCAACCAACACCACGTTGACGAAAGCCAACAGCTACAACGTCGATCTTTCGA
ATAGCACCGGTACACTTGAATTTGAACTGGTGTATGCCGTCAATACCACCCAAAC
GATCTCGAAGTCGGTGTTCGCGGACCTCTCCCTCTGGTTTAAAGGCCTGGAAGAC
CCCGAGGAGTACCTCAGAATGGGTTTCGAGGTTTCTGCGTCCTCCTTCTTCCTTGA
TCGCGGGAACAGCAAAGTAAAATTTGTTAAGGAGAACCCATATTTTACCAACAG
GATGAGCGTTAACAACCAACCATTCAAGAGCGAAAACGACCTGTCGTACTACAA
AGTGTATGGTTTGCTTGATCAAAATATCCTGGAACTCTACTTCAACGATGGTGAT
GTCGTGTCCACCAACACATACTTCATGACAACCGGGAACGCACTGGGCTCCGTGA
ACATGACGACGGGTGTGGATAACCTGTTCTACATCGACAAATTCCAGGTGAGGG
AAGTCAAGTGA
SEQ ID NO：9
TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA
SEQ ID NO：10
TTGTCGGAATGTCATATCAA
SEQ ID NO：11
TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA
SEQ ID NO：12
AACGCCTTTGTACAACTGCA
SEQ ID NO：13
TCCGGTGTGTTGTAAGTCCA
SEQ ID NO：14
MTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYFQYNPNDTVWGTPLF
WGHATSDDLTNWEDQPIAIAPKRNDSGAFSGSMVVDYNNTSGFFNDTIDPRQRCVAI
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FISINPGAPAGGSFNQYFVGSFNGTHFEAFDNQSRVVDFGKDYYALQTFFNTDPTYGS
ALGIAWASNWEYSAFVPTNPWRSSMSLVRKFSLNTEYQANPETELINLKAEPILNISN
AGPWSRFATNTTLTKANSYNVDLSNSTGTLEFELVYAVNTTQTISKSVFADLSLWFK
GLEDPEEYLRMGFEVSASSFFLDRGNSKVKFVKENPYFTNRMSVNNQPFKSENDLSY
YKVYGLLDQNILELYFNDGDVVSTNTYFMTTGNALGSVNMTTGVDNLFYIDKFQVR
EVK
SEQ ID NO：15
MLLQAFLFLLAGFAAKISAS
SEQ ID NO：16
MANKSLLLLLLLGSLASG
SEQ ID NO：17
MARLPLAALG
SEQ ID NO：18
MANKLLLLLLLLLLPLAASG
SEQ ID NO：19
MLLQAFLFLLAGFAAKISASMTNETSDRPLVHFTPNKGWMNDPNGLWYDEKDAKWHLYF
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DGDVVSTNTYFMTTGNALGSVNMTTGVDNLFYIDKFQVREVK
SEQ ID NO：20
CTGACCCGACCTATGGGAGCGCTCTTGGC
SEQ ID NO：21
CTTGACTTCCCTCACCTGGAATTTGTCG
SEQ ID NO：22
GTGGCCATATGGACTTACAA
SEQ ID NO：23
CAAGGGCTGGATGAATGACCCCAATGGACTGTGGTACGACG
SEQ ID NO：24
CACCCGTCGTCATGTTCACGGAGCCCAGTGCG
SEQ ID NO：25
gaattccccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgaga
cttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaag
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acccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgaacatggtggagcacgac
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ctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcaaaaggacagtagaaaaggaaggtggcacctacaaatgccatcattgcgat
aaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaaga
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agacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacacgctgaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctggcgcgcc
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cctaaaaccaaaatccagtactaaaatccagatcccccgaattaa

Claims (31)

1.生产可再生柴油或喷气式发动机燃料的方法，包括：
(a)在固定的碳源存在下培养微藻种群，其中：
(i)所述微藻表达外源蔗糖转化酶；
(ii)所述微藻将其干细胞重量的至少10％作为脂质累积；和
(iii)所述固定的碳源包含甘蔗、甜菜、糖蜜或其他含蔗糖的原料；
(b)从培养的微藻中分离脂质组分；和
(c)对分离的脂质组分进行一个或多个化学反应以产生烷烃，
从而产生可再生柴油或喷气式发动机燃料。
2.权利要求1的方法，其中所述甘蔗是甘蔗汁。
3.权利要求1的方法，其中所述蔗糖转化酶是可分泌的蔗糖转化酶。
4.权利要求1的方法，其中所述一种或多种化学反应选自加氢处理、氢化裂解、脱氧和异构化。
5.权利要求1或4的方法，其中所述微藻含有选自果糖激酶基因、葡糖激酶基因、己糖激酶基因和蔗糖转运蛋白基因的至少一种其他外源蔗糖利用基因。
6.微藻细胞，其含有其干细胞重量的至少10％作为脂质，并且含有编码蔗糖转化酶的外源基因。
7.权利要求6的细胞，其中所述蔗糖转化酶基因编码可分泌的蔗糖转化酶。
8.权利要求6到7任一项的细胞，其中所述重组微藻选自Achnanthesorientalis、Agmenellum、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformis linea、Amphora coffeiformis punctata、Amphoracoffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphora delicatissima capitata、Amphora sp.、Anabaena、Ankistrodesmus、Ankistrodesmus falcatus、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、Botryococcus braunii、Botryococcus sudeticus、Bracteococcus minor、Bracteococcus medionucleatus、Carteria、Chaetoceros gracilis、Chaetocerosmuelleri、Chaetoceros muelleri subsalsum、Chaetoceros sp.、Chlorellaanitrata、Chlorella Antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、Chlorella ellipsoidea、Chlorellaemersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var.vacuolata、Chlorellaglucotropha、Chlorelia infusionum、Chlorella infusionum var.actophila、Chlorella infusionum var.auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorellalobophora、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorella luteoviridis var.lutescens、Chlorella miniata、Chlorellaminutissima、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella ovalis、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、Chlorellaprotothecoides、Chlorella protothecoides var.acidicola、Chlorella regularis、Chlorella regularis var.minima、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorellareisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var.ellipsoidea、Chlorella salina、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、Chlorella sp.、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、Chlorellavulgaris、Chlorella vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.autotrophica、Chlorella vulgaris var.viridis、Chlorella vulgaris var.vulgaris、Chlorellavulgaris var.vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、Chlorellavulgaris、Chlorococcum infusionum、Chlorococcum sp.、Chlorogonium、Chroomonas sp.、Chrysosphaera sp.、Cricosphaera sp.、Crypthecodiniumcohnii、Cryptomonas sp.、Cyclotella cryptica、Cyclotella meneghiniana、Cyclotella sp.、Dunaliella sp.、Dunaliella bardawil、Dunaliella bioculata、Dunaliella granulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、Dunaliellaparva、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、Dunaliella salina、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、Dunaliella viridis、Dunaliellatertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、Euglena、Franceia sp.、Fragilaria crotonensis、Fragilaria sp.、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、Isochrysis aff.galbana、Isochrysisgalbana、Lepocinclis、Micractinium、Monoraphidium minutum、Monoraphidium sp.、Nannochloris sp.、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis sp.、Navicula acceptata、Navicula biskanterae、Naviculapseudotenelloides、Navicula pelliculosa、Navicula saprophila、Navicula sp.、Nephrochloris sp.、Nephroselmis sp.、Nitschia communis、Nitzschiaalexandrina、Nitzschia communis、Nitzschia dissipata、Nitzschia frustulum、Nitzschia hantzschiana、Nitzschia inconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、Nitzschia quadrangular、Nitzschia sp.、Ochromonas sp.、Oocystis parva、Oocystis pusilla、Oocystis sp.、Oscillatorialimnetica、Oscillatoria sp.、Oscillatoria subbrevis、Parachlorella kessleri、Pascheria acidophila、Pavlova sp.、Phagus、Phormidium、Platymonas sp.、Pleurochrysis carterae、Pleurochrysis dentate、Pleurochrysis sp.、Protothecawickerhamii、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Protothecamoriformis、Prototheca zopfii、Pseudochlorella aquatica、Pyramimonas sp.、Pyrobotrys、Rhodococcus opacus、Sarcinoid chrysophyte、Scenedesmusarmatus、Schizochytrium、Spirogyra、spirulina platensis、Stichococcus sp.、Synechococcus sp.、Tetraedron、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、Thalassiosira weissflogii和Viridiella fridericiana。
9.权利要求8的细胞，其中所述Chlorella lobophora为Chlorellalobophora株系SAG37.88。
10.权利要求8的细胞，其中所述Chlorella protothecoides包括UTEX株系1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25的任一种。
11.权利要求8的细胞，其中所述Micractinium为Micractinium UTEXLB2614。
12.权利要求8的细胞，其中所述重组微藻选自Bracteococcus、Chlorella、Parachlorella、Prototheca、Pseudochlorella、和Scenedesmus。
13.权利要求12的细胞，其中所述重组微藻是Chlorellaprotothecoides、Prototheca moriformis、Prototheca wickerhamii或Protothecazopfii。
14.产生脂质的方法，该方法包括：
(a)在包含固定碳源的培养基中培养包含编码蔗糖转化酶的外源基因的微藻种群直到微藻将其干细胞重量的至少10％作为脂质累积；和
(b)从微藻分离脂质。
15.权利要求14的方法，其中所述蔗糖转化酶基因编码可分泌的蔗糖转化酶。
16.权利要求14的方法，其中所述固定的碳源选自解聚的纤维素材料。
17.权利要求14的方法，其中所述固定的碳源选自甘蔗汁、甜菜和糖蜜。
18.权利要求14的方法，其中所述培养基包含从选自甘蔗汁、甜菜汁和糖蜜的来源提供的蔗糖，其中所述甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜具有至少50μM的蔗糖浓度。
19.权利要求18的方法，其中所述甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜具有至少500μM的蔗糖浓度。
20.权利要求19的方法，其中所述甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜具有至少5mM的蔗糖浓度。
21.权利要求20的方法，其中所述甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜具有至少50mM的蔗糖浓度。
22.权利要求21的方法，其中所述甘蔗汁、甜菜汁或糖蜜具有至少500mM的蔗糖浓度。
23.权利要求14的方法，其中从所述重组微藻分离脂质包括通过机械手段裂解重组微藻。
24.权利要求14的方法，其中所述培养基包含有限氮。
25.权利要求14-24任一项的方法，其中所述重组微藻选自Achnanthesorientalis、Agmenellum、Amphiprora hyaline、Amphora coffeiformis、Amphora coffeiformis linea、Amphora coffeiformis punctata、Amphoracoffeiformis taylori、Amphora coffeiformis tenuis、Amphora delicatissima、Amphora delicatissima capitata、Amphora sp.、Anabaena、Ankistrodesmus、Ankistrodesmus falcatus、Boekelovia hooglandii、Borodinella sp.、Botryococcus braunii、Botryococcus sudeticus、Bracteococcus minor、Bracteococcus medionucleatus、Carteria、Chaetoceros gracilis、Chaetocerosmuelleri、Chaetoceros muelleri subsalsum、Chaetoceros sp.、Chlorellaanitrata、Chlorella Antarctica、Chlorella aureoviridis、Chlorella candida、Chlorella capsulate、Chlorella desiccate、Chlorella ellipsoidea、Chlorellaemersonii、Chlorella fusca、Chlorella fusca var.vacuolata、Chlorellaglucotropha、Chlorella infusionum、Chlorella infusionum var.actophila、Chlorella infusionum var.auxenophila、Chlorella kessleri、Chlorellalobophora、Chlorella luteoviridis、Chlorella luteoviridis var.aureoviridis、Chlorella luteoviridis var.lurescens、Chlorella miniata、Chlorellaminutissima、Chlorella mutabilis、Chlorella nocturna、Chlorella ovalis、Chlorella parva、Chlorella photophila、Chlorella pringsheimii、Chlorellaprotothecoides、Chlorella protothecoides var.acidicola、Chlorella regularis、Chlorella regularis var.minima、Chlorella regularis var.umbricata、Chlorellareisiglii、Chlorella saccharophila、Chlorella saccharophila var.ellipsoidea、Chlorella salina、Chlorella simplex、Chlorella sorokiniana、Chlorella sp.、Chlorella sphaerica、Chlorella stigmatophora、Chlorella vanniellii、Chlorellavulgaris、Chlorella vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.autotrophica、Chlorella vulgaris var.viridis、Chlorella vulgaris var.vulgaris、Chlorellavulgaris var.vulgaris f.tertia、Chlorella vulgaris var.vulgaris f.viridis、Chlorella xanthella、Chlorella zofingiensis、Chlorella trebouxioides、Chlorellavulgaris、Chlorococcum infusionum、Chlorococcum sp.、Chlorogonium、Chroomonas sp.、Chrysosphaera sp.、Cricosphaera sp.、Crypthecodiniumcohnii、Cryptomonas sp.、Cyclotella cryptica、Cyclotella meneghiniana、Cyclotella sp.、Dunaliella sp.、Dunaliella bardawil、Dunaliella bioculata、Dunaliella granulate、Dunaliella maritime、Dunaliella minuta、Dunaliellaparva、Dunaliella peircei、Dunaliella primolecta、Dunaliella salina、Dunaliella terricola、Dunaliella tertiolecta、Dunaliella viridis、Dunaliellatertiolecta、Eremosphaera viridis、Eremosphaera sp.、Ellipsoidon sp.、Euglena、Franceia sp.、Fragilaria crotonensis、Fragilaria sp.、Gleocapsa sp.、Gloeothamnion sp.、Hymenomonas sp.、Isochrysis aff.galbana、Isochrysisgalbana、Lepocinclis、Micractinium、Monoraphidium minutum、Monoraphidium sp.、Nannochloris sp.、Nannochloropsis salina、Nannochloropsis sp.、Navicula acceptata、Navicula biskanterae、Naviculapseudotenelloides、Navicula pelliculosa、Navicula saprophila、Navicula sp.、Nephlochloris sp.、Nephroselmis sp.、Nitschia communis、Nitzschiaalexandrina、Nitzschia communis、Nitzschia dissipata、Nitzschia frustulum、Nitzschia hantzschiana、Nitzschia inconspicua、Nitzschia intermedia、Nitzschia microcephala、Nitzschia pusilla、Nitzschia pusilla elliptica、Nitzschia pusilla monoensis、Nitzschia quadrangular、Nitzschia sp.、Ochromonas sp.、Oocystis parva、Oocystis pusilla、Oocystis sp.、Oscillatorialimnetica、Oscillatoria sp.、Oscillatoria subbrevis、Parachlorella kessleri、Pascheria acidophila、Pavlova sp.、Phagus、Phormidium、Platymonas sp.、Pleurochrysiscarterae、Pleurochrysis dentate、Pleurochrysis sp.、Protothecawickerhamii、Prototheca stagnora、Prototheca portoricensis、Protothecamoriformis、Prototheca zopfii、Pseudochlorella aquatica、Pyramimonas sp.、Pyrobotrys、Rhodococcus opacus、Sarcinoid chrysophyte、Scenedesmusarmatus、Schizochytrium、Spirogyra、Spirulina platensis、Stichococcus sp.、Synechococcus sp.、Tetraedron、Tetraselmis sp.、Tetraselmis suecica、Thalassiosira weissfiogii和Viridiella fridericiana。
26.权利要求25的细胞，其中所述Chlorella lobophora为Chlorellalobophora株系SAG37.88。
27.权利要求25的细胞，其中所述Chlorella protothecoides包括UTEX株系1806、411、264、256、255、250、249、31、29、25的任一种。
28.权利要求25的细胞，其中所述Micractinium为MicractiniumUTEX LB2614。
29.权利要求25的方法，其中所述重组微藻选自Bracteococcus、Chlorella、Parachlorella、Prototheca、Pseudochlorella、和Scenedesmus。
30.权利要求29的方法，其中所述重组微藻是Chlorella protothecoides、Prototheca moriformis、Prototheca wickerhamii或Prototheca zopfii。
31.权利要求14的方法，其还包括(c)将脂质进行酯交换以产生脂肪酸酯和甘油。
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