CN111808892A - 脂肪酸酯的产生 - Google Patents

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Abstract

从基因工程化微生物产生诸如脂肪酸乙酯的脂肪酸酯的方法，在所述基因工程化微生物中，参与脂肪酸合成和/或乙醇产生的基因的表达被改变，使得获得的微生物在不存在外源添加的醇的情况下能产生醇、脂肪酸和酯合酶。

Description

脂肪酸酯的产生
本申请是申请日为2010年4月27日、申请号为201080027865.7、发明名称为“脂肪酸酯的产生”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年4月27日提交的美国临时申请第61/173,016号和2009年5月29日提交的美国临时申请第61/182,564号的权益，通过引用将上述申请的全部内容并入本文。
技术领域
本公开通常涉及利用基因工程化细胞和微生物来产生脂肪酸酯的方法以及由这些方法所产生的脂肪酸酯。产物尤其可用作生物燃料。
发明背景
石油是地球上发现的、液体、气体或固体形式的有限的天然资源。石油主要由烃组成，烃主要由碳和氢组成。石油还含有大量的处于不同形式的其它元素，例如氮、氧或硫。
石油是宝贵资源，但是以相当大的金融和环境代价对石油产品进行开发。首先，必须发现石油资源。石油勘探是耗资并有风险的投资。勘探深水井的费用可以超过1亿美元。除经济费用外，石油勘探存在严重的环境代价。例如近海勘探扰乱周围海洋环境。
发现生产井后，必须以巨大代价从地球开采石油。即使在最佳条件下，仅可以开采50％的井中石油。石油开采也存在环境代价。例如，石油开采可以导致大量石油渗漏上升至表面。近海钻井涉及挖掘河床，这扰乱或破坏周围海洋环境。
开采后，石油必须从石油生产区长距离运输到石油消费区。除运输费用外，还存在大规模油泄漏的环境风险。
从地球开采的原油在天然形式时具有很少的商业用途。其是具有不同长度和复杂性的烃(例如，石蜡(或烷)、烯烃(或烯)、炔、环烷(napthenes)(或环烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其它有机化合物(例如含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如硫磺、盐、酸、金属等)。
因此，在商业上可以使用前，必须提炼并纯化原油。由于其高能量密度及其便利的可运输性，大部分石油被提炼为燃料，例如运输燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油气等。
原油还是用于产生石化产品的原材料的主要来源。两类主要的来自石油的原材料是短链烯烃(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯异构体)。这些原材料来源于原油中较长链烃，这是通过以相当大的费用使用各种方法(例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整)来裂化长链烃。这些原材料用于制造不能直接从原油提炼的石化产品，例如单体、溶剂、去垢剂或粘合剂。
来源于原油的原材料的一个实例是乙烯。乙烯被用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。来源于原油的原材料的另一个实例是丙烯。丙烯用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、环氧氯丙烷和环氧树脂。
石化产品可以用于制造特种化学品，例如塑料、树脂、纤维、橡胶、药品、润滑剂或凝胶。可以产自石化材料的特种化学品的实例为：脂肪酸、烃(例如长链烃、支链烃、饱和烃、不饱和烃等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。
特种化学品具有很多商业用途。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂。表面活性剂可用于去垢剂和肥皂中。脂肪酸还可以被用作燃料中的添加剂、润滑油、涂料、漆、蜡烛、色拉油、起酥油、化妆品和乳化剂。此外，在橡胶产品中脂肪酸被用作促进剂活性剂。脂肪酸还可以被用作生产甲基酯、酰胺、胺、盐酸、酐、乙烯酮二聚物以及过氧酸和酯的原料。
烃具有很多商业用途。例如链较短的烷被用作燃料。甲烷和乙烷是天然气的主要成分。链较长的烷(例如5至16个碳)被用作交通工具燃料(例如汽油、柴油或航空燃料)。具有多于16个碳原子的烷是燃油和润滑油的重要组分。更长的烷在室温下为固体，其可以被用作例如石蜡。含有约35个碳的烷见于用于路面的沥青中。此外，可以裂化链较长的烷来生产商业上有用的链较短的烃。
与短链烷类似，短链烯也被用于交通工具燃料中。链较长的烯被用于塑料、润滑剂和合成润滑剂中。此外，烯被用作生产醇、酯、增塑剂、表面活性剂、叔胺、增强型采油剂(enhanced oil revovery agent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、环氧化物、氯化烷、氯化烯、蜡、燃油添加剂和粘性流减阻剂。
脂肪醇具有许多商业用途。链较短的脂肪醇在化妆品和食品工业中用作乳化剂、润滑剂和增稠剂。由于其两性属性，脂肪醇起非离子表面活性剂的作用，所述非离子表面活性剂可用于去垢剂中。此外，脂肪醇被用于蜡、树胶、树脂、药物软膏和洗剂、润滑油添加剂、纺织品抗静电剂和整理剂、增塑剂、化妆品、工业溶剂和脂肪溶剂中。
酯具有很多商业用途。例如作为替代燃料的生物柴油是由酯(例如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等)组成。一些低分子量的酯是挥发性的，具有令人愉悦的气味，这使得它们可用作芳香剂或调味剂。另外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶剂。此外，一些天然存在的物质，例如蜡、脂肪和油是由酯组成的。酯还被用作树脂和塑料中的软化剂、增塑剂、灭火剂以及汽油和油中的添加剂。此外，酯可以用于制造聚合物、胶片、纺织品、染料和药品。
醛用于生产很多特种化学品。例如，醛用于生产聚合物、树脂、染料、调味剂、增塑剂、香水、药品和其它化学品。一些被用作溶剂、防腐剂或消毒剂。一些天然和合成的化合物，例如维生素和激素是醛。此外，很多糖含有醛基。
酮在商业上被用作溶剂。例如，丙酮常常被用作溶剂，但其也是制造聚合物的原材料。酮还用于漆、涂料、爆炸物、香水和纺织品加工中。此外，酮用于生产醇、烯、烷、亚胺和烯胺。
此外，原油是润滑剂的来源。来自石油的润滑剂通常由烯烃组成，特别是聚烯烃和α-烯烃。润滑剂可以从原油提炼或使用提炼自原油的原材料生产。
从原油获得这些特种化学品需要大量的金融投资以及大量的能量。因为原油中的长链烃常常被裂化以产生较小的单体，其也是低效的过程。这些单体然后被用作生产更复杂的特种化学品的原材料。
除勘探、开采、运输和提炼石油的问题外，石油是有限的并逐渐减少的资源。估计当今世界石油消耗为每年300亿桶。据估计，以现有生产水平，世界石油储量预计在2050年前会耗竭。
最后，基于石油的燃料的燃烧释放温室气体(例如二氧化碳)和其它形式的空气污染(例如一氧化碳、二氧化硫等)。随着世界对燃料需求的增加，温室气体和其它形式的空气污染的排放也增加。大气中温室气体的累积导致增加全球变暖。因此，除局部破坏环境外(例如油泄漏、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油还破坏全球环境。
由于石油所引起的内在挑战，存在对于不需要像石油一样被勘探、开采、长距离运输或大量提炼的可再生石油资源的需要。存在对于可以经济地生产的可再生石油资源的需要。此外，还存在对于不会产生石油工业和基于石油的燃料的燃烧所产生的环境破坏类型的可再生石油资源的需要。基于相似原因，还存在对于通常来自石油的化学品的可再生资源的需要。
发明概述
本公开涉及在不向微生物提供外源醇的情况下，从基因工程化微生物产生脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯(“FAEE”)。通常，通过在不存在外源醇(例如外源乙醇或外源甲醇)的情况下，培养经过基因工程改造从而能产生脂肪酸和至少一种酯合酶的微生物来产生脂肪酸酯。所述微生物还可以经过基因工程改造，从而与野生型微生物相比增加乙醇产生。
一方面，本发明的特征是通过在不存在外源醇的情况下培养基因工程化微生物来产生脂肪酸酯的方法，其中所述微生物经过基因工程改造，从而能产生醇、脂肪酸和至少一种酯合酶。在一些实施方案中，所述方法还包括分离所述脂肪酸酯的步骤。在其它实施方案中，所述醇是乙醇。在其它实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约2g/L-约50g/L碳源的培养基中。在其它实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约2g/L-约10g/L碳源的培养基中。在其它实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约10g/L-约20g/L碳源的培养基中。在其它实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约20g/L-约30g/L碳源的培养基中。在其它实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约30g/L-约40g/L碳源的培养基中。在其它实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约40g/L-约50g/L碳源的培养基中。
在一些实施方案中，所述方法还包括监测培养基中的碳源水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括当养基中的碳源水平少于约0.5g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法还包括当养基中的碳源水平少于约0.4g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法还包括当养基中的碳源水平少于约0.3g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法还包括当养基中的碳源水平少于约0.2g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法还包括当养基中的碳源水平少于约0.1g/L时向培养基添加补充性碳源。
在一些实施方案中，添加所述补充性碳源从而维持约2g/L-约5g/L的碳源水平。在一些实施方案中，添加所述补充性碳源从而维持约2g/L-约3g/L的碳源水平。在一些实施方案中，添加所述补充性碳源从而维持约3g/L-约4g/L的碳源水平。在一些实施方案中，添加所述补充性碳源从而维持约4g/L-约5g/L的碳源水平。在一些实施方案中，所述碳源是葡萄糖。
在一些实施方案中，在有氧条件下培养所述微生物。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约10％-约50％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约10％-约20％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约20％-约30％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约30％-约40％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约40％-约50％溶解氧。
在其它实施方案中，在约30℃-约35℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约30℃-约31℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约31℃-约32℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约32℃-约33℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约33℃-约34℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约34℃-约35℃的温度下培养所述微生物。
在一些实施方案中，在约6.6-约7.0的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.6-约6.7的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.7-约6.8的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.8-约6.9的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.9-约7.0的pH下培养所述微生物。
在一些实施方案中，所述方法还包括向培养基添加约1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约170g/L，例如约1g/L-约10g/L；或例如约40g/L-约170g/L；或例如约100g/L-约170g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约10g/L-约100g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约40g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约40g/L-约100g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约100g/L。
在一些实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于对应的野生型微生物过表达至少一种选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因。在其它实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于对应的野生型有机体具有至少一种选自frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA的基因的降低的表达。在某些实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而具有乳酸脱氢酶基因的降低的表达，例如，编码EC 1.1.1.27的酶的基因。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性乳酸脱氢酶基因。在具体实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因编码NAD连接的发酵型D-乳酸脱氢酶(例如，Mat-Janet al.，J.Bacteriol.171(1)：342-8(1989)；Bunch et al.，Microbiol.143(1)：187-95(1997))。在其它实施方案中，所述乳酸脱氢酶由ldhA基因编码。
在一些实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因或编码酰基辅酶A合酶的基因。在其它实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因和编码酰基辅酶A合酶的基因。在一些实施方案中，所述编码硫酯酶的基因选自tesA、‘tesA、fatB1、fatB2、fatB3、fatA1、atfatA和fatA。在其它实施方案中，所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadD。在其它实施方案中，所述编码酯合酶的基因选自atfA1、wax-dgat和mWS。
在一些实施方案中，所述微生物是重组大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低脂肪酸生物合成调节基因表达的基因修饰。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性脂肪酸生物合成调节基因。在某些实施方案中，脂肪酸生物合成调节基因是转录抑制基因，例如，大肠杆菌基因fabA、fabB和/或yqfA的抑制基因。(参见，例如，McCue et al.，Nucleic Acids Res.，29(3)：774-82(2001)；Zhang etal.，J.Biol.Chem.277(18)：15558-65)(2002))。在具体实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是fabR。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低丙酮酸氧化酶基因表达的基因修饰，例如，编码EC 1.2.3.3.的酶的丙酮酸氧化酶基因(参见，例如，Changet al.，J.Bacteriol.154(2)：756-62(1983)；Abdel-Ahmid et al.，Micribiol.147(6)：1483-98(2001))。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性丙酮酸氧化酶基因。在具体实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是poxB。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低fadE基因表达或功能上缺失fadE基因的基因修饰。
在某些优选实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含(1)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型大肠杆菌细胞，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。
在优选实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含下述基因缺失中的至少一种：poxB、ldhA和/或fabR。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含相对于野生型大肠杆菌细胞减弱至少一种选自fadE、fabR、poxB和ldhA的基因的表达的基因修饰。
在一些实施方案中，产生的脂肪酸酯的产率为约0.5g-约50g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，产生的脂肪酸酯的产率为约0.5g-约40g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约30g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约20g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约10g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约5g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖或约0.5g-约4g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，产生的脂肪酸酯的产率为至少0.5g脂肪酸酯、至少4g脂肪酸酯、至少5g脂肪酸酯、至少10g脂肪酸酯、至少20g脂肪酸酯、至少30g脂肪酸酯、至少40g脂肪酸酯或至少50g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，产生的脂肪酸酯的产率为不大于50g脂肪酸酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。
在一些实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为约0.5％-约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为约0.5％-约40％、约0.5％-约30％、约0.5％-约20％、约0.5％-约10％、约0.5％-约5％或约0.5％-约4％。在具体实施方案中，以发酵培养基中葡萄糖的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中葡萄糖的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为不大于50％。
在一些实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为约10％-约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为约15％-约90％、约20％-约80％或约30％-约70％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，产生的脂肪酸酯的产率为不大于95％。
在一些实施方案中，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约0.5g-约50g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约0.5g-约40g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约30g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约20g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约10g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约5g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖或约0.5g-约4g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，所产生的脂肪酸乙酯的产率为至少0.5g脂肪酸乙酯、至少4g脂肪酸酯、至少5g脂肪酸乙酯、至少10g脂肪酸乙酯、至少20g脂肪酸乙酯、至少30g脂肪酸乙酯、至少40g脂肪酸乙酯或至少50g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，所产生的脂肪酸乙酯的产率为不大于50g脂肪酸乙酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。
在一些实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约0.5％-约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约0.5％-约40％、约0.5％-约30％、约0.5％-约20％、约0.5％-约10％、约0.5％-约5％或约0.5％-约4％。在具体实施方案中，以发酵培养基中葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为不大于50％。
在一些实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约10％-约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为约15％-约90％、约20％-约80％或约30％-约70％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸乙酯的产率为不大于95％。
在一些实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸甲酯。
在一些实施方案中，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约0.5g-约50g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在一些实施方案中，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约0.5g-约40g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约30g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约20g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约10g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖、约0.5g-约5g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖或约0.5g-约4g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，所产生的脂肪酸甲酯的产率为至少0.5g脂肪酸甲酯、至少4g脂肪酸酯、至少5g脂肪酸甲酯、至少10g脂肪酸甲酯、至少20g脂肪酸甲酯、至少30g脂肪酸甲酯、至少40g脂肪酸甲酯或至少50g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。在具体实施方案中，所产生的脂肪酸甲酯的产率为不大于50g脂肪酸甲酯每100g发酵培养基中的葡萄糖。
在一些实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约0.5％-约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约0.5％-约40％、约0.5％-约30％、约0.5％-约20％、约0.5％-约10％、约0.5％-约5％或约0.5％-约4％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为至少约0.5％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。在具体实施方案中，以发酵培养基中的葡萄糖的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为不大于50％。
在一些实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约10％-约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为约15％-约90％、约20％-约80％或约30％-约70％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％。在具体实施方案中，以发酵培养基中碳源中的碳的质量计，所产生的脂肪酸甲酯的产率为不大于95％。
另一方面，本发明的特征是通过本公开的方法产生的脂肪酸酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸乙酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16或18个碳。
在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯包含A侧和B侧。在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含直链。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含支链。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含至少一个环状部分。
在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯是饱和的。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯是不饱和的。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯是单不饱和的。
另一方面，本发明的特征是通过在不存在外源醇的情况下培养基因工程化微生物来产生脂肪酸乙酯的方法，其中所述微生物经过基因工程改造，从而能产生脂肪酸和至少一种酯合酶。
在一些实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而能产生乙醇。在一些实施方案中，所述微生物经过基因工程，从而相对于野生型微生物过表达至少一种选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因。在其它实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于野生型微生物具有至少一种选自frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA的基因的降低的表达。在某些实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而具有乳酸脱氢酶基因的降低的表达，例如编码EC 1.1.1.27的酶的基因。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性乳酸脱氢酶基因。在具体实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因编码NAD连接的发酵型D-乳酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述乳酸脱氢酶由ldhA基因编码。
在一些实施方案中，所述方法还包括分离所述脂肪酸乙酯。在其它实施方案中，所述方法还包括监测培养基中的碳源水平。在一些实施方案中，所述方法还包括向培养基添加约1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷。
在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约2g/L-约50g/L的碳源的培养基中。在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约2g/L-约10g/L的碳源的培养基中。在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约10g/L-约20g/L的碳源的培养基中。在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约20g/L-约30g/L的碳源的培养基中。在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约30g/L-约40g/L的碳源的培养基中。在一些实施方案中，所述微生物培养在包含初始浓度为约40g/L-约50g/L的碳源的培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括当培养基中的碳源水平少于约0.5g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法包括当培养基中的碳源水平少于约0.4g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法包括当培养基中的碳源水平少于约0.3g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法包括当培养基中的碳源水平少于约0.2g/L时向培养基添加补充性碳源。在一些实施方案中，所述方法包括当培养基中的碳源水平少于约0.1g/L时向培养基添加补充性碳源。
在一些实施方案中，添加补充性碳源从而维持约2g/L-约5g/L的碳源浓度。在一些实施方案中，添加补充性碳源从而维持约2g/L-约3g/L的碳源浓度。在一些实施方案中，添加补充性碳源从而维持约3g/L-约4g/L的碳源浓度。在一些实施方案中，添加补充性碳源从而维持约4g/L-约5g/L的碳源浓度。
在一些实施方案中，所述碳源是葡萄糖。
在一些实施方案中，在有氧条件下培养所述微生物。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约10％-约50％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约10％-约20％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约20％-约30％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约30％-约40％溶解氧。在一些实施方案中，所述有氧条件包括约40％-约50％溶解氧。
在一些实施方案中，在约30℃-约35℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约30℃-约31℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约31℃-约32℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约32℃-约33℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约33℃-约34℃的温度下培养所述微生物。在其它实施方案中，在约34℃-约35℃的温度下培养所述微生物。
在其它实施方案中，在约6.6-约7.0的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.6-约6.7的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.7-约6.8的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.8-约6.9的pH下培养所述微生物。在一些实施方案中，在约6.9-约7.0的pH下培养所述微生物。
在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约170g/L，例如约1g/L-约10g/L；或例如约40g/L-约170g/L；或例如约100g/L-约170g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约10g/L-约100g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约40g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约40g/L-约100g/L。在一些实施方案中，产生的脂肪酸乙酯的浓度为约1g/L-约100g/L。
在一些实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因或编码酰基辅酶A合酶的基因。在其它实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因和编码酰基辅酶A合酶的基因。在一些实施方案中，所述编码硫酯酶的基因选自tesA、‘tesA、fatB1、fatB2、fatB3、fatA1、atfatA和fatA。在其它实施方案中，所述编码硫酯酶的基因是‘tesA。在一些实施方案中，所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadD。在其它实施方案中，所述编码酯合酶的基因选自atfA1、wax-dgat和mWS。在其它实施方案中，所述编码酯合酶的基因是atfA1。
在一些实施方案中，所述微生物是重组大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低脂肪酸生物合成调节基因表达的基因修饰。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性脂肪酸生物合成调节基因。在某些实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是转录抑制基因，例如，大肠杆菌基因fabA，fabB和/或yqfA的抑制基因。在具体实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是fabR。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低丙酮酸氧化酶基因表达的基因修饰，例如，编码EC1.2.3.3的酶的丙酮酸氧化酶基因。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性丙酮酸氧化酶基因。在具体实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是poxB。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低fadE基因的的表达或功能上缺失fadE基因的基因修饰。在其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含相对于野生型大肠杆菌细胞减弱至少一种选自fadE，fabR，poxB和ldhA的基因的表达的基因修饰。
在某些优选实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。
在优选实施方案中，所述微生物包含下述基因缺失中的至少一种：poxB、ldhA和/或fabR。
另一方面，本发明的特征是通过本文所述的方法产生的脂肪酸乙酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯包含A侧和B侧。在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16或18个碳。
在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含直链。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含支链。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯的B侧包含至少一个环状部分。
在一些实施方案中，所述脂肪酸乙酯是饱和的。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯是不饱和的。在其它实施方案中，所述脂肪酸乙酯是单不饱和的。
在一些实施方案中，本发明的特征是使宿主细胞产生醇、脂肪酸和至少一种酯合酶的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在宿主细胞中表达包含至少一种选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因的重组载体。在一些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞分离脂肪酸酯。在其它实施方案中，所述醇是乙醇。在其它实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中，所述重组载体还包含可操作地连接至所述核苷酸序列的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是发育调节型、细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性启动子。在一些实施方案中，所述重组载体包含至少一种选自以下的序列：(a)可操作地连接至所述核苷酸序列的调节序列；(b)可操作地连接至所述核苷酸序列的选择标记；(c)可操作地连接至所述核苷酸序列的标记序列；(d)可操作地连接至所述核苷酸序列的纯化部分；(e)可操作地连接至所述核苷酸序列的分泌序列；以及(f)可操作地连接至所述核苷酸序列的引导序列。
在某些实施方案中，所述重组载体是质粒。
在一些实施方案中，所述宿主细胞表达由所述重组载体编码的多肽，例如Pdc、Adh、AdhA、AdhB、Pdh或CasAB多肽。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定并入所述宿主细胞的基因组DNA中，并且所述核苷酸序列的表达受调节型启动子的控制。
在一些实施方案中，所述方法还包括修饰一种或多种选自frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA的基因的表达。在某些实施方案中，修饰所述基因的表达包括在所述宿主细胞中表达该基因和/或增加该基因的表达或活性。在可选实施方案中，修饰所述基因的表达包括在所述宿主细胞中减弱该基因或降低该基因的表达或活性。在一些实施方案中，修饰所述基因的表达包括在所述宿主细胞中缺失或敲除该基因。在具体实施方案中，所述方法包括修饰乳酸脱氢酶基因的表达，例如，编码EC1.1.1.27的酶的基因。在某些实施方案中，乳酸脱氢酶表达降低。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性乳酸脱氢酶基因。在某些实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因编码NAD连接的发酵型D-乳酸脱氢酶。在其它实施方案中，所述乳酸脱氢酶由ldhA基因编码。
另一方面，本发明的特征是产生醇、脂肪酸和至少一种酯合酶的基因工程化微生物。在一些实施方案中，所述微生物经过工程化，从而相对于对应的野生型微生物过表达至少一种选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因。在其它实施方案中，所述微生物经过基因工程改造，从而相对于对应的野生型生物具有至少一种选自frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA的基因的降低的表达。
在某些实施方案中，所述基因工程化微生物包含外源控制序列，所述外源控制序列被稳定并入所述微生物的基因组DNA，并位于选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因的上游，其中所述微生物相对于野生型微生物产生增加水平的醇。在某些实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物产生增加水平的乙醇。在其它实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物还产生增加水平的脂肪酸酯。在其它实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物产生增加水平的脂肪酸乙酯。
在一些实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因或编码酰基辅酶A合酶的基因。在其它实施方案中，所述微生物相对于野生型微生物过表达编码硫酯酶的基因和编码酰基辅酶A合酶的基因。在一些实施方案中，所述编码硫酯酶的基因选自tesA、‘tesA、fatB1、fatB2、fatB3、fatA1、atfata和fatA。在其它实施方案中，所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadD。在其它实施方案中，所述编码酯合酶的基因选自atfA1、wax-dgat和mWS。
在一些实施方案中，所述微生物是重组大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述微生物是大肠杆菌B株、C株、K株或W株。在某些实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低脂肪酸生物合成调节基因表达的基因修饰。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性脂肪酸生物合成调节基因。在某些实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是转录抑制基因，例如，大肠杆菌基因fabA，fabB和/或yqfA的抑制基因。在具体实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是fabR。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低丙酮酸氧化酶基因表达的基因修饰，例如，编码EC 1.2.3.3的酶的丙酮酸氧化酶基因。在一些实施方案中，在功能上缺失或敲除一种或多种内源性丙酮酸氧化酶基因。在具体实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是poxB。在某些其它实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含降低fadE基因表达或在功能上缺失fadE基因的基因修饰。在一些实施方案中，所述重组大肠杆菌细胞包含相对于野生型大肠杆菌细胞减弱至少一种选自fadE、fabR、poxB和ldhA的基因的表达的基因修饰。
在某些优选实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述乳酸脱氢酶是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
在某些优选实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一个实施方案中，所述脂肪酸合成调节基因是缺失的。在可选实施方案中，所述微生物还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)脂肪酸合成调节基因，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。
在优选实施方案中，所述基因工程化微生物包含下述基因缺失中的至少一种：poxB、ldhA和/或fabR。
在一些实施方案中，所述微生物是细菌。在某些实施方案中，所述细菌是革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，所述微生物是选自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛型分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海洋分枝杆菌(Mycobacterium marinum)以及溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)的分枝杆菌。在某些实施方案中，所述微生物是蓝细菌，包括例如，聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC7002、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus)PCC 7942或集胞蓝细菌(Synechocystis Sp.)PCC 6803。在一些实施方案中，所述微生物是酵母，包括产油酵母，例如，亚罗酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)或油脂酵母属(Lypomyces)。
在其它实施方案中，所述微生物是绿色硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫非硫细菌、嗜极生物或合成的有机体。在一些实施方案中，所述野生型和/或工程化微生物可以是光依赖性的或固定碳的微生物。在其它实施方案中，所述野生型和/或工程化微生物具有自养活性，例如，在存在光的情况下的光合自养活性。在一些实施方案中，所述野生型和/或工程化微生物在不存在光的情况下是异养或兼养的。在一些实施方案中，所述微生物选自拟南芥(Avabidopsis thaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、巨芒(Miscanthusgiganteus)、玉米(Zea mays)、葡萄藻(Botryococcuse braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏盐藻(Dunaliela salina)、聚球蓝细菌(Synechococcus Sp.)PCC 7002、细长聚球蓝细菌PCC 7942、集胞蓝细菌(SynechocystisSp.)PCC 6803、细长嗜热聚球蓝细菌(Thermosynechococcus elongates)BP-1、绿硫菌(Chlorobium tepidum)、橙色绿屈挠菌(Chloroflexus auranticus)、酒色着色菌(Chromatiumm vinosum)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)、热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。
另一方面，本发明的特征是利用本文所述的任何方法或任何微生物产生的脂肪酸酯，或包含利用本文所述的任何方法或任何微生物产生的脂肪酸酯的生物燃料或表面活性剂组合物。
另一方面，本发明的特征是包含脂肪酸合成调节基因的基因工程化微生物，其中相对于野生型微生物，所述脂肪酸合成调节基因具有降低的表达。在一些实施方案中，所述基因工程化微生物还包含(1)丙酮酸氧化酶基因，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达和(2)乳酸脱氢酶基因，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
另一方面，本发明的特征是包含丙酮酸氧化酶基因的基因工程化微生物，其中相对于野生型微生物，所述丙酮酸氧化酶基因具有降低的表达。
另一方面，本发明的特征是包含乳酸脱氢酶基因的基因工程化微生物，其中相对于野生型微生物，所述乳酸脱氢酶基因具有降低的表达。
附图简要描述
图1展示了FAS生物合成途径。
图2展示了β氧化途径，包括由下述酶催化的步骤：(1)酰基辅酶A合酶(EC6.2.1.-)；(2)酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)；(3)烯酰辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)；(4)3-羟丁酰辅酶A表异构酶(EC 5.1.2.3)；以及(5)3-酮脂酰辅酶A硫解酶(EC 2.3.1.16)。β氧化循环的最终反应释放乙酰辅酶A和少了2个碳的酰基辅酶A脂肪酸，该酰基辅酶A脂肪酸能够立刻再次经过β氧化反应。
图3展示了根据提供的底物产生脂肪酯的生物合成途径。
图4展示了产生脂肪醇的生物合成途径。
图5展示了产生脂肪酯的生物合成途径。
图6是通过发酵过程产生的酯的图，所述发酵过程利用多次甲醇给料并且未利用外源乙醇。
图7是以占通过发酵过程产生的总产物的百分比的形式给出的酯的图，所述发酵过程利用多次甲醇给料并且未利用外源乙醇。
图8是通过发酵过程产生的酯的图，所述发酵过程利用单次甲醇给料并且未利用外源乙醇。
图9是以占通过发酵过程产生的总产物的百分比的形式给出的酯的图，所述发酵过程利用单次甲醇给料并且未利用外源乙醇。
图10是通过发酵过程产生的游离脂肪酸的浓度的图，所述发酵过程未利用外源乙醇。
图11是通过发酵过程产生的FAEE和乙醇的浓度的图，所述发酵过程未利用外源乙醇。
图12是以占通过发酵过程产生的总产物的百分比的形式给出的游离脂肪酸和FAEE的浓度的图，所述发酵过程未利用外源乙醇。
定义
本文所用冠词“a”和“an”是指一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。作为实例，“元件(an element)”表示一个元件或多于一个元件。
本文所用的术语“生物原油”是指来源于生物质、生物质衍生物或其它生物资源的产品，与石油原油一样，该产品可以被转化为其它燃料。例如，生物原油可以被转化为汽油、柴油、喷气燃料或燃用油。此外，与石油原油一样，生物原油可以被转化为用于例如药品、美容用品、消费品、工业加工等的其它工业用化学品。
生物原油可以包括，例如烃、烃产物、脂肪酸酯和/或脂族酮。在优选实施方案中，生物原油由烃组成，例如脂肪烃(例如烷、烯、炔)或芳香烃。
本文所用的术语“生物柴油”表示可以作为来源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被称为“纯(neat)”生物柴油的纯品形式或作为以任何浓度与基于石油的柴油的混合物用于内燃柴油发动机。在一个实施方案中，生物柴油可以包括酯类或烃类，例如醛类、烷类或烯类。
本文所用的术语“生物燃料”是指来源于生物质、生物质衍生物或其它生物资源的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括交通工具燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、燃用燃料和发电燃料。生物燃料是可再生能源。
本文所用的术语“生物质”是指来源于生物材料的碳源。生物质可以被转化为生物燃料。生物质的一个示例性来源是植物物质。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物质。生物质的另一非限制性实例是动物物质，例如牛粪。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废品。可以用作生物质的这些废品的实例是发酵废渣、秸秆、无用杂物、污水、垃圾和剩余食物。生物质还包括诸如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)的碳源。
本文所用的短语“碳源”是指适于用作原核或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如CO和CO2)。这些包括，例如各种单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素材料，例如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如甲醇、乙醇、丙醇或其混合物。碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。优选的碳源是生物质。另一优选的碳源是葡萄糖。
本文所用的“降低浊点的添加剂”是添加到组合物以减少或降低溶液的浊点的添加剂。
本文所用的短语“液体的浊点”表示溶解的固体不再完全可溶的温度。在该温度以下，固体开始作为第二相沉淀，给予液体浑浊的外观。在石油工业中，浊点是指这样的温度：在该温度以下，固化物质或其它重烃在原油、提炼油或燃料中结晶从而形成浑浊的外观。固化物质的存在影响该液体的流动特性、该液体堵塞燃料过滤器、喷嘴等的倾向、固化物质在冷表面(例如管道或热交换器污垢)上的累积以及该液体与水的乳化特性。
除非另外指明，术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containing)”应解释为开放式术语(例如，表示“包括但不限于”)。
本文所用的术语“足以允许表达的条件”表示允许宿主细胞或生产宿主产生所需产物的任何条件，所述所需产物例如多肽、酰基辅酶A、脂肪酸衍生物(例如脂肪酸、烃、脂肪醇、脂肪酯等)或本文所述的其它产物。合适的条件包括，例如发酵条件。发酵条件可以包括很多参数。示例性的条件包括温度范围、通气水平和培养基组成。这些条件中的每一个单独地并联合地允许宿主细胞生长。
示例性的培养基包括培养液或凝胶。通常，所述培养基包含可以直接被宿主细胞代谢的碳源，例如葡萄糖、果糖、纤维素等。此外，培养基中可以使用酶来促进碳源的动员(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。
为了确定条件是否足以允许表达，可以将宿主细胞培养例如约4、8、12、24、36或48小时。培养中和/或培养后，可以获取样品并分析样品以确定该条件是否允许表达。例如，可以测试样品中的宿主细胞或宿主细胞所生长的培养基中所需产物的存在。当测试产物的存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的检测。
本文所用的“允许产物产生的条件”是指允许生产宿主产生所需产物的任何发酵条件，所述所需产物例如酰基辅酶A或脂肪酸衍生物(例如脂肪酸、烃、脂肪醇、蜡或脂肪酯)。发酵条件通常包括很多参数。示例性的条件包括但不限于，温度范围、通气水平和培养基组成。这些条件中的每一个单独地和/或联合地允许生产宿主生长。
示例性的培养基包括培养液和/或凝胶。通常，合适的培养基包含可以直接被微生物代谢的碳源(例如，葡萄糖、果糖、纤维素等)。此外，培养基中可以使用酶来促进碳源的动员(例如，淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后的代谢。
为了确定发酵条件是否允许产物的产生，可以将生产宿主培养约4、8、12、24、36或48小时。培养中或培养后，可以获取样品并分析样品以确定发酵条件是否允许产物的产生。例如，可以测试样品中的生产宿主或生产宿主所生长的培养基中所需产物的存在。可以使用示例性的检测(例如TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及本文提供的检测对产物的存在进行鉴定和定量。
本文所用的“控制元件”表示转录控制元件。控制元件包括启动子和增强子。术语“启动子元件”、“启动子”或“启动子序列”是指作为激活基因表达的开关发挥功能的DNA序列。如果基因被激活，认为其被转录或参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子作为转录调节元件并且还提供基因转录为mRNA的起始位点。控制元件与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(Maniatis et al，Science 236：1237，1987)。
本文所用的术语“缺失”或“敲除”表示修饰编码靶蛋白的多核苷酸序列或使编码靶蛋白的多核苷酸序列失活，从而降低或去除靶蛋白的功能。可以通过本领域公知的方法进行多核苷酸缺失(参见，例如，Datsenko et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97：6640-45，2000或国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788)。
本文所用的术语“内源性的”表示位于细胞中并且不是利用重组基因工程技术被引入细胞的多核苷酸。例如，当细胞最初从自然界分离出来时，存在于所述细胞中的基因。如果通过重组技术改变了激活转录或翻译的控制序列(例如启动子或增强子序列)，则认为多核苷酸仍然是内源性的。
本文所用的术语“酯合酶”表示能产生脂肪酯的肽。更具体而言，酯合酶是将硫酯转化为脂肪酯的肽。在优选实施方案中，所述酯合酶将硫酯(例如，酰基辅酶A)转化为脂肪酯。
在可选实施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作为底物来产生脂肪酯。酯合酶能利用短链和长链硫酯作为底物。此外，酯合酶能利用短链和长链醇作为底物。
酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡酯合酶、酰基辅酶A:醇转酰基酶、酰基转移酶和脂肪酰辅酶A:脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶分类在酶分类号EC 2.3.1.75中。多种这些酶以及其它可用于制备本文所述的产物的酶公开于，例如国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中(例如，图1)，通过引用将以上文献并入本文。
本文所用的术语“外源的”表示不是来源于自然界中所发现的具体细胞中的多核苷酸。例如，“外源多核苷酸”可以指被插入微生物基因组多核苷酸序列的多核苷酸或指被引入微生物的染色体外多核苷酸。因此，非天然存在的多核苷酸一旦被引入细胞则被认为对于细胞是外源的。天然存在的多核苷酸对于具体细胞也可以是外源的。例如，如果分离自第一细胞的完整多核苷酸被从所述第一细胞引入第二细胞，则该多核苷酸对于所述第二细胞而言可以是外源性的多核苷酸。
本文所用的术语“脂肪酸”表示具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基团，优选地表示烷基。R可以包含约4到约22个碳原子。脂肪酸可以为饱和的、单不饱和的或多不饱和的。在优选的实施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途径产生。
本文所用的术语“脂肪酸生物合成途径”表示产生脂肪酸的生物合成途径。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸酶，其按照本文所述可以被工程改造从而产生脂肪酸，并且在一些实施方案中所述脂肪酸酶可以与其它酶一起表达从而产生具有所需碳链特征的脂肪酸。
本文所用的术语“脂肪酸降解酶”表示参与脂肪酸或脂肪酸衍生物分解或转化成另一产物的酶。脂肪酸降解酶的非限制性实例是酰基辅酶A合酶。多种这些酶以及其它可用于制备本文所述的产物的酶公开于，例如，国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中(例如，图1)，通过引用将以上文献并入本文。脂肪酸降解酶的其她实例如本文所述。
本文所用的术语“脂肪酸衍生物”表示部分地产生于生产宿主的脂肪酸生物合成途径的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分地产生于酰基-ACP或酰基-ACP衍生物的产物。所述脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，其按照本文所述可以被工程改造从而产生脂肪酸衍生物，并且在一些实例中，所述脂肪酸合酶可以与其它酶一起表达从而产生具有所需碳链特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基辅酶A、脂肪醛、短链醇和长链醇、烃类、脂肪醇、酮和酯(例如蜡、脂肪酸酯或脂肪酯)。
本文所用的术语“脂肪酸衍生酶”表示可以在脂肪酸衍生物的产生中表达或过表达的所有酶。这些酶在本文中统称为脂肪酸衍生物酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、醇酰基转移酶、羧酸还原酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、酯合酶、醛生物合成多肽和烷生物合成多肽。脂肪酸衍生物酶将底物转化成脂肪酸衍生物。在一些实例中，所述底物可以是脂肪酸衍生物，该衍生物被脂肪酸衍生酶转化为不同的脂肪酸衍生物。多种这些酶以及其它可用于制备本文所述的产物的酶公开于，例如，国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中(例如，图1)，通过引用将以上文献并入本文。
本文所用的“脂肪酸酶”表示参与脂肪酸生物合成的任何酶。可以在宿主细胞中表达或过表达脂肪酸酶从而产生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。多种这些酶以及其它可用于制备本文所述的产物的酶公开于，例如，国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中(例如，图1)，通过引用将以上文献并入本文。
本文所用的术语“脂肪酯”表示酯。在优选实施方案中，脂肪酯是从脂肪酸制备产生例如脂肪酸酯的任何酯。在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即，与羧酸氧连接的碳链)和B侧(即，包含母体羧酸酯的碳链)。在优选实施方案中，当脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧由醇提供，B侧由脂肪酸提供。任何醇均可用于形成脂肪酯的A侧。例如，所述醇可以来源于脂肪酸生物合成途径。或者，所述醇可以通过非脂肪酸生物合成途径产生。此外，可以外源提供所述醇。例如，当脂肪酯是由也能产生脂肪酸的有机体产生时，可以在发酵培养基中提供所述醇。或者，当脂肪酯是由也能产生醇的有机体产生时，可以外源提供诸如脂肪酸或乙酸的羧酸。
包含A侧或B侧的碳链可以为任何长度。在一个实施方案中，酯的A侧的长度为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18个碳。酯的B侧的长度为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。所述支链可以具有一个或多个分支点。此外，所述支链可以包括环状分支。此外，A侧和/或B侧可以是饱和的或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以具有一个或多个不饱和点。
在一个实施方案中，所述脂肪酯是通过生物合成产生的。在该实施方案中，首先“活化”脂肪酸。“活化的”脂肪酸的非限制性实例是酰基辅酶A、酰基ACP和酰基磷酸酯。酰基辅酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，可以从游离脂肪酸、辅酶A或三磷酸腺苷核苷酸(ATP)合成酰基辅酶A。产生酰基辅酶A的酶的实例是酰基辅酶A合酶。
脂肪酸被活化之后，可以容易地将其转移到受体亲核体。示例性的亲核体是醇、硫醇或磷酸酯。
在一个实施方案中，所述脂肪酯是蜡。蜡可以来源于长链醇和长链脂肪酸。在另一实施方案中，所述脂肪酯可以来源于脂肪酰硫酯和醇。在另一实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂肪酰辅酶A(辅酶A)。在其它实施方案中，所述脂肪酯是脂肪酰泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或脂肪磷酸酯。脂肪酯具有很多用途。例如，脂肪酯可用作生物燃料，表面活性剂或配制为向燃料和工业化学品提供润滑和其它益处的添加剂。
本文所用的“现代碳比例(fraction of modern carbon)”或“fM”与分别由称为草酸标准品HOxI和HOxII的国家标准技术研究院(National Institute of Standards和Technology(NIST))标准参考物(SRM)4990B和4990C所定义的具有相同意义。基本定义涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(参考AD 1950)。这大概等于衰变校正的工业革命前树木(decay-corrected pre-Industrial Revolution wood)。对于现今有生命生物圈(例如植物物质)而言，fM为约1.1。
可以按照以下计算两个序列之间的“同源性”。序列以最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入空位用于最佳比对，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少约30％、优选地至少约40％、更优选地至少约50％、更优选地至少约60％并且更优选地至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。然后比较位于对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列所共享的相同位置数的函数，这考虑了空位数和每个空位的长度，为了两个序列的最佳比对需要引入空位。
可以使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同源性百分比的测定。在优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch(1970)、J.Mol.Biol.48：444 453的算法(该算法被并入GCG软件包中的GAP程序中)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两个氨基酸序列之间的同源性百分比。在另一优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重测定两个核苷酸序列之间的同源性百分比。特别优选的参数组(并且是如果操作者不确定应当应用哪些参数来确定分子是否在要求的同源性限制内而应该使用的参数组)是具有12的空位罚分、4的空位延伸罚分和5的移码空位罚分的Blossum 62评分矩阵。
用于比较的其它比对序列的方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于，例如，Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988；Higgins&Sharp，Gene 73：237 244，1988；Higgins&Sharp，CABIOS 5：151-153，1989；Corpet et al.，Nucleic Acids Research 16：10881-10890，1988；Huang et al.，CABIOS 8：155-165，1992；以及Pearson et al.，Methodin Molecular Biology 24：307-331，1994.；和Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-410，1990。
本文所用的“宿主细胞”是用于产生本文所述的产物(例如醛或烷)的细胞。可以修饰宿主细胞，使其表达或过表达所选的基因或具有所选基因的减弱的表达。宿主细胞的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、蓝细菌、酵母或丝状真菌细胞。
本文所用的术语“微生物”表示来自古菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物。本文所用的术语“微生物细胞”表示来自微生物的细胞。
本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)以及适当情况下，指核糖核酸(RNA)。该术语还包括从核苷酸类似物制备而来的RNA或DNA的类似物，以及适用于所描述的实施方案的单链(有义或反义)和双链多核苷酸、EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA。术语“核酸”可以与“多核苷酸”、“DNA”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和/或“基因”交换使用，除非文中指出并非如此或上下文明显矛盾。
本文所用的术语“可操作地连接”表示所选择的核苷酸序列(例如编码本文所述的多肽)与启动子接近，从而允许所述启动子调节该选择的核苷酸序列的表达。此外，按照转录和翻译的方向，启动子位于所述选择的核苷酸序列的上游。“可操作地连接”表示将核苷酸序列和调节序列连接的方式，使得当合适的分子(例如转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。
本文所用术语“或”表示术语“和/或”并且与术语“和/或”可交换地使用，除非上下文明确表示并非如此。
本文所用的“过表达”表示在细胞中以高于对应野生型细胞中正常表达的浓度表达或被导致表达或产生核酸、多肽或烃类。例如，当在重组宿主细胞中多肽存在的浓度比其在相同物种的非重组宿主细胞中的浓度高时，所述多肽在所述重组宿主细胞中可以是“过表达”的。
本文所用的“分配系数”或“P”定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以在水相中(例如发酵液)平衡时的浓度。在本文所述的两相系统的一个实施方案中，在生产过程中所述有机相是由醛或烷形成的。但是，在一些实施例中，可以例如通过提供辛烷层来提供有机相以便于产物分离。当描述两相系统时，化合物的分配特性可以描述为logP。例如，logP为1的化合物会10：1分配到有机相。logP为-1的化合物会1：10分配到有机相。通过选择合适的发酵液和有机相，在发酵容器中具有高logP值的有机脂肪酸衍生物或产物可以离到有机相中，即使处于很低的浓度。
本文所用的术语“多肽”可以与“蛋白”、“肽”和/或“酶”交换使用，除非文中指出并非如此或上下文明显矛盾。
本文所用的术语“生产宿主”表示用于产生本文公开的产物的细胞。所述生产宿主经过修饰，从而表达所选多核苷酸、过表达所选多核苷酸、减弱或缺失所选多核苷酸的表达。生产宿主的非限制性实例包括植物、藻类、动物、人、细菌、酵母和丝状真菌细胞。
本文所用的术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”表示通过例如分离或隔离从分子的环境中移出或分离所述分子。“基本上纯化的”分子为至少约60％、优选地至少约75％以及更优选地至少约90％游离于与其相关的其它组分。本文所用的这些术语还指从样品中去除污染物。例如，污染物的去除可以导致样品中脂肪酸衍生物或产物的百分比增加。例如，当在宿主细胞中产生脂肪酸衍生物或产物时，可以通过去除宿主细胞蛋白纯化脂肪酸衍生物或产物。纯化后，样品中脂肪酸衍生物或产物的百分比增加。
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”或“纯化(purification)”不需要绝对纯。它们是相对的术语。因此，例如当在宿主细胞中产生脂肪酸衍生物或产物时，纯化的脂肪酸衍生物或产物是基本与其他细胞组分(例如核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他脂肪酸衍生物或产物)分离的脂肪醇。在另一实例中，纯化的脂肪酸衍生物或产物制剂是这样的：在该制剂中，所述脂肪酸衍生物或产物基本不含污染物，例如发酵后可能存在的那些污染物。在一些实施方案中，当样品重量的至少约50％是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。在其他实施方案中，当样品重量的至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由脂肪酸衍生物或产物组成时，所述脂肪酸衍生物或产物是纯化的。
本文使用的术语“重组多肽”是指通过重组DNA技术产生的多肽，其中通常将编码所表达的多肽或RNA的DNA插入合适的表达载体，并且所述表达载体接下来用于转化宿主细胞以产生多肽或RNA。
本文所用的术语“基本相同”(或“基本同源”)是用于指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似侧链)氨基酸残基(例如保守型氨基酸取代)或核苷酸，使得所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。
本文所用的术语“表面活性剂”表示能降低溶解其的液体的表面张力的物质。表面活性剂通常由水溶性头部和烃链或尾部组成。所述水溶性头部是亲水性的，并且可以是离子型或非离子型的。所述烃链是疏水性的。表面活性剂用于多种产品。例如，表面活性剂用于去垢剂、清洁剂、纺织品、皮革、纸、美容用品、药品、加工食品和农业产品的组合物或制备。此外，表面活性剂可用于提取和分离原油。
根据用途特征，存在4大类表面活性剂。阴离子表面活性剂具有去垢剂样活性，通常用于清洁用途。阳离子表面活性剂包含长链烃，通常被用于处理蛋白和合成的聚合物或者作为织物柔软剂和护发素的成分。两性表面活性剂也包含长链烃，但一般用于洗发剂。非离子型表面活性剂通常用于清洁产品。
本文所用的术语“合酶”表示催化合成过程的酶。本文所用的术语合酶包括合酶、合成酶和连接酶。
本文所用的术语“转染”表示将核酸通过核酸介导的基因转移而引入(例如通过表达载体)到接受体细胞。
本文所用的“转化”是指这样的过程，在该过程中，细胞的基因型由于细胞摄入外源核酸而改变。这可以导致表达重组形式的RNA或多肽的转化的细胞。在由转移的基因反义表达的情况下，天然存在形式的多肽的表达被干扰。
本文所用的术语“转运蛋白”表示便于一种或多种化合物移入和/或移出细胞器和/或细胞的多肽。多种这些蛋白以及可用于制备本文所述的产物的其它蛋白描述于，例如，国际专利申请号PCT/US2007/011923和PCT/US2008/058788中(例如，图1)，通过引用将以上文献并入本文。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种有用的载体是附加体(即能够进行染色体外复制的核酸)。有用的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些载体。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文被称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中，有用的表达载体通常是“质粒”的形式，所述“质粒”通常是指在其载体形式时不与染色体结合的环状双链DNA环。在本说明书中，因为质粒是最通常使用的载体形式，所以“质粒”和“载体”是可交换地使用的。但是，还包括发挥等同功能并随后至今成为本领域已知的表达载体的其它形式。
本文所用的术语“蜡”表示包含脂肪酯的组合物。在优选实施方案中，蜡中的脂肪酯包含中碳链至长碳链。除脂肪酯之外，蜡可以包含其它组分(例如烃、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、β-二酮、三酰甘油等)。
贯穿本说明书，可以利用缩写的基因名称或多肽名称进行指代，但是应当理解为这种缩写的基因或多肽名称分别代表基因或多肽的种类。这些基因名称包括编码相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名称包括具有相同活性的所有多肽(例如催化相同基本化学反应的多肽)。
本文所参考的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。除非另外指出，所述登录号为该数据库截止2009年4月所提供的登录号。
EC编号由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB，可访问http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)建立。本文所参考的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)维护的KEGG配体数据库，该数据库由东京大学部分资助。除非另外指出，所述EC编号是该数据库截止2009年4月所提供的编号。
除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的技术人员通常的理解具有相同的含义。
尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者试验，但下文描述了适合的方法和材料。可以以任何合适的顺序实施本文所述的所有方法，除非文中指出并非如此或上下文明显矛盾。
除非另外指出，以百分比(％)列出的量是占组合物总重的重量百分比。
通过引用将本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其整体并入本文。如果有冲突，本说明书，包括定义在内，将提供参考。所述材料、方法和实施例只是说明性的，而不是进行限制。
除非另外指出，本文中所记载的值的范围仅意图作为单独指代落入该范围的每个单独值的简单方法，并且每个单独值都被并入说明书，如同其被单独记载本文中一样。
除非另外声明，本文提供的任何和所有实例的或示例性的语言(例如，“例如”)的使用仅意图更好地阐述本发明，而不对本发明的范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应当解释为表明实施本发明所必需的任何未要求保护的原件。
下面的详细描述和权利要求书将使本发明的其它特征和优势显而易见。
发明的详细描述
本公开涉及在不向重组细胞提供诸如外源乙醇或甲醇的外源醇的条件下从所述细胞产生脂肪酸酯，例如脂肪酸乙酯(“FAEE”)。不用提供外源醇就产生脂肪酸酯简化了发酵过程、降低了成本和对其它原材料的处理，并且避免了贮存易燃性醇的需要。这提供了经济上的优势。
很多细胞和微生物可以利用脂肪酸作为能源，并因此具有代谢脂肪酸来产生能量的β氧化途径。已经发现，过表达具有酰基辅酶A合酶活性(β氧化途径中发现的第一酶活性)的肽和/或减弱β氧化途径中的其它基因可以增加产生的酰基辅酶A的量，同时保持细胞或微生物的活力。同样，过表达具有酰基辅酶A合酶活性的肽并联合过表达形成脂肪酸衍生物的肽可以提高脂肪酸衍生物的产生。提高细胞培养物中脂肪酸衍生物的产生的方法公开于WO2008/119082。
已经发现，令人意想不到的是，可以对重组细胞进行修饰，从而无需向细胞提供外源醇就能产生诸如FAEE的脂肪酸酯。在某些方法中，既不向细胞提供外源乙醇，也不向细胞提供外外源甲醇。在其它方法中，不向细胞提供外源醇。在某些方法中，所述重组细胞是重组大肠杆菌细胞。
在不被任何特定理论束缚的情况下，我们相信本文公开的产生FAEE的方法增加重组细胞产生的乙醇。此外，所述重组细胞经过修饰而能产生脂肪酸和表达编码酯合酶的基因。在不被任何特定理论束缚的情况下，我们相信所述重组细胞产生的脂肪酸和内源性乙醇作为原材料，用于蜡合酶来形成脂肪酸酯，例如FAEE。
通过本文所述的方法产生的脂肪酸不限于具有任何特性长度或其它性质的酯。例如，利用本文提供的教导，可以对微生物进行基因工程改造，从而使其产生Knothe，FuelProcessing Technology 86：1059-1070，2005中描述的任何脂肪酯。可以利用十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热来表征这些脂肪酯。
I.脂肪酸衍生物的产生和用于增加产生的修饰
可以对用于产生酰基辅酶A和/或脂肪酸衍生物的生产宿主进行重组修饰，从而使其包含过表达肽的核酸序列。例如，可以修饰生产宿主来增加酰基辅酶A的产生和减少脂肪酸生物合成途径中的脂肪酸衍生物和中间体(例如酰基辅酶A)的分解代谢，或减少脂肪酸生物合成途径中特定点的反馈抑制。除了修饰本文所述的修饰基因之外，可以转移其它细胞资源来过量产生脂肪酸，例如，可以减弱乳酸途径、琥珀酸途径和/或乙酸途径，并且可以过表达乙酰辅酶A羧化酶(acc)。本文所述的对生产宿主进行的修饰可以通过改变基因组、添加重组表达系统或其组合来进行。
所涉及的脂肪酸生物合成途径展示在图1-图5。下文中A-G子章节描述了这些途径中的步骤。所述途径中不同的步骤由不同的酶催化。每个步骤都是用于过表达基因来产生更多的酶并因此驱动产生更多的脂肪酸和脂肪酸衍生物的潜在位点。也可以将编码所述途径所需要的酶的基因重组添加到缺乏该酶的生产宿主。最后，可以减弱或阻断会与导致产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的途径发生竞争的步骤，从而增加所需产物的产生。产生脂肪酸衍生物的方法描述于WO2008/119082，通过引用将其全部并入本文。
A.乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A至酰基ACP
脂肪酸合酶(FAS)是催化酰基链的起始和延长的一组肽(Marrakchi et al.，Biochemical Society，30：1050-1055，2002)。酰基载体蛋白(ACP)以及FAS途径中的酶控制产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支度。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。根据所需产物，可以减弱或过表达这些基因中的一个或多个。
1.脂肪酸生物合成途径：乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A至酰基ACP
生产宿主中的脂肪酸生物合成途径利用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A(图1)。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。该途径描述于Heath et al.，Prog.Lipid Res.40(6)：467-97(2001)，通过引用将其全部并入本文。
乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶(Acc，由4个单独的基因编码的多亚基酶，accABCD)羧化而形成丙二酰辅酶A。丙二酸基团被丙二酰辅酶A:ACP转酰基酶(FabD)转移至ACP，从而形成丙二酰-ACP。然后发生缩合反应，其中丙二酰-ACP与乙酰辅酶A合并，产生β-酮脂酰ACP。β-酮脂酰ACP合酶III(FabH)启动FAS循环，同时β-酮脂酰ACP合酶I(FabB)和β-酮脂酰ACP合酶II(FabF)参与后续循环。
然后，重复步骤的循环，直至产生适当长度的饱和脂肪酸。首先，β-酮脂酰ACP被NADPH还原而形成β-羟酰ACP。该步骤由β-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化。然后，β-羟酰ACP被脱水而形成反式-2-烯酰-ACP。β-羟酰ACP脱水酶/异构酶(FabA)或β-羟酰ACP脱水酶(FabZ)催化该步骤。NADPH依赖性反式-2-烯酰-ACP还原酶I、II或III(分别为FabI、FabK和FabL)将反式-2-烯酰-ACP还原，而形成酰基ACP。通过β-酮脂酰ACP合酶I或β-酮脂酰ACP合酶II(分别为FabB和FabF)的丙二酰-ACP与酰基ACP的缩合启动后续循环。
2.对脂肪酸生物合成途径进行修饰来增加酰基ACP的产生
可以将生产宿主工程化，使其过量产生乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这些生产宿主包括植物、动物、藻类、细菌、蓝细菌、真菌或人类细胞。诸如细菌、蓝细菌、藻类、酵母或丝状真菌的微生物的细胞也可用作生产宿主。可用作生产宿主的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌、酿酒酵母、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，节细菌AK 19(Arthrobacter AK19)、红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)M-1株、解脂假丝酵母和其它产油微生物。其它合适的微生物包括但不限于，聚球蓝细菌(Synechococcus sp.)PCC7002、细长聚球蓝细菌(Synechococcus elongatus.)PCC7942和集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)PCC6803。可以对生产宿主进行数种不同的修饰(联合或单独)，从而获得增加的乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生物的产生。
例如，为了增加乙酰辅酶A的产生，可以在生产宿主中表达下述基因中的一个或多个：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-氧化戊二酸脱氢酶复合体的E1p脱氢酶组成部分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组成部分)、fabH、fabD、fabG、acpP、fabF。在其它实例中，可以在生产宿主中表达编码脂肪酰辅酶A还原酶和醛脱羰酶的其它DNA序列。本领域公知的是，可以构建含有一个或多个上述基因的质粒，所述基因都受组成型或可控性启动子的控制。这些基因的示例性的GenBank登录号：pdh(BAB34380，AAC73227，AAC73226)、panK(也称为coaA，AAC76952)、aceEF(AAC73227，AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。
此外，通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制性或非复制性质粒进行转化或通过替换启动子或增强子序列，可以降低或在功能上缺失工程化微生物中酰基辅酶A脱氢酶基因的表达水平。在某些实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶基因编码例如EC1.3.99.3的酶。在具体实施方案中，所述酰基辅酶A脱氢酶基因是fadE。
在一些实施方案中，通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制性或非复制性质粒进行转化或通过替换启动子或增强子序列，可以降低或在功能上缺失工程化微生物中脂肪酸生物合成调节基因的表达水平。在一些实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是转录抑制基因，例如fabA，fabB和/或yqfA基因的抑制基因(参见，例如，McCue etal.，Nucleic Acids Res.，29(3)：774-82(2001)；Zhang et al.，J.Biol.Chem.277(18)：15558-65(2002))。在具体实施方案中，所述脂肪酸生物合成调节基因是fabR基因。
在其它实施方案中，通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制性或非复制性质粒进行转化或通过替换启动子或增强子序列，可以降低或在功能上缺失工程化微生物中丙酮酸氧化酶基因(参见，例如，Chang et al.，J.Bacteriol.154(2)：756-62(1983)；Abdel-Ahmid et al.，Microbiol.147(6)：2001))的表达水平。在一些实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因编码例如EC 1.2.3.3的酶。在具体实施方案中，所述丙酮酸氧化酶基因是poxB基因。
在其它实施方案中，通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制性或非复制性质粒进行转化或通过替换启动子或增强子序列，可以降低或在功能上缺失工程化微生物中乳酸脱氢酶基因(参见，例如，Mat-Jan et al.，J.Bacteriol.171(1)：342-8；Bunch etal.，Microbiol.143(1)：187-95(1997))的表达水平。在一些实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因编码例如EC 1.1.1.27的酶。在具体实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因是NAD连接的发酵型D-乳酸脱氢酶基因。在其它实施方案中，所述乳酸脱氢酶基因是ldhA基因。
在某些实施方案中，通过用含有对应基因的无效或缺失突变的条件复制性或非复制性质粒进行转化或通过替换启动子或增强子序列，可以降低或或敲除工程化微生物中fadE、fabR、gpsA、ldhA、pflA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性的GenBank登录号为：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflA(AP_001532)、pflB(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。所得到的工程化生产宿主当生长在合适的环境中时能产生增加水平的乙酰辅酶A。
此外，可以通过利用包含在重头合成的质粒中的accABCD(例如，登录号AAC73296，EC 6.4.1.2)来按上文所述工程改造生产宿主，从而实现丙二酰辅酶A的过量产生。通过进一步包含重头合成的质粒中的编码脂肪酶(例如，登录号CAA89087，CAA98876)的DNA序列，可以实现脂肪酸的过量产生。
因此，在某些实例中，可以过表达乙酰辅酶A羧化酶来将其细胞内浓度相对于天然表达水平增加至少约2倍，优选至少约5倍或更优选至少约10倍。
此外，可以使用plsB(例如，登录号AAC77011)的D311E突变来增加可用酰基辅酶A的量。
此外，生产宿主中可以包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如，登录号AAN79592)的过表达，从而增加单不饱和脂肪酸的产生(Rock et al.，J.Bacteriology 178：5382-5387(1996))。
B.酰基ACP至脂肪酸
1.脂肪酸生物合成途径：酰基ACP至脂肪酸
如上文所述，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A在数个步骤中被加工而形成酰基ACP链。酶sn-甘油-3-磷酸酯酰基转移酶(PlsB)催化酰基从酰基ACP或酰基辅酶A转移到甘油-3-磷酸酯的sn-1位置。因此，PlsB是磷脂合成中的调节性酶，磷脂合成是脂肪酸途径的一部分。抑制PlsB可导致长链酰基ACP水平的增加，该反馈能抑制所述途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabI)。例如通过硫酯酶过表达来解偶联这种调节能导致脂肪酸的产生增加。tes和fat基因家族表达硫酯酶。长链酰基辅酶A也可以体外抑制FabI。
2.修饰脂肪酸生物合成途径来产生所需的脂肪酸
为了工程化生产宿主来产生脂肪酸衍生物的同质群体，可以减弱或在功能上缺失一个或多个内源基因，并因此，可以表达一种或多种硫酯酶。例如，可以通过减弱利用C18:1-ACP的硫酯酶C18(例如，登录号AAC73596和P0ADA1)并表达利用C10-ACP的硫酯酶C10(例如，登录号Q39513)来产生C10脂肪酸衍生物。这可以产生碳链长度为10的脂肪酸衍生物的相对同质的群体。在另一个实例中，可以通过减弱产生非C14脂肪酸的内源性硫酯酶并表达登录号为Q39473的硫酯酶(其利用C14-ACP)来产生C14脂肪酸衍生物。在另一个实例中，可以通过表达利用C12-ACP的硫酯酶(例如，登录号Q41635)并减弱产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生C12脂肪酸衍生物。可以利用本领域已知的方法证实乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的过量产生，例如通过利用放射性前体、细胞裂解后的HPLC和GC-MS。可用于要求保护的方法和生产宿主中的硫酯酶的非限制性实例列于表1中。
表1：硫酯酶
Figure BDA0002596267670000391
Figure BDA0002596267670000401
*Caner et al.，BMC Plant Biology 7：1-11，2007
C.脂肪酸至酰基辅酶A
1.脂肪酸至酰基辅酶A的转化
酰基辅酶A合酶(ACS)通过两步机制将游离脂肪酸酯化为酰基辅酶A。首先，游离脂肪酸通过ATP的焦磷酸解被转化为酰基AMP中间体(腺苷酸酯)。然后，所述腺苷酸酯的活化的羰基碳与辅酶A的硫醇基偶联，释放AMP和最终产物酰基辅酶A。参见Shockey et al.，Plant.Physiol.129：1710-1722(2002)。
大肠杆菌ACS酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL是脂肪酸摄取体系的必需组成部分。FadL介导脂肪酸转运入细菌细胞，FadD介导酰基辅酶A酯的形成。当无其它可用碳源时，外源脂肪酸被细菌摄入并转化为酰基辅酶A酯，所述酰基辅酶A酯可以结合转录因子FadR并抑制fad基因的表达，fad基因编码负责脂肪酸转运(FadL)、活化(FadD)和β氧化(FadA、FadB、FadE和Fadh)的蛋白。当有备选碳源可用时，细菌将脂肪酸合成为酰基ACP，酰基ACP用于磷脂合成，而不是β氧化的底物。因此，酰基辅酶A和酰基ACP都是能产生不同的终产物的脂肪酸的独立来源。参见Caviglia et al.，J.Biol.Chem.279(12)：1163-1169(2004)。
2.增加脂肪酸转化为酰基辅酶A的修饰
可以利用已知肽将生产宿主工程化，从而产生可转化为酰基辅酶A的不同长度的脂肪酸。一个示例性的方法包括增加一种或多种酰基辅酶A合酶肽(EC 6.2.1.-)的表达，或表达一种或多种酰基辅酶A合酶肽(EC6.2.1.-)的活性更高的形式。可以表达来产生酰基辅酶A和脂肪酸衍生物的酰基辅酶A合酶的列表如表2所示。
表2：酰基辅酶A合酶
Figure BDA0002596267670000411
Figure BDA0002596267670000421
根据它们与大肠杆菌FadD的相似度，选择以下同源基因进行合成和评估：来自结核分枝杆菌HR7Rv的fadDD35[NP_217021]；来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]；来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1[NP_251989]；以及来自酿酒酵母的fadD同系物Faa3p[NP_012257]。
可用于产生酰基辅酶A以及脂肪酸衍生物的来自真核有机体的其它脂肪酸酰基辅酶A合酶包括下述文献中所述的酶：Shockey et al.，Plant.Physiol.129：1710-1722(2002)(拟南芥)，Caviglia et al.，J.Biol.Chem.279：1163-1169(2004)(大鼠)和Knollet al.，J.Biol.Chem.269(23)：16348-56(1994)(酵母)。编码这些合成酶的基因序列是本领域已知的。参见，例如，Johnson et al.，J.Biol.Chem.269：18037-18046(1994)；Shockeyet al.，Plant.Physiol.129：1710-1722(2002)；Black et al.，J.Biol Chem.267：25513-25520(1992)。这些真核酰基辅酶A合酶尽管缺少与大肠杆菌fadD序列的高度同源性，但也能补充大肠杆菌fadD敲除体中的FadD活性。
D.酰基辅酶A至脂肪醇
1.酰基辅酶A至脂肪醇的转化
酰基辅酶A被NADH依赖性酰基辅酶A还原酶(例如，Acr1)还原为脂肪醛。然后，所述脂肪醛被NADPH依赖性醇脱氢酶(例如，YqhD)还原为脂肪醇。或者，脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)催化酰基辅酶A还原成脂肪醇和辅酶ASH。FAR在该四电子还原中利用NADH或NADPH作为辅因子。尽管产生醇的FAR反应通过醛中间体进行，但不释放游离醛。因此，形成醇的FAR不同于进行酰基辅酶A的两电子还原并产生游离脂肪醛作为产物的那些酶。(参见Cheng et al.，J.Biol.Chem.，279(36)：37789–37797(2004)；Metz et al.，PlantPhysiol.，122：635-644(2000))。
2.增加酰基辅酶A至脂肪醇的转化的修饰
可以利用已知多肽对生产宿主进行工程化，从而从酰基辅酶A产生脂肪醇。一个示例性的方法包括增加脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(由基因诸如来自FAR的acr1编码，EC1.2.1.50/1.1.1)或酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)以及醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的表达，或者表达这些酶的活性更高的形式。这些基因的示例性的GenBank登录号包括但不限于acr1[GenBank登录号YP_047869或AAC45217]。其它合适的基因描述于，例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)，通过引用将其并入本文。
脂肪醇可被描述为基于烃的表面活性剂。对于表面活性剂产生，可以修饰生产宿主，从而从可再生的碳源产生表面活性剂。该生产宿主可以包含编码能将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白的第一外源DNA序列和编码能将脂肪醛转化为醇的蛋白的第二外源DNA序列。在某些实例中，所述第一外源DNA序列能编码脂肪酸还原酶。在一个实施方案中，所述第二外源DNA序列能编码哺乳动物微粒体醛还原酶或长链醛脱氢酶。在另一实例中，所述第一和第二外源DNA序列可来自节细菌AK19、红酵母、不动杆菌M-1株或解脂假丝酵母。在一个实施方案中，所述第一和第二异源DNA序列可来自多酶复合体，所述多酶复合体来自不动杆菌M-1株或解脂假丝酵母。
可用于表面活性剂生产的编码脂肪酸至长链醇转化蛋白的异源DNA序列的其它来源包括但不限于，高山被孢霉(Mortierella alpine)(ATCC 32222)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)(也称为Apiotricum curvatum)、亚德食烷菌(Alcanivoraxjadensis)(T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌HO1-N(ATCC 14987)和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)(PD630 DSMZ 44193)。
在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和的或不饱和的表面活性剂产物，其碳链长度为约6-约36个碳原子、约8-约30个碳原子、约10-约26个碳原子、约12-约20个碳原子或约12-约16个碳原子。在另一个实例中，所述表面活性剂产物的碳链长度为约10-约18个碳原子或约12-约14个碳原子。
用于产生表面活性剂的合适的生产宿主可来自真核或原核微生物。示例性的生产宿主包括节细菌AK19、红酵母、不动杆菌M-1株、拟南芥、解脂假丝酵母、酿酒酵母和经过工程化而表达乙酰辅酶A羧化酶的大肠杆菌的细胞。也可以使用合成高水平的脂质和油形式的表面活性剂前体的生产宿主，例如混浊红球菌、节细菌AK 19、红酵母、经过工程化而表达乙酰辅酶A羧化酶的大肠杆菌和其它产油细菌、酵母和真菌的细胞。
IV.将生产株进行基因工程改造从而增加乙醇产生
可以将用于产生脂肪酸酯(例如FAEE)的生产宿主进行重组修饰，使其表达或过表达特定基因或减弱特定基因的表达，并从而允许该生产宿主产生乙醇或增加乙醇的产生。适用于本方法来产生乙醇或增加乙醇产生的重组修饰描述于，例如，Jarboe et al.，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：237-261(2007)；Peterson&Ingram，Ann.N.Y.Acad.Sci.1125：363-372(2008)；以及Yomano et al.，Biotechnol.Lett.30：2097-2103(2008)，通过引用将以上文献全部并入本文。
可以被表达、过表达或减弱来产生乙醇的基因的非限制性实例包括pdc[例如，GenBank登录号YP_163095]、adh[例如，GenBank登录号YP_162971]、adhA[例如，GenBank登录号AAA71935]、adhB[例如，GenBank登录号AAC70367]、pflA[例如，GenBank登录号AP_001532]、pflB[GenBank登录号AAC73989]、casA[例如，GenBank登录号AAB51563]、casB[GenBank登录号AAB51564]、frd[例如，GenBank登录号AAT36479]、idhA[GenBank登录号NP_415898]、adhE[例如，GenBank登录号NP_415757]、ackA[例如，GenBank登录号AAC75356]、focA[例如，GenBank登录号NP_415424]等。特别地，在本方法中可以被表达或过表达来产生乙醇或增加乙醇产生的基因的非限制性实例包括pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB。在本方法中可被减弱来产生乙醇或增加乙醇产生的基因的非限制性实例包括frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA。
E.将生产株进行基因工程改造来增加乙醇产生
可以将用于产生脂肪酸酯(例如FAEE)的生产宿主进行重组修饰，使其表达或过表达特定基因或减弱特定基因的表达，并从而允许该生产宿主产生乙醇或增加乙醇的产生。适用于本方法来产生乙醇或增加乙醇产生的重组修饰描述于，例如，Jarboe et al.，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：237-261(2007)；Peterson&Ingram，Ann.N.Y.Acad.Sci.1125：363-372(2008)；以及Yomano et al.，Biotechnol.Lett.30：2097-2103(2008)，通过引用将以上文献全部并入本文。
特别地，在本方法中可以被表达或过表达来产生乙醇或增加乙醇产生的基因的非限制性实例包括pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB。在本方法中可被减弱来产生乙醇或增加乙醇产生的基因的非限制性实例包括frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA。
F.脂肪醇至脂肪酯
可以利用已知的多肽对生产宿主进行工程化，从而产生不同长度的脂肪酯。一个示例性的方法包括增加一种或多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC 2.3.1.84)的表达，或表达一种或多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC 2.3.1.84)的活性更高的形式。这些肽通过将乙酰辅酶A和醇转化为辅酶A和酯来催化醇的乙酰化。在某些实例中，醇O-乙酰基转移酶肽可以与所选的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽联合表达，从而允许控制碳链长度、饱和度和分支度。在某些情况下，可以共表达bkd操纵子来实现分支脂肪酸前体的产生。
本文所用的醇O-乙酰基转移酶肽包括酶分类号EC 2.3.1.84中的肽，以及能催化乙酰辅酶A和醇形成辅酶A和酯的任何其它肽。此外，本领域技术人员应当理解，醇O-乙酰基转移酶肽能催化其它反应。
例如，某些醇O-乙酰基转移酶肽除脂肪醇或乙酰辅酶A硫酯之外还接受其它底物，例如其它醇和其它酰基辅酶A硫酯。因此，也包括这些非特异性或多特异性的醇O-乙酰基转移酶肽。醇O-乙酰基转移酶肽序列可公开获得。编码醇O-乙酰基转移酶的示例性的基因包括但不限于aat[GenBank登录号AAG13130]。其它O-乙酰基转移酶描述于，例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)，通过引用将其并入本文。
用于表征具体醇O-乙酰基转移酶肽的活性的分析是本领域公知的。可以将O-酰基转移酶工程化，使其具有对供体酰基或接受体醇部分的新的活性和特异性。可以通过公知的合理的和进化的方法产生工程化酶。
G.酰基辅酶A至脂肪酯
1.脂肪酯的产生
脂肪酯由酰基辅酶A:脂肪醇酰基转移酶(例如，酯合酶)合成，酰基辅酶A:脂肪醇酰基转移酶使醇与脂肪酰辅酶A通过酯键轭合。酯合酶及其编码基因已知来自霍霍巴植物和不动杆菌ADP1株(之前称为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，其表现出酯合酶活性以及由二酰甘油底物和脂酰辅酶A形成三酰甘油的能力(酰基辅酶A:二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wax/dgat编码酯合酶和DGAT。参见Cheng et al.,J.Biol.Chem.279(36):37798–37807,2004；Kalscheuer andSteinbuchel,J.Biol.Chem.278:8075-8082,2003。酯合酶还可以用于产生本文所述的能够作为诸如生物柴油的燃料的某些脂肪酯。
2.用于产生脂肪酯的修饰
可以利用已知的多肽，从酰基辅酶A和醇产生包括蜡在内的脂肪酯。一个示例性的方法包括增加一种或多种酯合酶(EC2.3.1.20,2.3.1.75)的表达，或者是表达这些酶的更具活性的形式。酯合酶肽序列可公开获得，其中很多描述于，例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)，通过引用将其并入本文。鉴定酯合酶活性的方法提供在，例如，美国专利第7,118,896号，通过引用将其全部并入本文。
在具体实施方案中，如果需要的产物是基于酯的生物燃料，则可以修饰生产宿主，使其能从可再生的能源产生酯。这类生产宿主可包含编码酯合酶的外源DNA序列，该酯合酶的表达能赋予所述生产宿主从可再生的能源合成饱和的、不饱和的或者支链脂肪酯的能力。在一些实施方案中，有机体还可以表达编码以下示例性蛋白的DNA序列：脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶、酰基转移酶、酯合酶、脂酰转移酶、二酰甘油酰基转移酶、酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶。在某些其它实施方案中，所述有机体可以表达编码双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶的基因。例如，所述双功能酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶可以选自多酶复合体，所述多酶复合体来自加州希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌ADP1株(以前称为醋酸钙不动杆菌ADP1)、博克岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、铜绿假单胞菌、Fundibacter jadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstoniaeutropha)。在一个实施方案中，脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶或者蜡合酶可来自多酶复合体，所述多酶复合体来自真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstonia eutropha)或文献中已知能产生诸如蜡或脂肪酯的酯的其它有机体。
编码可用于产生脂肪酯的酯合成蛋白的异源DNA序列的其它来源包括但不限于，高山被孢霉(例如，ATCC 32222)、弯曲隐球菌(也称为Apiotricum curvatum)、亚德食烷菌(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌HO1-N(例如，ATCC 14987)和混浊红球菌(例如，PD630，DSMZ 44193)。
用于产生脂肪酯的生产宿主可以是真核或者原核微生物。用于产生脂肪酯的生产宿主可以是真核或者原核微生物的非限制性实例包括酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节细菌AK 19、红酵母、不动杆菌M-1株、解脂假丝酵母和其它产油微生物。
在一个实例中，使用来自不动杆菌ADP1的、位于基因座AAO17391的酯合酶(在Kalscheuer and Steinbuchel,J.Biol.Chem.278:8075-8082,2003中有描述，通过引用将该文献并入本文)。在另一个实例中，使用来自加州希蒙得木的、位于基因座AAD38041的酯合酶。任选地，诸如FATP家族成员的酯输出蛋白(exporter)可以用来促进酯释放入胞外环境。可用的酯输出蛋白的非限制性实例是来自黑腹果蝇的、位于基因座NP_524723的脂肪酸(长链)转运蛋白CG7400-PA同种型A。
H.增强的FAEE产生
为了增强FAEE的产生，可以将生产宿主工程化，使其过表达编码硫酯酶的基因、编码酰基辅酶A合酶的基因和编码酯合酶的基因。所述酯合酶可以是双功能蜡酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶。示例性的双功能蜡酯合酶/酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶基因包括但不限于，atfA1[GenBank登录号AAO17391]，以及例如国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中描述的基因，通过引用将其并入本文。
为了增强FAEE的产生，可以任选地减弱、缺失、功能上缺失或敲除fadE、fabR、poxB、pflA、pflB和ldhA中的任何一个或任何组合。这些基因的示例性的GenBank登录号包括但不限于fabR[GenBank登录号NP_418398]、fadE[GenBank登录号AAC73325]、poxB[GenBank登录号AAC73958或NP_415392]、pflA[GenBank登录号AP_001532]、pflB[GenBank登录号AAC73989]和ldhA[GenBank登录号AAC74462或NP_415898]，以及例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中描述的基因，通过引用将其并入本文。适用于本方法的大肠杆菌生产宿主的非限制性实例包括大肠杆菌ID1株(MG1655ΔfadE，其具有整合在染色体中的操纵子，该操纵子含有受Trc启动子控制的基因‘tesA，fadD和atfA1)和大肠杆菌Δ4株(MG1655ΔfadEΔfabRΔpoxBΔldhA，其携带含‘tesA，fadD和atfA1的质粒)。
I.脂肪酸衍生物的释放–转运蛋白
转运蛋白可以将脂肪酸衍生物输出生产宿主并进入培养基。多种转运蛋白和外排蛋白能够分泌大量的化合物，并且能够被修饰为对特定类型的脂肪酸衍生物具有选择性。合适的转运蛋白的非限制性实例包括ATP结合盒(ABC)转运蛋白、外排蛋白以及脂肪酸转运蛋白(FATP)。转运蛋白的其它非限制性实例包括来自诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、拟南芥、真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)以及红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)的有机体的ABC转运蛋白。示例性的ABC转运蛋白包括CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1。在优选的实施方案中，ABC转运蛋白是CER5[例如，GenBank登录号AY734542]。其它示例性的转运蛋白包括但不限于，AtMRP5[GenBank登录号NP_171908]，AmiS2[登录号JC5491]，AtPGP1[GenBank登录号NP_181228]，以及例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中所述的基因，通过引用将其并入本文。可以将含有表达合适的转运蛋白的基因的载体插入生产宿主来增加脂肪酸衍生物的释放。
可以根据释放脂肪酸衍生物的内在能力来选择生产宿主。产物产生和释放到发酵液中的效率可以用胞内产物与胞外产物的比来表示。在某些实例中，所述比可以是约5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4或1：5。
II.脂肪酸衍生物的碳链特性的选择
可以产生具有特定分支点、饱和度、碳链长度和酯特性的脂肪酸衍生物。可以选择天然产生特定衍生物的微生物。或者，可以将微生物进行基因修饰，使其表达编码能产生特定脂肪酸衍生物的酶的基因。可单独使用或联合使用来产生具有所需性质的脂肪酸衍生物的酶和基因的非限制性实例公开于，例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)，通过引用将其并入本文。
在某些实例中，可以在生产宿主中引入来自不同物种或工程化变体的外源FAS基因的表达，以实现在结构上(长度、分支度，不饱和度等)与天然生产宿主的脂肪酸不同的脂肪酸的生物合成。还可以选择或者改造这些异源基因产物，使其不受生产宿主中的天然调控机制的影响，并因此允许控制所需商业产物的产生。例如，可以在生产宿主中表达来自枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌(Stretomyces spp.)、雷尔氏菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)、棒状杆菌(Corynebacteria)、短杆菌(Brevibacteria)、分枝杆菌(Mycobacteria)、产油酵母等的FAS酶。这类外源酶的表达能够改变所产生的脂肪酸的结构。
当生产宿主经工程化而能产生具有特定不饱和度、分支度或者碳链长度的脂肪酸时，所得到的工程化的脂肪酸可以用于产生脂肪酸衍生物。由这类生产宿主产生的脂肪酸衍生物会表现出工程化脂肪酸的特性。
例如，可以将生产宿主工程化，使其产生支链短链脂肪酸，然后这些支链短链脂肪酸可以被生产宿主用来产生支链短链脂肪醇。同样，可以通过将生产宿主工程化，使其产生具有限定分支水平、不饱和度和/或碳链长度的脂肪酸来制备烃，并因此产生同质的烃群体。可以利用其它的步骤来提高所得产物的同质性。例如，当需要不饱和醇、脂肪酯或者烃时，可以将生产宿主工程化，使其产生低饱和度的脂肪酸，另外可以对生产宿主进行修饰，使其表达其它去饱和酶，从而减少饱和产物的产生。
A.支链和环状部分
1.支链和环状脂肪酸衍生物的工程化
脂肪酸是产生脂肪酸衍生物的关键中间体。利用支链或者环状脂肪酸来产生脂肪酸衍生物，可以制备含有分支点、环状部分及其组合的脂肪酸衍生物。
例如，大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFA)。为了将大肠杆菌工程化使其产生支链脂肪酸(brFA)，可以将提供支链前体的数个基因(例如，bkd操纵子)引入生产宿主并使其表达，从而允许由支链前体起始脂肪酸的生物合成(例如fabH)。例如，可以表达或过表达bkd、ilv、icm和/或fab基因家族来产生支链脂肪酸衍生物。同样，为了产生环状脂肪酸，可以将能提供环状前体的基因引入生产宿主并使其表达，从而允许由环状前体起始脂肪酸的生物合成。可以表达或过表达ans、chc和plm基因家族来产生环状脂肪酸。这些基因家族的基因的非限制性实例包括ansJ、ansK、ansL、chcA[GenBank登录号U72144或AAQ84160]、ansM、plmJ[GenBank登录号AAQ84158]、plmK[GenBank登录号AAQ84158]、plmL[GenBank登录号AAQ84159]、plmM[GenBank登录号AAQ84161]、chcB[GenBank登录号AF268489]、以及其它基因，包括例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中公开的那些基因，通过引用将其并入本文。
此外，可以将生产宿主工程化，使其表达编码用于brFA延长的蛋白的基因(例如，ACP、FabF等)和/或使通常产生sFA的相应的大肠杆菌基因缺失或减弱。对于这一点，将与引入的基因产生竞争的内源基因(例如fabH、fabF)缺失或减弱。
支链酰基辅酶A(例如，2-甲基-丁酰辅酶A、异戊酰辅酶A、异丁酰辅酶A等)是brFA的前体。在大多数含有brFA的微生物中，brFA是由支链氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)经过两步合成的(Kadena,Microbiol.Rev.55:288,1991)。可以将生产宿主工程化，使其表达或过表达参与这两个步骤的一种或多种酶来产生brFA或者过量产生brFA。例如，生产宿主可以有能够完成产生brFA的一个步骤的内源酶，因此只需要重组引入编码参与第二步骤的酶的基因。
2.支链脂肪酸和支链脂肪酸衍生物的形成
形成brFA的第一步骤是利用支链氨基酸氨基转移酶产生对应的α-酮酸。生产宿主可以内源性地包含编码这些酶的基因，或可以重组引入这些基因。例如，大肠杆菌内源性地表达此酶I1vE(EC 2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在一些生产宿主中，可能不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是，对于大肠杆菌I1vE或任何其它支链氨基酸氨基转移酶(例如，来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的I1vE(GenBank登录号AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的I1vE(GenBank登录号NP_745648)或来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的I1vE(GenBank登录号NP 629657))，如果不是内源性的，可以将它们引入。如果氨基转移酶反应在所选生产宿主的brFA生物合成中是限速步骤，则可以过表达氨基转移酶。
第二步骤是将α-酮酸氧化脱羧为对应的支链酰基辅酶A。该反应可以由支链α-酮酸脱氢酶复合体(bkd；EC 1.2.4.4.)(Denoya et al.，J.Bacteriol.177：3504，1995)催化，该复合体由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰基酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基组成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合体与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合体相似。具有brFA和/或生长在支链氨基酸上的每种微生物可以用作分离用于在例如大肠杆菌的生产宿主中表达的bkd基因的来源。此外，大肠杆菌具有E3组成部分，作为其丙酮酸脱氢酶复合体的一部分(lpd，EC 1.8.1.4、GenBank登录号NP_414658)。在一些方法中，在生产宿主中仅表达E1α/β和E2 bkd基因。表3列举了来自几种微生物的bkd基因的非限制性实例，这些基因可以被重组引入生产宿主并在其中表达，从而提供支链酰基辅酶A前体。具有这些bkd基因的微生物也可以作为生产宿主。
表3：来自所选择的微生物的Bkd基因
Figure BDA0002596267670000511
Figure BDA0002596267670000521
在另一个实例中，可以通过共表达巴豆酰辅酶A还原酶(Ccr，EC 1.6.5.5，1.1.1.1)与异丁酰基辅酶A变位酶(大亚基IcmA，EC 5.4.99.2；小亚基IcmB，EC 5.4.99.2)来在生产宿主中(例如在大肠杆菌中)产生异丁酰辅酶A(Han和Reynolds，J.Bacteriol.179：5157，1997)。巴豆酰辅酶A是大肠杆菌和其它的微生物中脂肪酸生物合成中的中间体。表4中列出了来自所选择的微生物的ccr和icm基因的非限制性实例。
表4：来自所选择的微生物的ccr和icm基因
Figure BDA0002596267670000522
Figure BDA0002596267670000531
除bkd基因的表达外，brFA生物合成的起始利用对支链酰基辅酶A具有特异性的β-酮脂酰-酰基-载体蛋白合酶III(FabH、EC 2.3.1.41)(Li et al.，J.Bacteriol.187：3795-3799，2005)。这些FabH酶的非限制性实例在表5中列出。可以在生产宿主中表达参与任何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因。来自不天然产生brFA的生产宿主的Bkd和FabH酶可能不支持brFA产生，因此，可以重组表达bkd和fabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入这样的生产宿主中。同样，Bkd和FabH产生的内源性水平可能不足以产生brFA，因此，可以将它们过表达。此外，可以表达或过表达脂肪酸生物合成途径的其他组成部分，例如酰基载体蛋白(ACP)和β-酮脂酰-酰基-载体蛋白合酶II(fabF、EC 2.3.1.41)(候选者的非限制性实例在表5中列出)。除表达这些基因外，还可以将生产宿主中内源脂肪酸生物合成途径的某些基因减弱。可以将编码与产生brFA的途径的酶竞争底物的酶的基因减弱从而提高brFA的产生。例如，在大肠杆菌中最可能干扰brFA生物合成的候选者是fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF基因(GenBank登录号NP_415613)。
表5：来自所选择的具有brFA的微生物的FabH、ACP和fabF基因
Figure BDA0002596267670000532
Figure BDA0002596267670000541
如上文所提及的，通过联合表达支持brFA合成和醇合成的基因，可以产生支链醇。例如，当醇还原酶(例如来自贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADP1的Acr1)与bkd操纵子共表达时，大肠杆菌可以合成异戊醇、异丁醇或2-甲基丁醇。同样，当Acr1与ccr/icm基因共表达时，大肠杆菌可以合成异丁醇。
3.环状脂肪酸和脂肪酸衍生物的形成
为了将诸如大肠杆菌细胞的生产宿主转化为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFA)的细胞，向生产宿主中引入并表达能够提供环状前体环己基羰基辅酶A(CHC-辅酶A)的基因(Cropp et al.,Nature Biotech.18:980-983,2000)。对于诸如细菌细胞、酵母细胞、蓝细菌细胞和丝状真菌细胞的其它生产宿主而言，类似的转化也是可能的。
在大肠杆菌中提供CHC辅酶A的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)的安三烯菌素(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chen et al.，Eur.J.Biochem.261：98-107，1999)或来自链霉菌(Streptomyces sp.)HK803的磷内酯霉素B(phoslactomycin B)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappan et al.，J.Biol.Chem.278：35552-35557，2003)，以及来自山丘链霉菌、除虫链霉菌(S.avermitilis)或天蓝色链霉菌的chcB基因(Patton et al.，Biochem.39：7595-7604，2000)(参见表6的GenBank登录号)。然后，可以表达上文表5中所列的基因，以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长。或者，可以从产生cyFA的微生物中分离同源基因并在大肠杆菌中表达该同源基因。
表6：用于CHC-辅酶A合成的基因
Figure BDA0002596267670000551
*GenBank条目U72144中只注释了chcA，ansJKLM参见Chen et al.(Eur.J.Biochem.261：98-107，1999)。
表5所列的基因(fabH、ACP和fabF)足以允许ω-环状脂肪酸的起始和延长，因为它们具有宽的底物特异性。如果这些基因中的任何一个与表5的ansJKLM/chcAB或者pmlJKLM/chcAB基因的共表达不产生cyFA，则可以从产生cyFA的微生物中分离fabH、ACP和/或fabF同源物(例如通过利用简并PCR引物或者异源DNA序列探针)，并共表达这些同源物。表7列出含有ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例。
表7：包含ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例
Figure BDA0002596267670000552
Figure BDA0002596267670000561
*使用环庚基羰基辅酶A而非环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体。
B.饱和度
脂肪酸是脂肪酸衍生物产生中的关键中间体。可以通过调节脂肪酸中间体的饱和度来控制脂肪酸衍生物的饱和度。可以表达或过表达sfa、gns和fab基因家族来控制脂肪酸的饱和度。来自这些家族的示例性的基因包括但不限于，sfa[GenBank登录号AAN79590，ACC44390]；gnsA[GenBank登录号ABD 18647.1]、gnsB[GenBank登录号AAC74076.1]、fabB[GenBank登录号BAA16180]、fabK[GenBank登录号AAF98273]，fabL[GenBank登录号AAU39821]和fabM[GenBank登录号DAA05501]，以及例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中描述的那些基因，通过引用将其并入本文。
可以通过将生产宿主工程化，使其过表达fabB或通过使生产宿主在低温(例如低于37℃)下生长而将生产宿主工程化，使其产生不饱和脂肪酸。FabB具有对于cis-δ3癸烯酰-ACP的偏向性并导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸的产生。fabB的过表达导致显著百分比的不饱和脂肪酸的产生(de Mendoza et al.，J.Biol.Chem.258：2098-2101，1983)。可以将fabB插入不是天然含有该基因的生产宿主并进行表达。然后，这些不饱和脂肪酸可以作为生产宿主中的中间体，所述生产宿主经工程化而能产生脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪酯、蜡、烯烃、烷等。
或者，可以缺失脂肪酸生物合成的抑制基因，例如fabR(GenBank登录号NP_418398)，这也可以导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277：15558，2002)。可以在其它生产宿主中进行相似的缺失。例如，通过fabM(反式-2，顺式-3-癸烯酰-ACP异构酶、GenBank登录号DAA05501)的过表达和来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)的受控表达(Marrakchi et al.，J.Biol.Chem.277：44809，2002)，同时缺失大肠杆菌fabI(反式-2-烯酰-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。此外，为了提高不饱和脂肪酯的百分比，生产宿主还可以过表达fabB(编码β-酮脂酰-ACP合酶I，登录号：BAA16180,EC:2.3.1.41)、sfa(编码fabA的抑制物，登录号：AAC44390)以及gnsA和gnsB(两者均编码secG无效突变抑制物(即，冷休克蛋白)，登录号：ABD18647.1、AAC74076.1)。在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加所产生的棕榈油酸酯(C16:1)的百分比。
C.链长和酯的特性
1.链长和奇数链的产生
本文所述的方法允许产生不同链长的脂肪酯和脂肪酸衍生物。链长由硫酯酶控制，硫酯酶是通过tes和fat基因家族的表达所产生的。通过表达特定的硫酯酶，可以产生具有所需的碳链长度的脂肪酸和脂肪酸衍生物。合适的硫酯酶的非限制性实例包括TesA[GenBank登录号POADA1]、无前导序列的TesA[GenBank登录号AAC73596，NP_415027或POADA1]、FatB1[GenBank登录号Q41635]、FatB2[GenBank登录号AAC49269]、FatB3[GenBank登录号AAC72881]、FatB[GenBank登录号Q39473或CAA85388]、FatA1[GenBank登录号AAL79361]、AtfatA[GenBank登录号NP_189147，NP_193041]、FatA[GenBank登录号CAC39106或AAC72883]和描述于例如，国际申请PCT/US08/058788(例如，图1)中的其它硫酯酶，通过引用将其并入本文。可以将编码特定硫酯酶的基因引入生产宿主中，使得产生具有特定碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。然后，应当抑制内源硫酯酶的表达。
在一个实施方案中，脂肪酸衍生物含有约4-36个碳原子、约6-32个碳原子、约10-30个碳原子、约10-18个碳原子、约24-32个碳原子、约26-30个碳原子、约26-32个碳原子、约5-10个碳原子、约10-16个碳原子或约12-18个碳原子的碳链。在可选实施方案中，脂肪酸衍生物含有少于约20个碳原子、少于约18个碳原子或少于约16个碳原子的碳链。在另一实施方案中，脂肪酸酯产物是碳原子含量为24-46个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酯产物。在一个实施方案中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子的碳原子含量。在另一实施方案中，脂肪酯产物具有14-20个碳的碳含量。在另一实施方案中，脂肪酯是C18:1的甲酯。在另一实施方案中，脂肪酯是C16:1的乙酯。在另一实施方案中，脂肪酯是C16:1的甲酯。
某些微生物偏向于产生偶数或奇数碳链的脂肪酸和脂肪酸衍生物。如，大肠杆菌正常情况下产生偶数碳链的脂肪酸和脂肪酸乙酯(FAEE)。令人惊讶的是，本文公开的方法可以用于改变这种产生。例如，可以使大肠杆菌产生奇数碳链的脂肪酸和FAEE。
2.酯的特性
酯通常包含所谓的“A”侧和“B”侧。A侧是与酯的羧酸氧连接的碳链。B侧是包含酯的母体羧酸的碳链。B侧由生产宿主中从头合成所产生的脂肪酸提供。在某些实施方案中，当生产宿主经另外的工程化而能产生醇(包括脂肪醇)时，A侧也由该生产宿主产生。在其它实施方案中，A侧可以外源提供，例如，在培养基中。通过选择所需的硫酯酶基因，可以将B侧(当产生脂肪醇时，还有A侧)设计成具有某些碳链特性。这些特性包括分支点、不饱和度和所需的碳链长度。
当选择了特定的硫酯酶基因时，在A侧和B侧均由生产宿主利用脂肪酸生物合成途径中间体提供的情况下，它们会有类似的碳链特性。例如，至少约50％、60％、70％或者80％的产生的脂肪酯具有长度相差约2、4、6、8、10、12或者14个碳的A侧和B侧。A侧和B侧还可以表现出类似的分支度和饱和度。
除了产生提供给A侧的脂肪醇外，生产宿主还可以产生其它短链醇，如乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇和丁醇，可以利用本领域公知的技术将所述短链醇并入A侧。例如，生产宿主可以产生丁醇。为了制备产生丁醇的细胞，例如，可将菌株LS9001进一步工程化，使其在pBAD24表达载体中、在prpBCDE启动子系统下，表达大肠杆菌K12的atoB(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的β-羟丁酰辅酶A脱氢酶、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的巴豆酸酶、拜氏梭菌的丁酰辅酶A脱氢酶、黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的辅酶A酰化醛脱氢酶(ALDH)，和编码丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的醛-醇脱氢酶的adhE。可以类似地修饰其它生产宿主以产生丁醇或其它短链醇。例如，可以利用Kalscheuer等所教导的方法(Microbiology 152:2529-2536,2006,通过引用并入本文)在生产宿主中产生乙醇。
III.对生产株进行基因工程改造来增加脂肪酸衍生物的产生
利用本领域公知的技术，可以将参与产生脂肪酸衍生物的生物合成途径的异源DNA序列稳定引入或者瞬时引入生产宿主(非限制性实例包括电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导和基因组整合)。对于稳定转化，DNA序列还可以包含选择标记，包括诸如抗生素抗性和弥补营养缺陷的基因的非限制性实例。
本公开的各个实施方案可以利用包含异源DNA序列的表达载体，所述异源DNA序列编码参与代谢途径或者生物合成途径的蛋白。合适的表达载体包括但不限于，病毒载体(诸如杆状病毒载体)、噬菌体(phage)载体(如噬菌体(bacteriophage)载体)、质粒、噬菌粒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、细菌人工染色体、病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒等)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体和用于具体目的生产宿主(诸如大肠杆菌、豌豆假单胞菌(Pseudomonas pisum)和酿酒酵母的细胞)的任何其它载体。
有用的表达载体可以包含一种或者多种选择标记基因，以提供用于选择转化的生产宿主的表型性状。所述选择标记基因编码转化的生产宿主在选择培养基中存活或者生长所必需的蛋白。未用含有选择标记基因的载体转化的生产宿主不能在培养基中存活。通常的选择基因编码具有以下性质的蛋白：(a)赋予对抗生素或者其它毒素(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或者四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要养分(例如，编码杆菌的D-丙氨酸外消旋物的基因)。在可选实施方案中，选择标记基因是编码二氢叶酸还原酶或者赋予新霉素抗性(用于真核细胞培养)的基因，或者赋予四环素或者氨苄青霉素抗性(用于原核生产宿主，诸如大肠杆菌的细胞)的基因。
在表达载体中，编码生物合成途径中的基因的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子，增强子等)可操作地连接，以指导所编码的基因产物的合成。这类启动子可以来源于微生物或者病毒来源，包括CMV和SV40。根据所用的生产宿主/载体系统，表达载体中可以使用任意数量的合适的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如，Bitter et al.,Methods in Enzymology,153:516-544,1987)。
适用于原核生产宿主的启动子包括但不限于，能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，λ噬菌体的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和σ特异性启动子，杆菌的噬菌体的启动子，链霉菌启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶基因的bla启动子和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。其它的原核启动子描述于Glick,J.Indust.Microbiol.1:277,1987；Watson et al.,MOLECULARBIOLOGY OF THE GENE(基因的分子生物学),第四版,Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)。适用于真核生产宿主的真核启动子的非限制性实例来源于病毒，并且包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer et al.,J.Mol.Appl.Gen.1:273,1982)、疱疹病毒的TK启动子(McKnight,Cell,31:355,1982)、SV40早期启动子(Benoist et al.,Nature,290:304,1981)、巨细胞病毒启动子(Foecking etal.,Gene 45:101,1980)、酵母gal4基因启动子(Johnston,et al.,PNAS(USA)79:6971,1982；Silver,et al.,PNAS(USA)81:5951,1984)和IgG启动子(Orlandi et al.,PNAS(USA)86:3833,1989)。
可以用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列对生产宿主进行基因修饰，所述异源DNA序列与诱导型启动子可操作地连接。诱导型启动子是本领域已知的。合适的诱导型启动子的非限制性实例包括受蛋白、代谢物或者化学品影响的启动子。这些启动子包括但不限于：牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、四环素诱导型CMV启动子(例如，人即时早期CMV启动子)以及来自trp和lac操纵子的那些启动子。
在某些实例中，用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列对生产宿主进行基因修饰，所述异源DNA序列与组成型启动子可操作地连接。合适的组成型启动子是本领域已知的，并且包括组成型腺病毒主要晚期启动子、组成型MPSV启动子和组成型CMV启动子。
在某些实例中，修饰的生产宿主是用编码参与生物合成途径的单个蛋白的外源DNA序列进行基因修饰的宿主。在其它实施方案中，修饰的生产宿主是用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白(例如生物合成途径的第一酶和第二酶)的外源DNA序列进行基因修饰的宿主。
当生产宿主经基因修饰而表达两种或更多种参与生物合成途径的蛋白时，这些DNA序列的每一个都可以包含于单个表达载体中或者包含于分别的表达载体中。当这些DNA序列包含于单个表达载体中时，在一些实施方案中，多核苷酸序列与常见的控制元件可操作地连接，其中所述常见控制元件控制单个表达载体中所有编码生物合成途径蛋白的DNA序列的表达(例如启动子)。
当修饰的生产宿主是用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白的异源DNA序列进行基因修饰时，所述DNA序列之一可以与诱导型启动子可操作地连接，而所述DNA序列中的一个或者多个可以与组成型启动子可操作地连接。
在一些实施方案中，可以增加生物合成途径中间体的胞内浓度(例如，基因修饰的生产宿主中的中间体的浓度)以进一步提高终产物的产率。有许多方式可以增加中间体的胞内浓度，包括但不限于，增加培养基中生物合成途径底物的浓度、增加生物合成途径中起作用的酶的催化活性、增加生物合成途径中起作用的酶的底物(例如，主要底物)的胞内量等。
在某些实例中，在生产宿主的细胞质中产生脂肪酸衍生物或者中间体。有许多方式可以增加细胞质浓度，包括但不限于，增加通过脂肪酸途径的碳通量的量。此外，通过增加细胞中辅酶A的生物合成，可以增加酰基辅酶A的浓度，例如通过过表达泛酸盐生物合成相关基因(例如panD)或者敲除谷胱甘肽生物合成相关基因(例如谷胱甘肽合酶)。
可以在生产宿主的染色体中引入或者改动调控序列、编码序列及其组合。在某些实例中，所需重组序列整合进生产宿主基因组序列不需要使用诸如抗生素的选择标记。在某些实例中，基因组改变包括通过用对调控不敏感的启动子替换天然启动子而改变靶基因的控制序列。有很多方法可以实现这一点。例如，Valle and Flores,MethodsMol.Biol.267:113-122,2006描述了在大肠杆菌中过表达染色体基因的基于PCR的方法。另一种方法利用Court et al.,PNAS(USA).100:15748-15753,2003开发的技术，基于使用单链寡核苷酸直接在染色体中产生特定突变。该技术基于过表达来自λ噬菌体的β蛋白从而增强基因重组。这个方法的优点是可以使用70个碱基长(或更长)的合成寡核苷酸来产生点突变、插入和缺失，从而省略了任何克隆步骤。此外，该系统效率足够高，不需要标记来分离所需的突变。
利用这一方法，可以改变基因的调控区，从而产生更强的启动子和/或消除抑制基因的结合位点。因此，可以在生产宿主中过表达所需基因。
IV.发酵
A.产生效率的最大化
通过使用特定发酵技术，可以增强脂肪酸衍生物的产生和分离。使产生最大化同时降低成本的一种方法是增加被转变为烃产物的碳源的百分比。
在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能中，包括产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。降低生长相关活性所必需的碳的量可以增加碳源转变为输出的效率。可以通过首先使微细胞生长到所需密度(例如，达到对数生长期峰值的密度)来实现这点。在这点上，可以使用复制检查点基因(replication checkpoint gene)来阻止细胞生长。具体而言，群体感应机制(quorum sensing mechanisms)(综述于Camilli et al.，Science 311：1113，2006；Venturi FEMS Microbio.Rev.30：274-291，2006；和Reading et al.，FEMSMicrobiol.Lett.254：1-11，2006；通过引用将以上参考文献并入本文)可以用于激活诸如p53、p21的基因或其它检查点基因。
可以被激活以阻止大肠杆菌中细胞复制和生长的基因包括umuDC基因。umuDC基因的过表达阻止从静止期到指数性生长的进程(Murli et al.，J.of Bact.182：1127，2000)。UmuC是可以对非编码损伤进行跨损伤合成(translesion synthesis)的DNA聚合酶，这是是大部分UV和化学诱变的机制基础。umuDC基因产物用于跨损伤合成的过程并且还作为DNA序列损伤检查点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2和UmuD2。同时，可以激活产生产物的基因，从而在产生脂肪酸衍生物的同时，使复制和保持待使用的途径的需要最小化。还可以通过大肠杆菌的umuC和umuD与合适的终产物产生基因的重新合成，将生产宿主进行工程改造，使其在prpBCDE启动子系统下的pBAD24中表达umuC和umuD。
转变为脂肪酯或烃产物的输入碳的百分比是成本动因。该过程的效率越高(即转变为脂肪酯或烃产物的输入碳的百分比越高)，该过程的耗费越小。对于含氧碳源(例如葡萄糖和其它基于碳水化合物的来源)而言，氧必须以二氧化碳的形式释放。每释放2个氧原子，同时还释放1个碳原子，这导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对于脂肪酸来源的产物)。但是，这个数字对于其它烃产物和碳源会变化。文献中的通常效率约低于5％。进行工程改造从而产生烃产物的生产宿主可以具有大于1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一个实例中，生产宿主可以表现出约10％至约25％的效率。在其它实例中，这些生产宿主可以表现出约25％至约30％的效率。在其他实例中，这些生产宿主可以表现出大于30％的效率。
还可以将生产宿主工程化，使其表达重组纤维素体，例如PCT申请号WO/2008/100251中描述的那些(通过引用将其全文并入本文)，使得生产宿主能利用纤维素物质作为碳源。例如，还可以将生产宿主工程化，使之表达转化酶(EC3.2.1.26)，从而可以利用蔗糖作为碳源。
同样，可以利用美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号(Ingram et al.，通过引用将以上文献的全文并入本文)中描述的方法将生产宿主工程化，从而使得生产宿主可以有效地同化碳并利用纤维素物质作为碳源。
在一个实例中，发酵罐可以将正在进行连续还原的发酵封闭。这种情况下，可以创造稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(以气体形式)可以维持电子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于稳定电子平衡。通过将生产宿主进行工程改造，使其表达NADH：NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的可利用性。一种或多种NADH：NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转变为增强脂肪酸衍生物产生的NADPH。
B.葡萄糖的使用
在一些情况下，利用葡萄糖作为碳源实施本文公开的方法。在某些情况下，微生物生长在含有初始葡萄糖浓度为约2g/L-约50g/L(例如约5g/L-约20g/L)的培养基中。在一些情况下，培养基的葡萄糖浓度随着微生物消耗葡萄糖而从初始葡萄糖浓度降低，并且在脂肪酸酯产生过程中，使培养基中的葡萄糖维持在约0g/L-约5g/L的浓度。在某些情况下，将约50％-约65％葡萄糖溶液中的葡萄糖供给微生物。
在一些情况下，设定葡萄糖的给料速率来匹配细胞的生长速率，从而避免发酵罐中葡萄糖的过量积累(即，>0％葡萄糖)。在其它情况下，保持低浓度的过量葡萄糖(例如，约2g/L-约5g/L)。
在某些情况下，可以从葡萄糖之外的碳水化合物产生脂肪酸酯，包括但不限于果糖、水解蔗糖、水解糖蜜和甘油。
C.在提供或不提供外源醇的条件下产生FAEE
在一些情况下，在发酵罐中实施本文公开的脂肪酸酯产生方法，例如所述。例如，细胞培养物过夜生长，将小份培养物用于接种发酵罐中含约5g/L-约50g/L葡萄糖的合适的培养基，同时控制温度、pH、摇动、通风和溶解氧。优选约5g/L-约20g/L的初始葡萄糖浓度。合适的条件可以包括，例如，约30℃-约35℃的温度、约6.6-约7.0的pH和约10％-约50％饱和度的溶解氧(DO)浓度。通过添加合适的酸或碱(例如NH4OH)可以保持pH。在特定情况下，细胞保持在有氧条件下。
在一些情况下，在脂肪酸酯产生过程中，保持发酵罐中约0g/L-约5g/L葡萄糖。不希望被任何理论所约束，我们相信该过程限制了乙酸酯的形成，同时允许产生乙醇。在某些情况下，在给料流中使用含约50％-约65％葡萄糖的葡萄糖溶液。
在一些方法中，向发酵罐添加外源醇。在该情况下，设定葡萄糖的给料速率来匹配细胞的生长速率，从而避免发酵罐中葡萄糖的过量积累(即，>0％葡萄糖)。在其它方法中，不提供外源醇，并且保持低浓度的过量葡萄糖(例如，约2g/L-约5g/L)。
大多数利用大肠杆菌的工业和制药发酵过程是流加式过程，其中初始葡萄糖给料速率响应于支持所需生长速率的指数模式，然后是生产期，在生产期中葡萄糖给料速率保持恒定。在生长期中，通常利用对应于约0.1h-1-约0.4h-1的生长速率的葡萄糖给料速率。如果提供的是复合培养基，也可以利用更快的葡萄糖给料速率。生长期中的葡萄糖给料速率取决于诸如细胞密度、葡萄糖摄取速率和氧供给的因素。在某些本文所述的方法中，使用约4g/L/h-约15g/L/h的葡萄糖给料速率，例如约8g/L/h-约12g/L/h的葡萄糖给料速率。
在本文所述的方法中可以使用适于维持大肠杆菌生长的任何培养基。合适的培养基的非限制性实例描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis的Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验手册)，第二版，ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryPress：1989)，通过引用将其全部并入本文。培养基和诸如糖、氮、磷、镁、硫和钾的营养物的给料浓度将决定发酵中获得的最大细胞密度。诸如微量元素和维生素的微量营养物不是大肠杆菌生长所必需的，但通常能使其更快地生长，并且可以用于提高生产途径的效率。添加复合营养源也是这个目的。所述营养源的非限制性实例包括酵母提取物、蛋白水解物(乳、大豆、棉花和其它来源的蛋白水解物)、蛋白胨和玉米浆。在本发酵过程中，添加氨基酸能提高初始生长速率和生产速率。
在某些方法，在细胞生长的早期阶段，添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)可以诱导酯的产生。当提供外源醇时，在诱导时即，添加IPTG时)、以20mL/L的浓度添加醇。当提供外源醇时，在运行过程中分数次添加醇来维持约10mL/L-约30mL/L的浓度。
实施例
以下实施例描述了将生产宿主进行工程化，使其产生脂肪酸酯，例如FAEE。脂肪酸衍生物(例如FAEE)产生所涉及的生物合成途径如附图所示。
例如，图1是FAS途径示意图，其显示了直接参与酰基ACP合成的酶。为了增加诸如蜡、脂肪酯、脂肪醇和烃的脂肪酸衍生物的产生，可以过表达或者突变一种或者多种图1中的酶以减少反馈抑制，从而增加所产生的酰基ACP的量。此外，可以在功能上缺失或者减弱对中间体进行代谢而产生非脂肪酸基础的产物(例如副反应)的酶，从而增加通过脂肪酸生物合成(FAS)途径的碳通量。以下实施例中，描述了许多为了增加脂肪酸产生而经修饰的生产宿主。
图3、图4和图5分别显示了可以进行工程化分别来制备脂肪醇和脂肪酯的生物合成途径。如图4所示，可以利用所标明的酶分类的成员中的数种不同多肽来实现每种底物(例如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸和酰基辅酶A)向每种产物(例如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸和酰基辅酶A)的转化。
下文的实施例描述了通过在提供或不提供外源醇的条件下发酵微生物来产生FAEE的方法。
方法
下述方法用于下述实施例中。
葡萄糖浓度
在整个发酵过程中，利用高压液相色谱(HPLC)分析葡萄糖浓度。按照下述条件进行HPLC分析：配备了折光率检测器的Agilent HPLC 1200 Series；柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm；柱温：35℃；流动相：0.01M H2SO4(水溶液)；流速：0.6mL/分钟；上样体积：20μL。
脂肪酸酯浓度
利用配备了火焰离子化检测器的气相色谱(GC-FID)分析脂肪酸甲酯(本文中称为“FAME”)和FAEE的产生。用乙酸乙酯以1:1(体积/体积)的比例提取来自发酵液的样品。强烈涡旋后，将样品离心，并利用气相色谱(GC)分析有机相。分析条件如下：仪器：配备了火焰离子化检测器(FID)的Trace GC Ultra，Thermo Electron Corporation；柱：来自ThermoElectron Corporation的DB-1(1％二苯基氧硅烷；99％二甲基硅氧烷)CO1 UFM 1/0.1/501 DET，相pH 5，FT：0.4μm，长度5m，id：0.1mm；入口条件：250℃无分流，3.8分钟，根据样品浓度使用1/25分流法，分流流量为75mL/分钟；载体气体，流速：氦，3.0mL/分钟；模块温度：330℃；烘箱温度：50℃下保持0.5分钟；以100℃/分钟升至330℃；330℃下保持0.5分钟；检测器温度：300℃；上样体积：2μL；运行时间/流速：6.3分钟/3.0mL/分钟(无分流法)，3.8分钟/1.5mL/分钟(1/25分流法)，3.04分钟/1.2mL/分钟(1/50分流法)。
发酵条件
在2L发酵罐中进行发酵。使冻存细胞生长在含以下成分的规定培养基中：1.5g/LKH2PO4、4.54g/L K2HPO4·3H2O、4g/L(NH4)2SO4、0.15g/L MgSO4·7H2O、20g/L葡萄糖、200mMBis-Tris缓冲液(pH 7.2)、1.25ml/L微量矿物质和1.25mL/L维生素溶液。微量矿物质溶液由以下组成：27g/L FeCl3·6H2O、2g/L ZnCl2·4H2O、2g/L CaCl2·6H2O、2g/L Na2MoO4·2H2O、1.9g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L H3BO3和100mL/L浓HCl。维生素溶液由以下组成：0.42g/L维生素B2、5.4g/L维生素B3、6g/L烟酸、1.4g/L维生素B6、0.06g/L维生素H和0.04g/L叶酸。
冻存细胞过夜培养后，将50mL培养物用于接种发酵罐中的1L与上述相同但只含有5g/L葡萄糖的培养基，同时控制温度、pH、摇动、通气和溶解氧。发酵的条件为32℃、pH 6.8和30％饱和度的溶解氧(DO)。通过添加NH4OH来维持pH，NH4OH也作为细胞生长的氮源。当初始5g/L葡萄糖几乎都被消耗光时(例如，少于约0.5g/L葡萄糖)，向发酵罐提供由60％葡萄糖、3.9g/L MgSO4·7H2O和10mL/L微量矿物质溶液组成的给料。
当提供外源醇时，设定给料速率来匹配细胞的生长速率，从而避免发酵罐中葡萄糖的积累。当不提供外源醇时，保持低浓度的过量葡萄糖(例如，约2g/L-约5g/L)。
在生长的早期阶段，添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)来诱导酯的产生。当提供外源醇时，在诱导时间(即，添加IPTG时)、以20mL/L的浓度添加醇。发酵持续3天。当提供外源醇时，在运行过程中数次添加醇来维持约10mL/L-约30mL/L的浓度。
实施例1.在不提供外源乙醇、提供多次甲醇给料的条件下的FAEE产生
首先构建携带含‘tesA、fadD和atfA1的质粒的修饰的大肠杆菌Δ4株(MG1655ΔfadE ΔfabR ΔpoxB ΔldhA)。
1.Δ4株的构建：
利用Datsenko et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645(2000)中所述的λ红体系(也称为红色驱动整合)，将大肠杆菌MG1655(一种大肠杆菌K株)的fadE基因缺失，其中对所述体系进行了如下的改动。
使用两个引物来产生缺失：
Del-fadE-F
5’-AAAAACAGCAACAATGTGAGCTTTGTTGTAATTATATTGTAAACATATTGATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO:1)
Del-fadE-R
5’-AAACGGAGCCTTTCGGCTCCGTTATTCATTTACGCGGCTTCAACTTTCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO:2)
通过PCR，使用Del-fadE-F和Del-fadE-R引物从质粒pKD13(同上Datsenko et al.中所述)扩增卡那霉素抗性(KmR)盒。然后，将PCR产物用于转化含有pKD46(同上Datsenkoet al.中所述)的电感受态大肠杆菌MG1655细胞。这些细胞在之前已用阿拉伯糖诱导3-4小时。在37℃下、含分解代谢物抑制的超级优化培养基(super optimal broth)(SOC)中生长3小时后，将细胞接种在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。37℃下过夜孵育之后，鉴定抗性菌落并将其分离。通过利用引物fadE-L2和fadE-R1的PCR扩增来证实所选菌落中fadE基因的中断，引物fadE-L2和fadE-R1被设计为位于fadE基因的侧翼：
fadE-L2：5’-CGGGCAGGTGCTATGACCAGGAC(SEQ ID NO:3)
fadE-R1：5’-CGCGGCGTTGACCGGCAGCCTGG(SEQ ID NO:4)
证实fadE缺失后，利用同上的Datsenko et al.中所述的pCP20质粒，去除单菌落的KmR标记。将得到的具有fadE基因缺失并且去除了KmR标记的MG1655大肠杆菌菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔfadE或大肠杆菌MG1655 D1。
利用同上的Datsenko et al.中所述的λ红体系，从大肠杆菌MG1655 D1缺失大肠杆菌fabR基因，大肠杆菌fabR基因编码脂肪酸生物合成调节蛋白并且据报道是大肠杆菌fabA、fabB和yqfA的抑制基因(参见，例如，McCue et al.，Nucleic Acids Res.，29(3)：774-82(2001)；Zhang et al.，J.Biol.Chem.277(18)：15558-65(2002))，其中对所述体系进行了如下的改动。
使用两个引物来产生缺失：
Del-fabR-F
5’-ATGTTTTATTGCGTTACCGTTCATTCACAATACTGGAGCAATCCAGTATGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCC-3’(SEQ ID NO:5)
Del-fabR-R
5’-CGTACCTCTATCTTGATTTGCTTGTTTCATTACTCGTCCTTCACATTTCCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG–3’(SEQ ID NO:6)
通过PCR，使用Del-fabR-F和Del-fabR-R引物从质粒pKD13扩增KmR盒。将获得的PCR产物用于转化含有pKD46(参见上文)的电感受态大肠杆菌MG1655 D1细胞。这些细胞在之前已用阿拉伯糖诱导3-4小时。在37℃下、SOC培养基中生长3小时后，将细胞接种在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。37℃下过夜孵育之后，鉴定卡那霉素抗性菌落并将其分离。通过利用引物fabR-verF和fabR-verR的PCR扩增来证实所选菌落中fabR基因的中断，引物fabR-verF和fabR-verR被设计为位于fabR基因的侧翼。
fabR-verF：5’-AACCGGCCAAAGAATTGCAG-3’(SEQ ID NO:7)
fabR-verR：5’-TAAGCCAGCAACTAACGCCA-3’(SEQ ID NO:8)
证实fabR缺失后，利用同上的Datsenko et al.中所述的pCP20质粒，去除单菌落的KmR标记。将得到的具有fadE和fabR基因缺失的MG1655大肠杆菌菌株命名为Δ2，并用于进一步的基因缺失。
利用同上的Datsenko et al.中所述的λ红体系，从大肠杆菌MG1655Δ2株缺失大肠杆菌poxB基因，poxB基因编码丙酮酸氧化酶(参见，例如，Chang et al.，J.Bacteriol.154(2)：756-62(1983)；Abdel-Ahmid et al.，Microbiol.147(6)：1483-98(2001))，其中对所述体系进行了如下的改动。
使用两个引物来产生缺失：
Del-poxB-F
5’-GATGAACTAAACTTGTTACCGTTATCACATTCAGGAGATGGAGAACCATGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCC-3’(SEQ ID NO:9)
Del-poxB-R
5’-CCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTTTTTACCTTAGCCAGTTTGTTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG–3’(SEQ ID NO:10)
通过PCR，使用Del-poxB-F和Del-poxB-R引物从质粒pKD13扩增KmR盒。将获得的PCR产物用于转化含有pKD46(参见上文)的电感受态大肠杆菌MG1655Δ2细胞。这些细胞在之前已用阿拉伯糖诱导3-4小时。在37℃下、SOC培养基中生长3小时后，将细胞接种在含50μg/mL卡那霉素的Luria琼脂板上。37℃下过夜孵育之后，鉴定卡那霉素抗性菌落并将其分离。通过利用引物poxB-verF和poxB-verR的PCR扩增来证实所选菌落中poxB基因的中断，引物poxB-verF和poxB-verR被设计为位于poxB基因的侧翼。
poxB-verF：5’-CGGGCTATTTAACCGTTAGT-3’(SEQ ID NO:11)
poxB-verR：5’-AGAGCATTAACGGTAGGG-3’(SEQ ID NO:12)
证实poxB缺失后，利用同上的Datsenko et al.中所述的pCP20质粒，去除单菌落的KmR标记。将得到的MG1655大肠杆菌菌株命名为Δ3，并用于进一步的基因缺失。
利用同上的Datsenko et al.中所述的λ红体系，从大肠杆菌Δ3株缺失大肠杆菌ldhA基因，ldhA基因编码乳酸脱氢酶、具体是NAD连接的发酵型D-乳酸脱氢酶(参见，例如，Mat-Jan et al.，J.Bacteriol.171(1)：342-8(1989)；Bunch et al.，Microbiol.143(1)：187-95(1997))，其中对所述体系进行了如下的改动。
使用两个引物来产生缺失：
Del-ldhA-F
5’-TATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGGAGAAAGTCTTATGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCC-3’(SEQ ID NO:13)
Del-ldhA-R
5’-CTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGATTAAACCAGTTCGTTCGGGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG–3’(SEQ ID NO:14)
通过利用引物ldhA-verF和ldhA-verR的PCR扩增来证实所选菌落中ldhA基因的中断，引物ldhA-verF和ldhA-verR被设计为位于ldhA基因的侧翼。
ldhA-verF：5’-CAATATCGCCATAGCTTTC-3’(SEQ ID NO:15)
ldhA-verR：5’-TACAGTTTCTGACTCAGG-3’(SEQ ID NO:16)
证实ldhA缺失后，利用同上的Datsenko et al.中所述的pCP20质粒，去除单菌落的KmR标记。将得到的具有fadE、fabR、poxB和ldhA基因缺失的MG1655大肠杆菌菌株命名为Δ4。
2.tesA、fadD和atfA1质粒的制备
大肠杆菌‘tesA是包含无前导序列的大肠杆菌tesA(GenBank登录号AAC73596，参考序列登录号U00096.2)的核苷酸序列。‘tesA编码大肠杆菌硫酯酶(EC 3.1.1.5，3.1.2.-)，其中前25个氨基酸是缺失的并且第26位的氨基酸丙氨酸被替换为蛋氨酸。因此，该蛋氨酸成为‘tesA的第一个氨基酸。参见Cho et al.，J.Biol.Chem.，270：4216-4219(1995)。大肠杆菌fadD(GenBank登录号AAC74875；参考序列登录号U00096.2)编码酰基辅酶A合酶。博克岛食烷菌SK2株atfA1(GenBank条目：YP_694462；参考序列登录号NC_008260.1)编码酯合酶。
a)‘tesA质粒的构建
从pETDuet-1-‘tesA质粒扩增‘tesA，pETDuet-1-‘tesA质粒的构建如下文所述。(还可参见，例如，WO 2007/136762 A2，通过引用将其并入)。将‘tesA基因克隆到NdeI/AvrII消化的pETDuet-1质粒中(Novagen，Madison，WI)。
b)fadD质粒的构建
从pHZ1.61质粒扩增fadD，pHZ1.61质粒的构建如下文所述。将fadD基因克隆到pCDFDuet-1质粒中(Novagen，Madison，WI)并受T7启动子的控制，得到含有下述核苷酸序列的pHZ1.61质粒：
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGTGAAGAAGGTTTGGCTTAACCGTTATCCCGCGGACGTTCCGACGGAGATCAACCCTGACCGTTATCAATCTCTGGTAGATATGTTTGAGCAGTCGGTCGCGCGCTACGCCGATCAACCTGCGTTTGTGAATATGGGGGAGGTAATGACCTTCCGCAAGCTGGAAGAACGCAGTCGCGCGTTTGCCGCTTATTTGCAACAAGGGTTGGGGCTGAAGAAAGGCGATCGCGTTGCGTTGATGATGCCTAATTTATTGCAATATCCGGTGGCGCTGTTTGGCATTTTGCGTGCCGGGATGATCGTCGTAAACGTTAACCCGTTGTATACCCCGCGTGAGCTTGAGCATCAGCTTAACGATAGCGGCGCATCGGCGATTGTTATCGTGTCTAACTTTGCTCACACACTGGAAAAAGTGGTTGATAAAACCGCCGTTCAGCACGTAATTCTGACCCGTATGGGCGATCAGCTATCTACGGCAAAAGGCACGGTAGTCAATTTCGTTGTTAAATACATCAAGCGTTTGGTGCCGAAATACCATCTGCCAGATGCCATTTCATTTCGTAGCGCACTGCATAACGGCTACCGGATGCAGTACGTCAAACCCGAACTGGTGCCGGAAGATTTAGCTTTTCTGCAATACACCGGCGGCACCACTGGTGTGGCGAAAGGCGCGATGCTGACTCACCGCAATATGCTGGCGAACCTGGAACAGGTTAACGCGACCTATGGTCCGCTGTTGCATCCGGGCAAAGAGCTGGTGGTGACGGCGCTGCCGCTGTATCACATTTTTGCCCTGACCATTAACTGCCTGCTGTTTATCGAACTGGGTGGGCAGAACCTGCTTATCACTAACCCGCGCGATATTCCAGGGTTGGTAAAAGAGTTAGCGAAATATCCGTTTACCGCTATCACGGGCGTTAACACCTTGTTCAATGCGTTGCTGAACAATAAAGAGTTCCAGCAGCTGGATTTCTCCAGTCTGCATCTTTCCGCAGGCGGAGGGATGCCAGTGCAGCAAGTGGTGGCAGAGCGTTGGGTGAAACTGACAGGACAGTATCTGCTGGAAGGCTATGGCCTTACCGAGTGTGCGCCGCTGGTCAGCGTTAACCCATATGATATTGATTATCATAGTGGTAGCATCGGTTTGCCGGTGCCGTCGACGGAAGCCAAACTGGTGGATGATGATGATAATGAAGTACCACCGGGTCAACCGGGTGAGCTTTGTGTCAAAGGACCGCAGGTGATGCTGGGTTACTGGCAGCGTCCGGATGCTACAGATGAGATCATCAAAAATGGCTGGTTACACACCGGCGACATCGCGGTGATGGATGAAGAAGGGTTCCTGCGCATTGTCGATCGTAAAAAAGACATGATTCTGGTTTCCGGTTTTAACGTCTATCCCAACGAGATTGAAGATGTCGTCATGCAGCATCCTGGCGTACAGGAAGTCGCGGCTGTTGGCGTACCTTCCGGCTCCAGTGGTGAAGCGGTGAAAATCTTCGTAGTGAAAAAAGATCCATCGCTTACCGAAGAGTCACTGGTGACCTTTTGCCGCCGTCAGCTCACGGGCTACAAAGTACCGAAGCTGGTGGAGTTTCGTGATGAGTTACCGAAATCTAACGTCGGAAAAATTTTGCGACGAGAATTACGTGACGAAGCGCGCGGCAAAGTGGACAATAAAGCCTGAAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGCGCCCATTACATCCGATTGATTTTATATTCCTGTCACTAGAAAAAAGACAACAGCCTATGCATGTAGGTGGTTTATTTTTGTTTCAGATTCCTGATAACGCCCCAGACACCTTTATTCAAGATCTGGTGAATGATATCCGGATATCAAAATCAATCCCTGTTCCACCATTCAACAATAAACTGAATGGGCTTTTTTGGGATGAAGATGAAGAGTTTGATTTAGATCATCATTTTCGTCATATTGCACTGCCTCATCCTGGTCGTATTCGTGAATTGCTTATTTATATTTCACAAGAGCACAGTACGCTGCTAGATCGGGCAAAGCCCTTGTGGACCTGCAATATTATTGAAGGAATTGAAGGCAATCGTTTTGCCATGTACTTCAAAATTCACCATGCGATGGTCGATGGCGTTGCTGGTATGCGGTTAATTGAAAAATCACTCTCCCATGATGTAACAGAAAAAAGTATCGTGCCACCTTGGTGTGTTGAGGGAAAACGTGCAAAGCGCTTAAGAGAACCTAAAACAGGTAAAATTAAGAAAATCATGTCTGGTATTAAGAGTCAGCTTCAGGCGACACCCACAGTCATTCAAGAGCTTTCTCAGACAGTATTTAAAGATATTGGACGTAATCCTGATCATGTTTCAAGCTTTCAGGCGCCTTGTTCTATTTTGAATCAGCGTGTGAGCTCATCGCGACGTTTTGCAGCACAGTCTTTTGACCTAGATCGTTTTCGTAATATTGCCAAATCGTTGAATGTGACCATTAATGATGTTGTACTAGCGGTATGTTCTGGTGCATTACGTGCGTATTTGATGAGTCATAATAGTTTGCCTTCAAAACCATTAATTGCCATGGTTCCAGCCTCTATTCGCAATGACGATTCAGATGTCAGCAACCGTATTACGATGATTCTGGCAAATTTGGCAACCCACAAAGATGATCCTTTACAACGTCTTGAAATTATCCGCCGTAGTGTTCAAAACTCAAAGCAACGCTTCAAACGTATGACCAGCGATCAGATTCTAAATTATAGTGCTGTCGTATATGGCCCTGCAGGACTCAACATAATTTCTGGCATGATGCCAAAACGCCAAGCCTTCAATCTGGTTATTTCCAATGTGCCTGGCCCAAGAGAGCCACTTTACTGGAATGGTGCCAAACTTGATGCACTCTACCCAGCTTCAATTGTATTAGACGGTCAAGCATTGAATATTACAATGACCAGTTATTTAGATAAACTTGAAGTTGGTTTGATTGCATGCCGTAATGCATTGCCAAGAATGCAGAATTTACTGACACATTTAGAAGAAGAAATTCAACTATTTGAAGGCGTAATTGCAAAGCAGGAAGATATTAAAACAGCCAATTAAAAACAATAAACTTGATTTTTTAATTTATCAGATAAAACTAAAGGGCTAAATTAGCCCTCCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCATCGTGGCCGGATCTTGCGGCCCCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGACATTATTTGCCGACTACCTTGGTGATCTCGCCTTTCACGTAGTGGACAAATTCTTCCAACTGATCTGCGCGCGAGGCCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAAGATAAGCCTGTCTAGCTTCAAGTATGACGGGCTGATACTGGGCCGGCAGGCGCTCCATTGCCCAGTCGGCAGCGACATCCTTCGGCGCGATTTTGCCGGTTACTGCGCTGTACCAAATGCGGGACAACGTAAGCACTACATTTCGCTCATCGCCAGCCCAGTCGGGCGGCGAGTTCCATAGCGTTAAGGTTTCATTTAGCGCCTCAAATAGATCCTGTTCAGGAACCGGATCAAAGAGTTCCTCCGCCGCTGGACCTACCAAGGCAACGCTATGTTCTCTTGCTTTTGTCAGCAAGATAGCCAGATCAATGTCGATCGTGGCTGGCTCGAAGATACCTGCAAGAATGTCATTGCGCTGCCATTCTCCAAATTGCAGTTCGCGCTTAGCTGGATAACGCCACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAGCGCGGAGAATCTCGCTCTCTCCAGGGGAAGCCGAAGTTTCCAAAAGGTCGTTGATCAAAGCTCGCCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACGGTCACCGTAACCAGCAAATCAATATCACTGTGTGGCTTCAGGCCGCCATCCACTGCGGAGCCGTACAAATGTACGGCCAGCAACGTCGGTTCGAGATGGCGCTCGATGACGCCAACTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGGCGATCACCGCTTCCCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGCTAGCTCACTCGGTCGCTACGCTCCGGGCGTGAGACTGCGGCGGGCGCTGCGGACACATACAAAGTTACCCACAGATTCCGTGGATAAGCAGGGGACTAACATGTGAGGCAAAACAGCAGGGCCGCGCCGGTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCTCCTGCCAGAGTTCACATAAACAGACGCTTTTCCGGTGCATCTGTGGGAGCCGTGAGGCTCAACCATGAATCTGACAGTACGGGCGAAACCCGACAGGACTTAAAGATCCCCACCGTTTCCGGCGGGTCGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGTTTACCGGATACCTGTTCCGCCTTTCTCCCTTACGGGAAGTGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACACACTGGTATCTCGGCTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTAAGCAAGAACTCCCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTGTTCACTTGAGTCCAACCCGGAAAAGCACGGTAAAACGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGGGAGTTCGCAGAGGATTTGTTTAGCTAAACACGCGGTTGCTCTTGAAGTGTGCGCCAAAGTCCGGCTACACTGGAAGGACAGATTTGGTTGCTGTGCTCTGCGAAAGCCAGTTACCACGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCACCTCCCCAGGTGGTTTTTTCGTTTACAGGGCAAAAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACTGAACCGCTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:17)
c)atfA1质粒的构建
从pHZ1.97-atfA1质粒扩增atfA1，pHZ1.97-atfA1质粒的构建如下文所述。通过DNA2.0(Menlo Park，CA)合成atfA1基因，并将其克隆到NdeI和AvrII消化的pCOLA-Duet-1质粒(Novagen，Madison，WI)中，得到含有下述核苷酸序列的pHZ1.97-atfA1质粒：
GGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGGCCGCATAATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCATCTTAGTATATTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACATATGAAAGCGCTTAGCCCAGTGGATCAACTGTTCCTGTGGCTGGAAAAACGACAGCAACCCATGCACGTAGGCGGTTTGCAGCTGTTTTCCTTCCCGGAAGGTGCCGGCCCCAAGTATGTGAGTGAGCTGGCCCAGCAAATGCGGGATTACTGCCACCCAGTGGCGCCATTCAACCAGCGCCTGACCCGTCGACTCGGCCAGTATTACTGGACTAGAGACAAACAGTTCGATATCGACCACCACTTCCGCCACGAAGCACTCCCCAAACCCGGTCGCATTCGCGAACTGCTTTCTTTGGTCTCCGCCGAACATTCCAACCTGCTGGACCGGGAGCGCCCCATGTGGGAAGCCCATTTGATCGAAGGGATCCGCGGTCGCCAGTTCGCTCTCTATTATAAGATCCACCATTCGGTGATGGATGGCATATCCGCCATGCGTATCGCCTCCAAAACGCTTTCCACTGACCCCAGTGAACGTGAAATGGCTCCGGCTTGGGCGTTCAACACCAAAAAACGCTCCCGCTCACTGCCCAGCAACCCGGTTGACATGGCCTCCAGCATGGCGCGCCTAACCGCGAGCATAAGCAAACAAGCTGCCACAGTGCCCGGTCTCGCGCGGGAGGTTTACAAAGTCACCCAAAAAGCCAAAAAAGATGAAAACTATGTGTCTATTTTTCAGGCTCCCGACACGATTCTGAATAATACCATCACCGGTTCACGCCGCTTTGCCGCCCAGAGCTTTCCATTACCGCGCCTGAAAGTTATCGCCAAGGCCTATAACTGCACCATTAACACCGTGGTGCTCTCCATGTGTGGCCACGCTCTGCGCGAATACTTGATTAGCCAACACGCGCTGCCCGATGAGCCACTGATTGCAATGGTGCCCATGAGCCTGCGGCAGGACGACAGCACTGGCGGCAACCAGATCGGTATGATCTTGGCTAACCTGGGCACCCACATCTGTGATCCAGCTAATCGCCTGCGCGTCATCCACGATTCCGTCGAGGAAGCCAAATCCCGCTTCTCGCAGATGAGCCCGGAAGAAATTCTCAATTTCACCGCCCTCACTATGGCTCCCACCGGCTTGAACTTACTGACCGGCCTAGCGCCAAAATGGCGGGCCTTCAACGTGGTGATTTCCAACATACCCGGGCCGAAAGAGCCGCTGTACTGGAATGGTGCACAGCTGCAAGGAGTGTATCCAGTATCCATTGCCTTGGATCGCATCGCCCTAAATATCACCCTCACCAGTTATGTAGACCAGATGGAATTTGGGCTTATCGCCTGCCGCCGTACTCTGCCTTCCATGCAGCGACTACTGGATTACCTGGAACAGTCCATCCGCGAATTGGAAATCGGTGCAGGAATTAAATAGTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACAAGCTGACGACCGGGTCTCCGCAAGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGGTCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGCATGCTAGCGCAGAAACGTCCTAGAAGATGCCAGGAGGATACTTAGCAGAGAGACAATAAGGCCGGAGCGAAGCCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAACATCACGAAATCTGACGCTCAAATCAGTGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGATGGCTCCCTCTTGCGCTCTCCTGTTCCCGTCCTGCGGCGTCCGTGTTGTGGTGGAGGCTTTACCCAAATCACCACGTCCCGTTCCGTGTAGACAGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAAGAACCCCCCGTTCAGCCCGACTGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCATCTTGAGTCCAACCCGGAAAGACACGACAAAACGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGAGAATTAGTGGATTTAGATATCGAGAGTCTTGAAGTGGTGGCCTAACAGAGGCTACACTGAAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCCACTAAAGCCAGTTACCAGGTTAAGCAGTTCCCCAACTGACTTAACCTTCGATCAAACCGCCTCCCCAGGCGGTTTTTTCGTTTACAGAGCAGGAGATTACGACGATCGTAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTACGGATTCCCGACACCATCACTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATTAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:18)
3.‘tesA、fadD、atfA1整合盒的制备
将核苷酸序列‘tesA，fadD和aftA1整合入大肠杆菌MG1655Δ4的染色体的lacZ基因座。如下文所述，序列整合的顺序为‘tesA，然后是fadD，再然后是aftA1，并使这些序列位于Trc启动子的控制下。
a)含‘tesA、fadD和atfA1的pACYC-PTrc质粒的构建
使用具有下述序列的pACYC-PTrc载体来构建pACYC-PTrc-‘tesA-fadD-atfA1质粒。pACYC-PTrc载体的核苷酸序列为：
ACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCTTAATAAGATGATCTTCTTGAGATCGTTTTGGTCTGCGCGTAATCTCTTGCTCTGAAAACGAAAAAACCGCCTTGCAGGGCGGTTTTTCGAAGGTTCTCTGAGCTACCAACTCTTTGAACCGAGGTAACTGGCTTGGAGGAGCGCAGTCACCAAAACTTGTCCTTTCAGTTTAGCCTTAACCGGCGCATGACTTCAAGACTAACTCCTCTAAATCAATTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGTGCTTTTGCATGTCTTTCCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGACTGAACGGGGGGTTCGTGCATACAGTCCAGCTTGGAGCGAACTGCCTACCCGGAACTGAGTGTCAGGCGTGGAATGAGACAAACGCGGCCATAACAGCGGAATGACACCGGTAAACCGAAAGGCAGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCCGCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCACTGATTTGAGCGTCAGATTTCGTGATGCTTGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGGCTTTGCCGCGGCCCTCTCACTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATCTCCGCCCCGTTCGTAAGCCATTTCCGCTCGCCGCAGTCGAACGACCGAGCGTAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAATATATCCTGTATCACATATTCTGCTGACGCACCGGTGCAGCCTTTTTTCTCCTGCCACATGAAGCACTTCACTGACACCCTCATCAGTGCCAACATAGTAAGCCAGTATACACTCCGCTAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCTCAAAGATGCAGGGGTAAAAGCTAACCGCATCTTTACCGACAAGGCATCCGGCAGTTCAACAGATCGGGAAGGGCTGGATTTGCTGAGGATGAAGGTGGAGGAAGGTGATGTCATTCTGGTGAAGAAGCTCGACCGTCTTGGCCGCGACACCGCCGACATGATCCAACTGATAAAAGAGTTTGATGCTCAGGGTGTAGCGGTTCGGTTTATTGACGACGGGATCAGTACCGACGGTGATATGGGGCAAATGGTGGTCACCATCCTGTCGGCTGTGGCACAGGCTGAACGCCGGAGGATCCTAGAGCGCACGAATGAGGGCCGACAGGAAGCAAAGCTGAAAGGAATCAAATTTGGCCGCAGGCGTACCGTGGACAGGAACGTCGTGCTGACGCTTCATCAGAAGGGCACTGGTGCAACGGAAATTGCTCATCAGCTCAGTATTGCCCGCTCCACGGTTTATAAAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCTTAATTAATCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGACCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGTATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGGAGACCGTTTAAACTCAATGATGATGATGATGATGGTCGACGGCGCTATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCCATATGGTACCAGCTGCAGATCTCGAGCTCGGATCCATGGTTTATTCCTCCTTATTTAATCGATACATTAATATATACCTCTTTAATTTTTAATAATAAAGTTAATCGATAATTCCGGTCGAGTGCCCACACAGATTGTCTGATAAATTGTTAAAGAGCAGTGCCGCTTCGCTTTTTCTCAGCGGCGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGATGATAAGCTGTCAAACCAGATCAATTCGCGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTGACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCACCATTCGATGGTGTCAACGTAAATGCATGCCGCTTCGCCTTCGCGCGCGAATTGATCTGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGGCCGGCCTCG(SEQ ID NO:19)
利用高保真PhusionTM聚合酶(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)，利用下述引物从各自的质粒pETDuet-1-‘tesA、pHZ1.61和pHZ1.97-atfA1扩增‘tesA、fadD和atfA1基因。
‘tesA正向
5’-CTCTAGAAATAATTTAACTTTAAGTAGGAGAUAGGTACCCATGGCGGACACGTTATTGAT(SEQID NO:20)
‘tesA反向
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTCATTATGAGTCATGATTTACTAAAGGC(SEQ IDNO:21)
fadD正向
5’-CTCTAGAAATAATTTTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACCATGGTGAAGAAGGTTTGGCTTAA(SEQ ID NO:22)
fadD反向
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTTATCAGGCTTTATTGTCCAC(SEQ ID NO:23)
atfA1正向
5’-CTCTAGAAATAATTTAGTTAAGTATAAGAAGGAGATATACAT(SEQID NO:24)
atfA1反向
5’-CTTCGAATTCCATTTAAATTATTTCTAGAGTTACTATTTAATTCCTGCACCGATTTCC(SEQ IDNO:25)
b)将‘tesA插入pACYC-Ptrc质粒
利用插入物和载体上的NcoI和EcoRI位点，将从pETDuet-1-‘tesA扩增的‘tesAPCR产物克隆到pACYC-PTrc载体(SEQ ID NO:19)的初始位置。然后，使用T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)来连接pACYC-PTrc载体和‘tesA，产生pACYC-PTrc-‘tesA质粒。过夜连接后，将DNA产物转化到Top 10 One
Figure BDA0002596267670000861
细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过限制性消化验证‘tesA被插入pACYC-PTrc载体。还在‘tesA插入物的3’末端产生了SwaI限制性位点以及用于In-FusionTM克隆的重叠片段(Clontech，Mountain View，CA)。
c)pACYC-PTrc-‘tesA-fadD-atfA1的构建
然后，用SwaI对pACYC-PTrc-‘tesA质粒进行过夜消化。利用In-FusionTM克隆，将从pHZ1.61扩增的fadD克隆在‘tesA基因的后面。通过限制性消化证实fadD的插入。fadD的插入破坏了‘tesA基因之后的SwaI位点，但是在fadD的3’末端再次产生了新的SwaI位点。
利用SwaI将pACYC-PTrc-‘tesA-fadD质粒再次线性化，并利用In-FusionTM克隆，将从pHZ1.97-atfA1扩增的atfA1克隆到fadD基因的后面。通过限制性消化验证atfA1的正确插入。
d)pOP-80(pCL)质粒的构建
用限制性酶AflII和SfoI(New England BioLabs Inc.Ipswich，MA)消化携带强转录启动子的低拷贝质粒pCL1920(按照Lerner et al.，Nucleic Acids Res.18：4631(1990))。该消化产生3个DNA序列片段，其中利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)，将3737 bp的片段进行凝胶纯化。同时，通过利用下述引物的PCR，从商业质粒pTrcHis2(Invitrogen，Carlsbad，CA)扩增含有Trc-启动子和lacI区的片段：
LF302：5’-ATATGACGTCGGCATCCGCTTACAGACA-3’(SEQ ID NO:26)
LF303：5’-AATTCTTAAGTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’(SEQ ID NO:27)。
这两个引物还在PCR产物的末端引入了ZraI(gacgtc)和AflII(cttaag)的识别位点。利用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)纯化PCR产物，并按照供货商的推荐操作，用ZraI和AflII(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)进行消化。然后，将消化过的PCR产物进行凝胶纯化，并与来自pCL1920的3737 bp的DNA序列片段连接。将连接混合物转化到
Figure BDA0002596267670000871
化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，将转化体接种于含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上。37℃下过夜孵育之后，可看到多个菌落。将其中选定数量的菌落进行纯化，用限制性酶分析，并测序。保留了其中一个质粒，并命名为pOP-80。
e)pCL-TFW-atfA1的构建
利用MluI和EcoRI(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的限制性消化，从pACYC-‘tesA-fadD-atfA1去除操纵子‘tesA-fadD-atfA1。然后将其克隆到pOP-80上的互补位点，产生质粒pCL-TFW-atfA1。
f)PTrc-‘tesA-fadD-atfA1操纵子整合到大肠杆菌Δ4染色体的lacI-lacZ基因座
用限制性酶HindIII(New England Biolabs，Inc.，Ipswich)消化质粒pCL-TFW-atfA1。同时，通过限制性酶BamHI和AvrII(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的消化，从质粒pLoxPcat2(GenBank登录号AJ401047)获得氯霉素基因盒。利用DNA聚合酶Klenow片段，使两个DNA片段成为平末端。将得到的片段连接和转化，产生质粒pCLTFWcat。
通过DNA2.0(Menlo Park，CA)，按照SEQ ID NO:28的序列(下文)构建和合成的质粒placZ被用作PCR扩增的模板。
CTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCAGGCAGTTCAACCTGTTGATAGTACGTACTAAGCTCTCATGTTTCACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTAACGAACTAAACCCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGGCTAACGTACTAAGCTCTCATGTTTCACGTACTAAGCTCTCATGTTTGAACAATAAAATTAATATAAATCAGCAACTTAAATAGCCTCTAAGGTTTTAAGTTTTATAAGAAAAAAAAGAATATATAAGGCTTTTAAAGCTTTTAAGGTTTAACGGTTGTGGACAACAAGCCAGGGATGTAACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCCTCTCAAAGCAATTTTCAGTGACACAGGAACACTTAACGGCTGACAGCCTGAATTCTGCAGATCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGTACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGTTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGAGGAGGGCCACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCC(SEQ ID NO:28)
设计PCR引物LacZFnotI和pKDRspeI来分别产生NotI和SpeI的限制性位点：
LacZFnotI
5’-CAACCAGCGGCCGCGCAGACGATGGTGCAGGATATC(SEQ ID NO:29)
pKDRspeI
5’-CCACACACTAGTCAGATCTGCAGAATTCAGGCTGTC(SEQ ID NO:30)
将得到的DNA片段与用SpeI和NotI酶消化质粒pCLTFWcat产生的DNA片段连接。连接混合物作为另一PCR反应的模板，该PCR反应利用位于lacI和lacZ区的引物lacIF和lacZR。
lacIF：5’-GGCTGGCTGGCATAAATATCTC(SEQ ID NO:31)
lacZR：5’-CATCGCGTGGGCGTATTCG(SEQ ID NO:32)
得到的PCR产物(“整合盒”)在每一末端含有约500个与lacI或lacZ同源的碱基。使用该PCR产物转化利用质粒pKD46而成为高感受态的大肠杆菌MG1655Δ4细胞(参见上文)。
4.生产株产生脂肪酸乙酯
使携带‘tesA、fadD和atfA1质粒的大肠杆菌MG1655Δ4株在利于生长和FAME产生的有氧条件下生长在发酵罐中。最初，用过量葡萄糖和过量氧使细胞生长。未观察到乙醇的积累。诱导后，用低于消耗的葡萄糖给料维持培养物，这样葡萄糖不会积累。供给葡萄糖来维持葡萄糖限度。刚诱导后(约20小时)，甲醇浓度为约10g/L；48小时后，增加至约15g/L。发酵快要结束时积累了少量葡萄糖。在诱导后的前几个小时中，FAME占产生的总酯的71％，而FAEE的浓度为约2g/L，占总酯的另外29％。发酵后期，当甲醇浓度增加时，FAME产生的速率更高，并且分布变化为86％的FAME和14％的FAEE，FAEE的浓度为约2.5g/L。产生谱如图6所示。FAME的产率为9.3g FAME每100g葡萄糖或23.3g FAME每100g碳源中的碳。FAEE的产率为1.6g FAEE每100g葡萄糖或3.9g FAEE每100g碳源中的碳。总产物(FAME+FAEE)相对于葡萄糖用量的产率为10.9g产物每100g葡萄糖或27.2g每100g碳源中的碳。
该过程中产生的FAME和FAEE的B侧包括不同长度和饱和度的脂肪酸。该过程中产生的脂肪酯混合物的主要组分是：C1:C12(月桂酸甲酯)，C1:C14(肉豆蔻酸甲酯)，C1:C16(棕榈酸甲酯)，C1:C16:1(棕榈油酸甲酯)和C1:C18:1(11-反-十八碳烯酸甲酯)；C2:C12(月桂酸乙酯)，C2:C14(肉豆蔻酸乙酯)，C2:C16(棕榈酸乙酯)，C2:C16:1(棕榈油酸乙酯)和C2:C18:1(11-反-十八碳烯酸乙酯)。在本实施例的生产条件下的每种甲酯和乙酯的百分比分布图如图7所示。
实施例2.在不提供外源乙醇、提供单次甲醇给料的条件下的FAEE产生
使携带含有‘tesA、fadD和atfA1的质粒的修饰的大肠杆菌Δ4株(如实施例1所述)在利于生长和脂肪酸甲酯产生的有氧条件下生长在发酵罐中。最初，用过量葡萄糖和过量氧使细胞生长。未观察到乙醇的积累。诱导后，用低于消耗的葡萄糖给料维持培养物，这样葡萄糖不会积累。葡萄糖的给料速率快于实施例1中的速率。仅添加1次甲醇，浓度为约10g/L。在发酵的早期阶段，结果与实施例1相似，为78％的FAME和22％的FAEE。然而，运行后期，葡萄糖消耗下降，葡萄糖在发酵罐中积累，甲醇浓度降至约5g/L。此时，培养物几乎停止产生FAME，并增加FAEE的产生，最终分布为62％的FAME和38％的FAEE。最终FAEE浓度大于5g/L。发酵谱如图8所示。图9提供了产生的FAME和FAEE的百分比分布，以它们B侧(脂肪酸组分)进行区分。FAME的产率为6.5g FAME每100g葡萄糖或16.3g FAME每100g碳源中的碳。FAEE的产率为4.0g FAEE每100g葡萄糖或10.1g FAEE每100g碳源中的碳。总产物(FAME+FAEE)相对于葡萄糖用量的产率为10.5g产物每100g葡萄糖或26.4g每100g碳源中的碳。本实施例中存在实施例1中所述的所有FAME和FAEE。
实施例3.在不提供外源醇的条件下的FAEE产生
使大肠杆菌株ID1(按照实施例1构建的MG1655ΔfadE，其具有含有整合在染色体中的、受Trc启动子控制的基因‘tesA、fadD和atfA1的操纵子)在有利于生长和游离脂肪酸产生的条件下生长在发酵罐中。
最初，用过量的葡萄糖(5g/L)使细胞生长，并给予细胞指数形式的葡萄糖和矿物质给料，从而允许细胞以0.3h-1的速率生长；在这种给料之后，给予固定的给料方案。在整个运行中，保持培养物完全有氧。不向培养基添加外源醇。产生了少量乙醇，并产生了大量的游离脂肪酸。工程化的脂肪酸途径包括酯合酶，其是负责在添加醇的存在下产生酯的主要酶。在这种情况下，内源产生的乙醇以及积累的游离脂肪酸足以作为酯合酶的原材料，从而导致FAEE的产生和积累。脂肪酸、FAEE和乙醇的积累谱如图10和图11所示。在43小时内，游离脂肪酸积累到超过3g/L，而同时FAEE达到1.2g/L的浓度。图12显示了本过程产生的游离脂肪酸和FAME的相对组成。FFA的产率为2.1g FFA每100g葡萄糖或5.2g FFA每100g碳源中的碳。FAEE的产率为0.8g FAEE每100g葡萄糖或2.1g FAEE每100g碳源中的碳。FFA加FAEE的联合产率为2.9g每100g葡萄糖或7.3g每100g碳源中的碳。
实施例4.在不提供外源醇的条件下蓝细菌宿主细胞中的FAEE产生
制备了合适的载体，以便蓝细菌宿主细胞在不用外源添加醇的条件下产生FAEE，所述蓝细菌宿主细胞包括，例如聚球蓝细菌PCC7002、细长聚球蓝细菌PCC7942或集胞蓝细菌PCC6803的细胞。然后，将合适的基因例如，含有硫酯酶基因(例如，来自大肠杆菌的‘tesA)、脂肪酰辅酶A合酶基因(例如，来自大肠杆菌的fadD)和酯合酶基因(例如，来自博克岛食烷菌SK2株的atfA1)的质粒克隆到这个载体中，所述基因任选地整合于染色体中、受合适的启动子(例如，PTrc)的控制。还将一种或多种促进乙醇产生的合适的基因引入这些宿主细胞中，使得在不外源添加醇的条件下能产生FAEE，所述促进乙醇产生的基因例如来自运动发酵单胞菌的pdc[GenBank登录号YP_163095]、adh[GenBank登录号YP_162971]、adhA[GenBank登录号AAA71935]、adhB[GenBank登录号AAC70367]，或产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)的casA[GenBank登录号AAB51563]或casB[GenBank登录号AAB51564]。
利用对应于聚球蓝细菌PCC7002 pAQ1[GenBank登录号NC_0050525]的第3301-3800位和第3801-4300位的500bp同源区，来构建能实现与该聚球蓝细菌同源重组的载体。诸如含有氨基糖苷3’-腺苷转移酶基因(aad)、启动子和终止子的壮观霉素抗性盒的选择标记来源于质粒PCL1920(按照Lerner et al.，Nucleic Acids Res.18：4631(1990))。该选择标记被插入所述同源区。按照Chang，et al.J.Bacteriol.134：1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。添加氨基糖苷磷酸转移酶(aph)的启动子和核糖体结合位点，其后面跟随合适的独特克隆位点，例如NdeI和EcoRI识别序列。合成这样的完整整合盒，并将其克隆到pUC19载体(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)中。得到的质粒pLS9-7002允许外来基因的克隆和表达，以及递送和体内稳定整合入聚球蓝细菌PCC7002pAQ1。
制备含有硫酯酶基因(例如，来自大肠杆菌的‘tesA)、脂肪酰辅酶A合成酶基因(例如，来自大肠杆菌的fadD)和酯合酶基因(例如，来自博克岛食烷菌SK2株的atfA1)的质粒或合成操纵子，并随后将其克隆入pLS9-7002中位于aph启动子和核糖体结合位点下游的NdeI和EcoRI位点。同样地引入编码本文所述的促进乙醇产生的酶的基因。然后，利用Stevenset al.，PNAS 77：6052-56(1980)所述的方法，将得到的质粒转化入聚球蓝细菌PCC7002。
在一些实施方案中，利用对应于细长聚球蓝细菌PCC7942基因组(GenBank登录号CP_000100)第2577844-2578659位和第2578660-2579467位的800 bp同源区，来构建能与该细长聚球蓝细菌同源重组的另一载体。该染色体位置已知作为中和位点1(NS1)(Mackey etal.，Meth.Mol.Biol.362：115-129(2007)。按照上文所述得到并引入诸如壮观霉素抗性盒的选择标记。合成这样的整合盒，并将其克隆到pUC19(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。得到的质粒pLS9-7942-NS1允许外来基因的克隆和表达，以及递送和稳定整合入细长聚球蓝细菌PCC7942的基因组。按照上文所述，制备包含硫酯酶基因、脂肪酰辅酶A合成酶基因和酯合酶基因的质粒或合成操纵子，并随后将其克隆入pLS9-7942-NS1的NdeI和EcoRI位点。同样地引入编码本文所述的促进乙醇产生的酶的基因。按照同上的Mackeyet al.所述的方法，将得到的质粒转化入细长聚球蓝细菌PCC7942。
在一些实施方案中，构建另一载体用于中的同源重组，利用分别对应于集胞蓝细菌PCC6803基因组(GenBank Accession BA_000022)第2299015-2300690位和第2300691-2302056位的1300-1700bp的同源区，来构建能与该集胞蓝细菌同源重组的另一载体。。该染色体位置已知作为中和位点RS1/2(Shao et al.，Appl.Environ.Microbiol.68：5026-33(2002))。按照Chang，et al.J.Bacteriol.134：1141-1156(1978)制备诸如pACYC177的质粒。作为选择标记，卡那霉素抗性盒(含有氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、启动子、基因和终止子)来源于pACYC177质粒，并且所述卡那霉素抗性盒被添加在同源区之间。此外，添加合适的独特克隆位点，例如NdeI和XbaI识别位点。合成这样的整合盒，并将其克隆到pUC19(NewEngland Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)。得到的质粒pLS9-6803-RS允许外来基因的克隆和表达，以及递送和稳定整合入集胞蓝细菌PCC6803基因组。
按照上文所述，制备包含硫酯酶基因、脂肪酰辅酶A合成酶基因和酯合酶基因的质粒或合成操纵子，并随后将其克隆入pLS9-6803-RS的NdeI和XbaI位点。同样地引入编码本文所述的促进乙醇产生的酶的基因。按照Zang et al.J.Microbiol.，45：241-45(2007)所述的方法，将得到的质粒转化入集胞蓝细菌PCC6803。
实施例5.在不提供外源醇的条件下酵母中的FAEE产生
按照PCT公开WO2008/147935的方法构建tpFBAIN-MOD-1载体，通过引用将其公开内容并入本文。然后，用诸如NcoI和NotI(New England Biolabs，Inc.，Ipswich，MA)的合适的限制性酶消化该载体。按照上文所述，制备包含硫酯酶基因、脂肪酰辅酶A合成酶基因和酯合酶基因的质粒或合成操纵子，并随后在标准连接条件下将其插入预消化的pFBAIN-MOD-1载体。任选地，同样地引入编码本文所述的促进乙醇产生的酶的基因。然后，将该连接混合物在室温下孵育2小时，并用于转化合适的感受态细胞，例如大肠杆菌Top10感受态细胞(Life Technologies，Carlsbad，CA)。利用Qiagen Miniprep试剂盒从转化体回收质粒DNA。通过限制性图谱鉴定正确的克隆。
然后，将正确的克隆转化入合适的酵母宿主细胞，例如解脂耶氏酵母细胞，例如Y_FOAR。通过获得解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞并将它们接种在YPD琼脂板上(含10g/L酵母提取物(DIFCO，Detroit，MI)、20g/L细菌蛋白胨(DIFCO，Detroit，MI)和20g/L葡萄糖)来制备Y_FOAR。然后，将细胞在含有250mg/L 5-FOA(Zymo Research Orange，CA)的基础培养基(MM)平板(含75mg/L的尿嘧啶和75mg/L的尿苷、6.7g/L含硫酸铵但不含氨基酸的YNB(酵母氮源)以及20g/L葡萄糖)上划线。在28℃下孵育平板，并将得到的集落分别贴在含200mg/L5-FOA的MM平板和缺少尿嘧啶和尿苷的MM平板上。从而获得Ura3营养缺陷型，得到的菌株是Y_FOAR株。
将来自转化的细胞接种到缺少尿嘧啶的MM平板(0.17％不含硫酸铵或氨基酸的YNB(DIFCO Labs，Detroit，MI)、含2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、pH 6.1、20g/L琼脂)，并保持在30℃下2天。收集转化体，并任选地用于适于产生脂肪酸乙酯的条件下进行发酵。例如，将数个转化体用于接种MM培养基中的25mL培养物，该MM培养基不含硫酸铵或氨基酸，含2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、pH 6.1。允许每个培养物在30℃下生长2天，然后将其换至25mL HGM(含80g/L葡萄糖、2.58g/L KH2PO4、5.36g/L K2HPO4的高生长培养基)，并允许在30℃下生长约5天。提取总脂质，并利用本文所述的方法确定和测量脂肪酸乙酯的产生。
等同项
尽管本文清楚地公开了本发明的具体实施例，但是以上的说明书和实施例是示例性的而非限制性的。在阅读本说明书(包括实施例)后，本发明的多种变形对本领域技术人员是显而易见的。应当参考实施例及其等同项的全部范围以及说明书及这些变形来确定本发明的全部范围。
将本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献通过引用全部并入本文，如同特别和单独指出通过引用将每一个出版物、专利、专利申请和其它参考文献并入本文。
序列表
<110> LS9, INC.
<120> 脂肪酸酯的产生
<130> 2001235.00148WO1
<140> PCT/US10/32580
<141> 2010-04-27
<150> 61/182,564
<151> 2009-05-29
<150> 61/173,016
<151> 2009-04-27
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 1
aaaaacagca acaatgtgag ctttgttgta attatattgt aaacatattg attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 2
aaacggagcc tttcggctcc gttattcatt tacgcggctt caactttcct gtaggctgga 60
gctgcttc 68
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 3
cgggcaggtg ctatgaccag gac 23
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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cgcggcgttg accggcagcc tgg 23
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<212> DNA
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<400> 5
atgttttatt gcgttaccgt tcattcacaa tactggagca atccagtatg catatgaata 60
tcctccttag ttcc 74
<210> 6
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 6
cgtacctcta tcttgatttg cttgtttcat tactcgtcct tcacatttcc gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaccggccaa agaattgcag 20
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taagccagca actaacgcca 20
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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gatgaactaa acttgttacc gttatcacat tcaggagatg gagaaccatg catatgaata 60
tcctccttag ttcc 74
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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ccttattatg acgggaaatg ccaccctttt taccttagcc agtttgtttt gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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cgggctattt aaccgttagt 20
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agagcattaa cggtaggg 18
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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tatttttagt agcttaaatg tgattcaaca tcactggaga aagtcttatg catatgaata 60
tcctccttag ttcc 74
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
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ctcccctgga atgcagggga gcggcaagat taaaccagtt cgttcgggca gtgtaggctg 60
gagctgcttc g 71
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 15
caatatcgcc atagctttc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 16
tacagtttct gactcagg 18
<210> 17
<211> 6700
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 17
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atggtgaaga aggtttggct taaccgttat cccgcggacg ttccgacgga 120
gatcaaccct gaccgttatc aatctctggt agatatgttt gagcagtcgg tcgcgcgcta 180
cgccgatcaa cctgcgtttg tgaatatggg ggaggtaatg accttccgca agctggaaga 240
acgcagtcgc gcgtttgccg cttatttgca acaagggttg gggctgaaga aaggcgatcg 300
cgttgcgttg atgatgccta atttattgca atatccggtg gcgctgtttg gcattttgcg 360
tgccgggatg atcgtcgtaa acgttaaccc gttgtatacc ccgcgtgagc ttgagcatca 420
gcttaacgat agcggcgcat cggcgattgt tatcgtgtct aactttgctc acacactgga 480
aaaagtggtt gataaaaccg ccgttcagca cgtaattctg acccgtatgg gcgatcagct 540
atctacggca aaaggcacgg tagtcaattt cgttgttaaa tacatcaagc gtttggtgcc 600
gaaataccat ctgccagatg ccatttcatt tcgtagcgca ctgcataacg gctaccggat 660
gcagtacgtc aaacccgaac tggtgccgga agatttagct tttctgcaat acaccggcgg 720
caccactggt gtggcgaaag gcgcgatgct gactcaccgc aatatgctgg cgaacctgga 780
acaggttaac gcgacctatg gtccgctgtt gcatccgggc aaagagctgg tggtgacggc 840
gctgccgctg tatcacattt ttgccctgac cattaactgc ctgctgttta tcgaactggg 900
tgggcagaac ctgcttatca ctaacccgcg cgatattcca gggttggtaa aagagttagc 960
gaaatatccg tttaccgcta tcacgggcgt taacaccttg ttcaatgcgt tgctgaacaa 1020
taaagagttc cagcagctgg atttctccag tctgcatctt tccgcaggcg gagggatgcc 1080
agtgcagcaa gtggtggcag agcgttgggt gaaactgaca ggacagtatc tgctggaagg 1140
ctatggcctt accgagtgtg cgccgctggt cagcgttaac ccatatgata ttgattatca 1200
tagtggtagc atcggtttgc cggtgccgtc gacggaagcc aaactggtgg atgatgatga 1260
taatgaagta ccaccgggtc aaccgggtga gctttgtgtc aaaggaccgc aggtgatgct 1320
gggttactgg cagcgtccgg atgctacaga tgagatcatc aaaaatggct ggttacacac 1380
cggcgacatc gcggtgatgg atgaagaagg gttcctgcgc attgtcgatc gtaaaaaaga 1440
catgattctg gtttccggtt ttaacgtcta tcccaacgag attgaagatg tcgtcatgca 1500
gcatcctggc gtacaggaag tcgcggctgt tggcgtacct tccggctcca gtggtgaagc 1560
ggtgaaaatc ttcgtagtga aaaaagatcc atcgcttacc gaagagtcac tggtgacctt 1620
ttgccgccgt cagctcacgg gctacaaagt accgaagctg gtggagtttc gtgatgagtt 1680
accgaaatct aacgtcggaa aaattttgcg acgagaatta cgtgacgaag cgcgcggcaa 1740
agtggacaat aaagcctgaa agcttgcggc cgcataatgc ttaagtcgaa cagaaagtaa 1800
tcgtattgta cacggccgca taatcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag 1860
cggataacaa ttccccatct tagtatatta gttaagtata agaaggagat atacatatgc 1920
gcccattaca tccgattgat tttatattcc tgtcactaga aaaaagacaa cagcctatgc 1980
atgtaggtgg tttatttttg tttcagattc ctgataacgc cccagacacc tttattcaag 2040
atctggtgaa tgatatccgg atatcaaaat caatccctgt tccaccattc aacaataaac 2100
tgaatgggct tttttgggat gaagatgaag agtttgattt agatcatcat tttcgtcata 2160
ttgcactgcc tcatcctggt cgtattcgtg aattgcttat ttatatttca caagagcaca 2220
gtacgctgct agatcgggca aagcccttgt ggacctgcaa tattattgaa ggaattgaag 2280
gcaatcgttt tgccatgtac ttcaaaattc accatgcgat ggtcgatggc gttgctggta 2340
tgcggttaat tgaaaaatca ctctcccatg atgtaacaga aaaaagtatc gtgccacctt 2400
ggtgtgttga gggaaaacgt gcaaagcgct taagagaacc taaaacaggt aaaattaaga 2460
aaatcatgtc tggtattaag agtcagcttc aggcgacacc cacagtcatt caagagcttt 2520
ctcagacagt atttaaagat attggacgta atcctgatca tgtttcaagc tttcaggcgc 2580
cttgttctat tttgaatcag cgtgtgagct catcgcgacg ttttgcagca cagtcttttg 2640
acctagatcg ttttcgtaat attgccaaat cgttgaatgt gaccattaat gatgttgtac 2700
tagcggtatg ttctggtgca ttacgtgcgt atttgatgag tcataatagt ttgccttcaa 2760
aaccattaat tgccatggtt ccagcctcta ttcgcaatga cgattcagat gtcagcaacc 2820
gtattacgat gattctggca aatttggcaa cccacaaaga tgatccttta caacgtcttg 2880
aaattatccg ccgtagtgtt caaaactcaa agcaacgctt caaacgtatg accagcgatc 2940
agattctaaa ttatagtgct gtcgtatatg gccctgcagg actcaacata atttctggca 3000
tgatgccaaa acgccaagcc ttcaatctgg ttatttccaa tgtgcctggc ccaagagagc 3060
cactttactg gaatggtgcc aaacttgatg cactctaccc agcttcaatt gtattagacg 3120
gtcaagcatt gaatattaca atgaccagtt atttagataa acttgaagtt ggtttgattg 3180
catgccgtaa tgcattgcca agaatgcaga atttactgac acatttagaa gaagaaattc 3240
aactatttga aggcgtaatt gcaaagcagg aagatattaa aacagccaat taaaaacaat 3300
aaacttgatt ttttaattta tcagataaaa ctaaagggct aaattagccc tcctaggctg 3360
ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg 3420
gttttttgct gaaacctcag gcatttgaga agcacacggt cacactgctt ccggtagtca 3480
ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag cggctattta acgaccctgc cctgaaccga 3540
cgaccgggtc atcgtggccg gatcttgcgg cccctcggct tgaacgaatt gttagacatt 3600
atttgccgac taccttggtg atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat 3660
ctgcgcgcga ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta 3720
tgacgggctg atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg 3780
gcgcgatttt gccggttact gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc 3840
gctcatcgcc agcccagtcg ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct 3900
caaatagatc ctgttcagga accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg 3960
caacgctatg ttctcttgct tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg 4020
gctcgaagat acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct 4080
tagctggata acgccacgga atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc 4140
ggagaatctc gctctctcca ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc 4200
gccgcgttgt ttcatcaagc cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg 4260
gcttcaggcc gccatccact gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga 4320
gatggcgctc gatgacgcca actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg 4380
cttccctcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4440
tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aatagctagc tcactcggtc 4500
gctacgctcc gggcgtgaga ctgcggcggg cgctgcggac acatacaaag ttacccacag 4560
attccgtgga taagcagggg actaacatgt gaggcaaaac agcagggccg cgccggtggc 4620
gtttttccat aggctccgcc ctcctgccag agttcacata aacagacgct tttccggtgc 4680
atctgtggga gccgtgaggc tcaaccatga atctgacagt acgggcgaaa cccgacagga 4740
cttaaagatc cccaccgttt ccggcgggtc gctccctctt gcgctctcct gttccgaccc 4800
tgccgtttac cggatacctg ttccgccttt ctcccttacg ggaagtgtgg cgctttctca 4860
tagctcacac actggtatct cggctcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtaag 4920
caagaactcc ccgttcagcc cgactgctgc gccttatccg gtaactgttc acttgagtcc 4980
aacccggaaa agcacggtaa aacgccactg gcagcagcca ttggtaactg ggagttcgca 5040
gaggatttgt ttagctaaac acgcggttgc tcttgaagtg tgcgccaaag tccggctaca 5100
ctggaaggac agatttggtt gctgtgctct gcgaaagcca gttaccacgg ttaagcagtt 5160
ccccaactga cttaaccttc gatcaaacca cctccccagg tggttttttc gtttacaggg 5220
caaaagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctactgaa 5280
ccgctctaga tttcagtgca atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata 5340
cgatataagt tgtaattctc atgttagtca tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg 5400
ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta 5460
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 5520
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt 5580
tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag 5640
agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg 5700
gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg 5760
tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga 5820
tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat tcagcatttg catggtttgt 5880
tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg 5940
cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg 6000
cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc 6060
gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga 6120
aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc 6180
ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta 6240
caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg 6300
gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg 6360
gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg 6420
taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg 6480
gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc tgcgacatcg 6540
tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat 6600
gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt 6660
atgcgactcc tgcattagga aattaatacg actcactata 6700
<210> 18
<211> 4963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 18
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60
gagatatacc atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgaattcgag 120
ctcggcgcgc ctgcaggtcg acaagcttgc ggccgcataa tgcttaagtc gaacagaaag 180
taatcgtatt gtacacggcc gcataatcga aattaatacg actcactata ggggaattgt 240
gagcggataa caattcccca tcttagtata ttagttaagt ataagaagga gatatacata 300
tgaaagcgct tagcccagtg gatcaactgt tcctgtggct ggaaaaacga cagcaaccca 360
tgcacgtagg cggtttgcag ctgttttcct tcccggaagg tgccggcccc aagtatgtga 420
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tgacccgtcg actcggccag tattactgga ctagagacaa acagttcgat atcgaccacc 540
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ccgccgaaca ttccaacctg ctggaccggg agcgccccat gtgggaagcc catttgatcg 660
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gcatatccgc catgcgtatc gcctccaaaa cgctttccac tgaccccagt gaacgtgaaa 780
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gcaccattaa caccgtggtg ctctccatgt gtggccacgc tctgcgcgaa tacttgatta 1140
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ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt 1740
gaggggtttt ttgctgaaac ctcaggcatt tgagaagcac acggtcacac tgcttccggt 1800
agtcaataaa ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct atttaacgac cctgccctga 1860
accgacgaca agctgacgac cgggtctccg caagtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 1920
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgaattaat 1980
tcttagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 2040
ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 2100
cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 2160
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actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc 2280
cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat 2340
tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcggtcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc 2400
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tttagtctga ccatctcatc tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga 2640
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acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc 2760
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tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 2880
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cagagagaca ataaggccgg agcgaagccg tttttccata ggctccgccc ccctgacgaa 3000
catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3060
caggcgtttc cccctgatgg ctccctcttg cgctctcctg ttcccgtcct gcggcgtccg 3120
tgttgtggtg gaggctttac ccaaatcacc acgtcccgtt ccgtgtagac agttcgctcc 3180
aagctgggct gtgtgcaaga accccccgtt cagcccgact gctgcgcctt atccggtaac 3240
tatcatcttg agtccaaccc ggaaagacac gacaaaacgc cactggcagc agccattggt 3300
aactgagaat tagtggattt agatatcgag agtcttgaag tggtggccta acagaggcta 3360
cactgaaagg acagtatttg gtatctgcgc tccactaaag ccagttacca ggttaagcag 3420
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ccatcactct agatttcagt gcaatttatc tcttcaaatg tagcacctga agtcagcccc 3600
atacgatata agttgtaatt ctcatgttag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga 3660
ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac 3720
ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc 3780
tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgccagggtg 3840
gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc ccttcaccgc ctggccctga 3900
gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca ggcgaaaatc ctgtttgatg 3960
gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat cgtcgtatcc cactaccgag 4020
atgtccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc gcattgcgcc cagcgccatc 4080
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cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg gtgtctggtc agagacatca 4380
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agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga gaagattgtg caccgccgct 4500
ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca ccacgctggc acccagttga 4560
tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg cgtgcagggc cagactggag 4620
gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt gttgtgccac gcggttggga 4680
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catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt ccgggatctc gacgctctcc 4920
cttatgcgac tcctgcatta ggaaattaat acgactcact ata 4963
<210> 19
<211> 5733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 19
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 60
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 120
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 180
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag 240
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 300
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 360
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 420
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 480
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ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 600
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 660
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cttaataaga tgatcttctt 720
gagatcgttt tggtctgcgc gtaatctctt gctctgaaaa cgaaaaaacc gccttgcagg 780
gcggtttttc gaaggttctc tgagctacca actctttgaa ccgaggtaac tggcttggag 840
gagcgcagtc accaaaactt gtcctttcag tttagcctta accggcgcat gacttcaaga 900
ctaactcctc taaatcaatt accagtggct gctgccagtg gtgcttttgc atgtctttcc 960
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ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt 2640
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gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag 2820
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ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 4920
gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 4980
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<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成引物
<220>
<223> 混合DNA/RNA分子的描述: 合成引物
<400> 20
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<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 21
cttcgaattc catttaaatt atttctagag tcattatgag tcatgattta ctaaaggc 58
<210> 22
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 22
ctctagaaat aattttagtt aagtataaga aggagatata ccatggtgaa gaaggtttgg 60
cttaa 65
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 23
cttcgaattc catttaaatt atttctagag ttatcaggct ttattgtcca c 51
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 24
ctctagaaat aatttagtta agtataagaa ggagatatac at 42
<210> 25
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 25
cttcgaattc catttaaatt atttctagag ttactattta attcctgcac cgatttcc 58
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 26
atatgacgtc ggcatccgct tacagaca 28
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 27
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<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
<400> 28
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gtttcacgta ctaagctctc atgtttgaac aataaaatta atataaatca gcaacttaaa 240
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ttaaggttta acggttgtgg acaacaagcc agggatgtaa cgcactgaga agcccttaga 360
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gaactgcaca ccgccgacgg cacgctgatt gaagcagaag cctgcgatgt cggtttccgc 1320
gaggtgcgga ttgaaaatgg tctgctgctg ctgaacggca agccgttgct gattcgaggc 1380
gttaaccgtc acgagcatca tcctctgcat ggtcaggtca tggatgagca gacgatggtg 1440
caggatatcc tgctgatgaa gcagaacaac tttaacgccg tgcgctgttc gcattatccg 1500
aaccatccgc tgtggtacac gctgtgcgac cgctacggcc tgtatgtggt ggatgaagcc 1560
aatattgaaa cccacggcat ggtgccaatg aatcgtctga ccgatgatcc gcgctggcta 1620
ccggcgatga gcgaacgcgt aacgcgaatg gtgcagcgcg atcgtaatca cccgagtgtg 1680
atcatctggt cgctggggaa tgaatcaggc cacggcgcta atcacgacgc gctgtatcgc 1740
tggatcaaat ctgtcgatcc ttcccgcccg gtgcagtatg aaggcggcgg agccgacacc 1800
acggccaccg atattatttg cccgatgtac gcgcgcgtgg atgaagacca gcccttcccg 1860
gctgtgccga aatggtccat caaaaaatgg ctttcgctac ctggagagac gcgcccgctg 1920
atcctttgcg aatacgccca cgcgatgggt aacagtcttg gcggtttcgc taaatactgg 1980
caggcgtttc gtcagtatcc ccgtttacag ggcggcttcg tctgggactg ggtggatcag 2040
tcgctgatta aatatgatga aaacggcaac ccgtggtcgg cttacggcgg tgattttggc 2100
gatacgccga acgatcgcca gttctgtatg aacggtctgg tctttgccga ccgcacgccg 2160
catccagcgc tgacggaagc aaaacaccag cagcagtttt tccagttccg tttatccggg 2220
caaaccatcg aagtgaccag cgaatacctg ttccgtcata gcgataacga gctcctgcac 2280
tggatggtgg cgctggatgg taagccgctg gcaagcggtg aagtgcctct ggatgtcgct 2340
ccacaaggta aacagttgat tgaactgcct gaactaccgc agccggagag cgccgggcaa 2400
ctctggctca cagtacgcgt agtgcaaccg aacgcgaccg catggtcaga agccgggcac 2460
atcagcgcct ggcagcagtg gcgtctggcg gaaaacctca gtgtgacgct ccccgccgcg 2520
tcccacgcca tcccgcatct gaccaccagc gaaatggatt tttgcatcga gctgggtaat 2580
aagcgttggc aatttaaccg ccagtcaggc tttctttcac agatgtggat tggcgataaa 2640
aaacaactgc tgacgccgct gcgcgatcag ttcacccgtg cacgtctgct gtcagataaa 2700
gtctcccgtg aactttaccc ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc 2760
accgatatgg ccagtgtgcc ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac 2820
cgcgaaaatg acatcaaaaa cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc 2880
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttca cgtagaaagc cagtccgcag 2940
aaacggtgct gaccccggat gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca 3000
agcgcaaaga gaaagcaggt agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg 3060
gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg 3120
aagccctgca aagtaaactg gatggctttc tcgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga 3180
tcaagctctg atcaagagac aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg 3240
cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 3300
acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 3360
tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta 3420
tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 3480
ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 3540
gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 3600
ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 3660
atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 3720
gccgaactgt tcgccaggct caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 3780
catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 3840
gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 3900
attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 3960
gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaattatt 4020
aacgcttaca atttcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 4080
cgcatacagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4140
aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4200
agcacgtgag gagggccacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc 4260
gcgacgtcgc cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc c 4311
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 29
caaccagcgg ccgcgcagac gatggtgcag gatatc 36
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 30
ccacacacta gtcagatctg cagaattcag gctgtc 36
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 31
ggctggctgg cataaatatc tc 22
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成引物
<400> 32
catcgcgtgg gcgtattcg 19

Claims (10)

1.产生脂肪酸酯的方法，所述方法包括在不存在外源醇的情况下培养基因工程化微生物，其中所述微生物经过基因工程改造，从而能产生醇、脂肪酸和至少一种酯合酶。
2.如权利要求1所述的方法，还包括分离所述脂肪酸酯的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物培养在包含初始浓度为约2g/L-约50g/L的葡萄糖的培养基中。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述醇是乙醇。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述脂肪酸酯是脂肪酸乙酯。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述微生物经过基因工程改造，从而相对于对应的野生型微生物过表达至少一种选自pdc、adh、adhA、adhB、pdh和casAB的基因。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述微生物经过基因工程改造，从而相对于对应的野生型有机体具有至少一种选自frd、ldhA、pflA、pflB、adhE、ackA和focA的基因的降低的表达。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物是重组大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
9.通过权利要求1所述的方法产生的脂肪酸酯。
10.如权利要求9所述的脂肪酸酯，其中所述脂肪酸酯是脂肪酸乙酯。
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