MX2011006081A - Biosintesis de productos quimicos de uso generalizado. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos, enzimas, microorganismo recombinante, y sistemas microbianos para convertir monosacáridos u oligosacáridos apropiados, tal como aquellos derivados a partir de biomasa, así como varios aldehídos y/o cetonas, en productos químicos de uso generalizado, tal como biocombustibles. También se proporcionan los productos químicos de uso generalizado producidos por los métodos descritos en la presente. También se proporcionan producto químico de uso generalizado enriquecido, productos de petróleo producido por refinado, así como métodos para producir los mismos.

Description

BIOSINTESIS DE PRODUCTOS QUIMICOS DE USO GENERALIZADO Campo de la Invención La presente solicitud se refiere generalmente al uso de microorganismos recombinantes y sistemas químicos/enzimáticos para convertir aldehidos y/o cetonas a varios productos químicos de uso generalizado o biocombustibles , tal como isooctano .

Antecedentes de la Invención El petróleo enfrenta una disminución global en reservas y contribuye a más del 30% de las emisiones de gas de invernadero que llevan al calentamiento global. Anualmente se consumen 800 mil millones de barriles de combustible de transporte globalmente. El diesel y los combustibles de aeronáutica contribuyen a más del 50% de combustibles de transporte globales .

Se ha aprobado una legislación importante, que exige a los productores de combustible que limiten o reduzcan las emisiones de carbono de la producción y uso de combustibles de transporte. Los productores de combustible han buscado combustibles bajos en carbono, sustancialmente similares, que puedan mezclarse y distribuirse a través de la infraestructura existente (por ejemplo, refinerías, tuberías, pipas) .

Ref . :220151 Debido los costos del petróleo incrementados y la dependencia en materias primas petroquímicas, la industria química también busca la manera para mejorar la estabilidad de margen y precio, mientras se reduce su huella ambiental. La industria química está haciendo esfuerzos para desarrollar productos más ecológicos que sean más eficientes en energía, agua, y C02 que los productos actuales. Los combustibles producidos de fuentes biológicas, tales como biomasa, representan un aspecto de tal proceso.

Muchos métodos actuales para convertir la biomasa en biocombustibles se enfocan en el uso de biomasa lignocelulósica . Sin embargo, hay muchos problemas asociados con el uso de este proceso. El cultivo a gran escala de biomasa lignocelulósica requiere una cantidad sustancial de tierra cultivada, que sólo puede alcanzarse al reemplazar la producción de cultivo alimenticio con producción de cultivo energético, deforestación, y al recultivar la tierra actualmente no cultivada. Otros problemas incluyen una reducción en la disponibilidad y calidad del agua así como un incremento en el uso de pesticidas y fertilizantes.

La degradación de biomasa lignocelulósica usando sistemas biológicos presenta un reto importante debido a su resistencia mecánica sustancial y los componentes químicos complejos. Se requieren aproximadamente treinta enzimas diferentes para convertir completamente la lignocelulosa en monosacáridos . La única alternativa disponible a este enfoque complejo requiere una cantidad sustancial de calor, presión, y ácidos fuertes. La técnica, por lo tanto, necesita un proceso económico y técnicamente sencillo para convertir la biomasa en hidrocarburos para usar como biocombustibles o biopetróleos . La Solicitud E.U.A. Nos. 12/245,537 y 12/245,540 describe el uso de microorganismos recombinantes para producir varios biocombustibles a partir de biomasa, y también describe el uso de tales microorganismos recombinantes para producir varios aldehidos, tales como butiraldehído e isobutiraldehído, a partir de sacáridos derivados de biomasa.

El 2 , 2 , 4-trimetilpentano, también conocido como isooctano, es un isómero de octano que define los 100 puntos en la escala de clasificación del octano. El isooctano representa un componente importante de la gasolina. El isooctano se produce en una escala masiva en la industria del petróleo, a menudo como una mezcla con hidrocarburos relacionados. La industria del petróleo depende típicamente en el proceso de alquilación para producir isooctano, que alquila el isobutano con isobutileno usando un catalizador ácido fuerte.

Además, las reservas de petróleo existentes son menores y menos útiles para gasolina debido a su bajo contenido de octano, y la capacidad para agregar octano puede incrementar la capacidad de utilización de las reservas de petróleo actuales. La técnica, por lo tanto, necesita un proceso ambientalmente amigable y técnicamente sencillo para producir isooctano, así como otros biocombustibles relacionados.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra una trayectoria ejemplar por la cual el isobutiraldehído puede convertirse in vivo a 2,4,4-trimetil-1, 3 -pentanodiol .

Las Figuras 2A-2B muestran la producción de 3-hidroxi- 2,2,4- trimetilpentanal a partir de la cepa DH10B que porta pTrcTM1559 (figura 2A) y su plásmido de control (figura 2B) , como se mide por GC-MS.

Las Figuras 3A-3B muestran la producción de 2-etil-2-hexen-l-al a partir de la cepa DH10B que porta pTrcTM1559 (figura 3A) y su plásmido de control (figura 3B) , como se mide por GC-MS.

Las Figura 4A-4B muestran la producción de 2-butil-2-octen-l-al a partir de la cepa DH10B que porta pTrcTM1559 (figura 4A) y su plásmido de control (figura 4B) , como se mide por GC-MS Breve Descripción de la Invención Las modalidades de la presente invención se refieren generalmente a métodos para producir un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, que comprende hacer crecer un microorganismo recombinante con una fuente de un aldehido, una cetona, o ambos, en donde el microorganismo recombinante comprende: (i) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (ii) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa , en donde al menos uno de los polinucleótidos es exógeno, por ello se produce el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo.

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo, se selecciona de las siguientes fórmulas : en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , y CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de H, CH3( CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2, CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2, en donde n = 0-30.

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado se convierte enzimáticamente o químicamente además a su correspondiente alcano.

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado se selecciona del grupo que consiste de 3-hidroxi-2 , 2 , 4 trimetilpentanal y 2 , 2 , 4 -trimetil-1, 3 -pentanodiol . En ciertas modalidades, el 2 , 2 , 4 -trimetil - 1 , 3-pentanodiol se convierte enzimáticamente o químicamente además a 2 , 2 , 4 -trimetilpentano .

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado se selecciona del grupo que consiste de 3-hidroxi-2 -etilhexanal , 2-etil-2-hexen-l-al , 2 -etilhexanal , y 2-etilhexanol . En ciertas modalidades, el 2 -etilhexanol se convierte enzimáticamente o químicamente además a 2-etilhexano .

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado se selecciona del grupo que consiste de 3-hidroxi-2-butil-l-octanol, 2-butil-2-octen-l-al , 2-butil-octanal, y 2 -butil -octanol . En ciertas modalidades, el 2-butil-octanol se convierte además enzimáticamente o químicamente a 2 -butil-octano.

En ciertas modalidades, la fuente del aldehido, cetona, o ambos es un microorganismo recombinante que comprende un trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona seleccionada de una trayectoria de biosíntesis de acetoaldehído, propionaldehído, glutaraldehído, butiraldehído, isobutiraldehído, 2-metil-butiraldehído, 3- metil-butiraldehído, 4-metilpentaldehído, hexanaldehído, octanaldehído, fenilacetoaldehído, 2-fenil acetoaldehído, 2-(4-hidroxifenil) acetoaldehído, 2 -indol-3 -acetoaldehído, 5-amino-pentaldehído, succinato semialdehído, y un succinato 4-hidroxifenil acetaldehído, y combinaciones de las mismas.

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante que comprende la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona es la misma como el microorganismo recombinante que produce o sintetiza el producto químico de uso generalizado. En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante que comprende la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona es diferente que el microorganismo recombinante que produce o sintetiza el producto químico de uso generalizado.

En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de isobutiraldehído, y en donde el aldehido es isobutiraldehído . En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de butiraldehído, y en donde el aldehido es butiraldehído. En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de hexanaldehído, y en donde el aldehido es hexanaldehído .

En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de aldolasa comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 51 -82, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 51-82, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media. En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene la actividad de aldolasa comprende al menos una porción biológicamente activa seleccionada de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID N0S:223-244, 255-260.

En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de alcohol deshidrogenasa comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 33, o 83-96, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID N0S:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 33, o 83-96, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media. En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene la actividad de alcohol deshidrogenasa comprende al menos uno de una nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) , un NADH, fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP+) , o una porción enlazada a NADPH.

En ciertas modalidades, la NAD+, NADH, NADP+, o porción enlazada a NADPH se selecciona del grupo que consiste de Y-X-G-G-X-Y (SEQ ID N0:245), Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO:246), Y-X-¦X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO:247)( Y-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO:248), Y-X-X-G-G-X-X-Y (SEQ ID NO: 249), Y-X-X-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO:250), Y-X-G-X-Y (SEQ ID NO:251), Y-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:252), Y-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:253), e Y-X-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:254); en donde Y se selecciona independientemente de alanina, glicina, y serina, en donde G es glicina, y en donde X se selecciona independientemente de un aminoácido codificado genéticamente.

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante comprende además al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble y/o al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de deshidratasa . En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de reductasa de enlace doble comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS:35-50, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 35-50, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media.

Las modalidades de la presente invención también se refieren generalmente a microorganismos recombinantes , que comprenden (i) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (ii) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa .

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante es capaz de convertir una fuente de un aldehido, una cetona, o ambos, a un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, en donde el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo, se seleccionan de las siguientes fórmulas: en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2, CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , y CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2, en donde n = 0-30.

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante comprende además (iii) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona . En ciertas modalidades, el microorganismo que comprende además la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona es capaz de convertir un monosacárido apropiado u oligosacárido apropiado a un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, en donde el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo, se seleccionan de las siguientes fórmulas: en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2, CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , y CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2, en donde n = 0-30. En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria seleccionada de una trayectoria de biosíntesis de acetoaldehído, propionaldehído, glutaraldehído, butiraldehído, isobutiraldehído, 2-metil-butiraldehído, 3-metil-butiraldehído, 4 -metilpentaldehído, hexanaldehído, octanaldehído, fenilacetoaldehído, 2-fenil acetoaldehído, 2- (4-hidroxifenil) acetoaldehído, 2-indol-3- acetoaldehido, 5-amino-pentaldehído, succinato semialdehído, y succinato 4 -hidroxifenil acetaldehído, y combinaciones de las mismas.

En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de isobutiraldehído, y en donde el aldehido es isobutiraldehído . En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de butiraldehído, y en donde el aldehido es butiraldehído. En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona comprende una trayectoria de biosíntesis de hexanaldehído, y en donde el aldehido es hexanaldehído .

En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de aldolasa comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 51-82, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 51-82, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media. En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene la actividad de aldolasa comprende al menos una porción biológicamente activa seleccionada de las secuencias de aminoácido establecidas en SEQ ID NOS:223-244, 255-260.

En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de alcohol deshidrogenasa comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 33, o 83-96, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOSrl, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 33, o 83-96, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media. En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene la actividad de alcohol deshidrogenasa comprende al menos uno de un nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) , una NADH, fosfato de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP+) , o una porción enlazada a NADPH. En ciertas modalidades, la NAD+ , NADH, NADP+, o porción enlazada a NADPH se selecciona del grupo que consiste de Y-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO:245), Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO:246), Y-X-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO:247), Y-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO:248), Y-X-X-G-G-X-X-Y (SEQ ID NO:249), Y-X-X-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO : 250 ) , Y-X-G-X-Y (SEQ ID NO:251 ), Y-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:252), Y-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:253), e Y-X-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO:254); en donde Y se selecciona independientemente de alanina, glicina, y serina, en donde G es glicina, y en donde X se selecciona independientemente de un aminoácido codificado genéticamente.

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante comprende además al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble y/o al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de deshidratasa . En ciertas modalidades, al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa el polipéptido que tiene la actividad de reductasa de enlace doble comprende (i) una secuencia de nucleótido que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 35-50, o (ii) una secuencia de nucleótido que hibridiza al menos una secuencia de nucleótido establecida en SEQ ID NOS: 35-50, o un complemento de la misma, bajo condiciones de severidad media.

Las modalidades de la presente invención también se refieren generalmente a métodos para producir un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, que comprende hacer crecer un primer microorganismo recombinante con una fuente de un monosacárido apropiado u oligosacárido, en donde el primer microorganismo recombinante comprende, (i) una trayectoria de biosíntesis de aldehido o cetona, (ii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (iii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa, en donde al menos uno de los polinucleótidos es exógeno, por ello se produce el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo. En ciertas modalidades, la fuente del monosacárido apropiado u oligosacárido comprende un segundo microorganismo recombinante que es capaz de crecer en un polisacárido derivado de biomasa como la fuente única de carbono. En ciertas modalidades, el polisacárido derivado de biomasa es seleccionado de alginato y pectina.

Las modalidades de la presente invención también se refieren generalmente a métodos para producir un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, que comprende hacer crecer un microorganismo recombinante con un polisacárido derivado de biomasa, en donde el microorganismo recombinante es capaz de crecer en el polisacárido derivado de biomasa como la fuente única de carbono, y en donde el microorganismo recombinante comprende (i) una trayectoria de biosíntesis de aldehido o cetona, (ii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (iii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa, en donde al menos uno de los polinucleótidos es exógeno, por ello se produce el producto químico de uso generalizado, o el intermediario del mismo. En ciertas modalidades, el polisacárido derivado de biomasa es seleccionado de alginato y pectina.

Las modalidades de la presente invención también se refieren a microorganismos recombinantes, que comprenden (i) una trayectoria de biosíntesis de aldehido o cetona, (ii) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (iii) al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa . En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante es capaz de crecer en un polisacárido derivado de biomasa como la fuente única de carbono.

En ciertas modalidades, el microorganismo es seleccionado de Acetobacter aceti, Achromobacter, Acidiphilium, Acinetobacter, Actinomadura, Actinoplanes , Aeropyrum pernix, Agrobacterium, Alcaligenes, Ananas comosus (M) , Arthrobacter, Aspargillus niger, Aspargillus oryze, Aspergillus melleus, Aspergillus pulverulentus , Aspergillus saitoi, Aspergillus sojea, Aspergillus usamii, Bacillus alcalophilus , Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis , Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, Bifidobacterium, Brevibacillus brevis, Burkholdeha cepacia, Candida cylindracea, Candida rugosa, Carica papaya (L) , Cellulosimicrobium, Cephalospohum, Chaetomium erraticum, Chaetomium gracile, Clostridium, Clostridium butyricum, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Corynebacterium (glutamicum) , Corynebacteriura efficiens, Escherichia coli, Enterococcus , Erwina chrysanthemi , Gliconobacter, Gluconacetobacter, Haloarcula, Humicola insolens, Humicola nsolens, Kitasatospora setae, Klebsiella, Klebsiella oxytoca, Kluyve omyces , Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kocuria, Lactlactis, Lactobacillus , Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sake, Lactococcus, Lactococcus lactis, Leuconostoc, Metilocystis , Methanolobus siciliae, Methanogenium organophilum, Methanobactehum bryantii, Microbacterium imperiale, Micrococcus lysodeikticus , Microlunatus , Mucor javanicus, Mycobacterium, Myrothecium, Nitrobacter, Nitrosomonas , Nocardia, Papaya carica, Pediococcus, Pediococcus halophilus, Penicillium, Penicillium camemberti, Penicillium citrinum, Penicillium emersonii, Penicillium roqueforti, Penicillum lilactinum, Penicillum multicolor, Paracoccus pantotrophus , Propionibacterium, Pseudomonas, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas denithficans , Pyrococcus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus hohkoshii, Rhizobium, Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus Lindt, Rhizopus, Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhodococcus, Sccharomyces cerevisiae, Sclerotina libertina, Sphingobacterium multivorum, Sphingobium, Sphingomonas , Streptococcus , Streptococcus thermophilus Y-l, Streptomyces , Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, Streptomyces rubiginosus, Streptomyces violaceoruber, Streptoverticillium mobaraense, Tetragenococcus , Thermus, Thiosphaera pantotropha, Trametes, Trichoderma, Trichoderma Iongibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichosporon penicillatum, Vibrio alginolyticus , Xanthomonas , yeast, Zygosaccharomyces rouxii, Zymomonas, y Zymomonus mobilis .

Las modalidades de la presente invención también se refieren a productos químicos de uso generalizado producidos por cualquiera de los métodos o microorganismos recombinantes descritos en la presente. Ciertas modalidades también incluyen productos químicos de uso generalizado mezclados que comprenden cualquiera de los productos químicos de uso generalizado descritos en la presente y un producto de petróleo producido por refinado. En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado es seleccionado de isooctano, 2-etilhexano, y 2-butil-octano. En ciertas modalidades, el producto de petróleo producido por refinado es seleccionado de gasolina, combustible de aeronáutica, y combustible diesel.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un producto de petróleo producido por refinado enriquecido con producto químico de uso generalizado, que comprende (a) mezclar el producto de petróleo producido por refinado con cualquiera de los productos químicos de uso generalizado producidos por los métodos o microorganismos recombinantes descritos en la presente, por ello se produce el producto de petróleo producido por refinado enriquecido con producto químico de uso generalizado.

Descripción Detallada de la Invención Las modalidades de la presente invención se refieren al descubrimiento de que los microorganismos recombinantes pueden producirse por ingeniería para utilizar varios aldehidos y/o cetonas en la producción de una variedad de productos químicos de uso generalizado o biocombustibles . Por ejemplo, la inserción de uno o más polinucleótidos exógenos que codifican una enzima que tiene una actividad de aldolasa y uno o más polinucleótidos exógenos que codifican una enzima que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa pueden volver un microorganismo capaz de convertir aldehidos y/o cetonas en varios productos químicos de uso generalizado, o intermediarios de los mismos. En ciertos aspectos, estos productos químicos de uso generalizado pueden entonces convertirse además químicamente o enzimáticamente a otros productos químicos de uso generalizado, incluyendo biocombustibies . Tales biocombustibles pueden incluir, por ejemplo, alcanos de cadena media a larga, tal como isooctano y 2 -e ilhexano .

En ciertas modalidades, los métodos y microorganismos recombinantes proporcionados en la presente pueden ser utilizados para producir una variedad de productos químicos de uso generalizado, especialmente hidrocarburos de cadena media a larga. Por ejemplo, los microorganismos recombinantes de la presente invención pueden utilizarse generalmente para catalizar las siguientes reacciones: RI en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2)nCH2, CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , y CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2, CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2, en donde n = 0-30, y cualquiera de los alcanos correspondientes producidos de estos.

Típicamente, el primer químico de izquierda a derecha en la reacción ejemplificada arriba se produce a partir de la condensación de dos aldehidos y/o cetonas, que pueden ser las mismas o diferentes, y que pueden catalizarse por una enzima que tiene una actividad de aldolasa, como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Después de la etapa de. condensación de aldolasa, la primera etapa en la reacción ejemplificada arriba ocurre típicamente de forma espontánea, o puede catalizarse por una deshidratasa . La segunda reacción puede catalizarse por una reductasa de enlace doble endógena, o puede aumentarse por la adición de una reductasa de enlace doble exógena . La tercera reacción para producir el diol o alcohol puede catalizarse por una alcohol deshidrogenasa, como se describe en la presente y se conoce en la técnica. De esta manera, ciertos microorganismos recombinantes de la invención pueden comprender una exógeno aldolasa, opcionalmente una reductasa de enlace doble exógena, y/o una exógeno alcohol deshidrogenasa .

Como se nota arriba, el 2 , 2 , 4 -trimetilpentano, también conocido como isooctano, es un isómero de octano que define los 100 puntos en la escala de clasificación del octano, y representa un componente importante de la gasolina. Como una ilustración particular de la producción biológica in vivo de esta molécula, una trayectoria biosintética para producir isooctano puede iniciarse en un microorganismo recombinante que tiene acceso a una fuente de isobutiraldehído . En ciertas modalidades, el isobutiraldehído puede obtenerse a partir de un microorganismo recombinante que comprende una trayectoria de biosíntesis de isobutiraldehído, como se describe en la presente, y que puede convertir un monosacárido u oligosacárido apropiado a isobutiraldehído.

Brevemente, sin tener en cuenta la fuente de isobutiraldehído, un microorganismo recombinante de la invención puede utilizarse para condensar dos moléculas de isobutiraldehído para formar 3-hidroxi-2 , 2 , 4-trimetil pentanal, que se ha mostrado en la presente para catalizarse in vivo por un microorganismo recombinante que comprende una enzima exógena que tiene una actividad de aldolasa. En ciertas modalidades, 3-hidroxi-2 , 2 , 4-trimetil pentanal puede entonces reducirse rápidamente in vivo a 2 , 2 , 4 -trimetil- 1 , 3 -pentanodiol por un microorganismo recombinante que comprende una enzima exógena que tiene una actividad de alcohol deshidrogenasa (Adh) . De esta manera, en ciertas modalidades, un microorganismo recombinante comprende uno o más polinucleótidos que codifican una enzima de aldolasa y uno o más polinucleótidos que codifican una enzima de alcohol deshidrogenasa pueden utilizarse para sintetizar 3-hidroxi-2 , 2 , 4 -trimetil pentanal y 2 , 2 , 4 -trimetil-1 , 3 -pentanodiol a partir de una fuente de isobutiraldehído, que puede entonces convertirse además a isooctano.

Para las etapas finales en la producción de isooctano, si se desea, el 2 , 2 , 4-trimetil-l , 3 -pentanodiol puede entonces convertirse a 2 , 2 , 4 -trimetilpentano, o isooctano, por varios procesos, tales como procesos químicos o enzimáticos. Un ejemplo de tal proceso incluye "hidrotratamiento," como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Como un ejemplo adicional de convertir un aldehido o cetona a un producto químico de uso generalizado, un microorganismo recombinante proporcionados en la presente puede utilizarse para condensar dos moléculas de butiraldehído para formar 3-hidroxi-2-etilhexanal, que se ha mostrado en la presente para catalizarse in vivo por un microorganismo recombinante que comprende una enzima exógena que tiene una actividad de aldolasa. El 3-hidroxi-2-etilhexanal puede entonces deshidratarse espontáneamente o enzimáticamente para formar 2-etil-2-hexen-l-al , como también se describe en la presente. En ciertas modalidades, el 2-etil-2-hexen-l-al pueden entonces reducirse consecutivamente para formar 2 -etilhexanal y 2-etilhexanol, catalizarse por una reductasa de enlace doble y un alcohol deshidrogenasa, respectivamente (ver Ejemplo 4) . Para la etapa final, si se desea, el 2-etilhexanol puede entonces convertirse a 2-etilhexano de acuerdo a técnicas conocidas en el arte y descritas en la presente, tal como por conversión química o enzimática (por ejemplo, hidrotratamiento). De esta manera, en ciertas modalidades, un microorganismo recombinante comprende uno o más polinucleótidos exógenos que codifican una enzima de aldolasa y uno o más polinucleótidos exógenos que codifican una enzima de alcohol deshidrogenasa pueden utilizarse para sintetizar 2-etil-2-hexen-l-al y 2-etilhexanol a partir de una fuente de butiraldehído, que puede entonces convertirse a 2-etilhexano . En ciertas modalidades, el butiraldehído puede obtenerse a partir de un microorganismo recombinante que comprende una trayectoria de biosíntesis de butiraldehído, como se describe en la presente, y que puede convertir un monosacárido u oligosacárido a butiraldehído.

Los métodos descritos en la presente producen biocombustibles con ventajas importantes sobre otros biocombustibles . En particular, el isoctano y otros alcanos de cadena media a larga proporcionan un número de ventajas importantes sobre los biocombustibles comunes existentes, tales como etanol y butanol, son reemplazos de larga duración atractivos de combustibles basados en petróleo tal como gasolina, diesel, queroceno, y petróleos pesados en el futuro. Como un ejemplo, el isooctano y otros alcanos de cadena media a larga y alcoholes son componentes principales en todos los productos de petróleo y combustible de aeronáutica en particular, y por lo tanto los alcanos que se han producido pueden utilizarse directamente por los motores existentes. A modo de ejemplo adicional, los alcoholes de cadena media a larga son combustibles mucho mejores que el etanol, y tienen una densidad de energía casi comparable a la gasolina. Como se nota arriba, el isooctano es un componente principal de la gasolina.

Como otro ejemplo, los n-alcanos son componentes principales de todos los productos de petróleo incluyendo gasolina, diesel, queroseno, y petróleos pesados. Los microorganismos recombinantes pueden usarse para producir n-alcanos con diferentes intervalos de longitudes de carbono, por ejemplo, a partir de C7 hasta arriba de C20: C7 para gasolina (por ejemplo, vehículos de motor) , C10-C15 para diesel (por ejemplo, vehículos de motor, trenes, y barcos), y C8-C16 para queroseno (por ejemplo, aviación y barcos) , y para todos los petróleos pesados.

Ciertas modalidades de la presente invención se refieren generalmente a métodos para producir isooctano y otros alcanos de cadena media a larga a partir de materia prima derivada de biomasa, proporcionando por ello una fuente biocombustibles baja en carbono. Por ejemplo, al producir un producto químico de uso generalizado o biocombustible (por ejemplo, isooctano) a partir de biomasa, un monosacárido u oligosacárido derivado de biomasa apropiado puede obtenerse primero directamente a partir de cualquier fuente disponible, tal como un microorganismo que es capaz de crecer en un polisacárido derivado de biomasa, tal como pectina o alginato, como la fuente única de carbono. Este monosacárido u oligocacchahde puede entonces convertirse a un aldehido y/o cetona al poner en contacto tal monosacárido u oligosacárido con un microorganismo recombinante que comprende una trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona.

El aldehido y/o cetona producido por tal microorganismo recombinante puede entonces convertirse a un producto químico de uso generalizado o biocombustible al poner en contacto tal aldehido y/o cetona con un microorganismo recombinante de la presente invención, tal como un microorganismo que comprende tanto una enzima de aldolasa y una enzima de alcohol deshidrogenasa . En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante que comprende la trayectoria de biosíntesis de aldehido y/o cetona puede ser el mismo o diferente como el microorganismo recombinante que comprende la enzima de aldolasa y la enzima de alcohol deshidrogenasa.

Entre otros usos aparentes a una persona experta en la técnica, los productos químicos de uso generalizado y biocombustibles producidos por los métodos y microorganismos recombinantes descritos en la presente pueden utilizarse por las refinerías de petróleo existentes para mezclarse con productos de petróleo producidos por métodos de refinería tradicionales, para producir productos químicos de uso generalizado enriquecidos, productos de petróleo producidos por refinado. Para este punto, como se nota arriba, los productores de combustible han buscado combustibles bajos en carbono, sustancialmente similares, que pueden mezclarse y distribuirse a través de la infraestructura existente (refinerías, tuberías, pipas) . Como hidrocarburos, los productos químicos de uso generalizado producidos de acuerdo con los métodos en la presente son sustancialmente similares a los combustibles derivados de petróleo, reducen las emisiones de gas de invernadero por más de 80% de combustibles derivados de petróleo, y son compatibles con la infraestructura existente en la industria de petróleo y gas.

Por ejemplo, ciertos productos químicos de uso generalizado producidos en la presente, que incluyen, por ejemplo, isooctano, entre otros, se mezclan directamente en los productos de petróleo producidos por refinado, tal como gasolina, combustibles de aeronáutica y diesel. Al usar tales productos químicos de uso generalizado biológicamente producidos como una mezcla de abastecimiento para gasolina, combustibles de aeronáutica y diesel, las refinerías pueden reducir las emisiones de Gas de Invernadero por más del 80%.

La práctica de la presente invención empelara, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia de la técnica, muchas de las cuales se describen enseguida para el propósito de ilustración. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da Edición, 1989) ; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol . I y 11 (D. Glover, ed. ) ; Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. , 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds . , 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984) ; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed. , 1984) .

Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece. Aunque pueden usarse cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente en la práctica o prueba de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los propósitos de la presente invención, se definen enseguida los siguientes términos. Todas las referencias a las que se refieren en la presente se incorporan por referencia en su totalidad.

Los artículos "el/la" y "un/una" se usan en la presente para referirse a uno o a más de uno (es decir a al menos uno) del objeto del artículo gramático. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por "alrededor de" significa una cantidad, nivel, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía por tanto como 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o l % a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

El término "fragmento biológicamente activo, " como aplica a fragmentos de una secuencia de polinucleótido o polipéptido de referencia, se refiere a un fragmento que tiene al menos alrededor de 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% o más de la actividad de una secuencia de referencia.

El término "secuencia de referencia" se refiere generalmente a una secuencia que codifica el ácido nucleico, o secuencia de aminoácido, de cualquier polipéptido o enzima que tiene una actividad biológica descritos en la presente (por ejemplo, aldolasa, alcohol deshidrogenasa , deshidratasa, diol deshidrogenasa, reductasa de enlace doble etc.), tal como una secuencia "tipo natural", incluyendo aquellas secuencias de polinucleótido y referencia del polipéptido ejemplificadas por SEQ ID NOS: 1-96 y 215-222, e incluyendo aquellas secuencias de porción ejemplificadas por SEQ ID NOS: 223 -260. Una secuencia de referencia también puede incluir variantes funcionales, que se presentan naturalmente (es decir, ortólogos u homólogos) de secuencias descritas en la presente.

Incluido dentro del alcance de la presente invención, están fragmentos biológicamente activos de al menos alrededor de 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 500, 600 o más nucleótidos contiguos o residuos de aminoácido en longitud, incluyendo todos los enteros entre, que comprenden o codifican un polipéptido que tiene una actividad enzimática de un polinucleótido o polipéptido de referencia. Los fragmentos biológicamente activos representativos participan generalmente en una interacción, por ejemplo, una interacción intra-molecular o inter-molecular . Una interacción intermolecular puede ser una interacción de enlace específico o una interacción enzimática. Los ejemplos de interacciones o actividades enzimáticas incluyen actividades de aldolasa, actividades de alcohol deshidrogenasa, actividades de deshidratasas , actividades de liasa, actividades de de transportador, actividades de isomerasa, actividades de cinasa, entre otras descritas en la presente. Los fragmentos biológicamente activos típicamente comprenden uno o más sitios activos o porciones enzimáticas/de enlace, como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Una "biomolécula" se refiere generalmente a una molécula orgánica que es producida por un organismo vivo, incluyendo moléculas poliméricas grandes (biopolímeros) tales como proteínas, polisacáridos , y ácidos nucleicos también, como moléculas pequeñas tales como metabolitos primarios secundarios, lípidos, fosfolípidos , glicolípidos , esteróles, glicerolípidos , vitaminas, y hormones. Las moléculas orgánicas (por ejemplo, biomoléculas) consisten primariamente de carbono e hidrógeno, nitrógeno, y oxígeno, y, a una extensión más pequeña, fósforo y azufre, aunque pueden incorporarse otros elementos en una biomolécula.

Un "biopolímero" se refiere generalmente a una molécula grande o macromolécula compuesta de unidades estructurales repetidas, que se conectan típicamente por enlaces químicos covalentes, y que pueden ser producidas por organismos vivos. Los ejemplos de biopolímeros incluyen, sin limitación, polisacáridos, ácidos nucleicos, y proteínas.

Por "secuencia de codificación" significa cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuye al código para el producto de polipéptido de un gen. En contraste, el término "secuencia de no de codificación" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuye al código para el producto de polipéptido de un gen.

A través de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, las palabras, "comprende," "que comprende" y "comprendido" se entenderá que implica la inclusión de una etapa indicada o elemento o grupo de etapas o elementos pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.

Por "consiste de" significa incluir, y limitar a, lo que sigue a la frase "consiste de" . De esta manera, la frase "consiste de" indica que los elementos enlistados se requieren o son obligatorios, y que no pueden presentarse otros elementos.

Por "consiste esencialmente de" significa incluir cualquiera de los elementos enlistados después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enlistados. De esta manera, la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos enlistados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no presentarse dependiendo de si o no afectan la actividad o acción de los elementos enlistados.

Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionada por las reglas de emparejamiento de base. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T," es complementaria a la secuencia "T-C-A." Complementario puede ser "parcial," en lo cual sólo algunos de las bases de ácidos nucleicos se alinean de acuerdo con las reglas de emparejamiento de base. 0, estas pueden ser complementarias de forma "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las hebras de ácido nucleico tiene efectos importantes en la eficiencia y fuerza de hibridización entre hebras de ácido nucleico.

Por "corresponde a" o "que corresponde a" significa (a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido que es sustancialmente idéntica o complementaria a todo o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia o que codifican una secuencia de aminoácido idéntica a una secuencia de aminoácido en un péptido o proteína; o (b) un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína de referencia.

Por "derivado" significa un polipéptido que se ha derivado a partir de la secuencia básica por modificación, por ejemplo por conjugación o formación de complejo con otras porciones químicas (por ejemplo, pegilación) o por técnicas de modificación post-traduccional como se entendería en la técnica. El término "derivado" también incluye dentro de su alcance alteraciones que se han hecho a una secuencia precursora que incluye adiciones o eliminaciones que se proporcionan para moléculas funcionalmente equivalentes.

Por "condiciones que reactivan la enzima" significa que cualquiera de las condiciones necesarias están disponibles en un ambiente (es decir, factores tales como temperatura, pH, carencia de sustancias inhibidoras) que permitirán que la enzima funcione. Las condiciones de reactivación de enzima pueden ser ya sea in vitro, tal como en un tubo de prueba, o in vivo, tal como dentro de una célula.

Como se usa en la presente, los términos "función" y "funcional" y similares se refiere a una función biológica o enzimática.

Por "genes" significa una unidad de herencia que ocupa una ubicación específica en el cromosa y consiste de secuencias reguladoras transcripcional y/o traduccional y/o una región de codificación y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3').

"Homología" se refiere al número en porcentaje de aminoácidos que son idénticos o constituye sustituciones conservadoras . La homología puede determinarse usando programas de comparación de secuencia tales como GAP (Deveraux et "al, 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395) que se incorpora en la presente para referencia. De esta manera, las secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente a aquellas citadas en la presente pudieran compararse por inserción de espacios en la alineación, tales espacios se determinan, por ejemplo, por algoritmo de comparación usado por GAP.

El término "célula hospedera" incluye una célula individual o cultivo celular que puede o que ha recibido cualquiera de los vectores recombinantes o polinucleótido aislado de la invención. Las células hospederas incluyen progenie de una célula hospedera sencilla, y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula precursora original debido a la mutación y/o cambio natural, accidental, o deliberado. Una célula hospedera incluye células transíectadas , transformadas, o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedera que comprende un vector recombinante de la invención es una célula hospedera recombinante, célula recombinante, o microorganismo recombinante .

Por "aislado" significa un material que es sustancialmente o esencialmente libre de componentes que acompañan normalmente su estado natural. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido, que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado que se presenta naturalmente, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha removido de las secuencias que son normalmente adyacentes al fragmento. Alternativamente, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado" y similares, como se usa en la presente, se refiere a aislado y/o purificación in vitro de una molécula de péptido o polipéptido de su ambiente celular natural, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no se asocia con sustancias in vivo.

Por "aumento," "aumentado," "incremento," o "incrementado" significa la capacidad de uno o más microorganismos recombinantes para producir una mayor cantidad de un producto o molécula dado (por ejemplo, producto químico de uso generalizado, biocombustible , o producto intermediario del mismo) como se compara con un microorganismo de control, tal como un microorganismo no modificado o un microorganismo modificado diferentemente. Una cantidad "incrementada" es típicamente una cantidad "estadísticamente importante", y puede incluir un incremento que es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más veces (incluyendo todos los enteros y puntos decimales entre estos, por ejemplo, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, etc.) la cantidad producida por un microorganismo no modificado o un microorganismo modificado diferentemente. Una cantidad incrementada puede medirse de acuerdo con técnicas de rutina en el arte. Por ejemplo, una cantidad "incrementada" de un producto químico de uso generalizado puede medirse de acuerdo con un porcentaje de un rendimiento máximo teórico. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los métodos de la presente invención pueden aumentar el redimiento de una molécula objetivo (por ejemplo, producto químico de uso generalizado) a al menos alrededor de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de un rendimiento máximo teórico. En ciertas modalidades, el método puede caracterizarse al incrementar el porcentaje del rendimiento máximo teórico de la molécula objetivo por al menos alrededor de 10% (por ejemplo, a partir de alrededor de 30% hasta alrededor de 40% del rendimiento máximo teórico) , 15% (por ejemplo, a partir de alrededor de 30% hasta alrededor de 45%), 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% como se compara con la incubación del mismo microorganismo recombinante bajo condiciones de control o diferentes, o como se compara con la incubación de un microorganismo de control (por ejemplo, no modificado o modificado diferentemente) bajo las mismas o similares condiciones .

El término "reduce" se refiere generalmente a una "distribución" en una respuesta celular importante, tal como NADH o producción de acetato, como se mide de acuerdo con técnicas de rutina en la técnica diagnóstica. Otras respuestas celulares importantes (in vivo o in vitro) serán evidentes para personas expertas en la técnica. Una "disminución" en una respuesta puede ser cantidad "estadísticamente importante" como se compara con la respuesta producida por un microorganismo no modificado o un microorganismo modificado diferentemente, o por un microorganismo que crece bajo diferentes condiciones, y pueden incluir una disminución de 1%, 2% , 3%, 4%, 5% , 6% , 7% 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19% 20%, 25%, 30%, 35% , 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% , 70%, 75% 80%, 85%, 90%, 95%, o 100%, incluyendo todos los enteros en medio.

Por "obtenido de" significa que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto de polinucleótido o extracto de polipéptido se aisla de, o deriva de, una fuente particular, tal como un organismo deseado, típicamente un microorganismo. "Obtenido de" también puede referirse a la situación en la cual una secuencia de polinucleótido o polipéptido se aisla de, o deriva de, un organismo particular o microorganismo. Por ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de liasa de benzaldehído se puede aislar a partir de una variedad de microorganismos procarióticos o eucarióticos , tal como Pseudomonas . Como otro ejemplo, una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima de aldolasa se puede aislar a partir de una variedad de microrganismos procarióticos o eucarióticos, tal como Thermotoga marítima y Escherichia coli DH10B.

El término "ligado operativamente" como se usa en la presente significa colocar un gen bajo el control regulador de un promotor, que luego controla la transcripción y opcionalmente la traducción del gen. En la construcción de combinaciones de promotor heterólogo/gen estructural, generalmente se prefiere la posición de la secuencia genética o promotor en una distancia a partir del sitio de inicio de la transcripción de gen que es aproximadamente la misma como la distancia entre esa secuencia genética o promotor y el gen que controla en su entorno natural; esto es, el gen a partir del cual la secuencia genética o promotor se deriva. Como se conoce en la técnica, alguna variación en esa distancia se puede acomodar sin pérdida de la función. Similarmente , la posición preferida de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo para colocarse bajo su control se define por el posicionamiento del elemento en su entorno natural; es decir, los genes a partir de los cuales esto se deriva. Los "promotores constitutivos" son típicamente activos, es decir, promueven la transcripción, en la mayoría de las condiciones. Los "promotores inducibles" son típicamente activos únicamente bajo ciertas condiciones, tal como en la presencia de un factor de molécula determinada (por ejemplo, IPTG) o una condición ambiental dada (por ejemplo, concentración de C02, niveles de nutriente, luz, calor) . En ausencia de tal condición, los promotores inducibles típicamente no permiten niveles importantes o medibles de actividad transcripcional.

La recitación "polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa en la presente designa mARN, ARN, cARN, rARN, cADN o ADN. El término se refiere típicamente a forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases en longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de hebra sencilla y doble de ADN.

Como se entenderá por aquellos expertos en la técnica, las secuencias de polinucleótido de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias extra-genómicas y codificadas por plásmido y segmentos de gen producidos por ingeniería más pequeños que expresan, o pueden adaptarse para expresar, proteínas, polipéptidos , péptidos y similares. Tales segmentos pueden aislarse naturalmente, o modificarse sintéticamente por la mano del hombre.

Los polinucleótidos puede ser de hebra sencilla (codificados o antisentido) o hebra doble, y puede ser moléculas de ADN (genómico, cADN o sintético) o moléculas ARN. Las secuencias de codificación o no codificación adicionales pueden, pero no necesitan, presentarse dentro del polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no necesita, ligarse a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa o pueden comprender una variante, o un equivalente funcional biológico de tal secuencia. Las variantes de polinucleótido puede contener una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones e/o inserciones, como se describe además enseguida, preferiblemente tal actividad enzimática del polipéptido codificado no se disminuye sustancialmente con relación al polipéptido no modificado, y preferiblemente tal actividad enzimática del polipéptido codificado se mejora (por ejemplo, optimiza) con relación al polipéptido no modificado. El efecto en la actividad enzimática del polipéptido, codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente.

En ciertas modalidades, la presente invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden varias longitudes de extensiones contiguas de secuencia idéntica a o complementaria a una aldolasa o un alcohol deshidrogenasa, entre otras descritas en la presente, en donde los polinucleótidos aislados codifican una enzima truncada, biológicamente activa.

Las secuencias de nucleótidos ejemplares que codifican las enzimas de la solicitud abarcan aldolasas de longitud completa y alcohol deshidrogenasas , así como proporciones de la longitud completa o secuencias de nucleótido de longitud sustancialmente completa de estos genes o sus transcriptor o copias de ADN de estos transcriptos. Las porciones de una secuencia de nucleótido pueden codificar porciones de polipeptido o segmento que mantiene la actividad biológica del polipéptido de referencia. Una porción de una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento biológicamente activo de una enzima proporcionados en la presente puede codificar al menos alrededor de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 600, o más residuos de aminoácido contiguos, casi al número total de aminoácidos presente en una enzima de longitud completa. Se entenderá fácilmente que "longitudes intermedias," en este contexto y en todos los otros contextos usados en la presente, significa cualquier longitud entre los valores citados, tal como 101, 102, 103, etc.; 151, 152, 153, etc.; 201, 202, 203, etc.

Los polinucleótidos de la presente invención, sin tener en cuenta la longitud de la secuencia de codificación por sí misma, puede combinarse con otras secuencias de ADN, tal como promotores, señales de poliadenilación, sitios de restricción de enzima adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos de codificación, y similares, de tal manera que su longitud general puede variar considerablemente. Por lo tanto se contempla que el fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud puede emplearse, con la longitud total preferiblemente se limita por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante pretendido.

Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" y similares se refiere a polinucleótidos que exhiben identidad de secuencia sustancial con cualquiera de las secuencias de polinucleótido de referencia o genes descritos en la presente, y a polinucleótidos que hibridiza con cualquier secuencia de referencia de polinucleótido descrita en la presente, o cualquier secuencia de codificación de polinucleótido de cualquier gen o polipéptido referido en la presente, bajo condiciones de severidad baja, severidad media, severidad alta, o severidad muy alta que se definen de aquí en adelante y se conocen en la técnica. Estos términos también abarcan polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, eliminación o sustitución de al menos un nucleótido. En consecuencia, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los cuales uno o más nucleótidos se han agregado o eliminado, o reemplazado con diferentes nucleótidos. A este respecto, está bien entendido en el arte que ciertas alteraciones incluyendo mutaciones, adiciones, eliminaciones y sustituciones pueden hacerse a un polinucleótido de referencia por ello el polinucleótido alterado mantiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia, o tiene actividad incrementada con relación al polinucleótido de referencia (es decir, optimizado) . Variantes de polinucleótido incluyen, por ejemplo, polinucleótidos que tienen al menos 50% (y al menos 51 % hasta al menos 99% y todos los porcentajes enteros entre estas) de identidad de secuencia con un polinucleótido de referencia descrito en la presente.

Los términos "variante de polinucleótido" y "variante" también incluyen variantes alélicas que se presentan naturalmente que codifican estas enzimas. Los ejemplos de variantes que se presentan naturalmente incluyen variantes alélicas (misma ubicación) , homólogos (ubicación diferente) , y ortólogos (organismo diferente) . Variantes que se presentan naturalmente tal como estas pueden identificarse y aislarse usando técnicas de biología molecular bien conocidas que incluyen, por ejemplo, varias técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) y basadas en hibridización como se conoce en el arte. Las variantes que se presentan naturalmente pueden aislarse de cualquier organismo que codifica uno o más genes que tienen actividad enzimática apropiada descrita en la presente (por ejemplo, ligasa C-C, aldolasa, alchohol deshidrogenasa , reductasa, etc) .

Las variantes que se presentan naturalmente pueden hacerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a polinucleótidos, células, u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, eliminaciones, inversiones e inserciones de nucleótido. Puede ocurrir variación en cualquiera o ambas de las regiones codificada y no codificada. En ciertos aspectos, las variantes que no se presentan naturalmente pueden optimizarse para uso en un microorganismo dado (por ejemplo, E. coli) , tal como al producir por ingeniería y seleccionar las enzimas para actividad incrementada, estabilidad, o cualquier otra característica deseable. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácido conservadoras y no conservadoras (en comparación con el producto codificado originalmente. Para secuencias de nucleótido, las variantes conservadoras incluyen aquellas secuencias que, debido a la degradación del código genético, codifican la secuencia de aminoácido de un polipéptido de referencia. Las secuencias de variante de nucleótido también incluyen secuencias de nucleótido derivadas sintéticamente, tal como aquellas generadas, por ejemplo, al usar mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifica un polipéptido biológicamente activo.

Generalmente, las variantes de una secuencia de nucleótido de referencia particular puede tener al menos alrededor de 30%, 40% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos alrededor de 75%, 80%, 85%, 90% hasta 95% o más, y aún alrededor de 97% o 98% o más de identidad de secuencia con tal secuencia de nucleótido particular como se determina por los programas de alineación de secuencia descritos en otro lugar en la presente usando parámetros predeterminados.

La aldolasa, alcohol deshidrogenasa, reductasa de enlace doble, y otras secuencias de referencia de nucleótido conocidas pueden usarse para aislar secuencias correspondientes y alelos a partir de otros organismos, particularmente otros microorganismos. Los métodos están fácilmente disponibles en la técnica para la hibridización de secuencias de ácido nucleico. Las secuencias que codifican a partir de otros organismos pueden aislarse de acuerdo a técnicas bien conocidas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias de codificación establecidas en la presente. En estas técnicas todo o parte de la secuencia de codificación conocida se usa como una sonda que hibridiza selectivamente otras secuencias de codificación de referencia presentes en una población de fragmentos de ADN genómicos clonados o fragmentos de cADN (es decir, colecciones genómicas o cADN) a partir de un organismo elegido.

La presente invención también contempla polinucleotidos que hibridizan a la aldolasa, alcohol deshidrogenasa , reductasa de enlace doble, u otras secuencias de nucleótido de referencia, o a sus complementos, bajo condiciones de severidad descritas abajo. Como se usa en la presente, el término "hibridiza bajo condiciones de severidad baja, severidad media, severidad alta, o severidad muy alta" describe condiciones para hibridización y lavado. La guía para realizar reacciones de hibridización puede encontrarse en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Secciones 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en tal referencia y cualquiera puede usarse.

La referencia en la presente a condiciones de "severidad baja" incluye y abarca de al menos alrededor de 1 % v/v a al menos alrededor de 15% v/v de formamida y a partir de al menos alrededor de 1 M hasta al menos alrededor de 2 M de sal para hibridización a 42 °C, y al menos alrededor de 1 M hasta al menos alrededor de 2 M sal para lavado a 42 °C. Las condiciones de severidad baja también pueden incluir Albúmina de Suero de Bovino al 1% (BSA) , EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS al 7% para hibridización a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS al 0.1 %; o (ii) BSA al 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS al 5% para lavado a temperatura ambiente. Una modalidad de condiciones de severidad baja incluye hibridización en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a alrededor de 45°C, seguido por dos lavado en 0.2 x SSC, SDS al 0.1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede incrementarse hasta 55°C para condiciones de severidad baja) .

Condiciones de "severidad media" incluyen y abarcan a partir de al menos alrededor de 16% v/v hasta al menos alrededor de 30% v/v de formamida y a partir de al menos alrededor de 0.5 M hasta al menos alrededor de 0.9 M de sal para hibridización a 42°C, y al menos alrededor de 0.1 M hasta al menos alrededor de 0.2 M de sal para lavado a 55 °C.

Las condiciones de severidad media también pueden incluir Albúmina de Suero de Bovino al 1% (BSA) , EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS al 7% para hibridización a 65° C, y (i) 2 x SSC, SDS al 0.1 % ; o (ii) BSA al 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS al 5% para lavado a 60-65°C. Una modalidad de condiciones de severidad media incluye hibridizar en 6 x SSC a alrededor de 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS al 0.1 % a 60°C.

Condiciones de "severidad alta" incluyen y abarcan a partir de al menos alrededor de 31 % v/v hasta al menos alrededor de 50% v/v formamida y a partir de alrededor de 0.01 M hasta alrededor de 0.15 M de sal para hibridización a 42 °C, y alrededor de 0.01 M hasta alrededor de 0.02 M de sal para lavado a 55 °C. Las condiciones de severidad alta también pueden incluir BSA al 1 %, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS al 7% para hibridización a 65°C, y (i) 0.2 x SSC, SDS al 0.1 %; O (ii) BSA al 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), 1 % SDS para lavado a una temperatura en exceso de 65 °C. Una modalidad de condiciones de severidad alta incluye hibridizar en 6x SSC- a alrededor de 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS al 0.1 % a 65°C.

Una modalidad de condiciones de "severidad muy alta" incluye hibridizar en fosfato de sodio 0.5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS al 1 % a 65°C.

Otras condiciones de severidad son bien conocidas en la técnica y un destinatario experto reconocerá que pueden manipularse varios factores para optimizar la especificidad de la hibridización . La optimización de la severidad de los lavados finales puede servir para asegurar un alto grado de hibridización. Para ejemplos detallados, ver Ausubel et al., supra en las páginas 2.10.1 hasta 2.10.16 y Sambrook et al, Current Protocols in Molecular Biology (1989) , en las secciones 1.101 hasta 1.104.

Aunque se llevan a cabo los lavados rigurosos a temperaturas desde alrededor de 42°C hasta 68°C, alguien experto en la técnica apreciará que pueden ser apropiadas otras temperaturas para condiciones rigurosas. La relación de hibridización máxima ocurre típicamente a alrededor de 20° C hasta 25° C debajo del Tm para formación de un híbrido ADN-ADN. Es bien conocido en la técnica que el Tm es la temperatura de fusión, o temperatura a la cual dos secuencias de polinucleótido se disocian. Los métodos para estimar el Tm son bien conocidos en la técnica (ver Ausubel et al., supra en la página 2.10.8).

En general, el Tm de un doble perfectamente alineado de ADN puede predecirse como una aproximación por la fórmula: Tm = 81.5 + 16.6 (log10 M) + 0.41 (%G+C) - 0.63 (% formamida) - (600/longitud) en donde: M es la concentración de Na+, preferiblemente en el intervalo de 0.01 molar hasta 0.4 molar; %G+C es la suma de bases de guanosina y citosina como un porcentaje del número total de bases, dentro del intervalo entre 30% y 75% G+C; el % formamida es el porcentaje de concentración de formamida por volumen; longitud es el número de pares base en el doble ADN. El Tm de un ADN doble se reduce por aproximadamente 1°C con cada incremento del 1 % en el número de pares base desalineados aleatoriamente. Los lavados se llevan a cabo generalmente a Tm - 15 °C para severidad alta, o Tm - 30°C para severidad moderada.

En un ejemplo de un procedimiento de hibridización, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado se hibridiza durante la noche a 42° C en una solución amortiguadora de hibridización (formamida desionizada al 50%, 5 x SSC, 5 x solución de einhardt (fecal al 0.1 %, polivinilpirrolidona al 0.1 % y albúmina de suero de bovino al 0.1 %) , SDS al 0.1 % y 200 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) que contiene una sonda etiquetada. La membrana se somete entonces a dos lavados de severidad media secuenciales (es decir, 2 x SSC, SDS al 0.1 % por 15 min a 45°C, seguido por 2 x SSC, SDS al 0.1 % por 15 min a 50°C) , seguido por dos lavados de severidad más alta secuenciales (es decir, 0.2 x SSC, SDS al 0.1 % por 12 min a 55°C seguido por 0.2 x SSC y solución de SDS al 0.1 % por 12 min a 65-68°C. con base en lo anterior, las modalidades de la presente invención incluyen microorganismos recombinantes que comprenden una secuencia de polinucleótido que hibridiza al complemento de cualquiera de las secuencias de polinucleótido de referencia descritas en la presente, tal como una secuencia de polinucleótido que codifica una aldolasa o una enzima de alcohol deshidrogenasa, bajo condiciones de severidad media, alta, o muy alta, como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Los polinucleótidos y fusiones de los mismos pueden prepararse, manipularse y/o expresarse usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en el arte. Por ejemplo, las secuencias de polinucleótido que codifican polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de los mismos, pueden usarse en moléculas de ADN recombinantes para dirigir la expresión de una enzima seleccionada en células hospederas apropiadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de ADN que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácido o una funcionalmente equivalente puede producirse y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como se entenderá por aquellos de habilidad en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido que poseen codones que no se presentan naturalmente. Por ejemplo, los codones preferidos por un hospedero procariótico o eucariótico particular pueden seleccionarse para incrementar la velocidad de expresión de proteína o para producir un transcripto de AR recombinante que tiene propiedades deseables, tal como una vida media que es más larga que la de un transcripto generado a partir de la secuencia que se presenta naturalmente. Tales nucleótidos se refieren típicamente como "optimizados por codón" . Cualquiera de las secuencias de nucleótido descritas en la presente pueden utilizarse en tal forma #optimizada por codón" .

Por otro lado, las secuencias de polinucleótido de la presente invención pueden producirse por ingeniería usando métodos generalmente conocidos en el arte con objeto de alterar las secuencias que codifican el polipéptido por una variedad de razones, que incluyen pero no se limitan a, alternaciones que modifican la clonación, procesamiento, expresión y/o actividad del producto de gen.

Con objeto de expresar un polipéptido deseado, la secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido, o un equivalente funcional, puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Los métodos que son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control transcripcional y traduccional apropiados. Estos elementos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Tales técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989) .

Las células hospederas transformadas con una secuencia de polinucleótido de interés pueden cultivarse bajo condiciones apropiadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir de cultivo celular. La proteína producida por una célula recombinante puede secretarse o contener intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como se entenderá por aquellos de experiencia en el arte, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención pueden diseñarse para contener secuencias de señal con localización dirigida del polipéptido codificado a un sitio deseado dentro de la célula. Otras construcciones recombinantes pueden usarse para unir secuencias que codifican el polipéptido de interés a la secuencia de nucleótido que codifica un dominio de polipéptido que dirigirá la secreción de la proteína codificada.

Las modalidades de la presente invención contemplan el uso de microorganismos recombinantes que comprenden "polipéptidos" que tienen una actividad de aldolasa, actividad de alcohol deshidrogenasa, actividad de reductasa de enlace doble, u otra actividad descrita en la presente, incluyendo polipéptidos truncados, variantes y/o modificados de los mismos, para producir productos químicos de uso generalizado. "Polipéptido," "fragmento de polipéptido, " "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácido y a variantes y análogos sintéticos del mismo. De esta manera, estos términos aplican a polímeros de aminoácido en los cuales uno o más residuos de aminoácido son aminoácidos sintéticos que no se presentan naturalmente, tal como un análogo químico de un aminoácido que se presenta naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácido que se presentan naturalmente. En ciertos aspectos, los polipéptidos pueden incluir polipéptidos enzimáticos, o "enzimas," que catalizan típicamente (es decir, incrementan la velocidad de) varias reacciones químicas .

La recitación "variante" de polipéptido se refiere a polipéptidos que se distinguen de una secuencia de polipéptido de referencia por la adición, eliminación o sustitución de al menos un residuo de aminoácido. En ciertas modalidades, una variante de polipéptido puede distinguirse a partir de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservadoras o no conservadoras. En ciertas modalidades, la variante de polipéptido comprende sustituciones conservadoras y, a este respecto, está bien entendido en el arte que algunos aminoácidos pueden cambiarse por otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido. Las variantes de polipéptido también abarcan polipéptidos en los cuales uno o más aminoácidos se han agregado o eliminado, o reemplazado con diferentes residuos de aminoácido.

Las proteínas variantes abarcadas por la presente solicitud son "biológicamente activas," esto es, continúan manteniendo la actividad enzimática de un polipéptido de referencia. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una secuencia de polipéptido de referencia o fragmento del mismo pueden tener al menos alrededor de 40%, 50%, 60%, 70%, generalmente al menos alrededor de 75%, 80%, 85%, usualmente alrededor de 90% hasta 95% o más, y típicamente alrededor de 98% o más similitud de secuencia o identidad con la secuencia de aminoácido para una proteína de referencia como se determina por los programas de alineación de secuencia descritos en otro lado en la presente usando parámetros predeterminados. Una variante biológicamente activa de un polipéptido de referencia puede diferir de tal proteína generalmente por tanto como 200, 100, 50 o 20 residuos de aminoácido o de forma apropiada por tan poco como 1-15 residuos de aminoácido, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2, o aún 1 residuo de aminoácido. En algunas modalidades, un polipéptido variante difiere de una secuencia de polipéptido de referencia por al menos uno pero menos de 15, 10 o 5 residuos de aminoácido. En otras modalidades, difiere a partir de las secuencias de referencia por al menos un residuo pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% del residuo.

La presente invención contempla el uso en los métodos descritos en la presente de las variantes de polipéptidos de referencia de longitud completa que tienen cualquiera de las actividades enzimáticas descritas en la presente (por ejemplo, aldolasa, alcohol deshidrogenasa, reductasa de enlace doble etc.), fragmentos truncados de estos polipéptidos de longitud completa, las variantes de fragmentos truncados, así como sus fragmentos biológicamente activos relacionados. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido pueden participar en una interacción, por ejemplo, una interacción intra-molecular o inter-molecular . Una interacción inter-molecular puede ser una interacción de enlace específico o una interacción enzimática (por ejemplo, la interacción puede ser transitoria y se forma o rompe un enlace covalente) . Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido/enzima una actividad enzimática descritos en la presente incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácido suficientemente similares a, o derivadas de, las secuencias de aminoácido de una secuencia de polipéptido de referencia de longitud completa (putativa) . Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o porción con al menos una actividad enzimática, y pueden incluir uno o más (y en algunos casos todos) los diversos dominios activos. Un fragmento biológicamente activo de una enzima puede ser un fragmento de polipéptido que es, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 600 o más aminoácidos contiguos, incluyendo todos los enteros entre estos, de una secuencia de polipéptido de referencia. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo comprende una secuencia enzimática conservadora, dominio, o porción, como se describe en otro lugar en la presente y se conoce en la técnica. De forma apropiada, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de alrededor de 1%, 10%, 25%, 50% de una actividad del polipéptido de tipo natural a partir del cual se deriva.

Una aldolasa, alcohol deshidrogenasa, reductasa de enlace doble, u otro polipéptido de referencia puede alterarse de varias maneras incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncaciones , e inserciones de aminoácidos. Generalmente se conocen en la técnica métodos para tales manipulaciones. Por ejemplo, las variantes de secuencia de aminoácido de un polipéptido de referencia pueden prepararse por mutaciones en el ADN. Los métodos para mutagénesis y alteraciones de secuencia de nucleótido son bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc . Nati. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), Patente E.U.A No. 4,873,192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene", Cuarta Edición, Benj amin/Cummings , Menlo Park, Calif., 1987) y las referencias citadas en la presente. Las guías como para sustituciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés, pueden encontrarse en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found. , Washington, D. C) .

Se conocen en el arte métodos para seleccionar productos de genes de colecciones de combinación hechas por mutaciones o truncaciones puntuales, y para seleccionar colecciones de cADN para productos de gen que tiene una propiedad seleccionada. Tales métodos son adaptables para selección rápida de las colecciones de genes generadas por mutagénesis de combinación de aldolasa o polipéptidos de alcohol deshidrogenasa . La mutagénesis de ensamble recursiva (REM, por sus siglas en inglés) , una técnica que aumenta la frecuencia de los imitantes funcionales en las colecciones, puede usarse en combinación con los ensayos de selección de variantes de polipéptido identificadas (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7811 -7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering, 6: 327-331). Las sustituciones conservadoras, tales como intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser deseable como se discute en más detalle enseguida.

Las variantes de polipéptido pueden contener sustituciones de aminoácido conservadoras en varias ubicaciones a lo largo de su secuencia, como se compara con una secuencia de aminoácido de referencia. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, las cuales pueden generalmente sub-clasificarse como sigue: Ácido: El residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida de ión H en el pH fisiológico y el residuo se atrae por solución acuosa de manera que se buscan las posiciones de superficie en la conformación de . un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tiene una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.

Básico: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con ión H a pH fisiológico o con una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina) y el residuo se atrae por solución acuosa de manera que se busca las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tiene una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.

Cargado: Los residuos se cargan a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina) .

Hidrofóbico: Los residuos no se cargan a pH fisiológico y el residuo se repele por solución acuosa de manera que se buscan las posiciones interiores en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrofóbica incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptofan.

Neutro/polar: Los residuos no se cargan a pH fisiológico, pero el residuo no se repele suficientemente por soluciones acuosas de manera que . pudiera buscar posiciones interiores en la conformación de un péptido en los cuales está contenido cuando el péptido está en medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina .

Esta descripción también caracteriza ciertos aminoácidos como "pequeños" ya que sus cadenas laterales no son suficientemente grandes, aún si los grupos polares son carentes, para conferir hidrofobicidad . Con la excepción de prolina, aminoácidos "pequeños" son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando al menos un grupo polar está en la cadena lateral y tres carbonos o menos cuando no. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. La prolina de aminoácido secundario codificada por gen es un caso especial debido a sus efectos conocidos en la conformación secundaria de cadenas de péptido. La estructura de prolina difiere a partir de todos los otros aminoácidos que se presentan naturalmente en que su cadena lateral se enlaza al nitrógeno del grupo -amino, así como el a-carbono. Diversas matrices de similitud de aminoácido (por ejemplo, matriz PA 120 y matriz PAM250 como se describe por ejemplo por Dayhoff et al., (1978), Un modelo de cambio evolutivo en proteínas. Las matrices para determinar relaciones de distancia In M. 0. Dayhoff, (ed.), Atlas de secuencia de proteína y estructura, Vol . 5, pp . 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet et al., (Science, 256: 14430-1445, 1992), sin embargo, incluyen prolina en el mismo grupo como glicina, serina, alanina y treonina. En consecuencia, para los propósitos de la presente invención, la prolina se clasifica como un aminoácido "pequeño" .

El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como polar o no polar es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos específicamente contemplados por la invención se han clasificado como uno u otro. La mayoría de los aminoácidos no específicamente nombrados se puede clasificar en la base de comportamiento conocido.

Los residuos de aminoácido se pueden además sub-clasificar como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones auto-explicadas con respecto a los grupos sustituyentes de cadena lateral de los residuos, y tan pequeños o grandes. El residuo se considera pequeño si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, inclusive del carboxilo carbono, proporcionado de un sustituyente polar adicional está presente; tres o menos si no. Residuos pequeños son, por supuesto, siempre no aromáticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los residuos de aminoácido pueden caer en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteína que se presentan naturalmente, la sub-clasificación de acuerdo con su esquema se presenta en la Tabla A.

Tabla 1 Sub-clasificación de aminoácido La sustitución de aminoácido conservador también incluye agrupaciones basadas en cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, y isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas de hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre es cisteina y metionina. Por ejemplo, es razonable para esperar que el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante en las propiedades del polipéptido variante resultante. Si un cambio de aminoácido resulta en un polipéptido truncado funcional y/o variante se puede fácilmente determinar al analizar su actividad enzimática, como se describe en la presente (ver, por ejemplo, Ejemplos 2-4). Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla B bajo el calentamiento de sustituciones ejemplares. Las sustituciones de aminoácidos que caen dentro del alcance de la invención, son, en general, realizadas al seleccionar sustituciones que no difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Después de que las sustituciones se introducen, las variantes se separan por exclusión por actividad biológica.

Tabla 2 Sustituciones de Aminoácidos Ejemplares Alternativamente, los aminoácidos similares para hacer sustituciones conservadoras se pueden agrupar en tres categorías basadas en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina, histidina, que todos tienen cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, glutamina, asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina, como se describe en Zubay, G., Biochemistry, third edition, Wm.C. Brown Publishers (1993) .

De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial previsto en una aldolasa o polipéptido de deshidrogenasa de alcohol se reemplaza típicamente con otro residuo de aminoácido a partir de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, las mutaciones se pueden introducir aleatoriamente a lo largo de todo o parte de una secuencia de codificación, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden separar por exclusión por una actividad del polipéptido precursor para identificar mutantes que mantienen esa actividad. Después de la mutagénesis de las secuencias de codificación, el péptido codificado se puede expresar recombinantemente y la actividad del péptido se puede determinar. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar a partir de la secuencia de tipo natural de un polipéptido de modalidad sin abolir o sustancialmente alternar una o más de sus actividades. Adecuadamente, la alteración no suprime sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es al menos 20%, 40%, 60%, 70% o 80% 100%, 500%, 1000% o más de tipo natural. Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando se altera a partir de la secuencia de tipo natural de un polipéptido de referencia, resulta en la abolición de una actividad de la molécula precursora tal que menos que 20% de la actividad de tipo natural se presenta. Por ejemplo, tales residuos de aminoácido esenciales incluyen aquellos que se conservan en aldolasa, deshidrogenasa de alcohol, reductasa de enlace doble, u otros polipéptidos de referencias a través de diferentes especies, que incluyen aquellas secuencias que se conservan en los sitios enzimáticos de polipéptidos a partir de diversas fuentes.

En consecuencia, la presente invención también contempla variantes de las secuencias de polipéptido de referencia que se presentan naturalmente o sus fragmentos biológicamente activos, en donde las variantes se distinguen a partir de la secuencia que se presenta naturalmente por la adición, eliminación, o sustitución de uno o más residuos de aminoácido. En general, las variantes exhibirán al menos alrededor de 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% similitud o identidad de secuencia a una secuencia de polipéptido de referencia. Por otra parte, las secuencias que difieren a partir de las secuencias nativas o precursoras por la adición, eliminación, o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 O más aminoácidos pero que mantienen las propiedades de una secuencia de polipéptido de referencia o precursora se contemplan.

En algunas modalidades, los polipéptidos variantes difieren a partir de una referencia de aldolasa o secuencia de polipéptido de deshidrogenasa de alcohol por al menos uno pero por menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 o 2 residuos de aminoácidos. En otras modalidades, los polipéptidos variantes difieren a partir de una referencia por al menos 1% pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias se deben alinear para máxima similitud. Las secuencias "formadas en rizo" a partir de las eliminaciones o inserción, o desajustes, se consideran diferencias.) En ciertas modalidades, un polipéptido variante incluye una secuencia de aminoácido que tiene al menos alrededor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o más identidad de secuencia o similitud a una secuencia de correspondencia de un polipéptido de referencia, y retiene la actividad enzimática de ese polipéptido de referencia.

Lo recitado "identidad de secuencia" o, por ejemplo, comprende una "secuencia 50% idéntica a," como se usa en la presente, se refiere al grado que las secuencias son idénticas en una base nucleótido por nucleótido o una base aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. De esta manera, un "porcentaje de identidad de secuencia" se puede calcular al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, que determina el número de posiciones en el cual la base de ácido nucleico idéntico (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val,. Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) presente en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, que dividen el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) , y que multiplica el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos usados para describir relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial" . Una "secuencia de referencia" es al menos 12 pero frecuentemente 15 hasta 18 y frecuentemente al menos 25 unidades de monómero, incluyendo nucleótidos y residuos de aminoácido, en longitud. Ya que dos polinucleótidos pueden cada uno comprender (1) una secuencia (es decir, únicamente una porción de la secuencia de polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente al comparar secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de al menos 6 posiciones contiguas, usualmente alrededor de 50 hasta alrededor de 100, más usualmente alrededor de 100 hasta alrededor de 150 en las cuales una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de las dos secuencias se alinean de forma óptima. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) de alrededor de 20% o menos como se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias.

La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación se puede conducir por implementaciones automatizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Genetics Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, USA) o por la inspección y la mejor alineación (es decir, que resulta en la mayor homología de porcentaje sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia BLAST de los programas como por ejemplo descrito por Altschul et al., 1997, Nucí. Acids Res. 25:3389. Una discusión detallada del análisis de secuencia se puede encontrar en Unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" , John iley & Sons Inc, 1994-1998, Capitulo 15.

El término "endógeno" se refiere generalmente a copias que se presentan naturalmente de un gen, secuencia de polinucleótido, o polipéptido que se puede encontrar en una célula tipo natural genéticamente no modificada u organismo. Por ejemplo, ciertas especies de bacterias que se presentan naturalmente o levaduras que no contienen típicamente un gen de aldolasa, y, por lo tanto, no comprenden una secuencia de polinucleótido "endógeno" que codifica una enzima de aldolasa .

El término "exógeno" se refiere generalmente a una copia de un gen, copia de secuencia de polinucleótido o molécula de ácido nucleico, o un polipéptido que no se presenta naturalmente en una célula tipo natural u organismo, pero se introduce típicamente en la célula por técnicas biológicas moleculares, es decir, fabricadas por ingeniería para producir un microorganismo recombinante . Los ejemplos de genes "exógenos" o polinucleótidos incluyen vectores, plásmidos, y/o constructos de ácido nucleico hechos por el hombre que codifican una proteína deseada o enzima.

A este respecto, también se nota que aún aunque un organismo puede comprender una copia que se presenta naturalmente o endógena de una secuencia de polinucleótido determinada o gen, la introducción de un plásmido o vector que codifica esa secuencia o una secuencia relacionada, tal como para sobre-expresar o de otra manera regular la expresión del polipéptido codificado, representa una. copia "exógena" de ese gen o secuencia de polinucleótido. También, en ciertas modalidades, la colocación de un gen de otra manera endógeno o polinucleótido bajo el control de una secuencia de promotor exógeno, tal como un promotor constitutivo o inducible, para incrementar el nivel de expresión del gen endógeno, también se puede considerar un gen exógeno o polinucleótido dentro del significado de la presente invención. Similarmente , la modificación de un gen de otra manera endógeno o polinucleótido por la adición de secuencias que se presenta no naturalmente, tal como para producir un gen quimérico o polipéptido, también se puede considerar un gen exógeno o polinucleótido dentro del significado de la presente invención.

Cualquiera de las trayectorias, genes, polinucleótidos , moléculas de ácido nucleico, polipéptidos , o enzimas descritos en la presente pueden utilizar o cuentan con una secuencia "endógena", o se pueden proporcionar como uno o más secuencias "exógenas" .

La presente invención también contempla polipéptidos quiméricos o de fusión. Como se usa en la presente, una "proteína quimérica," "proteína de fusión," o "polipéptido de fusión" puede incluir, sin limitación, un primer polipéptido o fragmento del mismo ligado a un segundo, tercero, o cuarto (o más) polipéptido, o fragmento del mismo (por ejemplo, para crear fragmentos múltiples) . El segundo, tercero o cuarto polipéptido puede referirse al mismo polipéptido como el primer polipéptido, tal como para ligarse selectivamente juntos ciertos fragmentos de ese primer polipéptido, o puede referirse a un "polipéptido heterólogo," que típicamente tiene una secuencia de aminoácido que corresponde a una proteína que es diferente del primer polipéptido, y que se puede derivar del mismo o un organismo diferente. En ciertas modalidades, una proteína de fusión incluye al menos una (o dos, tres, cuatro, o más) porción biológicamente activa de una proteína de polipéptido determinada. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión se ligan típicamente de terminal C hasta terminal N, aunque también pueden ligar de terminal C hasta terminal C, terminal N hasta terminal N, o terminal N hasta terminal C. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden.

El compañero de fusión se puede diseñar e incluir esencialmente para cualquier propósito deseado siempre y cuando no afecten negativamente la actividad del polipéptido. Por ejemplo, en una modalidad, un compañero de fusión puede comprender una secuencia que ayuda en expresar la proteína (un potenciador de expresión) en mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Otros compañeros de fusión se pueden seleccionar a fin de aumentar la solubilidad de la proteína, dirigir la proteína a compartimentos intracelulares deseados, secretar la proteína, o atar la proteína a la superficie celular. Como un ejemplo, la proteína de fusión puede contener una secuencia de péptido de señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células hospederas, la secreción o atadura de superficie celular de polipéptidos de fusión se puede incrementar a través del uso de una o más secuencias de péptido de señal heterólogas, típicamente fusionadas en o cerca de la terminal N del polipéptido.

Un microorganismo "recombinantes" típicamente comprende una o más genes exógenos o secuencias de polinucleótido, tal como en un plásmido o vector. Los ejemplos de microorganismos que se pueden utilizar como microorganismos recombinantes incluyen, sin limitación, Escherichia coli, Acetobacter acefci, Achromobacter, Acidiphilium, Acinetobacter, Actinomadura, Actinoplanes, Aeropyrum pernix, Agrobacterium, Alcaligenes, Ananas comosus (M) , Arthrobacter, Aspergillus niger, Aspargillus oryze, Aspergillus melleus, Aspergillus pulverulentus, Aspergillus saitoi, Aspergillus sojea, Aspergillus usamii, Bacillus alcalophilus, Bacillus a yloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans , Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis , Bifidobacterium, Brevibacillus brevis, Burkholderia cepacia, Candida cylindracea, Candida rugosa, Carica papaya (L) , Cel lulosimicrobium, Cephalosporium, Chaetomium erraticum, Chaetomium gracile, Clostridium, Clostridium butyricum, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Corynebacterium (glutamicum) , Corynebacterium efficiens, Enterococcus, Erwina chrysanthemi , Gliconobacter, Gluconacetobacter, Haloarcula, Humicola insolens, Humicola nsolens, Kitasatospora setae, Klebsiella, Klebsiella oxytoca, Kluyveromyces, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kocuria, Lactlactis, Lactobacillus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sake, Lactococcus, Lactococcus lactis, Leuconostoc, Metilocystis, Methanolobus siciliae, Methanogenium organophilum, Methanobacterium bryantii , Microbacterium imperiale, Micrococcus lysodeikticus, Microlunatus, Mucor javanicus, Mycobacterium, Myrothecium, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nocardia, Papaya carica, Pediococcus, Pediococcus halophilus, Penicillium, Penicillium camemberti, Penicillium citrinu , Penicillium emersonii, Penicillium roqueforti , Penicillum lilactinum, Penicillum multicolor, Paracoccus pantotrophus, Propionibacterium, Pseudomonas, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas denitrificans, Pyrococcus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii , Rhizobiu , Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus Lindt, Rhizopus , Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus , Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhodococcus, Saccharophagus degradans, Sccharomyces cerevisiae, Sclerotina libertina, Sphingobacterium multivorum, Sphingobium, Sphingomonas , Streptococcus , Streptococcus thermophilus Y-l, Streptomyces , Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, Streptomyces rubiginosus, Streptomyces violaceoruber, Streptoverticillium mobaraense, Tetragenococcus, Thermus, Thiosphaera pantotropha, Trametes, Trichoderma, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichosporon penicillatum, Vibrio alginolyticus , Vibrio splendidus, Xanthomonas, yeast, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces rouxii, Zymomonas, o Zymomonus mobilis.

La "transformación" se refiere generalmente a la alteración permanente, hereditaria en una célula que resulta de la absorción e incorporación de ADN extraño en el genoma de la célula hospedera; también, la transferencia de un gen exógeno de un organismo en el genoma de otro organismo.

Por "vector" se entiende una molécula de polinucleótido, preferiblemente una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, levadura o virus, en el cual un polinucleótido se puede insertar o clonar. Un vector preferiblemente contiene uno o más sitios de restricción™.. únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en una célula hospedera definida que incluye una célula objetivo o tejido o una célula progenitora o tejido del mismo, o es integrable con el genoma del hospedero definido tal que la secuencia clonada es reproducible . En consecuencia, el vector puede ser un vector autónomamente replicante, esto es, un vector que existe como una entidad cromosomal, la replicación de la cual es independiente de replicación cromosomal, por ejemplo, un plásmido lineal o circular cerrado, un elemento extra-cromosomal , un mini-cromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquiera de los medios para asegurar la auto-replicación . Alternativámente , el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedera, se integra en el genoma y replica junto con los cromosomas en los cuales esto se ha integrado. Tal vector puede comprender secuencias específicas que permiten la recombinación en un sitio particular, deseado del cromosoma hospedero .

Un sistema de vector puede comprender un vector sencillo o plásmido, dos o más vectores o plásmidos, que juntos contienen el ADN total a introducirse en el genoma de la célula hospedera, o un transposón. La elección del vector dependerá típicamente en la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual el vector es para introducirse. En el presente caso, el vector preferiblemente es uno que es operativamente funcional en una célula bacteriana, tal como una célula cianobacteriana . El vector puede incluir un gen reportero tal como una proteína verde fluorescente (GFP) , que puede ser ya sea fusionada en el marco de uno o más de los polipéptidos codificados, o expresados separadamente. El vector también puede incluir un marcador de selección tal como un gen de resistencia al antibiótico que se puede usar para selección de transíromantes adecuados.

Los términos "tipo natural" y "que se presenta naturalmente" se usan intercambiablemente para referirse a un gen o producto de gen que tiene las características de que el gen o producto de gen cuando se aisla de una fuente que se presenta naturalmente. Un gen de tipo natural o producto de gen (por ejemplo, un polipéptido) es ese que se observa más frecuentemente en una población y por lo tanto se diseña arbitrariamente la forma "normal" o "tipo natural" del gen.

Los ejemplos de "biomasa" incluyen biomasa acuática o marina, biomasa basada en fruta tal como desecho de fruta, y biomasa de origen vegetal tal como residuos vegetales, entre otros. Los ejemplos de biomasa acuática o marina incluyen, pero no se limitan a, algas, algas gigantes, algas marinas, algas verdes, y microflora marina, microalgas verdes, hierba marina, y similares. Los ejemplos de biomasa de fruta y/o vegetal incluyen, pero no se limitan a, cualquier fuente de pectina tal como cáscara de planta y pulpa que incluye cítrico, naranja, toronja, papa, tomate, uva, mango, grosella, zanahoria, remolacha de azúcar, y manzana, entre otros. En ciertos aspectos, biomasa no incluye fuentes fósiles de carbono, tal como hidrocarburos que se encuentran típicamente dentro de la capa superior de la corteza de la tierra (por ejemplo, gas natural, materiales no volátiles compuestos de al menos carbono puro, como carbón de antracita, etc) .

Un "producto químico de uso generalizado," o un "intermediario del mismo," se refieren generalmente a químicos, tales como biocombustibles , que tienen las siguientes fórmulas: en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2 , CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , y CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de H, CH3, CH3CH2, CH3CH(CH3), CH3 (CH2) nCH2, CH3CH (CH3) (CH2) nCH2 , CH3CH2CH(CH3) (CH2)nCH2, en donde n = 0-30, que incluye cualquiera de los alcanos correspondientes que se pueden producir de los mismos.

En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado puede ser 3-hidroxi-2 , 2 , 4 trimetilpentanal , 2 , 2 , 4 -trimetil-1 , 3-pentanodiol , y/o 2 , 2, 4 -trimetilpentano . En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado puede ser 3-hidroxi-2-etilhexanal, 2-etil-2-hexen-l-al, 2-etilhexanal, 2 -etilhexanol , y/o 2 -etilhexano . En ciertas modalidades, el producto químico de uso generalizado puede ser 3-hidroxi-2-butil-l-octanol, 2-butil-2-octeno-l-al , 2-butil-octanal , o 2- butil -octanol .

En ciertos aspectos, el diol o alcohol, tal como 2,2,4-trimetil - 1 , 3 -pentanodiol o 2 -etilhexanol , se puede además convertir químicamente o enzimáticamente a su alcano correspondiente, tal como 2 , 2 , 4 -trimetilpentano o 2-etilhexano, respectivamente. Un ejemplo de tal proceso incluye "hidrotratamiento, " también conocido como "hidrogenación . " Por ejemplo, alcoholes tales como 2,2,4-trimetil-1, 3-pentanodiol, 2 -etilhexanol , y 2-butil-octanol puede ser "hidrotratado" para formar sus alcanos correspondientes, 2 , 2 , 4 -trimetilpentano, 2-etilhexano, y 2-butil-octano, respectivamente. El proceso de "hidrotratamiento" en sistemas de refinación de petróleo se refiere generalmente a la adición catalítica de hidrógeno a una molécula que contiene un grupo funcional. Un catalizador de hidrotratamiento se formula generalmente al colocar alguna combinación de molibdeno, níquel and óxido de cobalto en una partícula de alúmina calcinada. La partícula de alúmina se puede luego formular y fabricar para tener un área de superficie interna extremadamente alta (muy porosa) y los metales catalíticos se pueden depositar o distribuir "mono-automáticamente" en la superficie interna de la partícula. En hidrotratamiento (vs . "hidrocraqueo" ) la superficie de alúmina se formula típicamente y fabrica para estar tan inerte (esto es, químicamente pasivo) como sea posible.

Los ejemplos generales de "polisacáridos derivados de biomasa" incluyen, pero no se limitan a, alginato, agar, carragenina, fucoidan, pectina, poligalacturonato, celulosa, hemicelulosa , xilano, arabinan, y mañano. Los ejemplos de los polisacáridos, oligosacáridos , monosacáridos u otros componentes de azúcar de biomasa incluyen, pero no se limitan a, alginato (por ejemplo, polyG, polyMG, polyM) , oligoalginato (por ejemplo, ? , AG, ???, AMG, AGM, AGG, MM, MG, GM, GG, MMM, MGM, MMG, MGG, GMM, GMG, GGM, GGG) , agar, carragenina, fucoidan, pectina, gluronato, guluronato, manuronato, manitol, lixosa, celulosa, hemicelulosa, celobiosa, glicerol, xilitol, glucosa, mañosa, galactosa, xilosa, xilano, mañano, arabinan, arabinosa, glucuronato, galacturonato (que incluye di- y tri-galacturonatos) , ramnosa, y similares. Ciertos ejemplos de polisacáridos derivados de alginato incluyen polisacáridos saturados, tal como ß-D-manuronato, a-L-gluronato, dialginato, talginato, pentalginato, hexalginato, heptalginato, octalginato, nonalginato, decalginato, undecalginato, dodecalginato y polialginato, así como polisacáridos no saturados tales como ácido 4-Desoxi-L-eritro-5-hexoseulosa urónico, 4-(4-Desoxi-beta-D-mann-4 -enuronosil ) -D-manuronato o L-guluronato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -dialginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4 -enuronosil) -talginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -tetralginato, 4- (4 -Desoxi -beta-D-mann-4 -enuronosil) -pentalginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -hexalginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -heptalginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -octalginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -nonalginato, 4- (4-Desoxi-beta-D-mann-4-enuronosil) -undecalginato, y 4 - (4 -Desoxi -beta-D-mann-4 -enuronosil) -dodecalginato .

Ciertos ejemplos de polisacáridos derivados de pectina incluyen polisacáridos saturados, tales como galacturonato, digalacturonato, trigalacturonato, tetragalacturonato, pentagalacturonato, hexagalacturonato, heptagalacturonato, octagalacturonato, nonagalacturonato, decagalacturonato, dodecagalacturonato, poligalacturonato, y ramnopoligalacturonato, así como polisacáridos saturados tales como 4-Desoxi-L-treo-5-hexosulosa uronato, 4- (4-Desoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil) -D-galacturonato, 4- (4-Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil ) -D-digalacturonato, 4- (4 -Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil ) -D-trigalacturonato, 4- (4 -Desoxi -alfa-D-gluc-4 -enuronosil) -D-tetragalacturonato, 4- (4 -Desoxi -alfa-D-gluc-4-enuronosil) -D-pentagalacturonato, 4- (4-Desoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil) -D-hexagalacturonato, 4- (4 -Desoxi-alfa-D-gluc-4-enuronosil) -D-heptagalacturonato, 4- (4-Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil ) -D-octagalacturonato, 4- (4 -Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil) -D-nonagalacturonato, 4- (4 -Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil ) -D-decagalacturonato, y 4- (4 -Desoxi-alfa-D-gluc-4 -enuronosil) -D-dodecagalacturonato .

Un "raonosacárido apropiado" o "sacárido apropiado" se refiere generalmente a cualquier sacárido que se puede producir por un microorganismo recombinante que crece en pectina, alginato, u otro sacárido (por ejemplo, polisacáridos derivados de biomasa que incluyen galacturonato, celulosa, hemi-celulosa etc.) como una fuente o fuente única de carbono, y también se refiere generalmente a cualquier sacárido que se puede utilizar en una trayectoria de biosíntesis de combustible biológico de la presente invención para producir hidrocarburos tales como biocombustibles o biogasolinas . Los ejemplos de monosacáridos apropiados u oligosacáridos incluyen, pero no se limitan a, D-gluconato de 2-ceto-3-deoxi (KDG) , D-manitol, gluronato, manuronato, manitol, lixosa, glicerol, xilitol, glucosa, mañosa, galactosa, xilosa, arabinosa, glucuronato, galacturonatos , y ramnosa, y similares. Como se nota en la presente, un "monosacárido apropiado" o "sacárido apropiado" como se usa en la presente se puede producir por un microorganismo fabricado por ingeniería o recombinante descrito en la Solicitud de E.U.A. Nos. 12/245,537 y 12/245,540, incorporado en la presente como referencia para la descripción de tales microorganismos, o se puede obtener de fuentes comercialmente disponibles.

Lo recitado "optimizado" como se usa en la presente se refiere a una trayectoria, gen, polipéptido, enzima, u otra molécula que tiene una actividad biológica alterada, tal como por la alteración genética de una secuencia de aminoácido del polipéptido o por la alteración/modificación del ambiente celular que rodea al polipéptido, para mejorar sus características funcionales en relación con la molécula original o ambiente celular original (por ejemplo, una secuencia tipo natural de un polipéptido determinado o un microorganismo tipo natural) . Cualquiera de los polipéptidos o enzimas descritas en la presente se pueden opcionalmente "optimizar," y cualquiera de los genes o secuencias de nucleótido descritos en la presente pueden opcionalmente codificar un polipéptido optimizado o enzima. Cualquiera de las trayectorias descritas en la presente pueden opcionalmente contener una o más enzimas "optimizadas", o una o más secuencias de nucleótido que se codifican para una enzima optimizada o polipéptido.

Típicamente, las características funcionales mejoradas del polipéptido, enzima, u otra molécula se refieren a la conveniencia del polipéptido u otra molécula para usar en una trayectoria biológica (por ejemplo, un aldehido y/o trayectoria de biosintesis de cetona, una aldolasa, una deshidrogenasa de alcohol) para convertir un aldehido y/o cetona a un biocombustible, tal como isooctano. Ciertas modalidades, por lo tanto, contemplan el uso de trayectorias biológicas "optimizadas" . Un polipéptido "optimizado" ejemplar puede contener una o más alteraciones o mutaciones en su secuencia que codifica el aminoácido (por ejemplo, mutaciones de punto, eliminaciones, adición de secuencias heterólogas) que facilitan la expresión mejorada y/o estabilidad en un sistema microbiano determinado o microorganismo, permite la regulación de actividad de polipéptido en relación con un sustrato deseado (por ejemplo, actividad inducible o reprimible) , modula la localización del polipéptido dentro de una célula (por ejemplo, localización intracelular, secreción extracelular) , y/o efectúa el nivel general del polipéptido de la actividad en relación con un sustrato deseado (por ejemplo, reducir o incrementar la actividad enzimática) . Un polipéptido u otra molécula se puede también "optimizar" para usar con un sistema microbiano determinado o microorganismo al alterar una o más trayectorias dentro de ese sistema u organismo, tal como al alterar una trayectoria que regula la expresión (por ejemplo, sobre-regulación) , localización, y/o actividad del polipéptido "optimizado" u otra molécula, o al alterar una trayectoria que minimiza la producción de sub-productos indeseables, entre otras alteraciones. De esta manera, un polipéptido u otra molécula se puede "optimizar" con o sin alterar su secuencia de aminoácido de tipo natural o estructura química original. Los polipéptidos optimizados o trayectorias biológicas se pueden obtener, por ejemplo, por mutagenesis directa o por selección natural para un fenotipo deseado, de acuerdo con las técnicas conocidas en el arte.

En ciertos aspectos, genes "optimizados" o polipéptidos pueden comprender una secuencia que codifica nucleótido o secuencia de aminoácido que es 50% hasta 99% idéntica (que incluye todos los enteros en medio) al nucleótido o secuencia de aminoácido de una referencia (por ejemplo, tipo natural) gen o polipéptido. En ciertos aspectos, un polipéptido "optimizado" o enzima puede tener alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100 (que incluye todos los enteros y puntos decimales entre por ejemplo, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 5.5, 5.6, 5.7, 60, 70, etc.), o más veces la actividad biológica de un polipéptido de referencia.

Ciertos aspectos de la invención también incluye un producto químico de uso generalizado, tal como un biocombustible , que se produce de acuerdo con los métodos y microorganismos recombinantes descritos en la presente. Tal biocombustible (por ejemplo, alcano de cadena media o larga, isooctano) se puede distinguir de otros combustibles, tales como aquellos combustibles producidos por refinería tradicional de fuentes de carbono crudo, por técnicas de datación de radio-carbono . Por ejemplo, el carbono tiene dos isótopos no radioactivos, estables: carbono-12 (12C) , y carbono- 13 (13C) . Además., hay cantidades de rastros del carbono- 14 de isótopo inestable (14C) en la Tierra. El carbono- 14 tiene una vida media de 5730 años, y que ha desaparecido desde hace mucho tiempo de la Tierra si no fuera por el impacto continuo de los rayos cósmicos sobre nitrógeno en la atmosfera de la Tierra, que crea más de este isótopo. Los neutrones que resultan de las interacciones del rayo cósmico participan en la siguiente reacción nuclear en los átomos de moléculas de nitrógeno (N2) en el aire atmosférico: Las plantas y otros organismos fotosintéticos toman el dióxido de carbono atmosférico por fotosíntesis. Ya que muchas plantas se ingieren por animales, cada organismo vivo en la Tierra se intercambia constantemente carbono- 14 con su medio ambiente por la duración de su existencia. Una vez que un organismo muere, sin embargo, este intercambio se detiene, y la cantidad de carbono-14 gradualmente disminuye durante el tiempo a través de la desintegración de beta radioactiva.

La mayoría de los combustibles basados en hidrocarburo, tal como aceite crudo y gas natural derivado de operaciones de minería, son el resultado de compresión y calentamiento de materiales orgánicos antiguos (esto es, querógeno) durante tiempo geológico. La formación de petróleo típicamente ocurre de pirólisis de hidrocarburo, en una variedad de sobre todo reacciones endotérmicas en presión y/o temperatura alta. Hoy en día el aceite formado de los restos preservados de zooplancton prehistórico y algas verdes, que se habían establecido en el fondo de un océano o lago en grandes cantidades bajo condiciones anóxicas (los restos de plantas terrestres prehistóricas, por el contrario, tendidos para formar carbón vegetal) . Durante el tiempo geológico la materia orgánica mezclada con lodo, y se enterró bajo capas pesadas de sedimento que resulta en altos niveles de calor y presión (conocido como diagénesis) . Este proceso causado por la materia orgánica para cambiar químicamente, primero en un material ceroso conocido como querógeno que se encuentra en diversos esquistos de aceite alrededor del mundo, y luego con más calor en los hidrocarburos líquidos y gaseosos en un proceso conocido como catagénesis. La mayoría de los combustibles basados en hidrocarburo derivados de aceite crudo se han sometido a un proceso de decadencia de carbono-14 durante tiempo geológico, y, así, tendrá poco para carbono-14 no detectable. En contraste, ciertos biocombustibles producidos por los microorganismos vivos de la presente invención comprenderán carbono-14 en un nivel comparable con todas las otras cosas que actualmente viven (esto es, un nivel de equilibrio) . De esta manera, al medir la relación carbono-12 a carbono-14 de un biocombustible basado en hidrocarburo de la presente invención, y que compara esa relación a un combustible basado en hidrocarburo derivado de aceite crudo, los biocombustibles producidos por los métodos proporcionados en la presente se pueden distinguir estructuralmente de fuentes típicas de combustibles basado en hidrocarburo.

Las modalidades de la presente invención incluyen métodos para producir un producto químico de uso generalizado, que comprende hacer crecer un microorganismo recombinante con una fuente de un aldehido, una cetona, o ambos, en donde el microorganismo recombinante comprende: (i) al menos un polinucleótido (esto es, uno o más polinucleótidos) que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (ii) al menos un polinucleótido (esto es, uno o más polinucleótidos) que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de deshidrogenasa de alcohol, por ello se produce el producto químico de uso generalizado. En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante también puede comprender al menos un polinucleótido (esto es, una o más polinucleótidos) que codifican y expresan un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble, y/o al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad deshidratasa . En ciertas modalidades, al menos uno o dos de los polinucleótidos es un polinucleótido exógeno. En ciertas modalidades, cada uno de los polinucleótidos es exógeno.

Las modalidades de la presente invención también incluyen microorganismos recombinantes que comprenden (i) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (ii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de deshidrogenasa de alcohol. En ciertas modalidades, tales microorganismos también pueden comprender al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble. En ciertas modalidades, al menos uno o dos de los polinucleótidos es un polinucleótido exógeno. En ciertas modalidades, cada uno de los polinucleótidos es exógeno. Estos microorganismos recombinantes típicamente son capaces de producir un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, de una fuente de un aldehido, una cetona, o ambos.

Las modalidades de la presente invención también incluyen microorganismos recombinantes que comprenden (i) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un aldehido y/o trayectoria de biosíntesis de cetona (ii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa; y (ii) al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de deshidrogenasa de alcohol. En ciertas modalidades, tales microorganismos también pueden comprender al menos un polinucleótido que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble. En ciertas modalidades, al menos uno o dos de los polinucleótidos es un polinucleótido exógeno . En ciertas modalidades, cada uno de los polinucleótidos es exógeno. Estos microorganismos recombinantes típicamente son capaces de producir un producto químico de uso generalizado, o un intermediario del mismo, de una fuente de un aldehido, una cetona, o ambos, y también puede ser capaz de producir la fuente de un aldehido, una cetona, o ambos, de un monosacárido apropiado u oligosacárido .

Como se anota arriba, en ciertas modalidades, un microorganismo recombinante también puede comprender al menos un polinucleótido exógeno que codifica y expresa un polipéptido que tiene una actividad de reductasa de enlace doble, y/o un polipéptido que tiene una actividad deshidratasa . En esta y modalidades relacionadas, la presencia o sobre-expresión de una deshidratasa o reductasa de enlace doble exógeno no puede ser necesaria para alcanzar el producto deseado (por ejemplo, isooctano) , ya que tales reacciones se pueden catalizar por enzimas de reductasa y deshidratasa endógenas, pero se pueden usar para incrementar la cantidad de producto deseado producido por el microorganismo recombinante .

Como se usa en la presente, una enzima o polipéptido que tiene una actividad de "aldolasa" se refiere generalmente a una clase de enzimas que son capaces de catalizar la reacción reversible de desdoblamiento D-fructosa- 1 , 6 -bisfosfato para formar fosfato de dihidroxiacetona y D-gl iceraldehído- 3 - fosfato . Las enzimas de aldolasa están presentes en todos los tejidos de animales y plantas y en la mayoría de los microorganismos. Las aldolasas de clase I, encontradas en animales y tejidos de plantas superiores, se caracterizan típicamente por no requerir un co-factor de metal bivalente y por la formación de un intermediario de base Schiff de cetimina con el sustrato fosfato de dihidroxiacetona. Las aldolasas de clase II, típicamente encontradas en microorganismos tales como levadura y bacteria, requieren un co-factor de metal y se puede inhibir por EDTA.

Como una aldolasa ejemplar, la fructosa 1 , 6 -bifosfato aldolasa (aldolasa A) cataliza una reacción clave en la glicolisis y producción de energía. La aldolasa B es una isoenzima de aldolasa A, que es capaz de desdoblamiento de 1-fosfato de fructosa para formar gliceraldehído y fosfato de dihidroxiacetona . Esta reacción, sin embargo, es reversible, y se puede utilizar para condensar gliceraldehído y fosfato de dihidroxiacetona.

Más allá de la condensación de gliceraldehído y fosfato de dihidroxiacetona, se ha descubierto que las enzimas de aldolasa catalizan otras reacciones de condensación útiles entre aldehidos y/o cetonas . En particular, la naturaleza reversible de su actividad catalítica se ha mostrado en la presente para ser útiles en generar una variedad de productos químicos de uso generalizado, o intermediario de los mismos, de los productos de condensación de diversas combinaciones de aldehidos y/o cetonas. Por ejemplo, una enzima de aldolasa de la presente invención puede ser capaz de catalizar la condensación de dos moléculas de isobutiraldehído para formar pentanal de 3-hidroxi-2 , 2 , 4-trimetilo. Como otro ejemplo, una enzima de aldolasa de la presente invención puede ser capaz de catalizar la condensación de dos moléculas de butiraldehído para formar 3-hidroxi-2-etilhexanal . Como otro ejemplo, la enzima de aldolasa de la presente invención puede ser capaz de catalizar la condensación de dos moléculas de hexanaldehído para formar 2-butil-octanal . Por lo tanto, en ciertos aspectos, lo recitado "aldolasa" se refiere a una enzima que es capaz de catalizar la condensación de diversos aldehidos y/o cetonas, tales como acetoaldehído, propionaldehído, glutaraldehído, butiraldehído, isobutiraldehído, 2 -metil-butiraldehído, 3-metil-butiraldehído, 4-metilpentaldehído, hexanaldehído, heptanaldehído, octanaldehído, fenilacetoaldehído, acetoaldehído de 2-fenilo, 2- (4-hidroxifenil) acetaldehído, 2-indol-3-acetoaldehído, 5-amino-pentaldehído, semialdehído de succinato, y/o succinato 4 -hidroxifenil acetoaldehído, entre otros, que incluyen combinaciones de los mismos. La condensación de aldehidos y/o cetonas se puede utilizar para producir tales químicos como propanal, butanal, isobutanal, pentanal, 2-metilbutanal , 3 -metilbutanal , hexanal , 2-metilpentanal , 3 -metilpentanal , 4 -metilpentanal , heptanal, octanal, 2 -metilheptanal , nonanal , decanal, undecanal, dodecanal, entre otros reconocibles por una persona experta en la técnica.

Las enzimas de "aldolasa" o "aldolasas," como se usa en la presente, también incluyen aquellas enzimas que tienen una actividad de proteína portadora acilo-acilo (ACP) , tal como una actividad de tioesterasa ACP. Tales esterases ACP típicamente tienen la capacidad para catalizar la producción de ácidos grasos libres de sustratos de acilo-ACP grasos (por ejemplo, C8-C14) bajo condiciones reactivas de enzima. Sin embargo, se cree que las esterasas de acilo-ACP también son capaces de catalizar la condensación de dos aldehidos y/o cetonas, tal como isobutieraldehído y butieraldehído, para formar una aldehido de alquilo correspondiente, tal como 3-hidroxi-2 , 2 , 4 -trimetilpentanal y 2-etil-2-hexen-l-al , respectivamente.

Tales esterasas se obtienen de las secuencias ejemplificadas específicas proporcionadas en la presente y de fuentes relacionadas. Por ejemplo, diversas especies en el género Cuphea acumulan triglicéridos que contienen ácidos grasos de cadena media en sus semillas, por ejemplo, procumbens, lútea, hookehana, hyssopifolia, wrightii e inflata. Otra fuente de plantas naturales de ácidos grasos de cadena media son semillas de la familia Lauraceae (por ejemplo, Pisa {Actinodophne hookeri) y Bahía Dulce (Laurus nobilis) ) . Otras fuentes de plantas incluyen Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae, y Salvadoraceae, y especies de la selva de Erisma, Picramnia y Virola, que se han reportado que acumulan ácidos grasos C14. Las esterasas ejemplares que tienen actividad de aldolasa, que incluye FATB1 y FATB2 , se describen en la Patente de E.U.A. Nos. 5,298,421, 5,304,481, 5,344,771, 5,455,167, y 5,667,997, y Yuan et al. (PNAS USA 92: 10639-634, 1995), que se incorporan por referencia para su ACP-acil tioesterasa polinucleótido y secuencias de polipéptido .

En ciertas modalidades, un microorganismo recombinante puede comprender una o más secuencias de polinucleótido que codifican un polipéptido que tiene una actividad de aldolasa, en donde el polinucleótido tiene 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOS: 215-222, o secuencias de polinucleótido que hibridizan a sus .complementos bajo condiciones descritas en la presente y conocidas en la técnica. La SEQ ID NO: 215 codifica una enzima FATB2 de Cuphea hookeriana. La SEQ ID NO: 216 codifica una enzima FATB3 de Cuphea lanceolata. La SEQ ID NOS: 217 y 218 cada una codifica una sintasa IV de cetoacil-ACP (KASIV) de Cuphea lanceolata. La SEQ ID NO: 219 codifica una enzima ACP1-2 de Cuphea lanceolata, La SEQ ID NO: 220 codifica una enzima ACP1-3 de Cuphea lanceolata , y la SEQ ID NO: 221 codifica una enzima ACP1-1 de Cuphea lanceolata . La SEQ ID NO: 222 codifica un AcM de Cuphea lanceolata.

Las enzimas de aldolasa se pueden también obtener de tales organismos como Thermotoga marítima y Escherichia coli DH10B, entre otros. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una enzima de aldolasa se puede basar en las secuencias de referencia del polinucleótido establecidas en las SEQ ID NOS: 51-82, y/o las secuencias de referencia del polipéptido codificadas por estas secuencias de referencia del polinucleótido. Por lo tanto, ciertos microorganismos recombinantes de la invención pueden comprender una o más secuencias de polinucleótido que tienen 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOS: 51-82, o las secuencias de polinucleótido que hibridizan sus complementos bajo condiciones de severidad media o alta, como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Ciertas enzimas de "aldolasa" de la presente invención, o las secuencias de polinucleótido que codifican tales enzimas, también pueden caracterizarse por ciertas porciones o dominios conservadores. A este respecto, diversas secuencias de aminoácido que comprenden 20 enzimas de aldolasa de Escerichia coli DH10ß se analizaron por porciones de secuencia común usando la base de datos PROSITE. Muchas de estas secuencias producen coincidencias fuertes a perfiles de secuencia conocidos. Por ejemplo, ALDOL1 , codificada por ECDH10B0008 (SEQ ID NO: 63), ALDOL2 , codificada por EC ECDH10B0894 (SEQ ID NO: 64), ALDOL10, codificada por ECDH10B2629 (SEQ ID NO: 72), y ALD0L19, codificada por ECDH10B4135 (SEQ ID NO: 81), comparte las porciones "Transaldolasa firma 1" y "Transaldolasa firma 2" (ver Tabla 4, abajo) . También, ALDOL 5, codificada por ECDH10B1991 (SEQ ID NO: 67), contiene dos porciones, la porción "sitio activo de KDPG y KHG aldolasas" y la porción "residuo que forma base Schiff de KDPG y KHG aldolasas" (ver Tabla 4, abajo), y ALDOL6, codificada por ECDH10B2249 (SEQ ID NO: 68), ALD0L12, codificada por ECDH10B3100 (SEQ ID NO: 74) , y ALD0L16 , codificada por ECDH10B3310 (SEQ ID NO: 78), comparte las porciones, "Aldolasa fructosa-bisfosfato clase II firma 1" y "Aldolasa f uctosa-bisfosfato clase II firma 2" (ver Tabla 4, abajo) .

Las porciones ejemplares de aldolasa se dan abajo en la Tabla 3, y emparejan fragmentos de secuencia aldol ECDH10B (E. coli DH10B) se dan en la Tabla 4.

Tabla 3 Porciones de Aldolasa Tabla 4 Porción emparejada dentro de secuencias de aldolasa Por lo tanto, en ciertas modalidades, un microorganismo recombinante de la invención puede comprender uno o más polinucleót idos que codifican una enzima de aldolasa o polipéptido, donde la enzima de aldolasa o polipéptido comprende uno o más de los dominios o porciones ejemplificados en las Tablas 3 y 4, o variantes biológicamente activas de estas porciones que son capaces de facilitar la catálisis de la condensación de diversas combinaciones de aldehidos y/o cetonas.

Una enzima o polipéptido que tiene una actividad de "deshidrogenasa de alcohol" se refiere generalmente a una enzima que cataliza la conversión de aldehido o sustituyentes de cetona a alcoholes o dioles, y pueden incluir deshidrogenasas de alcohol secundario. Por ejemplo, 2,2,4-trimetilpentanal se puede reducir a 2 , 2 , 4-trimetil-l, 3-pentanodiol por una enzima que tiene actividad de deshidrogenasa de alcohol (Adh) , que representa una etapa enzimática en la conversión de isobutiraldehído a isooctano.

En ciertos aspectos, un microorganismo recombinante puede comprender una o más deshidrogenasas de alcohol codificadas por una secuencia de referencia de nucleótido seleccionada de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 30, 31, 33, y 83-96, o un polipéptido o enzima codificadas por cualquiera de estas secuencias de polinucleótido, tal como una secuencia de polipéptido seleccionada de las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, y 34, que incluyen fragmentos biológicamente activos o variantes de los mismos, tal como variantes optimizadas. Ciertos microorganismos recombinantes de la invención pueden comprender una o más secuencias de nucleótido o secuencias de polipéptido que tienen 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOS: 1-34 o 83-96.

Para ciertas de las secuencias de deshidrogenasa de alcohol referidas arriba, la SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 2 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-l: PP_1946) aislada de Pseudomonas putida KT2440. La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 4 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-2: PP_1817) aislada de Pseudomonas putida KT2440.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 6 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-3: PP_1953) aislada de Pseudomonas putida KT2440. La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 8 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-4: PP_3037) aislada de Pseudomonas putida KT2440.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 10 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-5: PP_1852) aislada de Pseudomonas putida KT2440. La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 12 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-6: PP_2723) aislada de Pseudomonas putida KT2440.

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 14 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-7: PP_2002) aislada de Pseudomonas putida KT2440. La SEQ ID NO: 15 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 16 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-8: PP_1914) aislada de Pseudomonas putida T2440.

La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 18 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-9: PP_1914) aislada de Pseudomonas putida KT2440. La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 20 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-10: PP_3926) aislada de Pseudomonas putida KT2440.

La SEQ ID NO: 21 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 22 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-ll: PFL_1756) aislada de Pseudomonas fluorescens Pf-5. La SEQ ID NO: 23 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 24 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-12: KPN_01694) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp . pneu oniae MGH 78578.

La SEQ ID NO: 25 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 26 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-13: KPN_02061) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578. La SEQ ID NO: 27 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 28 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-14: KPN_00827) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578.

La SEQ ID NO: 29 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 30 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-16: KPN_01350) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578. La SEQ ID NO: 31 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 32 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-M: KPN_03369) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578. La SEQ ID NO: 33 es la secuencia de nucleótido y la SEQ ID NO: 34 es la secuencia de polipéptido de una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh-18: KPN_03363) aislada de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578.

La deshidrogenasa de alcohol que codifica las secuencias de polinucleótido de la SEQ ID NOS: 83-96 se obtuvieron de Pseudomonas putida.

En ciertos aspectos, una deshidrogenasa de alcohol (adh) , una deshidrogenasa de alcohol secundaria (2adh) , un fragmento, variante, o derivados de los mismos, o cualquier otra enzima que utiliza tal sitio activo, puede comprender al menos una de un nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) , NADH, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+) , o porción que enlaza NADPH. En ciertas modalidades, la NAD+, NADH, NADP+, o porción que enlaza NADPH puede ser seleccionada del grupo que consiste de Y-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO: 245), Y-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO: 246), Y-X-X-X-G-G-X-Y (SEQ ID NO: 247), Y-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO: 248), Y-X-X-G-G-X-X-Y (SEQ ID NO: 249), Y-X-X-X-G-X-X-Y (SEQ ID NO: 250), Y-X-G-X-Y (SEQ ID NO: 251), Y-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO: 252), Y-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO: 253), y Y-X-X-X-X-G-X-Y (SEQ ID NO: 254); en donde Y se selecciona independientemente de alanina, glicina, y serina, en donde G es glicina, y en donde X se selecciona independientemente de un aminoácido codificado genéticamente .

En ciertas modalidades, un sistema microbiano o microorganismo recombinante puede comprender deshidrogenasas de alcohol naturales u optimizadas de Pseudomonas, Rhodococcus eritropolis ATCC4277, Norcadia fusca AKU2123, Klebsialla, u otros organismos adecuados. Las deshidrogenasas de alcohol que codifican genes se pueden aislar de estos y otros organismos de acuerdo con técnicas conocidas en el arte e incorporadas en los microorganismos recombinantes como se describe en la presente.

Una enzima o polipéptido que tiene una actividad de "reductasa de enlace doble" se refiere generalmente a una enzima que cataliza la siguiente reacción general: Como se nota en la presente, en ciertas modalidades, la reacción anterior se puede catalizar por las enzimas endógenas en un microorganismo determinado, tal que la adición de una enzima exógena que tiene actividad de reductasa de enlace doble no puede ser necesaria para la práctica de la presente invención. No obstante, se cree que en ciertos aspectos la sobre-expresión de una enzima de reductasa de enlace doble, o la expresión de una reductasa de enlace doble particular que tiene afinidad incrementada para los componentes de la reacción específica contemplada, puede permitir producción incrementada del producto químico de uso generalizado deseado, o intermediario del mismo.

Las reductasas de enlace doble se pueden obtener, por ejemplo, de tales organismos como Saecharomyees cerevisiae, Pichia angusta, Zymomonas mobilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida, entre otros.

En ciertas modalidades, una enzima de reductasa de enlace doble se puede basar en las secuencias de referencia del polinucleótido establecidas en las SEQ ID NOS: 35-50, y/o las secuencias de referencia correspondientes del polipéptido codificadas por estos polinucleótidos . Por lo tanto, ciertos microorganismos recombinantes de la invención pueden comprender una o más secuencias de polinucleótido que tienen 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% identidad de secuencia a las SEQ ID NOS: 35-50, o secuencias de polinucleótido que hibridizan sus complementos bajo condiciones descritas en la presente y conocidas en la técnica.

Las enzimas de "reductasa de enlace doble" de la presente invención, o las secuencias de polinucleótido que codifican tales enzimas, también pueden caracterizarse por ciertas porciones o dominios conservadores, como se describe en la presente y se conocen en la técnica.

En ciertas modalidades, la fuente del aldehido, la cetona, o ambas, que se condensan por una enzima que tiene actividad de aldolasa para formar un producto químico de uso generalizado, o intermediario del mismo, pueden incluir un microorganismo recombinante que comprende un aldehido y/o trayectoria de biosíntesis de cetona. En ciertas modalidades, tal trayectoria de biosíntesis puede incluir una trayectoria de biosíntesis de aldehido, una trayectoria de biosíntesis de cetona, o ambas.

En ciertas modalidades, la trayectoria de biosíntesis puede incluir uno o más de un acetoaldehído, propionaldehído, glutaraldehído, butiraldehído, isobutiraldehído, 2-metil-butiraldehído, 3-metil-butiraldehído, 4-metilpentaldehído, fenilacetoaldehído, acetoaldehído de 2-fenilo, 2- (4-hidroxifenil) acetoaldehído, 2-indol-3-acetoaldehído, 5-amino-pentaldehído, semialdehído de succinato, y/o trayectoria de biosíntesis de succinato 4 -hidroxifenil acetaldehído, que incluye diversas combinaciones de los mismos.

En ciertos aspectos, la trayectoria de biosíntesis comprende un butiraldehído o trayectoria de biosíntesis de isobutiraldehído . El aldehido ejemplar y la trayectoria de biosíntesis de cetonas se describen en la presente y en las Solicitudes de E.U.A. Nos. 12/245,537 y 12/245,540, que se incorporan por referencia para su descripción de trayectorias de biosíntesis de aldehído/cetona .

En ciertos aspectos, una trayectoria de biosíntesis de propionaldehído puede comprender un gen de treonina deaminasa (ilvA) de un organismo tal como Escherichia coli y un gen ceto-isovalerato decarboxilasa (kivd) de un organismo tal como Lactococcus lactis, y/o variantes funcionales de estas enzimas, que incluyen homólogos u ortólogos de los mismos, así como variantes optimizadas. Estas enzimas se pueden utilizar generalmente para convertir L-treonina a propionaldehído.

En ciertos aspectos, una trayectoria de biosíntesis de butiraldehído puede comprender al menos uno de un gen tiolasa (atoB) de un organismo tal como E. coli, un gen ß-hidroxi butiril-CoA deshidrogenasa (hbd) , un gen crotonasa (crt) , un gen butiril-CoA deshidrogenasa (bed) , un gen de flavoproteína A de transferencia de electrón (etfA) , y/o un gen de flavoproteína B de transferencia de electrón (etfB) de un organismo tal como Clostridium acetobutyricum (por ejemplo, ATCC 824), así como un gen deshidrogenasa de butiraldehído ligado a co-enzima A (aid) de un organismo tal como Clostridium beijerinckii acetobutyricum ATCC 824. En ciertos aspectos, un gen de deshidrogenasa de alcohol ligado a coenzima A (adhE2) de un organismo tal como Clostridium acetobutyricum ATCC 824 se puede usar como una alternativa a un gen de ayuda .

En ciertos aspectos, una trayectoria biosintética de isobutiraldehído puede comprender una sintasa de acetolactato (alsS) de un organismo tal como Bacillus subtilis o un gen ais de un organismo tal como Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (codón de uso se puede optimizar por expresión de proteína E. coli) . Tal trayectoria también puede comprender reductoisomerasa de acetolactato (HvC) y/o genes de deshidratasa de 2 , 3-dihidroxiisovalerato (HvD) de un organismo tal como E. coli, así como un gen decarboxilasa de ceto-isovalerato (kivd) de un organismo tal como Lactococcus lactis .

En ciertos aspectos, una trayectoria de biosíntesis de 3 -metilbutiraldehído y 2 -metilbutiraldehído puede comprender un gen de sintasa de acetolactato (alsS) de un organismo tal como Bacillus subtilis o un gen (ais) de un organismo tal como Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (codón de uso se puede optimizar por expresión de proteína E. coli) . Ciertos aspectos de tal trayectoria también pueden comprender reductoisomerasa de acetolactato [HvC) , deshidratasa de 2,3-dihidroxiisovalerato [HvD) , sintasa de isopropilmalato (LeuA) , isomerasa de isopropilmalato (LeuC y LeuD) , y genes de deshidrogenasa de 3 - isopropilmalato (LeuB) de un organismo tal como E. coli, así como una decarboxilasa de ceto-isovalerato (kivd) de un organismo tal como Lactococcus lactis.

En ciertos aspectos, una trayectoria de biosíntesis de fenilacetoaldehído y 4-hidroxifenilacetoaldehído puede comprender una o más de sintasa 3-Desoxi-7-fosfoheptulonato (aroF, aroG, y aroH) , sintasa 3 -dehidroquinato (aroB) , una deshidratasa 3 -dehidroquinato (aroD) , reductasa dehidrosiquimato (aroE) , siquimato quinasa II (aroL) , siquimato quinasa I (aroK) , sintetasa 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato (aroA) , corismato sintasa (aroC) , corismato mutasa P/prefenato deshidratasa fusionado (pheA) , y/o genes corismato mutasa T/prefenato deshidrogenasa fusionado (tyrA) de un organismo tal como E. coli, así como un ceto-isovalerato decarboxilasa (kivd) de un organismo tal como Lactococcus lactis.

En ciertas modalidades, el organismo recombinante que es la fuente del aldehido, la cetona, o ambos, puede ser el mismo microorganismo recombinante que convierte el aldehido o cetona al producto químico de uso generalizado. Por ejemplo, en la producción de isooctano, tal microorganismo recombinante puede comprender una trayectoria de biosíntesis de isobutiraldehído, una enzima de aldolasa, opcionalmente una enzima de reductasa de enlace doble, y una enzima de deshidrogenasa de alcohol, y podría ser capaz de convertir un monosacárido a isobutiraldehído adecuado, y luego a pentanal de 3 -hidroxi-2 , 2 , 4-trimetilo y 2 , 2 , 4 -trimetil-1 , 3 -pentanodiol . En estos y aspectos relacionados, 2,2,4-trimetil-1, 3 -pentanodiol se puede además convertir a isooctano, tal como por "hidrotratamiento, " como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

Como un ejemplo adicional, en la producción de productos químicos de uso generalizado tal como 2-etilhexanol y 2-etilhexano, tal microorganismo recombinante puede comprender una trayectoria de biosíntesis de butiraldehído, una enzima de aldolasa, opcionalmente una enzima de reductasa de enlace doble, y una enzima de deshidrogenasa de alcohol, y podría ser capaz de convertir a monosacárido adecuado a butiraldehído, y luego a hexanal de 3-hidroxi-2-etilo, 2-etil-2-hexen-l-al , 2-etilhexanal , y finalmente a 2-etilhexanol . En estos y aspectos relacionados, 2-etilhexanol se puede además convertir a 2 -etilhexano, tal como por "hidrotratamiento," como se describe en la presente y se conoce en la técnica.

En ciertas modalidades, el microorganismo recombinante que es la fuente del aldehido, la cetona, o ambos pueden ser diferentes que el microorganismo recombinante que convierte el aldehido o cetona al producto químico de uso generalizado. En estas y modalidades relacionadas, un primer microorganismo recombinante que comprende un aldehido y/o trayectoria de biosíntesis de cetona se puede utilizar como una fuente o materia prima para producir uno o más aldehidos y o cetonas, que se pueden convertir luego al producto químico de uso generalizado deseado, tal como 2 , 2 , 4 -trimetil-1 , 3 -pentanodiol o 2 -etilhexanol , por un segundo microorganismo recombinante que comprende una aldolasa, opcionalmente una reductasa de enlace doble exógena, y una deshidrogenasa de alcohol. En esta y modalidades relacionadas, los dos microorganismos recombinantes se pueden cultivar juntos. Alternativamente, el aldehido, cetona, o ambos se pueden producir separadamente por el primer microorganismo recombinante y entonces más tarde incubar con el segundo microorganismo recombinante que comprende la aldolasa y la deshidrogenasa de alcohol. Diversas otras combinaciones y aspectos de la invención serán evidentes para una persona experta en la técnica a este respecto .

En otras modalidades, la fuente de un aldehido y/o cetona, tal como isobutiraldehído, puede ser cualquier otra fuente adecuada, tal como una fuente comercialmente disponible. En esta y cualquiera de las modalidades, la "fuente" del aldehido, cetona, o ambos pueden incluir el aldehido o la cetona por sí mismo, que se puede agregar directamente a un sistema de cultivo microbiano como se necesite.

En cuanto a las demás trayectorias y enzimas descritas en la presente, las aldolasas, reductasas de enlace doble opcionales, y deshidrogenasas de alcohol, y los componentes para cada uno del aldehido y/o trayectorias de biosíntesis de cetona descritas en la presente se pueden presentar en un microorganismo recombinante ya sea endógenamente o exógenamente . Para mejorar la eficacia de una trayectoria de biosíntesis determinada, genes endógenos, por ejemplo, se pueden sobre-regular o sobre-expresar, tal como al introducir una copia adicional ((esto es, gen exógeno) de ese gen de otra manera endógeno en el microorganismo recombinante. Tales trayectorias se pueden también optimizar al alterar por medio de mutagénesis la versión endógena de un gen para mejorar la funcionalidad, seguido por la introducción del gen alterado en el microorganismo. La expresión de los genes endógenos se puede sobre o sub-regular, o aún eliminar, de acuerdo con técnicas conocidas en el arte y descritas en la presente. Similarmente , los niveles de expresión de genes exógenos o secuencias de polinucleótido se pueden regular como se desee, tal como al usar diversos promotores constitutivos o inducibles. Tales genes o polinucleótidos también pueden ser "optimizados de codón," como se describe en la presente y se conoce en la técnica. También se incluyen variantes que se presentan naturalmente funcionales de los genes y las enzimas/polipéptidos descritos en la presente, que incluyen homólogos o ortólogos de los mismos.

Cualquier microorganismo se puede utilizar de acuerdo con la presente invención. En ciertos aspectos, un microorganismo es un microorganismo eucariótico o procariótico . En ciertos aspectos, un microorganismo es una levadura, tal como S. cerevisiae . En ciertos aspectos, un microorganismo es una bacteria, tal como una bacteria gram-positiva o una bacteria gram-negativa . Dada su velocidad de crecimiento rápida, los genéticos bien entendidos, la variedad de herramientas genéticas disponibles, y su capacidad para producir proteínas heterólogas, E. coli genéticamente modificado se puede usar en ciertas modalidades de un sistema microbiano como se describe en la presente, si para la degradación y metabolismo de un polisacárido, tal como alginato o pectina, o la formación o biosíntesis de productos químicos de uso generalizado, tal como biocombustibles .

Otros microorganismos se pueden usar de acuerdo con la presente invención, basados en parte en la compatibilidad de enzimas y metabolitos a organismos hospederos. Por ejemplo, otros organismos tales como Acetobacter aceti, Achromobacter, Acidiphilium, Acinetobacter, Actinomadura, Actinoplanes, Aeropyrum pernix, Agrobacterium, Alcaligenes, Ananas comosus (M) , Arthrobacter, Aspargillus niger, Aspargillus oryze, Aspergillus melleus, Aspergillus pulverulentus, Aspergillus saitoi, Aspergillus sojea, Aspergillus usamii, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus macerans, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium, Brevibacillus brevis, Burkholderia cepacia, Candida cylindracea, Candida rugosa, Carica papaya (L) , Cellulosimicrobium, Cephalosporiu , Chaetomium erraticu , Chaetomium gracile, Clostridium, Clostridium butiricum, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Corynebacterium (glutamicu ) , Corynebacterium efficiens, Escherichia coli, Enterococcus, Erwina chrysanthemi , Gliconobacter, Gluconacetobacter, Haloarcula, Humicola insolens, Humicola nsolens, Kitasatospora setae, Klebsiella, Klebsiella oxytoca, Kluyveromyces, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kocuria, Lactlactis, Lactobacillus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus sake, Lactococcus, Lactococcus lactis, Leuconostoc, Metilocystis, Methanolobus siciliae, Methanogenium organophilum, Methanobacterium bryantii , Microbacterium imperiale, Micrococcus lysodeikticus, Microlunatus, Mucor javanicus, Mycobacterium, Myrothecium, Nitrobacter, Nitrosomonas, Nocardia, Papaya carica, Pediococcus, Pediococcus halophilus, Penicillium, Penicillium camemberti , Penicillium citrinum, Penicillium emersonii , Penicillium roqueforti , Penicillum lilactinum, Penicillum multicolor, Paracoccus pantotrophus, Propionibacterium, Pseudomonas, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas denitrificans, Pyrococcus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii , Rhizobium, Rhizomucor iehei, Rhizomucor pusillus Lindt, Rhizopus, Rhizopus delemar, Rhizopus japonicus, Rhizopus niveus, Rhizopus oryzae, Rhizopus oligosporus, Rhodococcus, Sccharomyces cerevisiae, Sclerotina libertina, Sphingobacteriu multivorum, Sphingobium, Sphingomonas, Streptococcus, Streptococcus thermophilus Y-l, Streptomyces, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces murinus, Streptomyces rubiginosus, Streptomyces violaceoruber, Streptoverticillium mobaraense, Tetragenococcus, Thermus, Thiosphaera pantotropha, Trametes, Trichoderma, Trichoderma Iongibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichosporon penicillatum, Vibrio alginolyticus, Xanthomonas, levadura, Zygosaccharomyces rouxii, Zymomonas, y Zymomonus mobilis, se pueden utilizar como microorganismos recombinantes proporcionadas en la presente, y, por lo tanto, se puede utilizar de acuerdo con los diversos métodos de la presente invención.

Las diversas modalidades descritas en la presente se pueden combinar para proporcionar modalidades adicionales. Todas de las Patentes de E.U.A., Publicaciones de solicitud de Patente de E.U.A., solicitudes de Patente de E.U.A., patentes extranjeras, solicitudes de patente extranjera y publicaciones de no patente referidas en esta especificación y/o enlistadas en la Hoja de Datos de Solicitud se incorporan en la presente como referencia, en su totalidad. Aspectos de las modalidades se pueden modificar, si es necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y aplicaciones para proporcionar aún modalidades adicionales.

Estos y otros cambios se pueden hacer a las modalidades a la luz de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no se deben interpretar para limitar las reivindicaciones a las modalidades específicas descritas en la especificación y las reivindicaciones, sino se deben interpretar para incluir todas las modalidades posibles junto con el alcance completo de los equivalentes a los cuales tales reivindicaciones tienen derecho. En consecuencia, las reivindicaciones no se limitan por la descripción.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, sin limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 TRAYECTORIAS DE BIOSÍNTESIS DE ALDEHÍDO/CETONA Para proporcionar una fuente útil de aldehidos y/o cetonas, tal como butiraldehído e isobutiraldehído, los microorganismos recombinantes que comprenden un aldehido y/o trayectoria de biosíntesis de cetona, y que son capaces de convertir un monosacárido apropiado u oligosacárido a un aldehido o cetona, se construyeron.

Una trayectoria biosintética de butiraldehído que comprende un gen tiolasa (atoB) de E. coli, ß-hidroxi butiril-CoA deshidrogenasa (hbd) , crotonasa (crt) , deshidrogenasa butiril-CoA (bed) , flavoproteína A de transferencia de electrón (etfA) , y genes de flavoproteína B de transferencia de electrón (effB) de Clostridium acetobutiricum ATCC 824, y un gen de deshidrogenasa de butiraldehído ligado a co-enzima A (aid) de Clostridium beijerinckii acetobutiricum ATCC 824 se construyó en E. coli Y probó por la capacidad a producir butiraldehído. También, un gen deshidrogenasa de alcohol ligado a co-enzima A (adhE2) de Clostridium acetobutiricum ATCC 824 se usó como una alternativa a ald y probó por la capacidad a producir butanol .

Una trayectoria biosintética de isobutiraldehído que comprende una sintasa de acetolactato (alsS) de Bacillus subtilis o (ais) de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 (codón de uso se optimizó por expresión de proteína E. coli) y reductoisomerasa de acetolactato (ilvC) y deshidratasa de 2 , 3 -dihidroxiisovalerato (HvD) , genes de E. coli y decarboxilasa de ceto- isovalerato (kivd) de Lactococcus lactis se construyó y probó por la capacidad a producir isobutiraldehído, como se midió por la producción de isobutanal .

Construcción de pBADButP.

La secuencia de ADN que codifica hbd, crt, bcd, etfA, y etfB de Clostridium acetobu iricum ATCC 824 se amplificó por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng Clostridium acetobutiricum ATCC 824 genoma (ATCC) en 50 µ?. El fragmento de ADN amplificado se digirió con BamHI y Xbal y ligó en pBAD33 pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pBADButP-atoB .

La secuencia de ADN que codifica atoB de Escherichia coli DH10B se amplificó por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng Escherichia coli DH10B genoma en 50 µ? . El fragmento de ADN amplificado se digirió con Xbal y PstI y ligó en pBADButP pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pBADatoB-ald.

La secuencia de ADN que codifica atoB de Escherichia coli DH10B y ald de Clostridium beijerinckii se amplificaron separadamente por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de ya sea 50 ng Escherichia coli DH10B o Clostridium beijerinckii genoma (ATCC) en 50 µ?, respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron en gel y eluyeron en 30 ul de solución amortiguadora EB (Qiagen) . 5 ul de cada solución de ADD se combinó y cada fragmento de ADN se empalmó por otra ronda de PCR. El fragmento empalmado se digirió con SacI y HindIII y ligó en pBADButP pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pBADButP-atoB-ALD .

El fragmento de ADN 1 que codifica acetiltransferasa de cloranfenicol (CAT) , P15 origen de replicación, promotor araBAD, atoB de Escherichia coli DH10B y ald de Clostridium beij erinckii y el fragmento de ADN 2 que codifica promotor araBAD, hbd, crt , bcd, etfA, y etfB de Clostridium acetobutiricum ATCC 824 se amplificaron separadamente por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng de ya sea pBADatoB-ald o pBADButP en 50 µ?, respectivamente. Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con Notl y Kpnl y ligaron entre sí.

Construcción de pBADals- ilvCD .

El fragmento de ADN que codifica ais de Klebsiella pneumoniae subsp . pneumoniae MGH 78578 de su codón de uso optimizado para sobre-expresión en E. coli se amplificó por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng pETals en 50 µ?. El fragmento de ADN amplificado se digirió con Sacl y Xbal y ligó en pBADilvCD pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pBADalsS- ilvCD .

Los fragmentos de ADN que codifican mitades frontal y de fondo de alsS de Bacillus subtilis B26 se amplificaron por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng Bacillus subtilis B26 genoma (ATCC) en 50 µ? . Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron en gel y eluyeron en 30 ul de solución amortiguadora EB (Qiagen) . 5 ul de cada solución de ADN se combinó y cada fragmento de ADN se empalmó por otra ronda de PCR. El fragmento empalmado fue sitio Xbal interno libre y por lo tanto se digirió con Sacl y Xbal y ligó en pBADilvCD pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pTrcBALK.

Una secuencia de ADN que codifica decarboxilasa de cetoisovalerato (kivd) de Lactococcus lavtis se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) 50 ng pETBAL en 50 µ?. El fragmento de ADN amplificado se digirió con Sacl y Xbal y ligó en pTrcBAL pre-digerido con las mismas enzimas de restricción .

Construcción de pTrcBALD.

Una secuencia de ADN que codifica deshidrogenasa de aldehido ligada a CoA (ald) de Clostridium beijerinckii se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng pETBAL en 50 µ? . El fragmento de ADN amplificado se digirió con Sacl y HndIII y ligó en pTrcBAL pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Construcción de pBBRPduCDEGH.

Una secuencia de ADN que codifica subunidades medias (pduD) y pequeñas (pduE) de propanediol deshidratasa y subunidades grandes (pduG) y pequeñas (pduH) de reactivación de deshidratasa de propanediol de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 se amplificó por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 en 50 µ? . El fragmento de ADN amplificado se digirió con SacII y Xbal y ligó en pTrc99A pre-digerido con las mismas enzimas de restricción para formar pBBRPduDEGH.

Una secuencia de ADN que codifica subunidad grande de deshidratasa de propanodiol (pduC) de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 se amplificó por reacción de cadena de polimerasa (PCR) de 50 ng Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578 en 50 µ? . Fragmento de ADN amplificado se digirió con Xhol y Xbal y ligó en pBBRPduDEGH pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Para probar la trayectoria de biosíntesis de butiraldehído, DH10B que alberga pBADButP-atoB/ TrcBALD y pBADButP-atoB-ALD/pTrcB2DH/pBBRpduCDEGH se hicieron crecer durante la noche en medio LB que contiene 50 ug/ml cloranfenicol (Cm50) y 100 ug/ml de ampicilina (AmplOO) en 37 C, 200 rpm. Una alícuota de cada cultivo de semilla se inoculó en medio TB fresco que contiene Cm50 y Amp100 y se hizo crecer en agitador de incubación a 37 C, 200 rpm. Tres horas después de la inoculación, los cultivos se indujeron con 13.3 mM arabinosa y 1 mM IPTG y se hicieron crecer durante la noche. 700 ul de este cultivo se extrajo con volumen igual de etilacetato y analizó por GC-MS.

Para probar la trayectoria de biosíntesis de isobutieraldehído, las células DH10B que albergan pBADals-ilvCD/pTrcBALK o pBADalsS- ilvCD/pTrcBALK se hicieron crecer durante la noche en medio LB que contiene 50 ug/ml cloranfenicol (Cm50) y 100 ug/ml ampicilina (AmplOO) a 37 C, 200 rpm. Una alícuota de cada cultivo de semilla se inoculó en medio TB fresco que contiene Cm50 y Amp100 y se hizo crecer en un agitador de incubación a 37°C, 200 rpm. Tres horas después de la inoculación, los cultivos se indujeron con 13.3 mM arabinosa y 1 mM IPTG y se hicieron crecer durante la noche. 700 ul de este cultivo se extrajo con volumen igual de etilacetato y analizó por GC-MS por la producción de isobutiraldehído, como se midió por producción de isobutanal. La Figura 2 muestra la producción de isobutanal de estos cultivos. Esta cepa también produce 2- metilbutiraldehído y 3 -metilbutiraldehído como componentes menores (no mostrados) .

EJEMPLO 2 PRODUCCION DE 3 -HIDROXI - 2 , 2 , 4 TRIMETILPENTANAL DE ISOBUTIRALDEHIDO La capacidad de una enzima que tiene actividad de aldolasa para condensar dos moléculas de isobutiraldehído para formar 3-hidroxi-2 , 2 , 4 -trimetilpentanal se probó in vivo. El plásmido TrcTM1559 se construyó como se describe en el Ejemplo 5 abajo, y contiene una secuencia de polinucleótido que codifica aldosa que se obtuvo de Thermotoga marítima .

Una colonia sencilla de cepa de E. coli DH10B que alberga pTrcTM1559 se inoculó en medio LB fresco que contiene AmplOO y el cultivo se hizo crecer en un agitador de incubación a 37°C durante la noche. El uno por ciento de este cultivo se inoculó en medio TB fresco que contiene AmplOO y el cultivo se hizo crecer en agitador de incubación a 37°C.

Cuando el cultivo se hizo crecer a un OD60onm de 0.6, el cultivo se indujo con 0.5 mM IPTG. 50mM de isobutiraldehído se agregó y los cultivos se hicieron crecer por un día. 500 ul de cultivo se extrajo con 500 ul de etilacetato, y los extractos se analizaron por GC-MS. La formación de 3-hidroxi-2 , 2 , 4-trimetilpentanal se observó (ver Figura 2).

EJEMPLO 3 PRODUCCION DE 2,2, 4-TRIMETIL- 1 , 3 -PENTANODIOL DE ISOBUTIRALDEHIDO La capacidad de un microorganismo recombinante comprende una enzima de aldolasan y una deshidrogenasa de alcohol para convertir isobutiraldehído a 2 , 2 , 4 -trimetil- 1 , 3 -pentanodiol se prueba. El plásmido TrcTM1559 se describe en el Ejemplo 2 arriba. Diversas deshidrogenasas de alcohol se aislaron de Pseudomonas putida T2440, Pseudomonas fluorescens Pf-5, y Klebsiella pneumoniae MGH 78578 (ver SEQ ID NO: 1-34) y clonaron en plásmidos de expresión, como se describe en la Solicitud de E.U.A. Nos. 12/245,537 y 12/245,540, que se incorporan por referencia para su descripción, construcción y prueba de enzimas de deshidrogenasa de alcohol. Las deshidrogenasas de alcohol adicionales también se obtuvieron de Pseudomonas putida (ver SEQ ID NOS: 83-96) .

Una colonia sencilla de cepa E. coli DH10B que alberga tanto pTrcTM1559 como una deshidrogenasa de alcohol que expresa plásmido se inocula en medio LB fresco que contiene AmplOO y el cultivo se hace crecer en agitador de incubación a 37°C durante la noche. El uno por ciento de este cultivo se inocula en medio TB fresco que contiene AmplOO y el cultivo se hace crecer en agitador de incubación a 37°C. Cuando el cultivo se hace crecer a un OD60onm de 0.6, el cultivo se induce con 0.5 mM IPTG. 50mM isobutiraldehído se agrega y los cultivos se hacen crecer por un día. 500 ul de cultivo se extrae con 500 ul de etilacetato, y los extractos se analizan por GC-MS. La formación de 2 , 2 , 4-trimetilpentandiol se observa .

EJEMPLO 4 PRODUCCION DE OTRO MEDIO A HIDROCARBUROS DE CADENA LARGA Además de la trayectoria antes mencionada para producir 2 , 2 , 4 -trimetil-1 , 3 -pentanodiol y luego 2,2,4, trimetilpentano (isooctano) , la condensación de aldol enzimático seguido por dehidrogenación de alcohol puede proporcionar variedad de medio a hidrocarburos de cadena larga de diversos aldehidos y cetonas como materiales de partida. Estos aldehidos y/o cetonas se pueden producir por microorganismos recombinantes de acuerdo con las trayectorias de biosíntesis de aldehido y/o cetona descritas en la Solicitud de E.U.A. Nos. 12/245,537 y 12/245,540, que se incorporan por referencia para la descripción, construcción, y prueba de estas trayectorias .

Un ejemplo se ilustra en la presente, en el cual dos moléculas de butiraldehído se condensaron por una aldolasa para formar 3-hidroxi-2-etil hexanal . Esta molécula entonces se deshidrato espontáneamente o enzimáticamente para formar 2-etil-2-hexen-l-al, que entonces se puede reducir consecutivamente para formar 2-etilhexanal y 2 -etilhexanol , catalizado por reductasa de enlace doble y deshidrogenasa de alcohol, respectivamente.

También se ilustra en la presente una reacción en la cual dos moléculas de hexanaldehído se condensaron por una aldolasa para formar 3-hidroxi-2-butil-l-octanal . Esta molécula luego se deshidrato espontáneamente o enzimáticamente para formar 2-butil-2-octen-l-al , que entonces se puede reducir consecutivamente por 2-butil-octanal y 2-butil octanol.

Para probar la producción de 2-etil-2-hexen-l-al, una colonia sencilla de cepa de E. coli DH10B que alberga pTrcTM1559 se inoculó en medio LB fresco que contiene Amp100 y el cultivo creció en agitador de incubación a 37 C durante la noche. El uno por ciento de este cultivo se inoculó en medio TB fresco que contiene Amp100 y el cultivo se hizo crecer en agitador de incubación a 37 C. Cuando el cultivo se hizo crecer OD6oonm de 0.6, el cultivo se indujo con 0.5 mM IPTG. Ya sea 50 mM butiraldehído o 50mm hexanaldehído se agregó y los cultivos se hicieron crecer por un día. 500 ul del cultivo se extrajo con 500 ul de etilacetato, y los extractos se analizaron por GC-MS. La formación de 2-etil-2-hexen-l-al se observó (ver Figura 3) . También, la formación de 2-butil-2-octen-l-al se observó (ver la Figura 4) .

EJEMPLO 5 AISLAMIENTO Y CLONACION DE ALDOLASAS Las secuencias de polinucleótido que codifican enzimas que tienen actividad de aldolasa se aislaron de Thermotoga marítima y Escherichia coli DH10B y clonaron en vectores de expresión .

Construcción de pTrcTM0040, pTrcTM0066, pTrcTM0273, pTrcTM0283, pTrcTM0295, pTrcTM0343, pTrcTM0720 , pTrcTM1072, pTrcTM1419, pTrcTM1521, pTrcTM1559 , y pTrcTM1744 Como las secuencias de ADN que codifican TM0273, TM0283, TM0720, TM 1559, y TM1744 contienen un sitio Ncol interno, regiones de acompañamiento de sitio Ncol para cada gen se amplificaron separadamente por reacción de cadena de polimerasa (PCR) : 98°C por 10 seg, 60°C por 15 seg, y 72°C por 30 min, repetido 30 veces. La mezcla de reacción contiene solución amortiguadora 1 x Phusion (NEB) , 2 mM dNTP, 0.5 µ? cebadores delantero e inverso (ver Tabla 5) , polimerasa de ADN de Fidelidad Alta 1U Phusion (NEB) , y 50 ng Thermotoga marítima genoma en 50 µ? .

Tabla 5 Las secuencias de ADN que codifican TM0040, TM0066, TM0273, TM0283, TM0295, TM0343, TM0720, TM1072, TM1419, TM1521, TM1559, y TM1744 de Themotoga marítima se amplificaron por reacción de cadena de polimerasa (PCR) : 98°C por 10 seg, 600C por 15 seg, y 72°C por 1 min, repetido 30 veces. La mezcla de reacción contiene solución amortiguadora 1 x Phusion (NEB) , 2 mM d TP, 0.5 µ? cebadores delantero e inverso (ver Tabla 6) , polimerasa de ADN de Fidelidad Alta 1 U Phusion (NEB) , y 50 ng T ermotoga marítima genoma en 50 µ? (Nota: Para TM0273, TM0283, TM0720, TM 1559, y TM1744, fragmentos preparados como se describe en el párrafo anterior se usaron) . Los fragmentos de ADN amplificados se digirieron con Ncol y Xbal y ligaron en pTrc99A pre-digeridos con las mismas enzimas de restricción.

Tabla 6 CATGCC GCTCTAGA TM1419 ATGGTCAAGGTCCTGATCCTCG TTACAGCCACTTCGGTTTCAAT GTC (SEQ ID O:141 ) CCC (SEQ ID NO:142) CATGCCATGGGG GCTCTAGA TM1521 ATGTTCAGAGGAGTAGGAACT TTATAGCAATCCACTCTCCTTG GCTA (SEQ ID O:143) AGA (SEQ ID NO:144) CATGCCATGGGG GCTCTAGA TM1559 ATGATAGAGTACAGGATTGAGG TTAACCTCCATATCTCTCTTCTC AGG (SEQ ID NO:145) CC (SEQ ID NO:146) CATGCCATGGGG GCTCTAGA TM1744 ATGATCGATCTCAGGTCCGACA TTAGGAGAA I I I I CTGAAGAGT CCG (SEQ ID NO:147) TTT (SEQ ID NO:148) Construcción de pTrcDHI OBxxx Las secuencias de ADN que codifican EC1648 y EC4071 contienen un sitio Ncol interno, y la secuencia de ADN que codifica EC2249 contiene un sitio Xbal . Las regiones de acompañamiento de los sitios de restricción para cada gen se amplificaron separadamente por la reacción de cadena de polimerasa (PCR) : 98°C por 30 seg, 55°C por 15 seg, y 72°C por 45 seg, repetido 30 veces. La mezcla de reacción contiene solución amortiguadora 1 x Phusion (NEB) , 2 mM dNTP, 0.3 µ? cebadores delantero e inverso (ver Tabla 7) , polimerasa de ADN de Fidelidad Alta 1 U Phusion (NEB) , y 20 ng E. coli ????ß.

Tabla 7 Las secuencias de ADN que codifican EC0008, EC0894, EC0940, EC1648, EC1991, EC2249, EC2250, EC2465, EC2629, EC2969, EC3100, EC3233, EC3299, EC3305, EC3310, EC4071, EC4092, EC4135 y EC4539of Escherichia coli ????ß se amplificaron por reacción de cadena de polimerasa (PCR) : 98°C por 30 seg, 55°C por 30 seg, y 72°C por 1 min, repetido 30 veces. La mezcla de reacción contiene solución amortiguadora 1 x Phusion (NEB) , 2 mM dNTP, 0.3 µ? cebadores delantero e inverso (ver Tabla 8) , polimerasa de ADN de Fidelidad Alta 1 U Phusion (NEB) ( y 20 ng Escherichia coli ????ß genoma en 50 µ? (Nota: Para EC1648, EC2249 y EC4071 fragmentos preparados en el párrafo anterior se usaron) .

Tabla 8 Los fragmentos amplificados que codifican EC3305 y EC3310 se ligaron juntos usando el método de traslape PCR. (PCR) : 98°C por 30 seg, 55°C por 30 seg, y 72°C por 1 min, repetido 30 veces. La mezcla de reacción contiene solución amortiguadora 1 x Phusion (NEB) , 2 mM dNTP, 0.3 µ? cebadores delantero e inverso (cebador delantero: catgccatggggatgaaacatctgacagaaatg (SEQ ID NO:189), cebador inverso: gctctagattatgctgaaattcgattcg (SEQ ID NO:190)), polimerasa de ADN de Fidelidad Alta 1 U Phusion (NEB) , y producto PCR 3 L del párrafo previo.

El fragmento de ADN amplificado se digirió con Ncol Xbal y ligó en pTrc99A pre-digerido con las mismas enzimas de restricción.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (25)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un microorganismo recombinante, caracterizado porque comprende : a) isobutiraldehído; b) 3-hidroxi-2 , 2 , 4 -trimetilpentanal y c) ADN recombinante que codifica para aldolasa en donde la aldolasa es expresada en el microorganismo y la isobutiraldehído es convertida a 3-hidroxi-2 , 2 , 4-trimetilpentanal por la aldolasa.

2. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una levadura.

3. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es E. coli.

4. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la aldolasa es derivada de Thermotoga marítima .

5. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN recombinante comprende SEQ ID NO: 51.

6. El método caracterizado porque comprende: a) proporcionar el microorganismo de conformidad con la reivindicación 1; b) crecimiento del microorganismo bajo condiciones por las cuales la aldolasa sea expresada y el isobutiraldehído sea convertido a 3 -hidroxi-2 , 2 , 4- trimetilpentanal por la aldolasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el microorganismo es una levadura.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el microorganismo es E. coli.

9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la aldolasa es derivada de Thermotoga marítima .

10. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el 3 -hidroxi-2 , 2 , 4 -trimetilpentanal es además convertido a un producto químico de uso generalizado en el microorganismo.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el producto químico de uso generalizado es 2,2, 4- trimetil-1 , 3 -pentanodiol .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el producto químico de uso generalizado es 2, 2, 4-trimetilpentano.

13. Un microorganismo recombinante, caracterizado porque comprende : a) hexanal; b) 2-butil-2-octen-l-al y c) ADN recombinante que codifica para aldolasa en donde la aldolasa es expresada en el microorganismo y el hexanal es convertido a 2-butil-2-octen-l-al por la aldolasa.

14. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es una levadura.

15. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es E. coli.

16. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la aldolasa es derivada de Thermotoga marítima .

17. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la aldolasa comprende SEQ ID NO: 51.

18. El método para producir 2-butil-2-octen-l-al en un microorganismo, caracterizado porque comprende: a) proporcionar el microorganismo de conformidad con la reivindicación 13 ; b) crecimiento del microorganismo bajo condiciones por las cuales la aldolasa sea expresada y el hexanal sea convertido a 2-butil-2-octen-l-al por la aldolasa.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el microorganismo es una levadura.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el microorganismo es E. coli.

21. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la aldolasa es derivada de Thermotoga marítima .

22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ADN recombinante comprende SEQ ID NO : 51.

23. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el 2-butil-2-octen-l-al es además convertido a un producto químico de uso generalizado en el microorganismo .

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el producto químico de uso generalizado es 2-butil-l-octanal .

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el producto químico de uso generalizado es 2-butil-l-octanal.