CN116376989B - 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用 - Google Patents

一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种制备酮酸的方法，其以甘氨酸和醇类有机物为底物进行酶催化反应，酶催化反应过程中，醇类有机物转化为醛类有机物，甘氨酸和醛类有机物转化成β‑羟基‑α氨基酸，β‑羟基‑α氨基酸再转化为酮酸。本发明还公开了酮酸的制备方法在制备氨基酸中的应用。本发明所用酶的数量大大少于天然合成途径，生产成本低，其搭建了酮酸的人工代谢平台，能够产生多种中药的酮酸，如苯丙酮酸、4‑甲基2‑氧戊酸、丙酮酸、2‑氧代丁酸等，操作简单，产率高，底物利用率高，污染低。

Description

一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸中的应用。
背景技术
氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，在人和动物的生命活动以及营养健康方面发挥着至关重要的作用。氨基酸是含有碱性氨基(-NH2)和酸性羧基(-COOH)的有机化合物，且氨基和羧基连接在同一个碳原子上，其化学通式是RCHNH2COOH。根据对人体需要程度,可分为必需氨基酸和非必需氨基酸。除了生物合成的天然氨基酸外，还包括人工合成的非天然氨基酸。氨基酸类产品在医疗/保健,食品(调味品),饲料添加剂,化妆品,化学合成等多领域有着广泛的用途，已然成为全球性一大产业。
目前世界上氨基酸的主要生产方法包括发酵法，化学合成法，水解法以及化学合成-酶法。发酵法是利用微生物自身所具有的合成各种氨基酸能力，通过菌株诱变等处理，选育出各种缺陷型及抗性的变异菌株，以解除代谢通路中的反馈与阻遏，以实现某种氨基酸过量生产为目的的一种生产方法。发酵法生产氨基酸不可避免的缺点是难以控制各种非目标氨基酸的产生与积累，生产周期长，提纯难度大，成本高。化学合成法是借助于各种有机物之间复杂的反应生产氨基酸的一种方法。虽然化学合成法可以生产各种天然氨基酸和非天然氨基酸，但所得氨基酸大多为光学消旋体(含有D和L两种旋光异构体)，大大制约了其工业价值。同时，化学合成法也存在反应复杂，步骤多，污染环境的问题。水解法是以富含蛋白质的物质如毛发等为原料，通过酸、碱或蛋白质水解酶进行水解，再经过分离纯化获得各种氨基酸的工艺过程。水解法原料较为丰富，投产相对容易，但产量低，成本较高且对环境的污染比较大。
目前，国内除谷氨酸、赖氨酸等少量氨基酸外，大部分氨基酸依然无法实现产业化生产，至今仍为国外企业垄断。而大多数氨基酸均可通过酮酸经一步转氨酶合成，因此，酮酸的生产和制备极为重要。目前来说，酮酸的制备存在的问题是使用有毒的催化剂，并且产量和转化率低的现象。公开号为US08153839B2的美国专利公开了通过乙炔化合物水合合成酮酸或氨基酸的方法，其使用金属盐和过渡金属络合物的水合允许在温和条件下由乙炔-羧酸合成酮酸(包括酮酸和酮酸衍生物)，而不使用极其有害的汞催化剂，并且可以在同一容器中通过随后的还原胺化由合成的酮酸(包括酮酸和酮酸衍生物)容易地合成氨基酸(包括氨基酸和氨基酸衍生物)，然而其操作复杂，生产过程难以控制，且产量和转化率较低，难以实现工业化大批量生产。
因此，本发明旨在从酮酸的制备着手突破技术创新，全面提高多种天然氨基酸或非天然氨基酸及衍生物产量，提高产品市场竞争力。
发明内容
本发明所解决的技术问题之一在于提供一种底物利用率高、污染底、产量高、生产成本低的一种制备酮酸的方法。
本发明所解决的技术问题之二在于提供一种底物利用率高、污染底、产量高、生产成本低的一种制备二醇类有机物的方法。
本发明所解决的技术问题之三在于能够产生多种重要的酮酸：苯丙酮酸、4-甲基2-氧戊酸、丙酮酸、2-氧代丁酸等，并且该途径可应用于其它酮酸及氨基酸的生产中。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种制备酮酸的方法，以甘氨酸和醇类有机物为底物进行酶催化反应，酶催化反应过程中，醇类有机物转化为醛类有机物，甘氨酸和醛类有机物转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸再转化为酮酸。
优选的，制备得到的酮酸包括但不限于具有如下通式的酮酸：
其中R的结构式可以为(CH3)2CH2-、(CH3)C-、CH3-、/>等。
进一步地，以甘氨酸和醇类有机物为底物，以含有L-醛缩酶和第一脱水酶基因的第一重组微生物及含有脱氢酶的第二重组微生物过表达产生的酶为催化剂进行酶催化反应；醇类有机物在脱氢酶的作用下转化为醛类有机物，甘氨酸和醛类有机物在L-醛缩酶的单独催化下转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸在第一脱水酶的催化下生成酮酸；
或以含有D-缩醛酶基因、消旋酶基因、第二脱水酶基因的第三重组微生物及含有所述脱氢酶的第二重组微生物过表达产生的酶为催化剂进行酶催化反应；醇类有机物在脱氢酶的作用下转化为醛类有机物，甘氨酸和醛类有机物在D-缩醛酶、消旋酶的共同催化下转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸在第一脱水酶的催化下生成酮酸。
进一步地，或以甘氨酸及醛类有机物为底物，以所述含有L-醛缩酶和第一脱水酶基因的第一重组微生物过表达产生的酶为催化剂进行酶催化反应；甘氨酸和醛类有机物在L-醛缩酶的单独催化下转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸在第一脱水酶的催化下生成酮酸；
或以所述含有D-缩醛酶基因、消旋酶基因、第二脱水酶基因的第三重组微生物过表达产生的酶为催化剂进行酶催化反应；甘氨酸和醛类有机物在D-缩醛酶、消旋酶的共同催化下转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸在第一脱水酶的催化下生成酮酸。
进一步地，第一重组微生物还含有烯胺/亚胺脱氨酶基因。
优选的，烯胺/亚胺脱氨酶基因为ridA，基因ridA来自大肠杆菌基因组。
优选的，所述醇类有机物包括苯甲醇、4-咪唑甲醇、2甲硫基乙醇、吲哚-3-甲醇、2-羟乙基-甲基次磷酸、对羟基苯甲醇、3，4-二羟基苯甲醇、对甲基苯甲醇、苯乙醇、特戊醇、异丁醇、乙醇中的一种或几种。以上为优选方案，本发明显然还可以采用其他醇类有机物作为底物。
进一步地，所述L-醛缩酶基因包括ItaE、psald、dhaa、CC_3093、fbaA、itaA、glyA或URA1中的一种或几种；所述第一脱水酶基因包括ilvA、tdcB、TDH、CHA1、TD2、A8H32_14290、Saut_1089、C0627_08730中的一种或几种；所述脱氢酶基因包括adhE、adh、ADH7、xylB、adhA、xylW、ped、leuB、BADH、aldh、ACIAD1578、qbdA中的一种或几种。
进一步地，所述D-缩醛酶基因包括A0A1C9ZZ39_CHLRE、tasS、dna、cghG、folB、guaB、dus、dhaa、bhcC、NCTC12151_01614、A4G23_03658、OJAG_33340、GGC03_18995中的一种或几种；所述消旋酶基因包括ILE2E_LENBU、agiA、puuE、PS659_05479、HRbin10_02390、CVS47_02795、HRbin08_01795、MJ8_44540中的一种或几种；所述第二脱水酶基因包括ilvA、tdcB、TDH、CHA1、TD2、A8H32_14290、Saut_1089、C0627_08730中的一种或几种。
进一步地，包括通过基因工程方法构建所述第一重组微生物、第二重组微生物或第三重组微生物，所述基因工程方法包括质粒表达或基因组整合。
优选的，第一重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：构建包含所述含有L-醛缩酶和第一脱水酶基因的重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微生物中即得到第一重组微生物。
优选的，第二重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：构建包含所述含有脱氢酶基因的重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微生物中即得到第二重组微生物。
优选的，第二重组微生物通过质粒表达的方法进行构建，构建方法为：构建包含所述D-缩醛酶编码基因、消旋酶编码基因及第二脱水酶编码基因的重组表达质粒载体；将重组表达质粒载体转化至微生物中即得到第三重组微生物。
在上述优选的方案中，均通过PCR扩增获得目的基因.
进一步地，质粒载体为pZAlac、pZElac中的一种或两种。
进一步地，重组微生物培养后进行酶催化反应，重组微生物的培养方法为：将重组微生物接种至含有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在20～60℃的条件下培养3～6h，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养15～30h后离心，倒去上清培养液即可。
进一步地，酶催化反应过程中，反应温度为20-90℃，反应缓冲液的PH为6.5-8.5。
进一步地，重组微生物包括重组的大肠杆菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、酵母或链霉菌中的一种或几种。
进一步地，重组微生物包括重组的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、尼古丁降解菌(Pseudomonas sp.)巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis)或毕赤酵母(Pichia pastoris)中的一种或几种。
一种制备二醇类有机物的方法，所述的β-羟基-α氨基酸在脱氨酶、脱羧酶及还原酶的作用下生成二醇类有机物。
本发明还涉及所述的方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用。
有益效果：本发明所述的酮酸制备的方法，其通过提供新型的多酶催化体系，甘氨酸和不同种类的醛生产酮酸在多酶催化体系的作用西进行酶催化反应，所用酶的数量大大少于天然合成途径，生产成本低，其搭建了酮酸的人工代谢平台，能够产生多种中药的酮酸，如苯丙酮酸、4-甲基2-氧戊酸、丙酮酸、2-氧代丁酸等，操作简单，产率高，底物利用率高，污染低。
本发明所述的酮酸制备的方法，应用于氨基酸及氨基酸衍生物的制备过程中，可实现多种氨基酸及氨基酸衍生物的高产量和高产率制备，实现工业化大批量生产。
本发明还可应用于二醇类有机物的制备。
附图说明
图1为R2体系苯甲醛和甘氨酸生产苯丙酮酸的过程曲线。
图2为R3、R4体系异丁醛和甘氨酸生产4-甲基-2-氧戊酸的过程曲线。
图3为R5体系乙醛和甘氨酸生产2-氧代丁酸的过程曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。
替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。
如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。转移的核酸通常连接到例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。很多载体在本领域中是已知的，包含但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体、细菌噬菌体以及动物病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。
在一些实施例中，L-缩醛酶编码基因包括ItaE基因、枯草芽孢杆菌的fbaA基因、假单胞菌的psald基因等、脱水酶基因包括大肠杆菌ilvA基因、假单胞杆菌的thadh基因、伯克霍尔德菌的A8H32_14290_14160基因、枯草芽孢杆菌的thrc基因等。
以A8H32_14290表示来自伯克霍尔德菌的脱水酶A8H32_14290_14160。
所述基因可以是野生型或突变型，例如在一些实施例中，所述A8H32_14290_14160基因可以为野生型的A8H32_14290或突变型A8H32_14290m，突变型A8H32_14290m是指使用PLP作为辅酶的A8H32_14290突变型基因，该突变型A8H32_14290与使用PLP为辅酶的野生型A8H32_14290不同，突变型A8H32_14290携带S246A、E291A的变异。
在一些实施例中，所述L-缩醛酶(ItaE)、脱水酶(ilvA，tdcB),烯胺/亚胺脱氨酶(ridA)来自大肠杆菌基因组。
在一些实施例中，所述L-缩醛酶(ItaE)可以来自恶臭假单胞菌，在本发明中以ItaE-Pp表示来自恶臭假单胞杆菌的L-缩醛酶。
在一些实施例中，所述脱水酶(A8H32_14290)可以来自伯克霍尔德菌。
上述基因利用DNA引物通过PCR反应获得。
本发明用到的载体中，包含前述任一项的多核苷酸分子，所述载体中还包含常用元件，包括但不限于复制起始位点(Origin of replication，ORI)、抗生素抗性基因、多克隆位点(multiple cloning site,MCS)、启动子、增强子、引物结合位点、选择标记中的一种或多种。
在一些实施例中，载体为质粒载体，质粒为pZAlac、pZElac中的一种或两种。
根据NCBI公布的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组序列设计引物：
ItaE_Pp-F:GAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGACAGACAAGAGCCAACAATTCGCCAGCG；
ItaE_Pp-R:AGGTCGACATAGTTAATTTCTCCTACTAGTTCAGCCACCAATGATCGTGCGGATATCCGC；
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物：
ItaE-F:TTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGATTGATTTACGCAGTGATACCG
ItaE-R:CAGCCATAGTTAATTTCTCCTACTAGTTCAGCCACCAATGATCGTGCGGATATCC；
ilvA-F:GCGCGTTAAACTAGTAGGAGAAATTAACTATGGCTGACTCGCAACCCCTGTCC)；
ilvA-R:CTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGACTAACCCGCCAAAAAGAACCTGAACGCCG；
根据NCBI公布的芽孢杆菌(Bacillus badius)的基因组序列设计引物:
pdh-F:CATCCGCATTTAAGCTAGCAGGAGAAATTAACTATGAGCCTGGTGGAAAAAACCAGCAT；
pdh-R:ATTTGATGCCTCTAGAGCTAGCTTAATTACGAATATCCCATTTCGGTTTAAC
根据NCBI公布的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的基因组序列设计引物:
A0A1C9ZZ39_CHLRE-F:GAATTCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGCGCGCACTGGTTAGCAAAGCACG
A0A1C9ZZ39_CHLRE-R:GCCCATAGTTAATTTCTCCTgctagcTCACTGGCCAGGACCACGACCACGAATC
根据NCBI公布的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)的基因组序列设计引物:
ILE2E_LENBU-F:CCAGTGAGCTAGCAGGAGAAATTAACTATGGGCAAACTGGACAAAGCGAGCAAAC
ILE2E_LENBU-R:GACATAGTTAATTTCTCCTAAGCTTTCACCAGCCAATTTTACCGGTGTCTTTCGGA
根据NCBI公布的伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis E264)的基因组序列设计引物有两组：
A8H32_14290-F:GGTGGCTGAACTAGTAGGAGAAATTAACTATGTCGACCTCACCCCACCGCCCCGCTCAT；
A8H32_14290-R:ATAGTTTTGCTCATAGTTAATTTCTCCTGCTAGCTCACGGCCACGACATGCGATGCAGCCGAGC)
A8H32_14290’-F:TGGCTGGTAAAAGCTTAGGAGAAATTAACTATGTCGACCTCACCCCACCGCCCCG
A8H32_14290’-R:CGTTTTATTTGATGCCTCTAGATCACGGCCACGACATGCGATGCAGCCGAG
根据NCBI公布的大肠杆菌MG1655的基因组序列设计引物：
ridA-F：
CATGTCGTGGCCGTGAGCTAGCAGGAGAAATTAACTATGAGCAAAACTATCGCGACGGAAAATGC
ridA-R:
GCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTCTAGATTAGCGACGAACAGCGATCGCTTCGATC
根据NCBI公布的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因组序列设计引物：
xylB-F:TCATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGGCGGTATTTGCCAGTGACTCTTTTG
xylB-R:CATAGTTAATTTCTCCTGCTAGCTTAAATGCGGATGATGGTCGTCTTTG
通过PCR获取对应的基因片段，通过限制性内切酶消化后，通过连接酶，连接在质粒pZElac上，得到重组表达质粒载体pZE-ItaE_Pp-A8H32_14290、pZE-ItaE_Pp-A8H32_14290-ridA、pZE-ItaE-ilvA、pZE-ItaE-ilvA--ridA、pZA-xylB-pdh、pZE-A0A1C9ZZ39_CHLRE-ILE2E_LENBU-A8H32_14290’。
其中：
ItaE_Pp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
ItaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
A8H32_14290基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
ridA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
xylB基因编的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
A0A1C9ZZ39_CHLRE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
ILE2E_LENBU基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
实施例4用到的pdh基因编码的脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
实施例1
本实施例以甘氨酸和苯甲醛为原料，产物为苯丙酮酸。
将重组表达质粒载体pZE-ItaE_Pp-A8H32_14290，pZE-ItaE_Pp-A8H32_14290-ridA分别转化至表达菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21中，得到重组大肠杆菌，标记为R1,R2。将重组大肠杆菌接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃下于50ml三角瓶中(装液量10mL)培养3-6个小时，转速240rpm，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养20h，以进行蛋白质表达。在4℃条件下离心5分钟，转速8000rpm，倒去上清培养液，得到菌液，冰浴待用。
在一个2ml体系中，加入上述菌液，体系中含有50mM的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，以20g/L的比例加入甘氨酸(该比例为甘氨酸与体系的比例)，并加入4.6g/L苯甲醛，在30℃摇床、240rpm的条件下振荡反应24个小时，得到含苯丙酮酸的转化液。其中，每催化2小时取样检测苯丙酮酸的生成；将所得的转化液用去离子水稀释20倍，12500转/分离心10～15分钟，吸取上清稀释进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。经测定，催化反应24h之后，R1体系产生苯丙酮酸3.6g/L，催化反应12h后，R2体系产生苯丙酮酸5g/L。R2体系中，增加基因ridA能加快从中间体烯胺到终产物的速度，进而让反应更快，并提高产物浓度及产量。
实施例2
本实施例以甘氨酸和异丁醛为原料，产物为4-甲基-2-氧戊酸。
将重组表达质粒载体pZE-ItaE-ilvA、pZE-ItaE-ilvA--ridA，分别转化至表达菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21中，得到重组大肠杆菌，标记为R3,R4。将重组大肠杆菌接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃下于50ml三角瓶中(装液量10mL)培养3-6个小时，转速240rpm，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养20个小时，然后在4℃离心5分钟，转速8000rpm，倒去上清培养液，得到菌液，冰浴待用。
在一个2ml体系中，加入上述菌液，体系中含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，20g/L的甘氨酸和2.6g/L的异丁醛，在30℃摇床，240rpm的条件下振荡反应24个小时，得到含苯丙酮酸的转化液。其中，每催化2小时取样检测氧代戊酸的生成；将所得的转化液用去离子水稀释20倍，12500转/分离心10～15分钟，吸取上清稀释进行高效液相色谱分析，测定催化体系中产物的浓度。经测定，催化反应26h，体系R3产生4-甲基-2-氧戊酸1.9g/L，体系R4产生4-甲基-2-氧戊酸3.1g/L。增加基因ridA能加快从中间体烯胺到终产物的速度，进而让反应更快，并提高产物浓度及产量。
实施例3
本实施例以甘氨酸和乙醛为原料，产物为2-氧代丁酸。
将重组表达质粒载体pZE-ItaE-ilvA转化至表达菌株大肠杆菌Escherichia coliBL21中，得到重组大肠杆菌，标记为R5。将重组大肠杆菌接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃下于50ml三角瓶中(装液量10mL)培养3-6个小时，转速240rpm，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养20个小时。在4℃条件下离心5分钟，转速8000rpm，倒去上清培养液，得到菌液，冰浴待用。
在一个2ml体系中，加入上述菌液，体系中含有50mM的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，以20g/L的量加入甘氨酸，并加入15ml乙醛,在30℃、240rpm的条件下摇床发酵，振荡反应3个小时，得到含2-氧代丁酸的转化液，将所得的转化液用去离子水稀释10倍，12500转/分离心10～15分钟，吸取上清稀释进行高效液相色谱分析，测定产物的浓度。经测定，催化反应18h后，共产生2-氧代丁酸1.4g/L。
实施例4
本实施例以甘氨酸和苯甲醇为原料，产物为苯丙酮酸和苯丙氨酸。将重组表达质粒载体pZE-ItaE_Pp-A8H32_14290、pZA-xylB-pdh同时电转至表达菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21中，得到重组大肠杆菌，标记为R6。(其中pdh基因编码把苯丙酮酸还原为苯丙氨酸的酶，该实施例中，底物酮酸进一步转化为氨基酸)。将菌种接入含有氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃下于50ml三角瓶中(装液量10mL)培养3-6个小时，转速240rpm，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养20个小时。在4℃离心5分钟，转速8000rpm，倒去上清培养液，得到菌液，冰浴待用。
在一个2ml体系中，加入上述菌液，使之含有50mM的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，以20g/L的比例加入甘氨酸并以4.6g/L的比例加入苯甲醇，在30℃、240rpm的条件下摇床发酵，振荡反应24h，得到含苯丙氨酸的转化液。催化反应24h之后，将所得的转化液用去离子水稀释20倍，12500转/分离心10～15分钟，吸取上清稀释进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。经测定，R6体系产生苯丙酮酸2.3g/L，苯丙氨酸1.2g/L。
实施例5
本实施例以甘氨酸和苯甲醛为原料，产物为苯丙酮酸(D-缩醛酶)
将重组表达质粒载体pZE-A0A1C9ZZ39_CHLRE-ILE2E_LENBU-A8H32_14290’转化至表达菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21中，得到重组大肠杆菌，标记为R7。将重组大肠杆菌接入含有氨苄青霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃下于50ml三角瓶中(装液量10mL)培养3-6个小时，转速240rpm，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养20h，以进行蛋白质表达。在4℃条件下离心5分钟，转速8000rpm，倒去上清培养液，得到菌液，冰浴待用。
在一个2ml体系中，加入上述菌液，体系中含有50mM的pH为7.5的Tris-HCl缓冲液，以20g/L的比例加入甘氨酸(该比例为甘氨酸与体系的比例)，并加入4.6g/L苯甲醛，在30℃摇床、240rpm的条件下振荡反应24个小时，得到含苯丙酮酸的转化液。其中，每催化2小时取样检测苯丙酮酸的生成；将所得的转化液用去离子水稀释20倍，12500转/分离心10～15分钟，吸取上清稀释进行高效液相色谱分析，测定催化体系中底物和产物的浓度。经测定，催化反应24h之后，R7体系产生苯丙酮酸2.6g/L。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
SEQUENCE LISTING
<110> 西湖大学
<120> 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用
<130> 2022
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1041
<212> DNA
<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400> 1
atgacagaca agagccaaca attcgccagc gacaactatt ccggtatctg ccccgaagcc 60
tgggtggcga tggagaaagc caaccgcggc cacgaccgcg cctacggcga cgaccagtgg 120
accgagcgtg catcggagta cttccgcaat ctgttcgaaa ccgactgcga ggtgttcttt 180
gccttcaacg gcaccgcggc caactccctg gccctggcat ccctgtgcca gagctatcac 240
agcgtgatct gctccgagac cgcccacgtc gaaaccgacg aatgcggtgc accggagttt 300
ttctccaacg gctccaagct gctgacggcg gccagcgtca acggcaagct gacgccacag 360
tcgatccgcg aagtggcgct caaacgccag gatatccact accccaagcc gcgcgtggtg 420
accattaccc aggccaccga agtgggcacg gtgtaccgcc ccgacgagct gaaggcgatc 480
agcgccacct gcaaggagct gggcctgaac ctgcacatgg acggcgcacg ctttaccaat 540
gcctgtgcgt tcctgggctg cagcccggcc gaactgacct ggaaggccgg tgtggatgtg 600
ctgtgctttg gcggcaccaa gaacggcatg gcggtgggcg aagcgattct gttcttcaac 660
cgccagctgg ccgaagactt cgattatcgc tgcaagcagg ccgggcaact ggcgtcgaag 720
atgcgcttct tgtcggcgcc ctgggtcggg ctgctggaag atggcgcatg gttacgccat 780
ggcaaccacg ccaatcattg cgcgcaactg ctggcatcgc tggtcagtga cctgccgggg 840
gtagagctga tgttcccggt ggaggccaac ggggtgttcc tgcagatgcc agagcacgcc 900
atcgaggcgc tgcggggcaa gggctggcgc ttctatacct ttatcggcag cggtggcgcg 960
cgcttcatgt gctcgtggga taccgaagaa gcgcgggtgc gtgagctggc ggcggatatc 1020
cgcacgatca ttggtggctg a 1041
<210> 2
<211> 1002
<212> DNA
<213> MG1655 E.coli Strain
<400> 2
atgattgatt tacgcagtga taccgttacc cgaccaagcc gcgccatgct cgaagcgatg 60
atggccgccc cggttgggga cgacgtttac ggagacgacc ctaccgttaa tgctctgcag 120
gactacgcag cagagctttc cggtaaagaa gccgccattt ttctgcctac cggcactcag 180
gccaacctgg tcgctctgct cagtcactgc gaacgcggcg aagagtatat tgtcggtcag 240
gccgcgcata actatctgtt tgaagccggt ggcgcggcgg tgctgggcag tattcaaccg 300
caacccatag acgcggctgc cgacggcacg ctaccgctgg ataaagtggc gatgaaaatc 360
aaacccgacg atatccattt cgcccgcacc aaattactca gtctggaaaa cacccacaac 420
ggcaaagtgt tgccgcggga atacctgaaa gaagcatggg aatttacccg cgagcgcaat 480
ctggcgctgc atgttgacgg tgcgcgcatc tttaatgccg tggtggctta cggctgcgaa 540
ctgaaagaga tcacgcaata ttgtgattcg ttcaccattt gcctgtcgaa aggtcttggg 600
acgccagtcg gttcattact cgtcggtaat cgtgattaca ttaaacgtgc cattcgctgg 660
cggaaaatga caggtggcgg gatgcgccag tccggcattc tggctgccgc cgggatatat 720
gccctgaaaa ataacgttgc gcgcttgcag gaagaccacg acaacgctgc ctggatggcg 780
gagcagctgc gtgaagcagg cgcggatgtg atgcgtcagg acaccaatat gctgtttgtt 840
cgcgtcgggg aagaaaatgc tgccgcgtta ggcgaataca tgaaagcgag aaacgtgctg 900
attaacgcct cgccgattgt ccgcctggtg acgcatcttg acgtctcgcg cgaacaactg 960
gcggaagtcg ccgcccactg gcgtgcattc ctggcgcgtt aa 1002
<210> 3
<211> 1545
<212> DNA
<213> MG1655 E.coli Strain
<400> 3
atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg 60
ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg 120
tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180
tttaagctgc gcggcgcata cgccatgatg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240
ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300
ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360
gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420
aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccgccgtt cgaccatccg 480
atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540
gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600
aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660
aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720
ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780
gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840
gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900
gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960
ttccacggcc tgcgctacgt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020
ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080
gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140
gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200
gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc gacgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260
tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320
ccggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380
tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440
cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctgggcta cgattgccac 1500
gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttag 1545
<210> 4
<211> 1032
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德菌（Burkholderia thailandensis E264）
<400> 4
atgtcgacct caccccaccg ccccgctcat ctgacgatca acggcgagcc gattccgacg 60
ctcgacgaaa tcgccgcgca gcacttcgcg ctcacgccgt gggtcacgcg tacgccggtg 120
ttcgagcgcg ccgatctgcc atcgctcgac aacacgcacg tgaacttcaa gttcgagctg 180
ctgcaggcga gcggcagctt caaggcgcgc ggcgcgttca cgaacctgct cgcgctcggc 240
gaggacagaa agcgcgcggg cgtcacctgc gtgtcggcgg gcaatcatgc ggcggccgtc 300
gcttatgcgg cgatgcggct cggcacgagc gcgaaggtcg tgatgttcga caccgcgagc 360
ccggcgcgcg tcgagctctg ccaccagtac cgcgcggagg tcgtgatggc gtcgagcccc 420
gccgacgcgt tcgagatcgt ccggcgaatc gaggccgagg aaggccgctt cttcgtgcat 480
ccgttcaacg gctatcacac gattctcggc accgcgacgc tcggctacga atgggcgacg 540
cagacgcccg acctcgatgc ggtgatcgtg ccgatcggcg gcggcggcct cgccgcgggc 600
acctcgaccg cgctgcggct tgcgaatccg cgcgtgcacg tgtacggcgt cgagccggaa 660
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catacgatcg ccgattcgct gatggcgccg cacaccgagg agtacagcta cgagctgtgc 780
cgccgccatg tcgaccggat cgtcaccgtc tcggacgacg cgctgcgagc ggcgatgctc 840
tatttgttca cgcatctgaa agtggcggtc gagcccgcgt gcgcggccgc gacggccgcc 900
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accaacatcg attcgacggc gctcgccacg catctcgagc atgctcggct gcatcgcatg 1020
tcgtggccgt ga 1032
<210> 5
<211> 401
<212> DNA
<213> MG1655 E.coli Strain
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aggagaaatt aactatgagc aaaactatcg cgacggaaaa tgcaccggca gctatcggtc 60
cttacgtaca gggcgttgat ctgggcaata tgatcatcac ctccggtcag atcccggtaa 120
atccgaaaac gggcgaagta ccggcagacg tcgctgcaca ggcacgtcag tcgctggata 180
acgtaaaagc gatcgtcgaa gccgctggcc tgaaagtggg cgacatcgtt aaaactaccg 240
tgtttgtaaa agatctgaac gacttcgcaa ccgtaaacgc cacttacgaa gccttcttca 300
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<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）
<400> 6
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cagtggaacc actacattaa cggggaatac gtatcacccg aatctgaaga gtatatccac 120
gagttcatcc caaccacggc tttgccgggt gactcaatcg caaggggctc ggcagctgac 180
gttgataagg ctgttcgtgc cgcggcagcg gctcagcctg cctggaatgc acgcaagcca 240
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ttctgcgcca aagaagcgga agaaactggc aagcctctga agatggccgc ctttgagatc 360
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cagttcgcgg aactggttgt gaaagaggca gggttgccac caggcgtatt gaacgtggtt 660
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ctggatcgag ctgtcgcggg tagcgtcttt gccttcaccg tcaacactgg tcaagtctgt 900
ctcgccggga cccgttgcct ggtgcatgag tcgatttttg aaaaattctc caagaagctt 960
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<400> 7
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gaaaaactga aaggtgttat ggcaggtttt cctggtgttg cagttcgtcc gcatgcaaaa 240
gcacataaat gtgcagaagt tgcccgccgt cagctgcagc tgctgggtgc taaaggtgtt 300
tgctgtcaga aagttattga agcggaagca atggcagaag gtggtgtttc cgatctgctg 360
ctgagcaatg aagtgattgc acctcgtaaa atcgatcgtc tggttggtct ggcagcggcc 420
ggtgcacgcg ttggtgtgtg ttatgaacgt gaagataatc tgcgtcagct gaatgccgca 480
gcagcagcac gtggtacaca tctggatgtt ctggttgaac tgaatgttgg tcaggatcgt 540
tgtggtgtta atagcgccga tgaagttgtt cagctggccc gtgcagccgc cggtctggat 600
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cgtgatcgcg cacagcgtgt tggtcaggtt gttggtcgtg cacgtgcagc agttgatgcg 720
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ggtacaaaag cagtgtctct ggatagtggt ccgccgcgtc tgccgccggc atttgaagct 1020
gcatacggta caatgatgga atatggctct ggtggtgatg aacatggtaa actgatgtgg 1080
ccgcagggtg cgtatcagct gccgatgtca ctgcctgaag ttggtagcct gctgctgctg 1140
cagccgggtc attgtgatcc gacagttaat ctgtatgatt ggctggtggc cgcgcgtcgt 1200
cagcagggtg gtcagcagca gggtggcgtt gatggttggc gtgttgaagc agtttggccg 1260
attcgtggtc gtggtcctgg ccagtga 1287
<210> 8
<211> 1353
<212> DNA
<213> 布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri)
<400> 8
atgggcaaac tggacaaagc gagcaaactg atcgacgaag aaaataaata ctacgcacgt 60
agcgcgcgta tcaactacta caacctggtg attgaccacg cccacggcgc aaccctggtg 120
gatgtggatg gaaataaata tatcgatctg ctggcaagcg caagcgcaat taatgttggt 180
catacccatg aaaaagttgt gaaagcaatt gcagatcaag cacaaaaact gattcattat 240
accccggcat acttccacca cgttccgggt atggaactga gcgaaaaact ggcaaaaatt 300
gcaccgggta atagccctaa aatggtgagt tttggaaata gcggaagcga tgcaaatgat 360
gcaattatca aatttgcacg tgcatatacg ggacgtcagt atattgttag ttacatgggt 420
agctatcacg gaagcaccta cggtagccag acactgtcag gttcaagcct gaatatgacc 480
cgcaaaatcg gtccgatgct gccgagcgtt gttcatgttc cgtatccgga ttcatatcgc 540
acctacccgg gagaaactga gcacgatgtt agcctgcgtt attttaatga gtttaaaaag 600
ccgttcgaga gctttctgcc tgcagatgag accgcatgtg ttctgattga accgattcag 660
ggcgatggag gtattattaa agcaccggaa gaatatatgc agctggtgta taaattttgt 720
catgaacatg gtatcctgtt tgcaattgat gaagttaatc aaggcctggg tcgtacagga 780
aaaatgtggg caatccagca gtttaaagat attgaaccgg atctgatgag cgttggtaaa 840
agcctggcgt ctggtatgcc gctgagcgca gttatcggta aaaaggaagt tatgcagagc 900
ctggacgcac ctgcacacct gtttaccacc gcaggtaatc cggtttgtag tgcagcaagc 960
ctggcaactc tggacgttat tgaatatgag gggctggtgg agaaaagcgc aaccgacggt 1020
gcatatgcca aacaacgttt tctggaaatg caacagcgcc atccgatgat cggagatgtt 1080
cgtatgtggg ggctgaatgg gggtattgaa ctggttaaag acccgaaaac caaagaacct 1140
gatagtgacg cagcaaccaa agtgatttac tacgcctttg cacacggggt tgtaattatt 1200
acgctggcag gcaacattct gcgctttcaa ccgccgctgg ttatcccgcg tgaacaactg 1260
gatcaggcac tgcaggtgct ggatgacgcc tttaccgcag tcgaaaatgg ggaagttacc 1320
attccgaaag acaccggtaa aattggctgg taa 1353
<210> 9
<211> 1143
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌（Bacillus badius)
<400> 9
atgagcctgg tggaaaaaac cagcattatt aaagatttta ccctgtttga aaaaatgagc 60
gaacatgaac aggttgtttt ttgtaatgat ccggcaaccg gtctgcgtgc aattattgca 120
attcatgata ccaccctggg tccggcactg ggtggttgtc gtatgcagcc gtataatagc 180
gttgaagaag cactggaaga tgcactgcgt ctgagcaaag gtatgaccta taaatgtgca 240
gcaagcgatg ttgattttgg tggtggtaaa gcagttatta ttggtgatcc gcagaaagat 300
aaaagcccgg aactgtttcg tgcatttggt cagtttgttg atagcctggg tggtcgtttt 360
tataccggta ccgatatggg taccaatatg gaagatttta ttcatgcaat gaaagaaacc 420
aattgtattg ttggtgttcc ggaagcatat ggtggtggtg gtgatagcag cattccgacc 480
gcaatgggtg ttctgtatgg tattaaagca accaataaaa tgctgtttgg taaagatgat 540
ctgggtggtg ttacctatgc aattcagggt ctgggtaaag ttggttataa agttgcagaa 600
ggtctgctgg aagaaggtgc acatctgttt gttaccgata ttaatgaaca gaccctggaa 660
gcaattcagg aaaaagcaaa aaccaccagc ggtagcgtta ccgttgttgc aagcgatgaa 720
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gaaaccatga aacagtttaa agttaaagca attgcaggta gcgcaaataa tcagctgctg 840
accgaagatc atggtcgtca tctggcagat aaaggtattc tgtatgcacc ggattatatt 900
gttaatagcg gtggtctgat tcaggttgca gatgaactgt atgaagttaa taaagaacgt 960
gttctggcaa aaaccaaaca tatttatgat gcaattctgg aagtttatca gcaggcagaa 1020
ctggatcaga ttaccaccat ggaagcagca aatcgtatgt gtgaacagcg tatggcagca 1080
cgtggtcgtc gtaatagctt ttttaccagc agcgttaaac cgaaatggga tattcgtaat 1140
taa 1143

Claims (3)

1.一种制备酮酸的方法，其特征在于，以甘氨酸及醛类有机物为底物，以含有D-缩醛酶基因、消旋酶基因、第二脱水酶基因的第三重组微生物过表达产生的酶为催化剂进行酶催化反应；甘氨酸和醛类有机物在D-缩醛酶、消旋酶的共同催化下转化成β-羟基-α氨基酸，β-羟基-α氨基酸在第二脱水酶的催化下生成酮酸；
所述醛类有机物为苯甲醛，所述第三重组微生物为通过基因工程方法将重组表达质粒载体pZE-A0A1C9ZZ39_CHLRE-ILE2E_LENBU-A8H32_14290’转化至表达菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21中，得到重组大肠杆菌；所述D-缩醛酶基因为A0A1C9ZZ39_CHLRE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述消旋酶为ILE2E_LENBU基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述第二脱水酶为A8H32_14290基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述酮酸为苯丙酮酸。
2.根据权利要求1所述的制备酮酸的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌的培养方法为：将重组大肠杆菌接种至含有氨苄青霉素和氯霉素的2-xyT培养基中，在30℃的条件下培养3～6h，加入IPTG至终浓度0.3mM，继续培养15～30h后，在4℃条件下离心，倒去上清培养液即可。
3.根据权利要求1所述的制备酮酸的方法，其特征在于，所述酶催化反应过程中，反应温度为30℃，反应缓冲液的PH为7.5。
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