CN114250237B - 一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用 - Google Patents

一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用，所述突变体编码基因核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；本发明所提供的酪氨酸酚裂解酶突变体与野生型相比，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达146g/L以上，与野生型相比提高了25％～45％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％‑20％。

Description

一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴 中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种酪氨酸酚裂解酶突变体，工程菌及应用。
(二)背景技术
随着全球老龄化的加剧，老年性疾病日渐增多已是无法回避的现实，帕金森病是近年来逐渐引起公众密切关注的一种老年性疾病，是一种中枢神经系统常见的慢性病。
多巴胺是治疗帕金森综合征的主要物质，但由于其不能通过血脑屏障到达中枢神经系统发挥作用，而左旋多巴(β-3,4-二羟苯基-α-丙氨酸，3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine，L-DOPA)能过通多血脑屏障，达到中枢神经系统，在脱羧酶的作用下，转化为多巴胺，进而发挥治疗帕金森综合征的作用，因此左旋多巴作为治疗帕金森综合征的首选药物。由于帕金森病患者数目日益增加，左旋多巴的需求量也不断增加。
酪氨酸酚裂解酶(TPL)因其反应条件温和、过程高效、高度立体选择性等优点已成为合成左旋多巴的主要生物催化法。TPL广泛存在于多种微生物中，如假单胞菌属、真菌、链霉菌等，目前已报道用于左旋多巴的TPL来源包括具核酸杆菌(Fusobacteriumnucleatum)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)，弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)以及嗜热菌(Symbiobacterium sp.)等。
目前已报道来源于具核酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶(Fn-TPL)以邻苯二酚、丙酮酸钠和氨为底物，通过C-C键形成反应合成左旋多巴产量最高。但由于底物邻苯二酚并非该酶的天然底物，其催化效率有待提高，另一方面，高浓度的邻苯二酚会对酶和细胞产生毒害作用，甚至使酶不可逆的失活，最终抑制左旋多巴的合成。
定向进化(Directed evolution)是近年发展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成的进化过程。
易错PCR(error prone PCR)是一种简便快速地在DNA序列中随机制造突变的方法，它通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变。其核心思想是随机地改变编码蛋白质的基因序列，获得文库，然后通过大量的筛选从文库中获得正向进化的目的基因。一般来说，合适的突变频率是每个序列2～3个碱基或1个氨基酸残基突变。本发明引入易错PCR突变，利用高通量筛选方法获得左旋多巴高产菌株。
(三)发明内容
本发明目的是通过定向进化手段对来源于具核酸杆菌的酪氨酸酚裂解酶进行改造，提供一种酪氨酸酚裂解酶突变体，工程菌及应用，以邻苯二酚、丙酮酸钠和氨为底物，高效催化合成左旋多巴，酶活提高了1.9-3.2倍，左旋多巴的最终产量最高达到146g/L，邻苯二酚转化率达到99.8％。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种酪氨酸酚裂解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第402位或第409位进行易错PCR单突变获得的。
进一步，优选所述突变体是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第402位赖氨酸突变为苏氨酸(K402T，氨基酸序列为SEQ ID NO：4，核苷酸序列为SEQ ID NO：3)或第409位苏氨酸突变为丙氨酸(T409A，氨基酸序列为SEQ ID NO：6，核苷酸序列为SEQ ID NO：5)。任何对SEQID NO.4和SEQ ID NO.6所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或者替换一个或几个氨基酸且具有TPL活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明所述SEQ ID NO：2所示氨基酸序列来源于具核梭杆菌(F.nucleatumsubsp.CGMCC 1.2526)，编码基因序列为SEQ ID NO：1所示。从具核酸杆菌CGMCC1.2526提取的基因组为模板，成功克隆了编码TPL的基因(Fn-TPL)，转化于大肠杆菌(Escherichiacoli)后进行了该基因的表达；再从大肠杆菌中提取含Fn-TPL质粒，使用易错PCR方法对TPL基因进行随机突变，连接于表达载体后，同样表达于大肠杆菌，通过高通量筛选方法获得活力提高的突变体。本发明对SEQ ID NO.1编码的TPL进行突变，可采用常规的分子改造手段。优先地，通过易错PCR扩增，改变PCR体系内Mn2+浓度，以获得突变体DNA序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6。
进一步，本发明还涉及所述酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因、编码基因构建的重组载体(优选质粒pET-28b(+))以及重组载体转化得到的基因工程菌，所述工程菌以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为宿主构建获得。本发明可通过本领域常规方法将本发明的TPL突变体的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28b(+)。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将获得的野生型TPL及突变体基因产物与载体pET-28b(+)连接，构建本发明的TPL突变基因重组表达质粒pET-28b(+)-Fn-TPL、pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T和pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A。引入编码本发明的TPL突变体的DNA的宿主细胞没有限制，只要已经为其建立了重组表达系统，满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的TPL突变基因可以有效表达。例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、曲霉菌，以及动物细胞和高等植物细胞。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET-28b(+)-Fn-TPL、pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T和pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL、E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-K402T和E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-T409A。
本发明TPL突变体的制备包括培养本发明的重组表达转化体，诱导获得TPL突变蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的TPL的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生TPL即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-K402T或E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-T409A接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的TPL突变蛋白。
进一步，本发明还涉及所述酪氨酸酚裂解酶突变体在合成左旋多巴中的应用，所述应用的方法为：以含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸钠和乙酸铵为底物，以亚硫酸钠和EDTA·Na2为助剂，以磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5’-phosphate,PLP)为辅酶，以pH 6.0～10.5(优选pH 8.5)的缓冲液为反应介质构成转化体系，在温度5～30℃(优选15℃)、转速100～200rpm(优选150rpm)条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得左旋多巴。
进一步，所述转化体系中，邻苯二酚加入终浓度5～50g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠加入终浓度5～50g/L(优选7g/L)，乙酸铵加入终浓度0.1～1.4M(优选0.4M)，亚硫酸钠加入终浓度0.5～10g/L(优选1g/L)，EDTA·Na2加入终浓度0.5～10g/L(优选2g/L)，磷酸吡哆醛加入终浓度0.05～5mM(优选1mM)，湿菌体用量为2～50g/L(优选20g/L)。
进一步，所述转化反应过程中对邻苯二酚、丙酮酸钠和乙酸铵进行补料，每隔0.5～4h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，丙酮酸钠每次补料0.1～10g/L(优选5g/L)，醋酸铵每次补料1～20g/L(优选3.5g/L)。
本发明提供的TPL突变体可以以游离酶、固定化酶以及重组游离细胞的形式催化合成左旋多巴。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养8～16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，2％琼脂，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的乳糖以终浓度为15g/L的量直接添加到发酵罐中于28℃下诱导培养6～8h后，放罐收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨25g/L，酵母粉6.55g/L，NaCl 10g/L，蔗糖9.1g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM，MgSO4 5mM，KH2PO4 10mM，溶剂为蒸馏水，pH自然。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明所提供的酪氨酸酚裂解酶突变体与野生型相比，具有更优良的催化性能。TPL突变体合成左旋多巴累积浓度高达146g/L以上，与野生型相比提高了25％～45％，光学纯度大于99.5％；底物邻苯二酚的转化率达到99.8％以上，与野生型相比较提高了15％-20％。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、TPL基因的获得
用DNA提取试剂盒(购自Thermo Fisher Scientific公司)提取具核酸杆菌(F.nucleatum subsp.CGMCC 1.2526，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的全基因组DNA，以该DNA为模板，上游引物(5’TGTTAGCAGCCGGATCTCAGT3’)和下游引物(5’GGAGATATACCATGCGCTTTGA3’)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：5×PrimeSTARTM HS DNA polymerase Buffer10μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μL，浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，基因组DNA 1μL，PrimeSTARTM HS DNA polymerase 0.5μL，无核酸水32.5μL。PCR反应条件为：预变性95℃5min，然后进入温度循环95℃1min，55℃1min，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。测序分析结果表明，经上述过程扩增得到编码TPL的基因(Fn-TPL)，核苷酸序列长度为1383bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2、易错PCR构建TPL突变文库
以实施例1获得的TPL基因为模板，通过易错PCR扩增，获得突变序列。扩增引物为：
(5’TGTTAGCAGCCGGATCTCAGT3’)和(5’GGAGATATACCATGCGCTTTGA3’)。
扩增体系为：50μl反应体系：
10×Taq polymerase buffer：5μL；Mg2+(25mM)：2-16μL；Mn2+(5mM):2-20μL；10mMdNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)4μl；浓度为50μM的上游引物、下游引物各1μL，DNA模板：1μL；Taq DNA聚合酶：0.5μL；用双蒸水补足体系。
PCR反应条件为：预变性95℃5min，然后进入温度循环95℃1min，55℃1min，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析和切胶回收，由BamHI/XhoI进行双酶切，与同样进行酶切处理的pET28b(+)连接，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，取上清液用于筛选TPL突变文库。
实施例3、TPL突变文库的筛选
采用水杨醛分光光度法对实施例2构建的TPL突变文库进行筛选，其显色原理是：在碱性条件下，丙酮酸钠和水杨醛会发生克莱森-施密特(Claisen-Schmidt)反应，生成一种黄色化合物，该物质的颜色深浅与丙酮酸钠的含量成正比，再利用分光光度计在特定波长下测定反应液的吸光值进行测定。
显色反应的具体反应步骤为：在1mL标准反应体系中，按顺序先后加入100μL250g/L NaOH水溶液，40μL上清液，560μL超纯水，20μL水杨醛显色液，充分摇匀后加入200μL250g/L NaOH水溶液，80μL超纯水，室温下放置2h后，取200μL显色反应液于96孔标准板，通过酶标仪于波长465nm处测吸光值，根据吸光值的变化比较突变体酶活的变化。以突变前的酶为参照，通过显色反应，从4000个突变株中初筛获得表1所示活力提高的阳性克隆，进一步通过液相色谱测定。检测条件如下：液相色谱仪为EClassical 3100，色谱柱为：C18柱(Welch,5μm×250×4.6mm)；柱温：34℃；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测波长：UV 280nm；流动相：20mM KH2PO4(HCl调pH至2.6)：甲醇＝9:1。在上述色谱条件下，L-DOPA和邻苯二酚的出峰时间分别为4.073min和17.00min。
通过液相色谱检测，获得表1所示活性最高的突变体67-3-D9和35-1-C1，测序表明突变体67-3-D9(K402T)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；突变体35-1-C1(T409A)氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。
表1 TPL突变体文库中的初筛数据
a在水杨醛分光光度法初筛中，Fn-TPL的吸光值为100％时，其吸光值为0.9841。
实施例4野生型和突变体TPL工程菌的诱导表达
1、工程菌的构建：
分别将野生型TPL(SEQ ID No.1)及突变体基因(SEQ ID No.3和SEQ ID No.5)与载体pET-28b(+)连接，构建重组表达质粒pET-28b(+)-Fn-TPL、pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T和pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A。
将重组质粒pET-28b(+)-Fn-TPL、pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T和pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A分别转化至E.coli BL21(DE3)中，分别获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL、E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-K402T和E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Fn-TPL-T409A。
2、工程菌的诱导表达
分别将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T和E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以2％(v/v)接种量接种到含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养6～8h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体，于-80℃贮存备用。
实施例5、TPL突变体催化剂的制备
(1)斜面培养：将工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A分别接种至含50μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37℃培养16h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，2％琼脂，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，使用前加入50μg/ml卡那霉素。
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37℃培养8～10h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，50μg/ml卡那霉素，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的乳糖以终浓度为15g/L的量直接添加到发酵罐中，于28℃下诱导培养6～8h后，放罐，收集湿菌体。所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨25g/L，酵母粉6.55g/L，NaCl 10g/L，蔗糖9.1g/L，磷酸吡哆醛(PLP)0.05mM，MgSO45mM，KH2PO4 10mM，溶剂为蒸馏水，pH自然。
实施例6野生型及突变体TPL催化合成左旋多巴
以实施例5方法获得的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-K402T(简称K402T湿菌体)、E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL-T409A(简称T409A湿菌体)和出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-Fn-TPL湿菌体(简称TPL湿菌体)细胞作为催化剂，催化合成左旋多巴的能力。检测方法为高效液相色谱法，流动相：A:B＝9:1(A:0.02MKH2PO4-6M HCl，pH＝2.6；B:甲醇)；色谱柱：C18(Welchrom 4.6*250mm)；检测波长280nm；柱温34℃；进样量10μL；流速1ml/min。以邻苯二酚、左旋多巴标准品，用超纯水配置成适当的浓度，利用上述液相检测方法，制备浓度与物质峰面积的标准曲线。邻苯二酚标准曲线方程为：Y＝1283.3X+10.827，左旋多巴标准曲线为Y＝1437.7X+127.3，根据反应体系中邻苯二酚的减少量和左旋多巴的积累量计算获得转化率和产率。
在500ml反应体系中添加邻苯二酚5g/L，丙酮酸钠7g/L，乙酸铵0.4M，亚硫酸钠1g/L，EDTA·Na2 2g/L，磷酸吡哆醛(PLP)1mM，实施例5方法制备的K402T突变体重组细胞湿菌体20g/L(湿重)，溶剂为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(50mM)，氨水调pH至8.0；在温度15℃、转速150rpm条件下进行反应，反应过程采用底物补料的方式进行，每隔2h补料一次，其中邻苯二酚每次补料5g/L，丙酮酸钠每次补料5g/L，乙酸铵每次补料3.5g/L，补料17批次。反应结束后，加入1mL 1M HCl终止反应。终止后的反应液经滤膜过滤后，取反应液，用高效液相色谱检测。
结果显示，K402T湿菌体目标产物浓度达到146g/L，转化率达99.8％，产率高于90％，左旋多巴光学纯度大于99.9％。
将反应体系中K402T湿菌体替换为T409A湿菌体，目标产物浓度达到132g/L，转化率达92％，产率为82％，左旋多巴光学纯度大于99.9％。
将反应体系中K402T湿菌体替换为TPL湿菌体，并反应过程中，底物补料14次，目标产物浓度达到118g/L，转化率达89％，产率为78％，左旋多巴光学纯度大于99.9％。
将反应体系中，丙酮酸钠改为8g/L，温度改为20℃，补料间隔时间改为1.5h，其他条件不变，目标产物浓度达到139g/L，转化率达94％，产率位86％，左旋多巴光学纯度大于99.9％。
本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种酪氨酸酚裂解酶突变体、工程菌及在催化合成左旋多巴中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1386
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
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attaattcag aagatgtgta tattgatctg ctgaccgatt ctggcaccaa tgctatgtct 180
gataaacagt ggggcggcct gatgcagggc gatgaagctt atgctggctc tcgtaatttt 240
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Claims (5)

1.一种酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列为SEQID No.5所示。
2.一种由权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因构建的基因工程菌。
3.一种权利要求1所述酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因编码的酪氨酸酚裂解酶突变体在合成左旋多巴中的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸钠和乙酸铵为底物，以亚硫酸钠和EDTA·Na2为助剂，以磷酸吡哆醛为辅酶，以pH 6.0～10.5的缓冲液为反应介质构成转化体系，在温度5～30 ℃、转速100～200rpm条件下进行转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得左旋多巴；
所述转化体系中，邻苯二酚加入终浓度5～50 g/L，丙酮酸钠加入终浓度5～50 g/L，乙酸铵加入终浓度0.1～1.4 M，亚硫酸钠加入终浓度0.5～10 g/L，EDTA·Na2加入终浓度0.5～10 g/L，磷酸吡哆醛加入终浓度0.05～5 mM，湿菌体用量为2～50 g/L。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应过程中对邻苯二酚、丙酮酸钠和乙酸铵进行补料，每隔0.5～4 h补料一次，其中邻苯二酚每次补料0.1～10 g/L，丙酮酸钠每次补料0.1～10 g/L，乙酸铵每次补料1～20 g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含酪氨酸酚裂解酶突变体编码基因的工程菌接种至含50 μg/ml卡那霉素的斜面培养基，在37 ℃培养8～16 h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，2％琼脂，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(2)种子培养：将斜面菌体接种至种子培养基，在37 ℃培养8～10 h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，50 μg/ml卡那霉素，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(3)发酵培养：将种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的装有3L发酵培养基的5L机械搅拌通风通用式发酵罐中，将已灭菌的乳糖以终浓度为15 g/L的量直接添加到发酵罐中于28 ℃下诱导培养6～8h后，放罐收集湿菌体；所述发酵培养基终浓度组成为：蛋白胨25g/L，酵母粉6.55 g/L，NaCl 10 g/L，蔗糖9.1 g/L，磷酸吡哆醛0.05 mM，MgSO4 5 mM，KH2PO410 mM，溶剂为蒸馏水，pH自然。
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