KR100209785B1

KR100209785B1 - 무작위적 돌연변이유발법을 이용한 돌연변이티로신 페놀리아제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제

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Publication number: KR100209785B1
Application number: KR1019970015425A
Authority: KR
Inventors: 성문희; 이승구; 홍승표; 노현수; 최윤호; 배희성; 백대헌; 박진서; 곽미선; 박영훈
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-04-24
Filing date: 1997-04-24
Publication date: 1999-07-15
Also published as: KR19980078035A

Abstract

본 발명은 무작위적 돌연변이유발법을 이용한 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제(MTPL)에 관한 것으로, 티로신 페놀리아제(TPL)의 유전자를 무작위적 돌연변이유발법에 의해 돌연변이시켜 TPL의 15번째 아미노산 및 304번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 MTPL을 얻고 상기 MTPL을 코드하는 유전자를 대장균에서 발현시킨 후 상기 대장균을 배양시켜 얻어진 본 발명의 MTPL은 온도 및 유기용매에 대한 안정성, 및 카테콜, 피루브산, 암모늄 이온으로부터 L-DOPA를 합성하는 효소 활성이 TPL보다 월등히 증가되어 파킨슨병 치료제인 L-DOPA의 산업적 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

무작위적 돌연변이유발법을 이용한 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법 및 이에 의해 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제

본 발명은 무작위적 돌연변이유발법(random mutagenesis)을 이용한 돌연변이 티로신 페놀리아제(tyrosine phenol-lyase, EC 4.1.99.2: 이하 TPL로 약칭함)의 제조방법 및 이에 의해 제조된 돌연변이 티로신 페놀리아제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 TPL의 유전자를 무작위적 돌연변이유발법에 의해 돌연변이시켜 TPL의 15번째 아미노산 및 304번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이 티로신 페놀리아제(mutant tyrosine phenol-lyase: 이하 MTPL로 약칭함)를 얻고, 상기 MTPL을 코드하는 유전자를 대장균에서 발현시킨 후, 상기 대장균의 배양에 의해 온도 및 유기용매에 대한 안정성, 및 카테콜, 피루브산, 암모니아로부터 L-DOPA를 합성하는 효소 활성이 TPL보다 월등히 증가된, 새로운 효소 촉매 특성을 갖는 MTPL을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기와 같이 제조된 재조합 열안정성 TPL을 이용하여 파킨슨병 치료제인 L-DOPA(3,4-디하이드록시페닐알라닌)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

TPL은 티로신을 페놀과 피루브산으로 가수분해하는 α,β-제거반응(α,β-elimination), 같은 기질로부터 페놀과 세린을 생성하는 β-교환반응(β-replacement) 등의 다양한 반응을 촉매하는 효소로서(Enei et al., Agri. Biol. Chem., 36, 1869-1876(1972)), 티로신을 유도 물질로 첨가한 배지에서 배양한 미생물 배양액에서 흔히 발견된다. 상기 미생물의 예로는, 에스케리키아 속(Kumagai Yamada, J. Biol. Chem., 245, 1767-1772(1970)), 어위니아 속[Enei et al., Agri. Biol. Chem., 37, 725-735(1973), 씨트로박터 속(Kupletskaya, M. B., Prinkl. Biokhim. i Microbiol., 17, 278-283(1981)), 심비오박테리움 속(Suzuki et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 84-89(1992)) 등이 있다.

미생물 효소 TPL을 이용한 L-DOPA의 합성은 기질인 페놀 대신 카테콜을 가한 반응액에 높은 농도의 암모늄 이온과 피루브산을 가하여 반응의 평형을 물리적으로 조절한 조건에서 다음과 같은 α,β-제거반응의 역반응인 L-DOPA 합성 반응을 수행함으로써 이루어진다.

피루브산 + 암모늄 이온 + 카테콜 → L-DOPA + 물

효소를 생물 촉매로 이용하는 생물 공정에 있어서 가장 중요한 것은 효소, 즉 생물 촉매의 안정성이다. 특히 TPL의 효소 반응을 이용하여 파킨슨병 치료제로서 주목받고 있는 고부가가치 의약용 아미노산인 L-DOPA를 합성 및 생산하기 위한 효소 공정은, 반응 기질로 사용되는 카테콜이 강력한 단백질 변성제이기 때문에 안정성이 높은 효소가 요구된다. 따라서 미생물 효소 또는 균체의 고정화, 카테콜의 독성을 감소시키는 보렉스(sodim borate)의 첨가 등을 이용한 효소의 안정화 연구가 시도되었다. 그러나 다양한 연구에도 불구하고 성공적으로 L-DOPA 합성 반응의 안정성을 개선한 결과는 거의 보고된 바가 없다. 이는 L-DOPA 합성효소 자체의 안정성이 증가되지 않고서는 L-DOPA 생산 반응을 효율적으로 수행하기 어려움을 보여주는 것이다.

일반적으로 열에 대하여 안정한 내열성 효소는 열에 안정한 특징 이외에도 유기용매에 대한 안정성, 극단의 수소이온 농도에 대한 안정성 및 화학 변성제에 대한 안정성도 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-DOPA 합성을 위한 생물 촉매로서 보다 안정하고 강력한 내열성 효소를 개발하는 것이 L-DOPA 합성 반응의 안정성 개선에 급선무이다.

이에 본 발명자들은 L-DOPA 합성의 생물 촉매로 사용될 수 있는 TPL의 안정성 및 활성을 증대시키는 방법을 계속 연구한 결과, TPL 유전자에 무작위적으로 돌연변이를 유발하여 만들어진 돌연변이 효소들 중 TPL의 15번째 쓰레오닌이 알라닌으로, 304번째 이소류신이 발린으로 치환된 돌연변이 티로신 페놀리아제가 증가된 열안정성과 유기용매에 대한 안정성 및 화학 변성제에 대한 안정성을 가짐을 발견하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 파킨슨병 치료제로 주목받고 있는 L-DOPA의 효소적 합성에 유용하게 이용될 수 있는, 증대된 내열성 및 유기용매에 대한 안정성을 갖는 신규 돌연변이 TPL 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 무작위적 돌연변이유발법에 의해 돌연변이 티로신 페놀리아제(MTPL) 유전자를 함유하는 발현벡터의 제조 과정을 개략하여 도시한 것이고,

도 2는 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(MTPL)와 티로신 페놀리아제(TPL)의 유기용매(10 % 메탄올) 함유 L-DOPA 합성 반응액에서의 안정성을 비교한 것이며,

도 3은 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(MTPL)를 코드하는 유전자의 염기배열을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명의 돌연변이 티로신 페놀리아제(MTPL)와 TPL의 아미노산 배열을 비교하여 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 TPL의 15번째 쓰레오닌이 알라닌으로 치환되고 304번째 이소류신이 발린으로 치환된 돌연변이 티로신 페놀리아제를 제공한다.

본 발명에서는 또한 상기 MTPL을 코드하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 대장균 및 상기 대장균을 배양하여 MTPL을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 MTPL을 이용하여 카테콜, 암모늄 이온 및 피루브산을 반응시켜 보다 안정되게 L-DOPA를 합성하는 방법 또한 제공된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따르면, TPL로부터 무작위적 돌연변이유발법을 이용하여 MTPL의 라이브러리(library)를 제조하고, 이로부터 안정성이 증대된 신규 MTPL을 탐색하여 그의 유전자 염기 배열을 결정하고, 상기 유전자를 대장균에서 발현시켜 안정성 및 활성이 증대된 MTPL을 수득하고, 이를 L-DOPA의 효소적 합성에 이용할 수 있다.

무작위적 돌연변이 유발은 DNA 중합효소(polymerase) 반응의 정확도(fidelity)가 감소된 조건에서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 주형(template) DNA의 뉴클레오티드(nucleotide)에 상보적이지 않은 뉴클레오티드가 일부 결합되어 DNA 염기 배열이 변화된 새로운 폴리펩티드가 만들어지도록 하는 것이다(Fromant et al., Anal. Biochem., 224, 347-353(1995)).

본 발명에서는 주형으로서 TPL 유전자를 이용하고, 프라이머로서 TPL을 코드하는 유전자의 염기배열에 근거하여 제조한 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머를 사용하여 무작위적 돌연변이 유발을 위한 PCR을 수행한다.

이와 같이 PCR을 수행하여 증폭된 MTPL의 DNA 단편은 고발현 벡터인 pTrc99A(파마시아사, 스웨덴)에 삽입한 후, 일렉트로포레이션(electroporation)법에 의하여 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 MTPL의 라이브러리를 제조한다.

제조된 MTPL의 라이브러리로부터 내열성이 증가된 MTPL의 탐색은 반응 온도를 18 ℃ 및 37 ℃로 달리하면서 L-DOPA 합성 반응을 수행한 후, 생성된 L-DOPA의 농도를 비교함으로써 수행할 수 있다. 라이브러리 탐색 결과, TPL에 비하여 열안정성이 증가되어 18 ℃에서의 반응성은 변화가 없으나, 37 ℃에서의 반응성이 약 49 % 높아진 MTPL을 생산하는 재조합 대장균 1 종을 분리하였다.

본 발명에 따라 탐색, 분리된 열안정성이 증대된 MTPL은 열에 대한 안정성 뿐만 아니라, L-DOPA 합성 반응액 중에 첨가시 L-DOPA 생산 효율을 증가시키는 효과가 있는(Lee et al., Kor. J. Appl. Microb. Biotechnol., 24, 222-226(1996)) 유기용매인 메탄올에 대한 안정성도 매우 크게 증가되었다. 즉, TPL은 5 % 이하의 메탄올 농도에서는 비교적 안정한 반면, 10 %의 메탄올 농도에서는 메탄올에 의한 효소 실활이 유발되어 L-DOPA 합성 반응 속도가 현저히 감소하였다. 그러나 본 발명의 신규 MTPL은 10 % 메탄올 첨가시에도 효소 안정성이 유지되어 L-DOPA 합성반응이 보다 더 높게 지속적으로 진행되었다.

또한 본 발명의 MTPL은 가역 반응인 α,β-제거반응과 이의 역반응인 합성 반응의 상대적인 반응 속도가 TPL과 크게 다른 것으로 나타났다. α,β-제거반응은 티로신을 분해하는 효소 활성으로 측정하고 합성 반응은 L-DOPA를 합성하는 효소 활성으로 측정하여 MTPL과 TPL의 L-DOPA 합성에 대한 촉매 활성을 비교한 결과, MTPL은 α,β-제거반응 속도가 TPL의 약 50 %로 감소된 반면에 합성반응 속도는 거의 그대로(90 %) 유지되어 MTPL의 α,β-제거반응과 합성반응의 반응 평형이 TPL에 비하여 합성반응 쪽으로 편향되어서 L-DOPA 합성반응에 보다 더 유효한 효소인 것으로 확인되었다.

본 발명에 따라 탐색된, 온도 및 유기용매에 대한 안정성이 증대된 MTPL을 생산하는 재조합 대장균으로부터 분리한 재조합 플라스미드 pDA44로부터 MTPL을 코드하는 유전자를 분리한 후, 생거의 방법(Sanger, F., Science, 214, 1205-1210(1981))에 의해서 그 염기배열을 결정하였다. 결정된 염기배열로부터 MTPL의 아미노산 배열을 추정하고 TPL의 아미노산 배열과 비교한 결과, 본 발명의 MTPL은 TPL의 15번째 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로 변환되었고, 304번째 아미노산인 이소류신이 발린으로 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 것으로 확인되었다.

DNA 염기배열이 문헌으로 보고되어 있는 씨트로박터 속(Citrobacter freundii)(Antson et al., Biochemistry, 32, 4195-4206(1993))과 에스케리키아 속(Escherichia intermedia)(Kurusu et al., Biotechnol. Lett., 13, 769-772(1991)) 유래 TPL의 아미노산 배열이 100 %의 상동성을 나타내는 등 다양한 미생물 유래 TPL들이 매우 상동성이 높은 아미노산 염기배열을 가지는 것으로 볼 때, 본 발명의 신규 MTPL은 아미노산 배열이 다를 뿐만 아니라, 온도 및 유기용매에 대한 안정성이 증가하고 효소의 반응 촉매 성질이 크게 변화하였으므로 기존의 TPL과 다른 특성을 갖는 신규 티로신 페놀리아제로 판단할 수 있다.

상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pDA44를 이용하여 적당한 숙주 미생물, 예를 들면 대장균 균주 XL1-Blue(스트라타진사, 미국)를 형질전환시킬 수 있다.

이렇게 형질전환된 대장균 균주는 MTPL의 발현을 위해 적당한 배지, 예를 들면 엠피실린 함유 LB 배지를 이용하여 대량 배양한 후, 이 배양액으로부터 균체 파쇄 및 원심분리를 거쳐 본 발명의 내열성 신규 MTPL 조효소액을 얻을 수 있다. 이와 같이 조제된 MTPL 함유 조효소액은 -20 ℃에 보관하면서 L-DOPA 합성반응의 생물 전환 반응 촉매로 사용한다.

과량의 아세트산암모늄, 피루브산나트륨 및 카테콜을 함유한 L-DOPA 합성반응액에 상기 MTPL 조효소액을 1.5 Units/㎖ 농도로 가하고 18 ℃에서 12 시간 동안 효소반응을 수행함으로써 L-DOPA를 합성할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 무작위적 돌연변이유발법에 의한 MTPL 라이브러리의 제조 및 이로부 터 온도 및 유기용매에 대한 안정성이 증대된 신규 MTPL의 탐색

(단계 1) MTPL 라이브러리의 제조

무작위적 돌연변이 유발을 위한 PCR용 프라이머로서, 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii) 유래 TPL 유전자의 염기배열에 근거하여 다음과 같은 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머를 합성하였다.

N-프라이머 : 5'-CAGCGACCCTGGGCGGAACC-3'

C-프라이머 : 5'-TGACTAAGTCAAGCTTATTAGCTGATCGGCTCGAAGCG-3'

PCR 반응액은 각각 1.0 μM의 상기 N 말단 프라이머 및 C 말단 프라이머, 주형으로 TPL 유전자를 pTrc99A 벡터에 연결한 재조합플라스미드 pHL1001 0.1 ng, 10 mM 트리스 완충액(pH 8.3), 50 mM KCl, 10 ㎍/㎖ 젤라틴, 6.1 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 0.1 mM dATP, 1.0 mM dCTP, 1.0 mM dGTP, 1.0 mM dTTP, 및 Taq 중합효소 2.5 Unit를 포함하도록 조제하였다. 상기 반응액 50 ㎕를 이용하여 95 ℃에서 1 분(첫번째 사이클의 경우는 5 분), 50 ℃에서 2 분, 72 ℃에서 3 분(마지막 사이클의 경우는 7 분)의 조건으로 PCR을 25 회 실시하였다.

상기와 같이 증폭된 DNA 단편을 제한효소 HindIII로 절단한 후, 고 발현벡터인 pTrc99A(파마시아사, 스웨덴)를 제한효소 NcoI 및 HindIII로 절단하고 클레나우(Klenow) 효소로 평활말단 처리하여 얻은 단편과 접합시켜 벡터 pTrc99A에 MTPL 유전자가 삽입된 플라스미드 pDA44를 제조한 후, 일렉트로포레이션법에 의하여 균주 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 MTPL의 라이브러리를 제조하였다.

도 1은 무작위적 돌연변이유발법에 의해 MTPL 유전자를 함유하는 발현벡터의 제조 과정을 개략하여 도시한 것이다.

(단계 2) 안정성 및 활성이 증대된 MTPL의 탐색

단계 1에서 제조된 MTPL의 라이브러리로부터 내열성이 증가된 MTPL의 탐색은 반응온도를 18 ℃ 및 37 ℃로 달리하면서 L-DOPA 합성반응을 수행한 후, 생성된 L-DOPA 농도를 비교함으로써 수행되었다. 탐색 결과, 원래의 TPL에 비하여 열안정성이 증가되어 18 ℃에서의 반응성은 변화가 없으나, 37 ℃에서의 반응성이 약 49 % 높아진 MTPL을 생산하는 재조합 대장균 1 종을 분리하였다.

실시예 2 : 탐색, 분리된 MTPL의 유기용매에 대한 안정성 및 L-DOPA 합성 촉매 활성 평가

(1) 유기용매에 대한 안정성 평가

실시예 1에서 탐색, 분리된, 본 발명의 증대된 열안정성을 갖는 신규 MTPL은 열에 대한 안정성 뿐 아니라, L-DOPA 합성 반응액에 첨가시 L-DOPA 생산 효율을 증가시키는 효과가 있는 유기용매인 메탄올에 대한 안정성도 매우 크게 증가되었다. 즉, 원래의 TPL은 5 % 이하의 메탄올 농도에서는 비교적 안정한데 반해, 10 % 메탄올을 반응액에 첨가하는 경우에는 메탄올에 의한 효소 실활이 유발되어 L-DOPA 합성반응 속도가 현저히 감소하였다. 그러나 본 발명의 MTPL은 10 % 메탄올 첨가시에도 효소 안정성이 유지되어 도 2에 나타낸 바와 같이 L-DOPA 합성반응이 보다 더 높게 지속적으로 진행되었다. 도 2는 본 발명의 MTPL와 TPL의 10 % 메탄올 함유 L-DOPA 합성 반응액에서의 안정성을 비교한 것이다.

(2) L-DOPA 합성반응에 대한 촉매 활성 평가

본 발명의 MTPL은 가역반응인 α,β-제거반응과 이의 역반응인 합성반응의 상대적인 반응속도가 TPL과 크게 달라졌다. α,β-제거반응은 티로신을 분해하는 효소활성으로 측정하고 합성반응은 L-DOPA를 합성하는 효소활성으로 측정하여 MTPL과 TPL의 L-DOPA 합성에 대한 촉매 활성을 비교하였다. 각 경우의 효소 활성을 측정한 방법은 다음과 같다.

[α,β-제거반응 활성의 측정]

신규 MTPL 및 TPL의 α,β-제거반응 활성을 측정하기 위한 반응액은 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 0.2 ㎖에 10 mM의 L-티로신과 배양액 0.1 ㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제되었으며, 37 ℃에서 1 시간 동안 정치반응시켰다. 반응에 의하여 생성된 피루베이트의 양은 반응액에 0.2 ㎖의 60 % 수산화칼륨염 용액과 2 % 살리실알데히드(salicylaldehyde) 0.1 ㎖를 가한 후 37 ℃에서 30 분간 정치반응시켜 발색시킨 후, 물로 2 배 희석하고 480 nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 결정되었다(Berntsson S, Anal. Chem., 27, 1659-1660(1955)).

[L-DOPA 합성반응 활성의 측정]

MTPL 및 TPL의 L-DOPA 합성반응 활성은, 0.65 M 아세트산암모늄(pH 8.5), 50 mM 피로카테콜, 50 mM 피루베이트, 100 μM 피리독살-5'-포스페이트, 0.1 % 아황산나트륨을 포함한 용액 1.0 ㎖에 조효소액 50 ㎕를 가하고 18 ℃에서 30 분간 정치반응시킨 후, 반응액 100 ㎕에 2 N HCl 100 ㎕를 가하여 반응을 중지시켜 생성된 L-DOPA의 양을 HPLC를 사용하여 분석함으로써 결정되었다. 본 발명에서 효소 활성 1 Unit은 1 분 동안에 1 μmole의 L-DOPA를 생성하는 효소의 양으로 정의된다. 반응액 중의 피로카테콜 및 L-DOPA의 양은 HPLC(영인과학, 한국)를 이용하여 분석하였다. 컬럼은 μbondapak C18(Waters, MA)를 사용하였고, 용출액으로는 메탄올과 아세트산을 각각 5 %와 2 % 농도로 가한 0.1 M 인산 수소 나트륨 용액을 사용하였다. 유량은 1 ㎖/min이었고, 피로카테콜 및 L-DOPA는 UV 280nm에서 검출하였다.

상기 각 반응에 대한 활성 측정 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

효소	α,β-제거반응 활성¹(Unit/㎎ 단백질)	합성반응 활성²(Unit/㎎ 단백질)	합성반응 활성α,β-제거반응 활성
TPL	0.143	0.88	6.2
MTPL	0.065	0.79	12.2

표 1에서 보듯이, 본 발명의 MTPL은 α,β-제거반응의 속도가 원래의 약 50 %로 감소된 반면에 합성반응의 속도는 거의 그대로(90 %) 유지되어 MTPL의 α,β-제거반응과 합성반응의 반응 평형이 TPL에 비하여 합성반응 쪽으로 편향되어 L-DOPA 합성반응에 보다 더 유효한 효소임이 입증되었다.

실시예 3 : 본 발명의 MTPL을 코드하는 유전자의 염기배열 결정

상기 실시예 1에서 얻은 재조합 플라스미드 pDA44로부터 MTPL을 코드하는 유전자를 분리한 후, 생거의 방법(Sanger, F., Science, 214, 1205-1210(1981))에 의해 염기배열을 결정하였다. 도 3은 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pDA44에 함유된 MTPL의 DNA 염기배열을 나타낸 것이다.

상기 염기배열로부터 재조합 플라스미드 pDA44에서 분리된 DNA 단편에 MTPL을 코드하는 1,368 bp 크기의 유전자가 함유되어 있는 것을 확인하였다. 이 유전자의 염기배열로부터 MTPL의 아미노산 배열을 추정하고, TPL의 아미노산 염기배열과 비교하였다. 도 4는 본 발명의 MTPL과 TPL의 아미노산 배열을 비교하여 나타낸 것이다. 여기에서 보듯이, MTPL은 TPL의 15번째 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로, 304번째 아미노산인 이소류신이 발린으로 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질이었다. DNA 염기배열이 문헌으로 보고되어 있는 씨트로박터 속(Citrobacter freundii)과 에스케리키아 속(Escherichia intermedia) 유래 TPL들의 아미노산 배열이 100 %의 상동성을 나타내는 등, 다양한 미생물의 TPL들이 매우 상동성이 높은 아미노산 염기배열을 가지는 것으로 볼 때, 본 발명의 MTPL은 아미노산 배열이 다를 뿐만 아니라, 온도 및 유기용매에 대한 안정성이 증가하고 효소의 촉매반응 성질이 크게 변화하였으므로 기존의 TPL과 다른 특성을 갖는 신규 티로신 페놀리아제로 판단할 수 있다.

실시예 4 : 재조합 플라스미드 pDA44를 함유하는 대장균 XL1-Blue를 이용한 MTPL의 생산

본 발명의 MTPL 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pDA44로 대장균 균주 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pDA44는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자은행에 1997년 1월 27일자 기탁번호 제 KCTC 0303BP 호로 기탁되었다.

상기 재조합 대장균 XL1-Blue/pDA44를 엠피실린을 100 ㎎/ℓ 농도로 첨가한 LB 배지(1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % NaCl) 200 ㎖에 접종하고, 37 ℃에서 200 rpm으로 진탕배양하였다. 균체 농도가 약 OD₆₀₀=0.8에 이르렀을 때, 이소프로필티오갈락토사이드(IPTG)를 0.6 mM 농도로 가하여 내열성 MTPL의 생산을 유도하고 8 시간 동안 계속 배양한 후, 5,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 재조합 대장균 균체는 초음파 처리하여 파쇄한 후, 원심분리하여 내열성 MTPL 조효소액으로 제조하였다. LB 배지에서 생산된 균체는 600 nm에서의 흡광도(OD₆₀₀)가 약 5.2 정도이었고, SDS-PAGE로 생산된 단백질을 분석한 결과, 내열성 MTPL은 재조합 대장균 균체의 총 단백질의 약 35 %였으며, 전부 가용성인 상태로 생산되었다. 이와 같이 제조된 MTPL 조효소액은 -20 ℃에 보관하면서 L-DOPA 합성반응의 생물 전환 반응 촉매로 사용하였다.

실시예 5 : 본 발명의 MTPL을 이용한 L-DOPA의 합성

L-DOPA 합성에 대한 촉매 활성이 증대된 본 발명의 MTPL을 이용하여 L-DOPA를 효소 전환법으로 생산하기 위하여, 0.65 M 아세트산암모늄(pH 8.5), 50 mM 피루브산나트륨, 25 mM 카테콜, 0.1 mM 피리독살-5'-포스페이트, 0.1 % 아황산나트륨과 재조합 내열성 MTPL 조효소액을 1.5 Unit/㎖ 농도가 되도록 가하여 L-DOPA 합성 반응액을 제조하였다. 이 반응액을 고무 마개로 밀봉하고 질소 가스로 충분히 플러싱(flushing)한 후, 온도를 37 ℃로 조절한 수조에 넣고, 서서히 교반하면서 L-DOPA 합성 반응을 수행하였다. 상기의 효소 전환 반응을 통하여 L-DOPA를 고농도로 생산하기 위하여, 카테콜 및 피루브산나트륨은 동일한 양을 간헐적으로 반응액에 첨가하는 방식으로 공급하였다.

L-DOPA 합성 반응을 시작한 후 약 1-2 시간이 경과하였을 때, 반응액 중에 L-DOPA의 흰색 침전이 관찰되기 시작하여 점차 반응액이 L-DOPA의 생산 증가로 인하여 혼탁해졌으며, 2-3 시간이 경과한 후에는 반응액이 완전히 불투명한 용액으로 변하였다. 상기 효소 반응은 18 ℃에서 12 시간 동안 수행하였다. 그 결과, 51.8 g/ℓ의 L-DOPA를 수득하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 TPL의 유전자를 무작위적 돌연변이유발법에 의해 돌연변이시켜 TPL의 15번째 아미노산 및 304번째 아미노산 잔기가 각각 알라닌 및 발린 잔기로 치환된 MTPL 유전자를 대장균에서 발현시킨 후 상기 대장균을 배양시켜 얻어진 MTPL은 온도 및 유기용매에 대한 안정성, 및 L-DOPA 합성 반응에 대한 촉매 활성이 TPL보다 월등히 증가되어 파킨슨병 치료제인 L-DOPA의 산업적 생산에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

티로신 페놀리아제의 15번째 아미노산인 쓰레오닌이 알라닌으로 치환되고 304번째 아미노산인 이소류신이 발린으로 치환된 돌연변이 티로신 페놀리아제.
제 1 항의 돌연변이 티로신 페놀리아제를 코드하는 유전자.
제 2 항에 있어서, 하기 염기배열을 갖는 유전자.
제 2 항의 유전자를 함유하는 발현벡터.
제 4 항에 있어서, 발현벡터 pDA44.
제 4 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균.
제 6 항에 있어서, 대장균 XL1-Blue/pDA44(KCTC 0303BP).
제 6 항의 대장균을 돌연변이 티로신 페놀리아제의 발현에 적절한 배지에서 배양하고, 생산된 돌연변이 티로신 페놀리아제를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 돌연변이 티로신 페놀리아제의 제조방법.
제 1 항의 돌연변이 티로신 페놀리아제를 이용하여 카테콜, 피루브산 및 암모늄 이온을 반응시켜 L-DOPA를 합성하는 방법.