KR102230151B1 - 이산화탄소 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템과 이의 용도 - Google Patents

이산화탄소 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템과 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝 하는 방법과 그 방법을 이용하여 수득한 환원활성이 증대된 변이 포메이트 탈수소화 효소에 관한 것이다. 구체적으로 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물, 상기 미생물을 이용하여 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 이산화탄소를 포메이트로 환원시키는 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 미생물, 상기 미생물을 배양하여 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 방법 및 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 이용하여 이산화탄소부터 포메이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

이산화탄소 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템과 이의 용도{A screening system for formate dehydrogenase with increased carbon dioxide reducing activity and uses thereof}
본 발명은 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝 하는 방법과 그 방법을 이용하여 수득한 환원활성이 증대된 변이 포메이트 탈수소화 효소에 관한 것이다. 구체적으로 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물, 상기 미생물을 이용하여 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 이산화탄소를 포메이트로 환원시키는 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 상기 벡터가 도입된 미생물, 상기 미생물을 배양하여 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 방법 및 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 이용하여 이산화탄소부터 포메이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
대기 중 이산화탄소의 농도가 높아짐으로써 발생한 기후변화에 따라 자연재해 문제가 심각해지면서, 전 세계적으로 이산화탄소를 감소시키기 위한 연구가 활발히 진행 중이다. 연구 초기에는 이산화탄소를 포획하여 지하 탱크 시설에 저장하는 CCS (Carbon Capture and Storage) 방법으로 접근하였지만, 최근에는 이산화탄소를 기타 유용한 물질로 전환하여 이용하는 CCU (Carbon Capture and Utilization) 방법의 연구가 활발해지고 있다. 이산화탄소를 다른 화합물질로 전환시키기 위해서 고온과 고압의 상태에서 화학 반응을 일으키는 화학적인 방법(KR 제10-1832049호, KR 제10-1824661호)은 현재까지 가장 높은 효율을 갖는 방법이지만 고가의 설비 시설이 필요하고, 반응에 의한 부산물로 다시 환경오염을 일으킬 수 있다는 단점을 가지고 있다. 반면 생물학적 효소를 이용하여 이산화탄소를 전환시키는 접근 방법은 고온이나 고압의 상태가 아닌 일반적인 환경에서 환경오염을 일으키는 부산물 없이 이산화탄소를 전환 시킬 수 있다는 장점이 있다.
이산화탄소(CO2)를 전환시켜서 얻을 수 있는 다음 단계 화학 물질 중 하나는 포메이트 (formate, 화학식 COOH-) 또는 포름산 (formic acid, 화학식 HCOOH)이다. 포름산은 환경 친화적이고 매우 효율적인 유기산으로서 그 활용 범위가 넓다. 예를 들어 산성 성질을 이용하여 가축 사료의 방부제와 사료 첨가제로 사용 되거나, 가죽 생산, 섬유의 염색과 마무리제로 사용 된다. 또한 포메이트의 형태로는 고무 생산에 사용 되거나 세제 생산에 사용된다. 삶의 질이 올라갈수록 수요가 올라가는 산업에 주로 사용되고 있고, 2009년 이후로는 매년 3% 이상의 세계 소비 수요 증가가 이루어지고 있다.
생물학적 효소를 이용하여 이산화탄소를 포메이트로 전환시키는 방법은 이산화탄소를 감소시키고, 유용 화합 물질을 환경오염없이 생산할 수 있는 좋은 대안이지만 여전히 단점이 존재한다. 열역학적으로 매우 안정한 이산화탄소를 반응시키기 위해서 환원 활성이 높은 효소가 필요한데, 현재까지 알려진 효소의 대부분은 포메이트를 이산화탄소로 전환시키는 산화 반응의 활성이 더 높다.
효소의 활성을 증가시키기 위해서는 효소를 스크리닝할 수 있는 시스템이 필요한데 이산화탄소와 포메이트는 두 물질 모두 매우 작은 크기의 분자이므로 적당한 스크리닝 시스템을 구축하는데 어려움이 있다. 스크리닝 시스템의 질은 용액 내 포메이트의 농도를 측정하는 기술 수준에 따라 평가될 수 있다. 현존하는 포메이트 농도 측정 방법은 화학적인 방법과 생물학적 효소를 사용하는 두 가지 방법이 대표적이다. 화학적인 방법은 사용되는 케미컬 대부분이 독성이 높고, 한 번의 반응으로 측정이 끝나므로 연속적인 모니터링이 불가능하다. 따라서 세포 내에서 작용하는 효소의 활성을 반영하거나, 한 번에 많은 숫자의 변이 체를 검사해야 하는 스크리닝 방법으로는 적합하지 못하다. 생물학적 효소를 사용하는 방법은 용액 내 존재하는 포메이트가 세 번의 연속적인 효소 반응을 일으켜서 마지막 단계에서 발광을 하면 흡광도계를 이용하여 측정하는 방법을 주로 사용하게 된다. 하지만, 이 효소 반응에서 사용되는 효소(Formate dehydrogenase, diaphorase, luciferase)와 조효소(NADH)들은 이산화탄소를 포메이트로 전환 시키는데 작용하는 반응과 공통적으로 사용되기 때문에 역시 스크리닝 시스템에 적용하기에는 문제가 된다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 환원 활성이 증가된 변이형 생물학적 효소를 제조하고, 가장 환원 활성이 증가된 변이형 효소를 찾아낼 수 있는 in vivo 포메이트 스크리닝 시스템을 제조하여 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명자들은 상기 스크리닝 시스템을 이용하여 효소 유전자의 돌연변이 유발을 통하여 포메이트 탈수소화 효소 활성을 증가시킨 변이체를 선별하는 방법을 최초로 규명하였다.
본 발명의 하나의 목적은 ⅰ) 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리; 및 ⅱ) FhlA 단백질을 코딩하는 유전자 및 fdhF 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 이용하여 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 폴리펩티드에 변이가 도입되어 이산화탄소를 포메이트로 환원 활성을 증가시키는, 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 환원 활성이 증가된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 환원 활성이 증가된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 변이형 포메이트 탈수소화 효소의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를, 이산화탄소 및 전자공여체를 포함하는 혼합물과 반응시키는 단계; 및 상기 반응 단계 후 포메이트를 회수하는 단계를 포함하는, 포메이트의 생산방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다. 구체적으로, ⅰ) 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리; 및 ⅱ) FhlA 단백질을 코딩하는 유전자 및 fdhF 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 용어, "포메이트 탈수소화 효소 (formate dehydreogenase, FDH)"는 44kDa의 크기로 단백질 구조가 밝혀져 있고, 호모 다이머(Homodimer)로 작용하는 NADH 의존적 효소임이 임이 알려져 있다. 또한, 포메이트 탈수소화 효소는 이산화탄소를 유용물질 포메이트로 전환할 수 있는 효소로서, 온실가스 감축에 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나, 포메이트 탈수소화 효소는 실제로 사용하기에는 역방향(산화)의 경향이 더 강하며 활성이 낮아 우리가 원하는 방향(환원)인 이산화탄소에서 포메이트로 전환하는 활성을 강화시킬 필요가 있다.
본 발명의 시스템을 이용하여 환원 활성이 증가된 변이체를 스크리닝 하기 위하여 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리를 제조하였다. 구체적으로, 상기 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리는 티오바실러스 속(Thiobacillus sp .) 균주로부터 유래된 서열번호 1의 FDH를 이용하여 변이체 라이브러리를 제조하였으며, 렌덤 돌연변이를 통해 라이브러리를 제조하였다.
본 발명에서 용어 "포메이트 탈수소화 효소 라이브러리"는 FDH에 다양한 렌덤 돌연변이를 통해 제조된 다양한 변이형 FDH를 발현할 수 있는 벡터의 집합체이다.
본 발명에서 상기 ⅱ) 구성 요소인 FhlA 단백질을 코딩하는 유전자 및 fdhF 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 발현카세트는 제1프로모터가 fhlA 유전자와 작동가능하게 연결되고, 제1프로모터에 의해 발현된 FhlA 단백질이 인핸서로 작동할 수 있는 제2프로모터인 fdhF 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현카세트 일 수 있다. 상기 제1프로모터는 공지의 다양한 프로모터가 제한없이 포함될 수 있으며, 제2프로모터는 fdhF 프로모터 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 제조된 상기 라이브러리 중에서 포메이트 전환 활성이 강화된 변이체를 스크리닝하기 위해 사용된 미생물은 FhlA 단백질을 코딩하는 유전자 및 fdhF 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물일 수 있으며, 구체적으로 도 5의 벡터가 포함된 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물일 수 있다. .
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 인위적으로 생성되는 FhlA 단백질이 돌연변이 포메이트 탈수소화효소에 의해서 이산화탄소로부터 생성된 포메이트와 결합하고, 이러한 결합단백질이 fdhF 프로모터에 작용하여 그 하위에 있는 녹색형광단백질(sfGFP)을 발현하는 시스템을 구축하고, 포메이트 탈수소화효소의 활성이 강해지면 이산화탄소로부터 생성된 포메이트의 양이 많아지고, 녹색형광을 강하게 하므로써, 환원 활성이 증가된 변이체를 선별할 수 있는 시스템을 구축하였다(실시예 1).
본 발명의 시스템을 사용하는 경우, 화학적인 방법을 사용하는 경우에 연속적인 모니터링이 불가능하다는 문제점과, 기존에 알려진 생물학적 효소를 사용하는 경우, 효소 반응에서 사용되는 효소(Formate dehydrogenase, diaphorase, luciferase)와 조효소(NADH)들이 이산화탄소를 포메이트로 전환 시키는데 작용하는 반응과 공통적으로 사용되기 때문에 역시 스크리닝 시스템에 적용하기 어렵다는 문제점을 해결할 수 있으며, 환원 활성이 개선된 변이형 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝할 수 있는 시스템을 최초로 규명하였다는데 의의가 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물을 이용하여 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은 포메이트 탈수소화효소에 의해 환원된 포메이트가 리포터 단백질을 발현시켜, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 검출하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 폴리펩티드에 변이가 도입되어 이산화탄소를 포메이트로 환원 활성이 증가된, 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명에서 상기 서열번호 1은 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 구체적으로, Fdh 유전자에 의해 코딩되는 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 단백질 서열이다. 상기 서열번호 1의 아미노산은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 티오바실러스 속(Thiobacillus sp .) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산과 동일한 활성을 갖는 서열은 제한없이 포함될 수 있다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열의 범위는 서열번호 1의 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 아미노산은 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 용어, "포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드"는 유전적 또는 비유전적으로 하나의 안정적인 표현형적 변화를 나타내는 배양물이나 개체를 뜻하며, 구체적으로 본 발명에서는 티오바실러스 속 유래의 아미노산 서열상에서 하나 이상의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 강화되어 이산화탄소를 포메이트로 환원시키는 활성이 강화된 변이형 폴리펩티드를 의미한다. 또한 상기 변이현 폴리펩티드는 이산화탄소를 포메이트로 환원시키는 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 이산화탄소의 포메이트로의 환원형 폴리펩티드, 포메이트로 환원시키는 변이형 폴리펩티드 등과 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 몇몇 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 서열번호 1에 비하여 강화된 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 이와 같은 변이형 폴리펩티드는 위에서 설명한 서열번호 서열번호 1 및/또는 상기 서열번호 1와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산에서 N-말단으로부터 몇몇 아미노산이 변이된 것을 의미한다
본 발명의 목적상 상기 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 경우, 포메이트 탈수소화 효소 활성이 증가하는 것을 특징으로 한다. 이는 야생형 티오바실러스 속 균주가 포메이트 탈수소화 효소 활성이 없거나, 활성이 있더라도 아주 미약하다는 것에 반해, 본 발명의 변이형 폴리펩티드는 포메이트 탈수소화 효소 활성이 강화되어 많은 양의 이산화탄소를 포메이트로 환원시킬 수 있다는 것에 의의가 있다.
또한, 본 발명에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 특정 활성을 부여하는 상기 특정 변이 이외에 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
구체적으로, 상기 변이형 폴리펩티드 중 서열번호 1의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3로 이루어진 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 109번째, 387번째 아미노산이 각각 세린(Serine), 쓰레오닌(Threonine)으로 치환되거나, 128번째, 323번째 아미노산이 각각 이소류신(Isoleucine), 발린(Valine)으로 치환된, 변이형 폴리펩티드는 각각 서열번호 2, 3로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2, 3의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2, 3 및 상기 서열번호 2, 3와 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 109번째/387번째, 128번째/323번째 위치의 아미노산 서열 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, "동일성성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미하며, 경우에 따라서는 그러한 서열의 스트링 사이의 일치에 의해 결정된다. 예를 들면, 점수(score), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
또한, 코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 2 및 3로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 변이형 폴리펩티드 또는 이와 상동성을 가지는 변이형 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 2 및 3로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 변이형 폴리펩티드의 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 발명의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 발명에서 포메이트 탈수소화 효소의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 Fdh 이며, 구체적으로 티오바실러스 속 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 109번째/387번째, 128번째/323번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2, 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 몇몇 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 발명에서 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 Fdh 유전자이며, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 변이형 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pACY Duet-1 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 본 발명의 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하거나, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 환원 활성이 증가된 변이형 폴리펩티드를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다. 구체적으로 변이형 폴리펩티드 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환에 의해 제조되는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "환원 활성이 증가된 폴리펩티드를 포함하는 미생물"이란, 자연적으로 약한 포메이트 환원 활성을 가지고 있는 미생물 또는 포메이트 환원 활성이 없는 모균주에 포메이트 환원 활성능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 몇몇 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는, 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 도 5의 벡터가 포함된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은, 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 발명의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 변이형 포메이트 탈수소화 효소를 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 발명에서 용어, "환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 강화시킨 미생물 일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여, 목적하는 포메이트 탈수소화 효소의 환원 활성이 증가된 것을 특징으로 하며, 환원활성이 증가된 변이형 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 생산하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지에서 환원 활성이 증가된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 변이형 포메이트 탈수소화 효소의 생산방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 5’-이노신산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를, 이산화탄소 및 전자공여체를 포함하는 혼합물과 반응시키는 단계; 및 상기 반응 단계 후 포메이트를 회수하는 단계를 포함하는, 포메이트의 생산방법을 제공한다. 본 발명의 목적상 상기 전자공여체는 NADH인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 혼합물은 반응완충액을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 반응완충액은 중성의 인산염 완충액인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 또는 포메이트를 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 또는 포메이트를 회수 할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 또는 포메이트는 정제된 형태 또는 변이형 포메이트 탈수소화 효소 또는 포메이트를 함유한 미생물 발효액일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 야생형 FDH와 스크리닝에서 선별된 변이형 FDH의 포메이트 생성양을 비교한 결과, 야생형 FDH는 활성이 낮아서 HPLC로 측정하기 어려울 만큼 적은 양이 환원된 것에 반해, 변이형 FDH는 많은 양의 포메이트를 생성하였음을 확인하였다.
이는 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝을 하기 위하여 제작한 시스템(대장균 세포주)을 이용하면, 환원 활성이 증가된 변이형 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝할 수 있음을 확인한 것이며, 또한 스크리닝 시스템을 이용하여 선별된 변이형 포메이트 탈수소화 효소가 이산화탄소를 포메이트로 환원시켜 생성한 양이 야생형에 비하여 현저히 증가함을 확인한 것이다.
본 발명의 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝 시스템을 사용하면 신속하고 효율적으로 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 제조할 수 있으며, 신규하게 분리된 포메이트 탈수소화 효소 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 이용하여, 이산화탄소를 포메이트로 환원시키는 경우 많은양의 포메이트의 생산이 가능하다.
도 1은 포메이트 탈수소화 효소가 대장균 안에서 발현하여 이산화탄소를 포메이트로 변환시키면, 생성된 포메이트의 농도에 따라서 녹색 형광 단백질이 발현됨을 도식화한 것이다.
도 2는 효소 스크리닝 시스템이 예측대로 작동하는지 두 가지 기질 포름산나트륨(포메이트)과 포름산으로 확인한 결과이다. 구체적으로, a)는 시간경과에 따른 성장 곡선 그래프이고, b)는 시간 경과에 따른 형광값 수치를 나타낸 것이며, c)는 기질 농도에 따른 형광값 수치를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 스크리닝 시스템을 이용하여 티오바실러스 유래 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝한 FACS 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 변이 FDH 2종과 야생형 FDH의 포메이트 생성양을 비교한 그래프이다.
도 5는 포메이트 센서를 위한 벡터 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예 1: 포메이트 스크리닝을 하기 위한 대장균 세포주 제작
실시예 1-1: 변이체 라이브러리 제작
티오바실러스(Thiobacillus) 유래의 포메이트 탈수소화 효소(formate dehydrogenase; FDH) (서열번호 1)의 환원 활성이 증가된 변이체를 상기 시스템을 이용하여 스크리닝 하기 위하여 변이체 라이브러리를 제작하였다. 상기 야생형 포메이트 탈수소화 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고(바이오니아, 대전), 합성된 폴리뉴클레오티드를 pET21b 벡터에 클로닝하여 발현벡터를 수득하였다. 수득한 발현벡터는 변이 라이브러리를 구축하기 위한 방향성 진화 실험(direct evolution)의 주형으로 사용하였다. Diversity® PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech, USA)을 이용하여 FDH 유전자 내 변이를 유도하고, 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여, 변이 라이브러리를 구축하였다. 이때, PCR 조건은 94 ℃에서 30초간 1회; 25회(94℃ 30초, 68℃ 1분); 68℃에서 1분간 1회의 반응조건으로 수행하였다.
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
4 FDH_forword CGATGCGTCCGGCGTAGAGG
5 FDH_reverse AAAGGATCCCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG
구축된 라이브러리는 전기 형질전환 방법으로 스크리닝 세포주에 도입하였다. 실험 방법은 BIO-RAD사 GenePulser Xcell??의 박테리아 유전자 도입 방법을 따랐다. 변이체 라이브러리 이외에 대조군으로 사용하기 위한 야생형 FDH의 도입 실험도 동시에 진행하였다.
실시예 1-2: pACYC Duet-fhlA-PfdhF-sfGFP-1 벡터의 제작
대장균을 이용하여 활성이 개선된 포메이트 탈수소화 효소를 스크닝하는 시스템을 제작하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 pACYC Duet-fhlA-PfdhF-sfGFP-1 벡터를 제조하였다. 구체적으로, fhlA 유전자를 대장균 BL21에서 프라이머 fhlA-forword와 fhlA-reverse를 이용하여 PCR 증폭하여, NdeI과 PacI 제한 효소로 자르고 동 제한효소로 절단된 pACYC Duet-1 벡터에 클로닝하여 pACYC Duet-fhlA를 제작하였다.
이후 fdhF promoter를 fdhF-forword와 fdhF-reverse 프라이머(표 2)를 이용하여 증폭하고, pCL-GESS 벡터(KR10-1723868)에서 프라이머 GFP-forword와 GFP-reverse를 이용하여 증폭한 한 뒤, 이 두 PCR 반응의 결과물을 혼합하고 fdhF-forword, GFP-reverse 프라이머를 이용하여 PfhdF-sfGFP가 연결된 폴리펩티드 조각을 증폭하였다. 이를 제한효소 NarI과 AflII로 절단한 뒤, 같은 제한 효소로 절단한 pACYC Duet-fhlA에 클로닝하여 pACYC Duet-fhlA-PfdhF-sfGFP-1를 제작하였다(도 5).
서열번호 프라이머명 서열(5'-3')
6 fhlA- forword TATACATATGTCATATACACCGATGAGTGATCTCG
7 fhlA- reverse CCTAGGTTAATTAAATCAATGCCGATTTATCAATTCCCAG
8 fdhF- forword AAAGGCGCCAATGTCTGCCGCGTGATGGCTGTCACGCGGT
9 fdhF- reverse CACCTTTGCTCATCGGTCTCGCTCCAGTTAATCAAATCACGCA
10 GFP- forword GGAGCGAGACCGATGAGCAAAGGTGAAGAACTGTTTACCGGC
11 GFP- reverse ATTCTTAAGAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCATCC
실시예 1-3: 대장균을 이용한 활성이 개선된 포메이트 탈수소화 효소를 스크닝하는 시스템의 제작
효소 유전자의 돌연변이 유발을 통하여 활성이 개선된 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝 하기 위하여, 대장균을 이용하여 활성이 개선된 포메이트 탈수소화 효소를 스크닝하는 시스템을 제작하였다. 구체적으로, 도 1에서와 같이 pACYC Duet-1 벡터에서 인위적으로 생성되는 FhlA 단백질이 돌연변이 포메이트 탈수소화효소에 의해서 이산화탄소로부터 생성된 포메이트와 결합하고, 이러한 결합단백질이 fdhF 프로모터에 작용하여 그 하위에 있는 녹색형광단백질(sfGFP)을 발현하는 시스템을 구축하였다. 상기 시스템은 포메이트 탈수소화효소의 활성이 강하면 이산화탄소로부터 생성된 포메이트의 양이 많아지고, 이는 녹색형광을 강하게 한다. 따라서 녹색형광이 강한 미생물을 선별하면, 그 미생물이 이산화탄소 환원 활성이 강한 포메이트 탈수소화효소를 선별할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 포메이트의 농도에 따라 형광 세기를 다르게 하는 포메이트 센서를 개발하였다.
더욱 구체적으로, pACYC 벡터의 MCS(multiple cloning site) 1에 fhhF 유전자 프로모터와 결합한 sfGFP 유전자를 도입하고, MCS2에 fhlA 유전자를 도입하였다(도 5). 이렇게 제작한 벡터로 대장균 BL21 (DE3)를 형질전환하였다.
실시예 1-4: 형질전환한 대장균의 포메이트 센서 역할의 확인
실시예 1-3에서 형질전환한 대장균이 포메이트 센서 역할을 할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, 준비된 세포가 포메이트 농도에 따라 다른 형광 값을 갖는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 포메이트는 포름산 나트륨 (Sodium formate)과 포름산(Formic acid)의 두 가지 종류로 공급하였다. 각각 0 mM, 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM의 농도로 처리 후에 세포의 성장 속도와 형광 값을 2시간 간격으로 16 시간 동안 측정하였다(도 2). 대장균 세포는 50 uM 가나마이신과 25 uM 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지에서 12시간 배양하여, 600 nm 흡광도에서 수치 1이 되도록 멸균된 증류수를 이용하여 희석하였다. 이 세포 용액 5ul와 동일한 항생제를 포함하는 M9 배지 195 ul를 섞어서 형광값을 측정할 수 있는 96 웰 플레이트에 37 ℃, 500 rpm 조건에서 배양하면서 측정하였다. 그 결과, 16시간 동안 세포는 일반적인 대장균의 성장 곡선을 나타내며 성장하였다.
형광 수치는 excitation 485nm, emission 510nm에서 측정하였고, 각 수치는 세포 1개가 나타내는 형광 수치를 알 수 있도록 세포의 수로 나누어서 그래프를 작성하였다. 그 결과, 포름산 나트륨과 포름산 모두 8시간 배양 후에 가장 높은 형광값을 보였다.
실시예 2: 야생형 보다 높은 이산화탄소 환원 활성을 갖는 FDH 변이주 선별
대조군으로 FDH 발현 벡터를 갖지 않고 스크리닝을 위한 시스템만 갖춰진 세포군과 이 시스템에 야생형 FDH 발현 벡터까지 갖는 세포군을 준비하였다. 이 대조군 2종류와 FDH 라이브러리를 발현시키는 스크리닝 세포 각각을 적당한 항생제를 포함한 LB 배지에서 12시간 동안 배양하였다. 이 세포를 600 nm 흡광도에서 수치 1이 되도록 멸균된 증류수를 이용하여 희석하고, 그 용액 500 ul를 적당한 항생제가 포함된 M9 배지 50 ml에서 8시간 동안 37℃, 180rpm에서 배양하였다. 이때 환원 반응의 기질로 사용되는 탄산수소나트륨 (Sodium bicarbonate)을 30 mM로 첨가하고, 동시에 FDH를 발현시키기 위하여 0.1 uM IPTG를 첨가하였다. 8시간 배양 후에 각 세포를 3000 rpm, 10분 조건으로 침전 시킨 후, PBS 용액에 다시 부유시켰다. 이 세포들은 FACS 시스템을 이용하여 형광 값을 측정하고, FDH 라이브러리를 발현시키는 세포군에서 상위 1 %의 시그널을 보이는 세포 3X105개를 수거하였다 (1차 양성 시그널 세포 분류).
수거된 세포들은 적당한 항생제를 갖는 LB 배지에서 12시간 동안 농축 (enrichment)단계를 거쳤다. 그 다음 이 세포들은 음성 시그널 세포 분류 단계를 거치기 위해서 1차 양성 시그널 분류와 동일한 방법으로 M9 배지에서 배양 되었는데, 이때 환원 반응의 기질인 탄산수소나트륨은 첨가 하지 않았다. FACS 시스템으로 세포가 수거될 때, 음성 시그널을 보이는 세포 3X105개를 수거함으로써 허위 양성 시그널을 나타내는 세포군을 배제하였다.
2차 양성 시그널 분류는 1차 실험과 동일한 조건으로 M9 배지에서 배양되었고, FACS 시스템에서 상위 0.1% 시그널을 보이는 세포 1X103개를 수거하였다(도 3). 수거된 세포는 스크리닝과 동일한 농도의 기질 탄산 수소 나트륨, IPTG, 항생제를 포함하는 한천 플레이트 (agar plate)에 도말하였다. 플레이트에 생성된 콜로니들의 FDH 발현 벡터를 수거하였고, 수거된 벡터 내의 변이된 FDH 유전자의 서열 정보를 읽었다. 변이 FDH는 단백질 C 말단에 His-tag되었기 때문에 니켈(Ni)-친화성 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제하였고, 환원 활성은 환원 반응 동안 사용되는 NADH 양을 340 nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
그 결과 여러 변이체들 중 대장균 단백질 발현 시스템에서 발현하여 정제한 후 환원 활성을 측정하였을 때, 두 가지 변이 FDH I109S/A387T, V128I/R323V가 높은 환원 활성을 나타내었다.
실시예 3: 변이 FDH의 포메이트 생성양 비교
정제된 야생형 FDH와 스크리닝에서 선별된 변이 FDH I109S/A387T와 V128I/R323V의 포메이트 생성양을 비교하였다. 구체적으로, 100 ug의 FDH가 25℃에서 4 시간 동안 기질 탄산수소나트륨 170 mM을 환원시켜서 생성한 포메이트 농도를 HPLC로 측정하였다(도 4). LC 컬럼은 BIO-RAD사의 Aminex HPX-87H 300 X 7.8 mm 이온 교환 컬럼을 사용하였다.
그 결과, 야생형 FDH는 활성이 낮아서 HPLC로 측정하기 어려울 만큼 적은 양이 환원된 것에 반해, 변이 FDH I109S/A387T는 16.4 mM, V128I/R323V는 34.7 mM을 각각 생성하였다.
상기 결과들은 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝을 하기 위하여 제작한 시스템(대장균 세포주)을 이용하면, 환원 활성이 개선된 변이형 포메이트 탈수소화 효소를 스크리닝할 수 있음을 확인한 것이다. 또한, 스크리닝 시스템을 이용하여 선별된 변이형 포메이트 탈수소화 효소가 이산화탄소를 포메이트로 환원시켜 생성한 양이 야생형에 비하여 현저히 증가함을 확인한 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Intelligent Synthetic Biology Center <120> A screening system for formate dehydrogenase with increased carbon dioxide reducing activity and uses thereof <130> KPA180246-KR <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thiobacillus sp. formate dehydrogenase; FDH <400> 1 Met Ala Lys Ile Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 50 55 60 Glu Ala Asn Gly His Thr Phe Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Phe Glu Lys Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val 115 120 125 Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160 Gly Leu Val Arg Asn Tyr Ile Pro Ser His Asp Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu His Ser Tyr Asp Leu Glu Gly 180 185 190 Met Thr Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205 Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220 Arg Leu Pro Glu Ala Val Glu Lys Glu Leu Gly Leu Val Trp His Asp 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro His Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Val 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 260 265 270 Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Ala Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Ile Glu Ser Gly Gln Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Arg Thr Met Lys Trp Glu Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380 Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400 Gly <210> 2 <211> 401 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thiobacillus sp. formate dehydrogenase; FDH (I109S/A387T) <400> 2 Met Ala Lys Ile Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 50 55 60 Glu Ala Asn Gly His Thr Phe Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Phe Glu Lys Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ser Ala Lys Ala 100 105 110 Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Val 115 120 125 Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160 Gly Leu Val Arg Asn Tyr Ile Pro Ser His Asp Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu His Ser Tyr Asp Leu Glu Gly 180 185 190 Met Thr Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205 Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220 Arg Leu Pro Glu Ala Val Glu Lys Glu Leu Gly Leu Val Trp His Asp 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro His Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Val 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 260 265 270 Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Ala Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Ile Glu Ser Gly Gln Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Arg Thr Met Lys Trp Glu Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380 Gly Asn Thr Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400 Gly <210> 3 <211> 401 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Thiobacillus sp. formate dehydrogenase; FDH (V128I/R323V) <400> 3 Met Ala Lys Ile Leu Cys Val Leu Tyr Asp Asp Pro Val Asp Gly Tyr 1 5 10 15 Pro Lys Thr Tyr Ala Arg Asp Asp Leu Pro Lys Ile Asp His Tyr Pro 20 25 30 Gly Gly Gln Thr Leu Pro Thr Pro Lys Ala Ile Asp Phe Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Leu Leu Gly Ser Val Ser Gly Glu Leu Gly Leu Arg Lys Tyr Leu 50 55 60 Glu Ala Asn Gly His Thr Phe Val Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Phe Glu Lys Glu Leu Val Asp Ala Asp Val Val Ile Ser 85 90 95 Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Pro Glu Arg Ile Ala Lys Ala 100 105 110 Lys Asn Leu Lys Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His Ile 115 120 125 Asp Leu Gln Ser Ala Ile Asp Arg Gly Ile Thr Val Ala Glu Val Thr 130 135 140 Tyr Cys Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Met Ile Leu 145 150 155 160 Gly Leu Val Arg Asn Tyr Ile Pro Ser His Asp Trp Ala Arg Lys Gly 165 170 175 Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Glu His Ser Tyr Asp Leu Glu Gly 180 185 190 Met Thr Val Gly Ser Val Ala Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val Leu 195 200 205 Arg Arg Leu Ala Pro Phe Asp Val Lys Leu His Tyr Thr Asp Arg His 210 215 220 Arg Leu Pro Glu Ala Val Glu Lys Glu Leu Gly Leu Val Trp His Asp 225 230 235 240 Thr Arg Glu Asp Met Tyr Pro His Cys Asp Val Val Thr Leu Asn Val 245 250 255 Pro Leu His Pro Glu Thr Glu His Met Ile Asn Asp Glu Thr Leu Lys 260 265 270 Leu Phe Lys Arg Gly Ala Tyr Ile Val Asn Thr Ala Arg Gly Lys Leu 275 280 285 Ala Asp Arg Asp Ala Ile Val Arg Ala Ile Glu Ser Gly Gln Leu Ala 290 295 300 Gly Tyr Ala Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Lys Asp His 305 310 315 320 Pro Trp Val Thr Met Lys Trp Glu Gly Met Thr Pro His Ile Ser Gly 325 330 335 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Arg Glu Ile 340 345 350 Leu Glu Cys Phe Phe Glu Gly Arg Pro Ile Arg Asp Glu Tyr Leu Ile 355 360 365 Val Gln Gly Gly Ala Leu Ala Gly Thr Gly Ala His Ser Tyr Ser Lys 370 375 380 Gly Asn Ala Thr Gly Gly Ser Glu Glu Ala Ala Lys Phe Lys Lys Ala 385 390 395 400 Gly <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDH_forword <400> 4 cgatgcgtcc ggcgtagagg 20 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FDH_reverse <400> 5 aaaggatccc tagttattgc tcagcggtgg 30 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhlA- forword <400> 6 tatacatatg tcatatacac cgatgagtga tctcg 35 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fhlA- reverse <400> 7 cctaggttaa ttaaatcaat gccgatttat caattcccag 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fdhF- forword <400> 8 aaaggcgcca atgtctgccg cgtgatggct gtcacgcggt 40 <210> 9 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fdhF- reverse <400> 9 cacctttgct catcggtctc gctccagtta atcaaatcac gca 43 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP- forword <400> 10 ggagcgagac cgatgagcaa aggtgaagaa ctgtttaccg gc 42 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP- reverse <400> 11 attcttaaga gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatcc 39

Claims (15)

  1. ⅰ) 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리; 및 ⅱ) FhlA 단백질을 코딩하는 유전자 및 fdhF 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 발현카세트를 포함하는, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리는 티오바실러스 속(Thiobacillus sp.) 균주로부터 유래된 것인, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포메이트 탈수소화 효소 라이브러리는 렌덤 돌연변이된 포메이트 탈수소화 효소인 것인, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소 스크리닝용 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 미생물을 이용하여 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 스크리닝 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 스크리닝 방법은 포메이트 탈수소화효소에 의해 환원된 포메이트가 리포터 단백질을 발현시켜, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를 검출하는 단계를 포함하는, 스크리닝 방법.
  6. 삭제
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 폴리펩티드에 변이가 도입되어 이산화탄소를 포메이트로 환원 활성을 증가시키는, 변이형 폴리펩티드로서,
    상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진, 변이형 폴리펩티드.
  8. 제7항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터를 포함하는 미생물.
  11. (a) 제10항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및,
    (b) 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소의 생산방법.
  12. (a) 제7항의 환원 활성이 증가된 포메이트 탈수소화 효소를, 이산화탄소 및 전자공여체를 포함하는 혼합물과 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 반응 단계 후 포메이트를 회수하는 단계를 포함하는, 포메이트의 생산방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 전자공여체는 NADH(Nicotinamide adenine dinucleotide) 인 것인, 포메이트의 생산방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 혼합물은 반응완충액을 추가로 포함하는 것인, 포메이트의 생산방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 반응완충액은 중성의 인산염 완충액인 것인, 포메이트의 생산방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002505590A (ja) 1997-06-16 2002-02-19 ディベルサ コーポレーション 新規な酵素のハイスループットスクリーニング

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Choe et al., Efficient CO2-Reducing Activity of NAD-Dependent Formate Dehydrogenase from Thiobacillus sp. KNK65MA for Formate Production from CO Gas. PLOS ONE. July 2014, Vol. 9, Issue 7, e103111
Sanchez-Torres V et al., Protein engineering of the transcriptional activator FhlA To enhance hydrogen production in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2009 Sep;75(17):5639-46

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