JP5915649B2 - 改良型ニトリルヒドラターゼ - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)以下の(A)又は(B)のタンパク質;
(A)野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、下記(a)、(b)、(c)、(d)及び(e)のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換され、さらに、下記(f)〜(q)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質、
(a)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて167残基下流のアミノ酸残基、
(b)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて219残基下流のアミノ酸残基、
(c)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて57残基下流のアミノ酸残基、
(d)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて114残基下流のアミノ酸残基、
(e)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて107残基下流のアミノ酸残基、
(f)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて218残基下流のアミノ酸残基、
(g)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて190残基下流のアミノ酸残基、
(h)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて168残基下流のアミノ酸残基、
(i)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて144残基下流のアミノ酸残基、
(j)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて133残基下流のアミノ酸残基、
(k)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて112残基下流のアミノ酸残基、
(l)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて105残基下流のアミノ酸残基、
(m)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて95残基下流のアミノ酸残基、
(n)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて17残基下流のアミノ酸残基、
(o)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて15残基下流のアミノ酸残基、
(p)αサブユニットのアミノ酸配列において、補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より67残基下流のアミノ酸残基、
(q)αサブユニットのアミノ酸配列において、補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より17残基下流のアミノ酸残基。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、1又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。
(2) (1)に記載のタンパク質をコードするDNA。
(3) (2)に記載の遺伝子DNAを含む組換えベクター。
(4) (3)に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(5) (4)に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ。
(6) (4)に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
(7) (1)に記載のタンパク質又は(4)に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
なお本明細書においては、特記した場合を除き、「上流」及び「上流側」とは、アミノ酸配列に関しては「N末端側」を意味し、塩基配列に関しては「5’末端側」を意味する。
また、「下流」及び「下流側」とは、アミノ酸配列に関しては「C末端側」を意味し、塩基配列に関しては「3」を意味する。
(a)野生型ニトリルヒドラターゼ
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼは、野生型ニトリルヒドラターゼの改良型であり、その由来は特に限定されるものではない。ここで、「野生型ニトリルヒドラターゼ」とは、自然界の生物(例えば、土壌細菌等の微生物)より分離され得るニトリルヒドラターゼを指し、当該酵素を構成するアミノ酸配列、及び当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列が、人為的に欠失又は挿入せず、あるいは、他のアミノ酸又は塩基で置換されておらず、天然由来の特性を保持したままのニトリルヒドラターゼを意味する。
本発明は、野生型ニトリルヒドラターゼにアミノ酸置換を施した改良型(変異型)ニトリルヒドラターゼである。置換を施す対象となる野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列はGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等のNCBIのデータベースに公表されている。
(b)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて219残基下流のアミノ酸残基。
(c)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて57残基下流のアミノ酸残基。
(d)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて114残基下流のアミノ酸残基。
(e)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて107残基下流のアミノ酸残基。
(f)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて218残基下流のアミノ酸残基。
(g)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて190残基下流のアミノ酸残基。
(h)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて168残基下流のアミノ酸残基。
(i)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて144残基下流のアミノ酸残基。
(j)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて133残基下流のアミノ酸残基。
(k)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて112残基下流のアミノ酸残基。
(l)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて105残基下流のアミノ酸残基。
(m)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて95残基下流のアミノ酸残基。
(n)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて17残基下流のアミノ酸残基。
(o)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて15残基下流のアミノ酸残基。
(p)αサブユニットのアミノ酸配列において補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より67残基下流のアミノ酸残基。
(q)αサブユニットのアミノ酸配列において補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より17残基下流のアミノ酸残基。
(1)上記(a)〜(e)、及び(n)のアミノ酸残基。
(2)上記(a)〜(e)、及び(n)のアミノ酸残基、並びに、上記(g)〜(j)、(l)、(m)、(o)及び(q)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基。
(3)上記(a)〜(e)、(n)、(i)、及び(p)のアミノ酸残基。
(4)上記(a)〜(e)、(n)、(p)、及び(f)のアミノ酸残基。
(5)上記(a)〜(e)、(n)、(i)、(p)のアミノ酸残基、並びに、上記(f)、(k)及び(m)からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基。
アミド化合物としては、例えば、下記一般式(1):
R−CONH2 (1)
(ここで、Rは、置換されていてもよい炭素数1〜10の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基又はアルケニル基、置換されていてもよい炭素数3〜18のシクロアルキル基又はアリール基、あるいは、置換されていてもよい飽和又は不飽和複素環基である。)
で表されるアミド化合物が挙げられる。特に、式中、Rが「CH2=CH−」であるアクリルアミドが好ましい。
変異体を用いたタンパク質の機能、性質を研究する方法の一つに、ランダム変異導入法がある。ランダム変異導入法とは、特定のタンパク質をコードする遺伝子に対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。PCRによるランダム変異導入法では、DNA増幅時に厳密度(ストリンジェンシー)の低い条件を設定して、塩基の変異を導入する(Error prone PCR)ことができる。
本発明の改良型ニトリルヒドラターゼには、表1に示す変異を導入したタンパク質をコードした遺伝子が含まれる。
ニトリルヒドラターゼ遺伝子は、形質転換される宿主生物において発現可能なように、ベクターに組み込むことが必要である。例えば、ベクターとしてはプラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。
本発明において、改良型ニトリルヒドラターゼは、上記形質転換体を培養し、得られる培養物から採取することにより製造することができる。
上述のように製造された改良型ニトリルヒドラターゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。例えば、ニトリル化合物に、上記改良型ニトリルヒドラターゼを接触させることにより、アミド化合物を生成する。そして、接触により生成されるアミド化合物を採取する。これにより、アミド化合物を製造することができる。
(1)変異遺伝子ライブラリーの構築
鋳型としたプラスミドとしては、βサブユニットのアミノ酸配列(配列番号2)のN末端のアミノ酸残基から数えて167残基下流のアミノ酸残基がアスパラギン(N)からセリン(S)に変異し、かつ、上記N末端のアミノ酸残基から数えて219残基下流のアミノ酸残基がバリン(V)からアラニン(A)に変異し、かつ、上記N末端のアミノ酸残基から数えて57残基下流のアミノ酸残基がセリン(S)からメチオニン(M)に変異し、かつ、上記N末端のアミノ酸残基から数えて114残基下流のアミノ酸残基がリジン(K)からチオrシン(Y)に変異し、かつ、上記N末端のアミノ酸残基から数えて107残基下流のアミノ酸残基がスレオニン(T)からリジン(K)に変異したプラスミドpER855(特開2010−172295参照)の改変物であるpER855A(図1)を用いた。
先ず、ニトリルヒドラターゼ遺伝子への変異導入を下記の手法で行った。
滅菌水 20μl
pER855A (1ng/ml) 1μl
Forward Primer (10mM) 2μl
Reverse Primer (10mM) 2μl
PrimeSTAR MAX (2×) 25μl
50μl
<PCR反応条件>
(98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃で90秒)×30サイクル
<プライマー>β17の飽和変異プライマー
β17RM−F ggatacggaccggtcNNStatcagaaggacgag (配列番号5)
β17RM−R ctcgtccttctgataSNNgaccggtccgtatcc (配列番号6)
<反応条件>
(94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で3分)×30サイクル
ロドコッカス・ロドクロウス ATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて3回洗浄し、滅菌水に懸濁した。上記(1)で調製したプラスミド1μlと菌体懸濁液10μlを混合して氷冷し、キュベットにプラスミドDNAと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser II(BIO RAD)により2.0KV、200 OHMSで電気パルス処理を行った。
スクリーニングには、上記(2)で得られたニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むロドコッカス菌形質転換体、及び比較株であるATCC12674/pER855Aを使用した。GGPK培地(1.5%グルコース、1%グルタミン酸ナトリウム、0.1%酵母エキス、0.05%K2HPO4、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4・7H2O、1%CoCl2、0.1%尿素、50μg/mlカナマイシン、pH7.2)を1mlずつ入れた96穴ディープウェルプレートに上記菌株を各々接種し、30℃で3日間液体培養した。
ニトリルヒドラターゼ遺伝子の塩基配列の確認をするため、得られた選抜株からプラスミドを回収した。ロドコッカス形質転換体を、10mlのMYK培地(ポリペプトン0.5%、バクトイーストエキス0.3%、マルツエキス0.3%、グルコース1%、カナマイシン50μg/ml)に植菌した。24時間培養した後に終濃度2%となるように滅菌した20%グリシン溶液を添加し、さらに24時間培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、菌体をTES(10mMTris−HCl(pH8)−10mMNaCl−1mMEDTA)緩衝液で洗浄後、2mlの50mMTris−HCl(pH8)−12.5%シュークロース−100mMNaCl−1mg/mlリゾチームに懸濁し、37℃にて3時間振盪した。これに0.4mlの10%SDSを加え室温で穏やかに1時間振盪し、さらに2.1mlの5M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.2)を添加し氷中で1時間静置した。その後、4℃にて10,000xg、1時間遠心し上清を得た。これに5倍量のエタノールを加え、−20℃で30分静置した後、10,000xg、20分間遠心した。沈澱物を10mlの70%エタノールで洗浄した後、100μlのTE緩衝液に溶解しDNA溶液を得た。
<PCR反応液組成>
鋳型プラスミド 1μl
10× PCR Buffer(NEB社製) 10μl
プライマーNH−19(50μM) 1μl
プライマーNH−20(50μM) 1μl
2.5mM dNTPmix 8μl
滅菌水 79μl
Taq DNAポリメラーゼ(NEB社製) 1μl
<プライマー>
NH−19 GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG(配列番号7)
NH−20 ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC(配列番号8)
<反応条件>
(94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で3分)×30サイクル。
(4)で取得した改良型ニトリルヒドラターゼのアミド化合物耐性を以下の手法で実施した。
ATCC12674/pER855Aと、上記(2)の工程で得られた各形質転換体を10mlのMYK培地(50μg/mlカナマイシン)にそれぞれ接種し、30℃にて2日間振盪培養し、100mlのGGPK培地(1.5%グルコース、1%グルタミン酸ナトリウム、0.1%酵母エキス、0.05%K2HPO4、0.05%KH2PO4、0.05%MgSO4・7H2O、1%CoCl2、0.1%尿素、50μg/mlカナマイシン、pH7.2)に1%植菌を行った。30℃で3日間振盪培養し、遠心分離により集菌した。
<分析条件>
分析機器: ガスクロマトグラフGC−14B(島津製作所製)
検出器: FID(検出200℃)
カラム: ポラパックPS(ウォーターズ社製カラム充填剤)を充填した1mガラスカラム
カラム温度: 190℃
アクリルアミドの量からニトリルヒドラターゼ活性を換算した。ここで、ニトリルヒドラターゼ活性は、1分間に1μmolのアクリルアミドを生成する酵素量を1Uと定義する。
<反応液組成>
50%アクリルアミド溶液 94g
アクリロニトリル 4g
1Mリン酸緩衝液 1g
菌液(同一の酵素活性単位(U)量)
<反応条件>
攪拌しながら5時間反応(30℃)
(1)ニトリルヒドラターゼへの変異導入と選抜
実施例1で取得したpFR005を鋳型として、さらにアクリルアミド耐性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼの取得を試みた。使用したプライマーのみを変更し、実施例1と同様の手法(変異導入、ロドコッカス形質転換体の作成、ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理方法、塩基配列の確認)を実施し、表6に選抜された変異酵素を取得した。
<プライマー>
β15の飽和変異プライマー
β15RM−F:atgaccggatacggaNNSgtcccctatcagaag(配列9)
β15RM−R:cttctgataggggacSNNtccgtatccggtcat(配列10)
β95の飽和変異プライマー
β95RM−F:accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag(配列11)
β95RM−R:ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt(配列12)
β105の飽和変異プライマー
β105RM−F:GAGATCCTTGAGGGTNNSTACACGGACAGG(配列13)
β105RM−R:CCTGTCCGTGTASNNACCCTCAAGGATCTC(配列14)
β133の飽和変異プライマー
β133RM−F:cacgagccccactccNNSgcgcttccaggagcg(配列15)
β133RM−R:cgctcctggaagcgcSNNggagtggggctcgtg(配列16)
β144の飽和変異プライマー
β144RM‐F:ggagccgagtttctctNNSggtgacaagatc(配列17)
β144RM‐R:gatcttgtcaccSNNagagaaactcggctcc(配列18)
β168の飽和変異プライマー
β168RM−FcgaaatatgtgcggagcNNSatcggggaaatcg(配列19)
β168RM−RcgatttccccgatSNNgctccgcacatatttcg(配列20)
β190の飽和変異プライマー
β190RM−F:gagcagctccgccggcctcNNSgacgatcctcg(配列21)
β190RM−R:cgaggatcgtcSNNgaggccggcggagctgctc(配列22)
α124の飽和変異プライマー
α124RM−F:gtacaagagcatgNNStaccggtcccgagtgg(配列23)
α124RM−R:ccactcgggaccggtaSNNcatgctcttgtac(配列24)
取得した改良型ニトリルヒドラターゼの性能評価を実施例1(5)と同様の手法で実施した。
(1)ニトリルヒドラターゼへの変異導入と選抜
実施例2で取得したpFR108Aを鋳型として、さらにアクリルアミド耐性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼの取得を試みた。使用したプライマーのみを変更し、実施例1と同様の手法(変異導入、ロドコッカス形質転換体の作成、ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理方法、塩基配列の確認)を実施し、表8に選抜された変異酵素を取得した。尚、改良型ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の選抜は、55℃の温度下、60分間の熱処理を行い、それ以外は実施例1と同様の方法で行なった。
<プライマー>
α174の飽和変異プライマー
α174RM−F:gccggcaccgacNNStggtccgaggag(配列25)
α174RM−R:ctcctcggaccaSNNgtcggtgccggc(配列26)
取得した改良型ニトリルヒドラターゼの性能評価を実施例1(5)と同様の手法で実施した。
実施例2で取得したpFR211を鋳型として、さらにアクリルアミド耐性の向上した改良型ニトリルヒドラターゼの取得を試みた。使用したプライマーのみを変更し、実施例3と同様の手法(変異導入、ロドコッカス形質転換体の作成、ロドコッカス菌形質転換体のアミド処理方法、塩基配列の確認)を実施し、表10に選抜された変異酵素を取得した。
<プライマー>
β95の飽和変異プライマー
β95RM−F:accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag(配列27)
β95RM−R:ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt(配列28)
β112の飽和変異プライマー
β112RM−F:GACAGGAAGCCGNNSCGGAAGTTCGATCCG(配列29)
β112RM−R:CGGATCGAACTTCCGSNNCGGCTTCCTGTC(配列30)
β218の飽和変異プライマー
β218RM−F:gggaaagacgtagtgNNSgccgatctctgggaa(配列31)
β218RM−R:ttcccagagatcggcSNNcactacgtctttccc(配列32)
取得した改良型ニトリルヒドラターゼの性能評価を実施例1(5)と同様の手法で実施した。結果を表11に示す。
実施例4で取得したpFR306を鋳型として、Lβ144Sを野生型アミノ酸に置換した改良型ニトリルヒドラターゼを作製した。方法としては、下記のプライマーを使用し、実施例1と同様の方法でロドコッカス形質転換体を作製した。
<プライマー>
β144の変異を野生型に戻す
F_Sβ144L−F:TTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG(配列33)
F_Sβ144L−R:GTCACCGAGAGAGAAACTCGGCTCCGC(配列34)
本発明で取得した改良型ニトリルヒドラターゼの性能評価を下記の手法で実施した。
表13に示す変異ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む形質転換体を実施例1(5)の方法で培養し、耐熱性の評価に用いた。得られた培養物を50mMリン酸緩衝液で適宜希釈し、70℃のウォーターバスで10分間熱処理に供した後、残存ニトリルヒドラターゼ活性の測定を行った。活性測定は実施例1(5)記載の方法に従った。比較対照として熱処理を行わず4℃で保冷したものをそれぞれの無処理菌として残存活性を求めた。
配列番号1:J1菌由来のニトリルヒドラターゼβサブユニットの塩基配列
配列番号2:J1菌由来のニトリルヒドラターゼβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号3:J1菌由来のニトリルヒドラターゼαサブユニットの塩基配列
配列番号4:J1菌由来のニトリルヒドラターゼαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号5:β17の飽和変異プライマー
配列番号6:β17の飽和変異プライマー
配列番号7:NH−19プライマー
配列番号8:NH−20プライマー
配列番号9:β15の飽和変異プライマー
配列番号10:β15の飽和変異プライマー
配列番号11:β95の飽和変異プライマー
配列番号12:β95の飽和変異プライマー
配列番号13:β105の飽和変異プライマー
配列番号14:β105の飽和変異プライマー
配列番号15:β133の飽和変異プライマー
配列番号16:β133の飽和変異プライマー
配列番号17:β144の飽和変異プライマー
配列番号18:β144の飽和変異プライマー
配列番号19:β168の飽和変異プライマー
配列番号20:β168の飽和変異プライマー
配列番号21:β190の飽和変異プライマー
配列番号22:β190の飽和変異プライマー
配列番号23:α124の飽和変異プライマー
配列番号24:α124の飽和変異プライマー
配列番号25:α174の飽和変異プライマー
配列番号26:α174の飽和変異プライマー
配列番号27:β95の飽和変異プライマー
配列番号28:β95の飽和変異プライマー
配列番号29:β112の飽和変異プライマー
配列番号30:β112の飽和変異プライマー
配列番号31:β218の飽和変異プライマー
配列番号32:β218の飽和変異プライマー
配列番号33:β144の変異を野生型に戻すプライマー
配列番号34:β144の変異を野生型に戻すプライマー
配列番号35:Rhodococcus M8のβサブユニット
配列番号36:Rhodococcus ruber THのβサブユニット
配列番号37:R.pyridinovorans MW3のβサブユニット
配列番号38:R.pyridinovorans S85−2のβサブユニット
配列番号39:R.pyridinovorans MS−38のβサブユニット
配列番号40:Nocardia sp JBRsのβサブユニット
配列番号41:Nocardia YS−2002のβサブユニット
配列番号42:R.rhodocrous ATCC39384のβサブユニット
配列番号43:uncultured bacterium SP1のβサブユニット
配列番号44:uncultured bacterium BD2のβサブユニット
配列番号45:Comamonas testosteroniのβサブユニット
配列番号46:G.thermoglucosidasius Q6のβサブユニット
配列番号47:P.thermophila JCM3095のβサブユニット
配列番号48:R.rhodocrous Cr4 のβサブユニット
配列番号49:Rhodococcus M8のαサブユニット
配列番号50:Rhodococcus ruber TH αサブユニット
配列番号51:R.pyridinovorans MW3のαサブユニット
配列番号52:R.pyridinovorans S85−2のαサブユニット
配列番号53:Nocardia sp JBRsのαサブユニット
配列番号54:Nocardia YS−2002のαサブユニット
配列番号55:uncultured bacterium BD2のαサブユニット
配列番号56:uncultured bacterium SP1のαサブユニット
配列番号57:R.rhodocrou ATCC39484のαサブユニット
配列番号58:Sinorhizobium medicae WSM419のαサブユニット
配列番号59:P.thermophila JCM3095のαサブユニット
配列番号60:R.rhodocrous Cr4 のαサブユニット
配列番号61:ロドコッカス属N−771株由来の鉄型ニトリルヒドラターゼαサブユニットのシステインクラスター
配列番号62:J1菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼαサブユニットのシステインクラスター
Claims (7)
- 以下の(A)又は(B)のタンパク質;
(A)野生型ニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列において、下記(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(n)の置換を含み、さらに、下記(f)〜(m)及び(o)〜(q)からなる群より選ばれる少なくとも1つの置換を含むかつ、野生型より高い耐熱性及びアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質、
(a)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて167残基下流のアミノ酸残基のセリンへの置換、
(b)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて219残基下流のアミノ酸残基のアラニンへの置換、
(c)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて57残基下流のアミノ酸残基のメチオニンへの置換、
(d)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて114残基下流のアミノ酸残基のチロシンへの置換、
(e)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて107残基下流のアミノ酸残基のリシンへの置換、
(f)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて218残基下流のアミノ酸残基のヒスチジンへの置換、
(g)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて190残基下流のアミノ酸残基のヒスチジンへの置換、
(h)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて168残基下流のアミノ酸残基のアルギニンへの置換、
(i)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて144残基下流のアミノ酸残基のアルギニン又はセリンへの置換、
(j)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて133残基下流のアミノ酸残基のアスパラギン又はアルギニンへの置換、
(k)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて112残基下流のアミノ酸残基のトレオニンへの置換、
(l)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて105残基下流のアミノ酸残基のトリプトファンへの置換、
(m)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて95残基下流のアミノ酸残基のバリンへの置換、
(n)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて17残基下流のアミノ酸残基のアスパラギン酸、ヒスチジン、グリシン、又はセリンへの置換、
(o)βサブユニットのアミノ酸配列においてN末端のアミノ酸残基から数えて15残基下流のアミノ酸残基のセリンへの置換、
(p)αサブユニットのアミノ酸配列において、補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より67残基下流のアミノ酸残基のロイシン又はバリンへの置換、
(q)αサブユニットのアミノ酸配列において、補欠分子結合領域を構成するアミノ酸配列C(S/T)LCSCの最も下流側のC残基より17残基下流のアミノ酸残基のセリンへの置換、
但し、野生型ニトリルヒドラターゼのα及びβサブユニットは、それぞれ配列番号4及び2で示される。
(B)(A)のタンパク質のアミノ酸配列において、前記置換後のアミノ酸残基を除き、1〜10個のアミノ酸残基が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、野生型より高い耐熱性及びアミド化合物耐性を有するニトリルヒドラターゼ活性を有することを特徴とするタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項2に記載のDNAを含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取されるニトリルヒドラターゼ。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼの製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質又は請求項4に記載の形質転換体を培養して得られる培養物若しくは当該培養物の処理物をニトリル化合物に接触させることを特徴とする、アミド化合物の製造方法。
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