KR20140006052A

KR20140006052A - 개량형 니트릴 히드라타제

Info

Publication number: KR20140006052A
Application number: KR1020137029289A
Authority: KR
Inventors: 후미아끼 와따나베; 다까노리 암보; 아이 하라
Original assignee: 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2014-01-15
Also published as: EP2716754A1; AU2012264058A1; EP2716754A4; AU2012264058B2; KR20160108569A; US9382528B2; JPWO2012164933A1; KR101734797B1; US20140120588A1; WO2012164933A1; CN103649312A; EP2716754B1; US20150337287A1; US9388403B2; JP5915649B2; CN103649312B

Abstract

야생형 니트릴 히드라타제의 개량에 의해, 내열성 및 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 보다 한층 향상된 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 제공한다. 이하의 (A) 또는 (B)의 단백질; (A) 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에서 특정한 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질, (B) 상기 (A)의 단백질의 아미노산 배열에서, 상기 특정한 아미노산 잔기를 제외하고, 1 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 사용한다.

Description

개량형 니트릴 히드라타제{IMPROVED NITRILE HYDRATASE}

본 발명은 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제, 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 나아가, 당해 효소를 코드하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 당해 재조합 벡터를 갖는 형질 전환체, 및 아미드 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

최근 들어, 니트릴기를 수화하여 아미드기로 변환하는 니트릴 수화 활성을 갖는 효소인 니트릴 히드라타제가 발견되어, 당해 효소 또는 당해 효소를 함유하는 미생물 균체 등을 사용하여 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 이 제조 방법은, 종래의 화학 합성법과 비교하여, 니트릴 화합물로부터 대응하는 아미드 화합물로의 전화율 및 선택율이 높은 것으로 알려져 있다.

니트릴 히드라타제를 생산하는 미생물로는, 예를 들어 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 로도코커스(Rhodococcus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다. 그 중에서도 로도코커스·로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1주는 아크릴아미드의 공업적 생산에 사용되고 있어, 유용성이 실증되어 있다. 또한, 그 균주가 산생하는 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자도 명확해져 있다(특허문헌 1 참조).

한편, 자연계에 존재하는 미생물로부터 단리한 니트릴 히드라타제나 그 유전자를 이용할 뿐만 아니라, 니트릴 히드라타제에 대하여 활성, 기질 특이성, Vmax, Km, 열 안정성, 기질에 대한 안정성, 생성물에 대한 안정성 등을 변화시킬 목적으로 니트릴 히드라타제에 변이를 도입하는 것이 시도되어 있으며(특허문헌 2 참조), 본 발명자들에 의해 내열성 또는 아미드 화합물 내성을 함께 향상시킨 니트릴 히드라타제 유전자가 취득되어 있다(특허문헌 3 및 4 참조).

그러나, 더욱 내열성 및 아미드 화합물 내성의 향상, 또는 고온에서의 반응이 가능한 니트릴 히드라타제를 개발하여, 아미드 화합물의 제조에 사용하는 것은, 촉매 비용 등의 생산 비용의 관점 등에서 매우 유용하며, 그와 같은 성능을 갖는 효소의 취득은, 반응시의 효소량의 삭감 및 비용 삭감 등의 관점에서 개발이 요망되고 있다.

일본 특허 제3162091호 공보 국제 공개 제2004/056990호 팸플릿 국제 공개 제2005/116206호 팸플릿 일본 특허 공개 제2007-143409호 공보

따라서, 본 발명의 목적은, 니트릴 히드라타제의 개량에 의해, 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 더욱 향상된 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은, 당해 단백질을 코드하는 유전자 DNA, 당해 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터, 당해 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체, 당해 형질 전환체의 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제 및 그 제조 방법을 제공하는 데에 있다. 또한, 본 발명의 목적은, 당해 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 사용한 아미드 화합물의 제조 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열 중, 특정한 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 단백질이, 니트릴 히드라타제 활성을 가짐과 함께, 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 향상된 것임을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 이하의 (A) 또는 (B)의 단백질;

(A) 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에서, 하기 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 또한, 하기 (f) 내지 (q)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질,

(a) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 167 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(b) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 219 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(c) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 57 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(d) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 114 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(e) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 107 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(f) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 218 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(g) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 190 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(h) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 168 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(i) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 144 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(j) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 133 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(k) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 112 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(l) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 105 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(m) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 95 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(n) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 17 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(o) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 15 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(p) α 서브유닛의 아미노산 배열에서, 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T)LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 67 잔기 하류의 아미노산 잔기,

(q) α 서브유닛의 아미노산 배열에서, 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T)LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 17 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(B) (A)의 단백질의 아미노산 배열에서, 상기 치환 후의 아미노산 잔기를 제외하고, 1 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.

(2) (1)에 기재된 단백질을 코드하는 DNA.

(3) (2)에 기재된 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(4) (3)에 기재된 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.

(5) (4)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제.

(6) (4)에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법.

(7) (1)에 기재된 단백질 또는 (4)에 기재된 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.

본 발명에 따르면, 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 향상된 신규의 개량형(변이형)니트릴 히드라타제를 제공할 수 있다. 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 모두 보다 향상된 당해 개량형 니트릴 히드라타제는, 아미드 화합물의 제조 효율이 높아지므로 매우 유용하다.

도 1은 플라스미드 pER855A의 구성도이다.
도 2a는 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산 배열을 도시하는 도면이다.
도 2b는 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산 배열을 도시하는 도면이다(도 2a의 계속).
도 3a은 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열을 도시하는 도면이다.
도 3b는 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산 배열을 도시하는 도면이다(도 3a의 계속).

이하에, 본 발명을 상세하게 설명한다.

또한 본 명세서에서는, 특기했을 경우를 제외하고, "상류" 및 "상류측"이란, 아미노산 배열에 대해서는 "N 말단측"을 의미하고, 염기 배열에 대해서는 "5' 말단측"을 의미한다.

또한, "하류" 및 "하류측"이란, 아미노산 배열에 대해서는 "C 말단측"을 의미하고, 염기 배열에 대해서는 "3"을 의미한다.

1. 개량형 니트릴 히드라타제

(a) 야생형 니트릴 히드라타제

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 야생형 니트릴 히드라타제의 개량형이며, 그 유래는 특별히 한정되는 것은 아니다. 여기서, "야생형 니트릴 히드라타제"란, 자연계의 생물(예를 들어, 토양 세균 등의 미생물)로부터 분리될 수 있는 니트릴 히드라타제를 가리키며, 당해 효소를 구성하는 아미노산 배열 및 당해 효소를 코드하는 유전자의 염기 배열이, 인위적으로 결실 또는 삽입되지 않고, 또는, 다른 아미노산 또는 염기로 치환되어 있지 않아, 천연 유래의 특성을 유지한 채의 니트릴 히드라타제를 의미한다.

또한, 기지의 미생물 유래의 니트릴 히드라타제뿐만 아니라, 생물의 유래가 특정되지 않는 DNA 배열만으로부터 특정된 니트릴 히드라타제도, 상기 "야생형 니트릴 히드라타제"에 포함된다.

"야생형 니트릴 히드라타제"는, α 서브유닛 및 β 서브유닛의 도메인이 집합해서 이루어지는 고차 구조를 취하며, 보결 분자로서 비헴철 원자, 또는 비콜린 핵 코발트 원자를 갖고 있다. 이러한 니트릴 히드라타제는, 각각 철형 니트릴 히드라타제 및 코발트형 니트릴 히드라타제라는 호칭으로 구별되어 있다.

철형 니트릴 히드라타제로는, 로도코커스속 N-771주 유래의 것을 그 대표 예로서 들 수 있다. 이 철형 니트릴 히드라타제는, X선 결정 구조 해석이 이루어져, 그 입체 구조가 밝혀져 있다. 그 결과, 당해 효소는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(: 배열 번호 61) 중의 4개의 아미노산 잔기를 개재하여 비헴철과 결합하고 있다.

코발트형 니트릴 히드라타제로는, 로도코커스·로도크로우스 J1주(이하 "J1균"이라고도 함) 유래의 것, 또는 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia thermophila) 유래의 것을 대표 예로서 들 수 있다. J1균 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제는, 활성 중심을 형성하는 α 서브유닛의 시스테인 클러스터(: 배열 번호 62)로 나타내는 영역을 개재하여 코발트 원자와 결합하고 있다. 또한, 슈도노카르디아·서모필라 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제의 시스테인 클러스터는, 상기 J1균 유래의 시스테인 클러스터에서의 상류측(N 말단측)에서부터 제4번째의 시스테인(Cys)이 시스테인 술핀산(Csi)이며, 가장 하류측(C 말단측)의 제6번째의 시스테인(Cys)이 시스테인 술펜산(Cse)이다.

상술한 바와 같이, 보결 분자는, α 서브유닛 중의 시스테인 클러스터 "C(S/T)LCSC"(배열 번호 61 및 62)로 표현되는 영역과 결합하고 있다. 이러한 보결 분자 결합 영역을 포함하는 니트릴 히드라타제로는, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478), 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814), 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D), 로도코커스·로도크로우스 ATCC39484(일본 특허 공개 제2001-292772호), 바실러스 스미티이(Bacillus smithii)(일본 특허 공개 평 9-248188호), 슈도노카르디아·서모필라(일본 특허 공개 평 9-275978호) 또는 지오바실러스 서모글루코시데시어스(Geobacillus thermoglucosidasius) 유래의 아미노산 배열을 갖는 니트릴 히드라타제 및 유전자 배열로 코드되는 니트릴 히드라타제를 들 수 있다.

각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 α 서브유닛의 아미노산(1 문자 표기) 배열의 얼라인먼트를, 도 3a 및 도 3b에 나타냈다. 또한, 도 3a, 3b 각각에서, 위의 아미노산 배열부터 순서대로, 배열 번호 4 및 49 내지 60을 나타낸다.

한편, β 서브유닛의 기능에 대해서는 구조의 안정성에 관여하고 있는 것으로 여겨지고 있다. 각종 미생물 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산(1 문자 표기) 배열의 얼라인먼트를, 도 2a 및 도 2b에 나타냈다. 또한, 도 2a, 2b 각각에서, 위의 아미노산 배열부터 순서대로, 배열 번호 2 및 35 내지 48을 나타낸다.

(b) 개량형 니트릴 히드라타제

본 발명은 야생형 니트릴 히드라타제에 아미노산 치환을 실시한 개량형(변이형) 니트릴 히드라타제이다. 치환을 실시하는 대상이 되는 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열은 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등의 NCBI의 데이터베이스에 공표되어 있다.

예를 들어, 로도코커스·로도크로우스 J1(FERM BP-1478) 유래의 α 서브유닛은, 아미노산 배열이 배열 번호 4로 나타나고, 염기 배열이 배열 번호 3으로 나타난다. 또한, β 서브유닛은 아미노산 배열이 배열 번호 2로 나타나고, 염기 배열이 배열 번호 1로 나타나고, 액세션 번호는 "P21220"이다. 또한, 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814) 유래의 α 서브유닛의 액세션 번호는 "ATT79340"이며, β 서브유닛의 액세션 번호는 "AAT79339"이다. 또한, 슈도노카르디아·서모필라(Pseudonocardia thermophila) JCM3095 유래의 α 서브유닛의 액세션 번호는 "1IRE A"이며, β 서브유닛의 액세션 번호는 "1IRE B"이다.

또한, 특정한 아미노산 잔기가 치환된 아미노산 배열에서, 1개 또는 수개(예를 들어 1개 내지 10개 정도, 바람직하게는 1개 내지 5개 정도)의 아미노산 잔기(단, 상기 치환 후의 아미노산 잔기를 제외함)가 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지며, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 개량형 니트릴 히드라타제도 본 발명의 범위이다.

본 발명에서의 "개량형 니트릴 히드라타제"로는, 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에서 하기 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 또한, 하기 (f) 내지 (q)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질을 들 수 있다. 또한, 하기 (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n), (o), (p) 및 (q)의 아미노산 잔기는, 각각, 각종 야생형 니트릴 히드라타제 중에서도 로도코커스·로도크로우스종에 속하는 세균 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열 중의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.

(a) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 167 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(b) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 219 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(c) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 57 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(d) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 114 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(e) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 107 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(f) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 218 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(g) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 190 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(h) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 168 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(i) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 144 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(j) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 133 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(k) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 112 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(l) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 105 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(m) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 95 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(n) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 17 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(o) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 15 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(p) α 서브유닛의 아미노산 배열에서 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T)LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 67 잔기 하류의 아미노산 잔기.

(q) α 서브유닛의 아미노산 배열에서 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T)LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 17 잔기 하류의 아미노산 잔기.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제로는, 상기 단백질 중에서도, 치환되는 아미노산 잔기가 이하에 열거하는 아미노산 잔기인 것을 바람직하게 들 수 있다.

(1) 상기 (a) 내지 (e) 및 (n)의 아미노산 잔기.

(2) 상기 (a) 내지 (e) 및 (n)의 아미노산 잔기, 및 상기 (g) 내지 (j), (l), (m), (o) 및 (q)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기.

(3) 상기 (a) 내지 (e), (n), (i) 및 (p)의 아미노산 잔기.

(4) 상기 (a) 내지 (e), (n), (p) 및 (f)의 아미노산 잔기.

(5) 상기 (a) 내지 (e), (n), (i), (p)의 아미노산 잔기, 및 상기 (f), (k) 및 (m)으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 일례로는, J1균 유래의 야생형 니트릴 히드라타제의 β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제167번째의 아미노산 잔기(아스파라긴), β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제219번째의 아미노산(발린), β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제57번째의 아미노산(세린), β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제114번째의 아미노산(리신), β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제107번째의 아미노산(트레오닌) 및 β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단측에서 제17번째의 아미노산(프롤린)을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 효소 단백질을 바람직하게 들 수 있다. 이러한 아미노산 치환된 양태의 표기 예로는, "Nβ167S, Vβ219A, Sβ57R, Kβ114Y, Tβ107K, Pβ17D" 등을 들 수 있다.

또한, 아미노산의 알파벳 표기는 통상의 1 문자로 나타낼 수 있고, 치환 부위까지의 아미노산 잔기 수를 나타내는 숫자(예를 들어 "26")의 좌측에 표시한 알파벳은, 치환 전의 아미노산의 1 문자 표기를 나타내고, 우측에 표시한 알파벳은 치환 후의 아미노산의 1 문자 표기를 나타내고 있다.

구체적으로는, 배열 번호 2에 나타내는 β 서브유닛의 아미노산 배열에 대해서, "Nβ167S"라고 표기한 경우에는, β 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 2) 중 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 (당해 N 말단의 아미노산 잔기를 포함해서 세서) 167번째의 아스파라긴(N)이 세린(S)으로 치환된 개량형 니트릴 히드라타제에서의 아미노산 치환된 양태를 의미한다.

여기서, "α↓"라는 표기는, 치환 위치가 CTLCSC 영역의 가장 하류측의 C 잔기보다 하류에 있는(당해 C 잔기를 포함하지 않고 세서 C 말단측에 있음) 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제로는, 상기 단백질 중에서도 치환되는 아미노산 잔기가 표 1에 열거하는 아미노산 잔기인 것을 보다 바람직하게 들 수 있다.

<표 1>

이들 중에서도, 상기의 치환 번호 13 내지 29의 양태로 아미노산 치환이 실시된 개량형 니트릴 히드라타제가 더욱 바람직하고, 상기의 치환 번호 26 내지 29의 양태로 아미노산 치환이 실시된 개량형 니트릴 히드라타제가 특히 바람직하다.

상기 아미노산 치환을 발생시키기 위한 염기 치환으로는, 이하의 표 2의 양태를 바람직하게 들 수 있다.

<표 2>

또한, 본 발명의 아미노산 치환된 장소는, 배열 번호 2의 J1균 유래의 니트릴 히드라타제 β 서브유닛과의 얼라인먼트에서, 167번째, 219번째, 57번째, 114번째, 107번째, 218번째, 190번째, 168번째, 144번째, 133번째, 112번째, 105번째, 95번째, 17번째 및 15번째의 아미노산 잔기에 상당하는 장소도 포함된다. 일례로서, 슈도노카르디아·서모필라에서 상당하는 아미노산 배열로는 각각, 164번째, 216번째, 57번째, 114번째, 107번째, 215번째, 187번째, 165번째, 141번째, 129번째, 108번째, 102번째, 92번째, 17번째 및 15번째에 상당한다. 또한, 본 발명의 아미노산 치환된 장소는, 배열 번호 4의 J1균 니트릴 히드라타제 α 서브유닛과의 얼라인먼트에서 124번째 및 174번째에 상당하는 장소도 포함되고, 슈도노카르디아·서모필라에서는, 각각 130번째와 180번째에 상당한다.

아미노산 배제(配劑)의 얼라인먼트 수단으로서, 거기에 사용하는 수단은 특별히 한정되지 않지만, GENETXY(일본 제네틱스사), DNASIS(히타치 소프트사)나 무료 소프트인 CLUSTALW나 BLAST 등의 유전자 배열 해석 소프트를 들 수 있다. 얼라인먼트의 일례인 도 2a, 도 2b, 도 3a, 도 3b는, GENETXY Ver.7(일본 제네틱스사, 디폴트 설정)을 사용한 결과이다.

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제의 활성은, 천연 유래의 특성을 유지한 채의 야생형 니트릴 히드라타제의 활성에 대하여 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 향상되어 있다.

여기서, "니트릴 히드라타제 활성"이란, 니트릴 화합물을, 대응하는 아미드 화합물로 변환하는 수화 반응(RCN+H₂O→RCONH₂)을 촉매하는 효소이다. 활성 측정은, 기질인 니트릴 화합물을 니트릴 히드라타제와 접촉시켜, 대응하는 아미드 화합물로 변환한 후, 당해 아미드 화합물을 정량함으로써 산출할 수 있다. 기질로는, 니트릴 히드라타제가 반응하면 어떠한 니트릴 화합물이라도 사용할 수 있지만, 아크릴로니트릴이 바람직하다.

반응 조건으로는, 기질 농도는 2.5%, 반응 온도는 10℃ 내지 30℃, 반응 시간은 10분 내지 30분의 범위에서 행한다. 효소 반응은 인산을 첨가하여 정지시킨다. 그 후, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)에 의해, 생성된 아크릴아미드를 분석함으로써 아미드 화합물의 정량을 행할 수 있다.

또한, 니트릴 히드라타제 활성의 유무는 활성 염색법에 의해 간편하게 조사할 수 있다. 예를 들어, 기질에 안트라닐로니트릴(anthranilonitrile)을 사용하면, 니트릴 히드라타제에 의해 변환된 안트라닐아미드(anthranilamide)는 형광을 가지므로 고감도로 간편하게 검출할 수 있다(Antonie Van Leeuwenhoek 80(2): 169-183, 2001 참조).

"내열성의 향상"이란, 가열 처리한 개량주의 잔존 활성이, 동일한 처리를 행한 비교예의 잔존 활성보다 10% 이상 높은 것을 의미한다. 가열 처리 방법으로는, 배양액, 또는 집균·세정한 배양 균체를 용기에 넣은 후, 당해 용기를 워터 배스나 인큐베이터 등의 가열 장치에 넣어 일정 시간 보온하면 된다. 이때, 효소의 안정성을 높이기 위해서, 니트릴 화합물이나 아미드 화합물을 첨가하여 가열 처리를 실시할 수도 있다. 가열 처리의 조건으로는 처리 온도와 처리 시간을 적절히 검토하여, 비교주의 활성이 가열 처리 전에 대하여 50% 이하로 저하되는 조건을 설정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 50℃ 내지 70℃의 범위에서, 5분 내지 60분 가열 처리를 행한다. 잔존 활성이란, 가열 처리한 균체를 사용하여 활성 측정한 아미드 화합물의 생성량과, 동일량의 무처리 균체를 사용하여 활성 측정한 아미드 화합물의 생성량의 비를 나타낸다. 무처리 균체는, 배양액, 또는 집균·세정한 배양 균체를 4℃에서 보냉해 둔 것을 사용한다. 여기서, 본 발명에서의 비교예로는, pER855A가 도입된 형질 전환체를 의미하고, 잔존 활성이 비교주보다 10% 이상 높은 니트릴 히드라타제를 내열성이 향상되었다고 평가할 수 있다.

"아미드 화합물 내성"이란, 아미드 화합물 존재하에서도 니트릴 히드라타제 활성을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 개량형 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 배양물 또는 당해 형질 전환체로부터 단리한 개량형 니트릴 히드라타제를, 아크릴아미드 등의 아미드 화합물(예를 들어, 30 내지 50%의 고농도)의 존재하에서, 기질인 아크릴로니트릴 등의 니트릴 화합물의 소비량 또는 소비 속도를 분석한다. 비교예에 대하여 소비량 또는 소비 속도가 1.01배를 초과한 니트릴 히드라타제를 아미드 화합물 내성이라고 평가할 수 있다.

"고온 축적성"이란, 20℃보다 높은 반응 온도에서, 35%를 초과하는 고농도의 아크릴아미드를 생산할 수 있는 것을 의미한다. 개량형 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 배양물 또는 당해 형질 전환체로부터 단리한 개량형 니트릴 히드라타제를, 아크릴로니트릴을 첨가하면서 효소 반응을 계속하여, 생성된 아크릴아미드 농도를 분석한다. 아크릴로니트릴의 첨가 방법은, 반응 용액 내의 아크릴로니트릴 농도를 제어하면서 첨가해도 되고, 순서대로 첨가하면서 반응시켜도 된다. 본 발명에서의 고온이란 20℃ 이상의 반응 온도를 나타낸다. 생성된 아크릴아미드 농도가 비교예를 초과한 니트릴 히드라타제는, 고온 축적성이 향상되었다고 평가할 수 있다.

아미드 화합물로는, 예를 들어 하기 화학식 (1):

R-CONH₂ (1)

(여기서, R은, 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 내지 10의 직쇄상 또는 분지상의 알킬기 또는 알케닐기, 치환되어 있어도 되는 탄소수 3 내지 18의 시클로알킬기 또는 아릴기, 또는, 치환되어 있어도 되는 포화 또는 불포화 복소환기임)

로 표현되는 아미드 화합물을 들 수 있다. 특히, 식 중, R이 "CH₂=CH-"인 아크릴아미드가 바람직하다.

상기의 개량형 니트릴 히드라타제는, 야생형 니트릴 히드라타제를 아미노산 치환함으로써 얻어지는 것이며, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 J1주 유래의 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열(배열 번호 2 및/또는 4)을 개변하여, 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성이 향상된 니트릴 히드라타제를 선택함으로써 얻어진다.

또한, 로도코커스·로도크로우스 J1주는, FERM BP-1478로서 독립 행정법인 산업 기술 종합연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1987년 9월 18일자로 국제 기탁되어 있다.

J1균 이외의 니트릴 히드라타제에서도 아미노산 호몰로지가 높은 효소는 상술한 변이에 의해 내열성 및/또는 아미드 화합물 내성이 향상되는 것으로 생각된다.

그와 같은 균으로는, 바실러스 스미티이(Bacillus smithii)(일본 특허 공개 평 09-248188호), 슈도노카르디아·서모필라(일본 특허 공개 평 09-275978호), 지오바실러스·서모글루코시데시어스(특허 번호) 등을 들 수 있고, 아미노산 호몰로지가 90%를 초과하는(고호몰로지 효소를 나열) 로도코커스·로도크로우스 M8(SU1731814), 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D)이 더욱 바람직하다. 또한, 로도코커스·로도크로우스 M33(VKM Ac-1515D)은 상기 M8균(SU1731814)으로부터 자연 돌연변이에 의해 구성적으로 니트릴 히드라타제를 발현하는 주로서 선발된 균주이다. 그 니트릴 히드라타제 자체의 아미노산 배열 및 유전자 배열에 변이는 없다(미국 특허 제5,827,699호).

야생형 니트릴 히드라타제를 아미노산 치환하는 방법으로는, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 미생물에 하이드록실아민이나 아질산 등의 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법, 자외선 조사에 의해 변이를 유발하는 방법, 니트릴 히드라타제를 코드하는 유전자에 PCR을 사용하여 랜덤으로 변이를 도입하는 Error prone PCR이나 Site-directed Mutagenesis 등의 방법을 채용할 수 있다.

(b-1) 랜덤 변이 도입법

변이체를 사용한 단백질의 기능, 성질을 연구하는 방법의 하나로, 랜덤 변이 도입법이 있다. 랜덤 변이 도입법이란, 특정한 단백질을 코드하는 유전자에 대하여 랜덤한 변이를 도입하여, 변이체를 제작하는 방법이다. PCR에 의한 랜덤 변이 도입법에서는, DNA 증폭시에 엄밀도(엄격함)가 낮은 조건을 설정하여, 염기의 변이를 도입할(Error prone PCR) 수 있다.

이 Error prone PCR에서는, 증폭되는 DNA의 전역에 대하여 임의의 부위에 변이가 도입된다. 그러면, 얻어진 임의의 부위에 변이가 도입된 변이체의 기능을 검토함으로써, 단백질 고유의 기능에 중요한 아미노산이나 도메인의 정보를 얻을 수 있다.

Error prone PCR의 주형이 되는 니트릴 히드라타제는, 야생주 유래의 니트릴 히드라타제 유전자, Error prone PCR에 의한 증폭 산물인 DNA를 사용할 수 있다.

Error prone PCR의 반응 조건으로는, 예를 들어 반응액 중의 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 또는 dTTP) 중 어느 1종, 2종 또는 3종의 배합 비율을 다른 dNTP에 비해 저감시킨 조성으로 하는 조건을 들 수 있다. 이에 의해, DNA 합성시, 배합 비율을 저감시킨 dNTP가 필요한 부위에서는, 잘못해서 다른 dNTP가 사용될 가능성이 높아져, 변이가 도입된다. 또한, 다른 반응 조건으로는, 반응액 내의 MgCl₂ 및/또는 MnCl₂ 양을 증가시킨 조성으로 하는 조건도 바람직하게 들 수 있다.

(b-2) 로도코커스·로도크로우스 J1주 유래 개량형 니트릴 히드라타제 및 그 유전자

본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제에는, 표 1에 나타내는 변이를 도입한 단백질을 코드한 유전자가 포함된다.

이러한 개량형 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA는, 야생형 니트릴 히드라타제 유전자를 기초로, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987-1997)] 등에 기재된 부위 특이적 변위 유발법에 따라서 제조할 수 있다. DNA에 변이를 도입하기 위해서는, Kunkel법이나 Gapped duplex법 등의 공지 방법에 의해, 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예를 들어 QuickChangeTM XL Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라테이진사 제조), GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등: 타카라바이오사 제조) 등을 사용하여 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자로는, 당해 유전자의 염기 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA도 포함된다.

이러한 개량형 니트릴 히드라타제 유전자는, 상기와 같이 야성형 유전자에 변이를 도입함으로써 얻을 수 있지만, 당해 유전자 배열 또는 그 상보 배열, 또는 이것들의 단편을 프로브로 해서, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리로부터 얻을 수도 있다. 라이브러리는, 공지된 방법으로 제작된 것을 이용하는 것이 가능하며, 시판되는 cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리를 이용하는 것도 가능하다.

"엄격한 조건"이란, 하이브리다이제이션 후의 세정시의 조건으로 염 농도가 300 내지 2000mM, 온도가 40 내지 75℃, 바람직하게는 염 농도가 600 내지 900mM, 온도가 65℃인 조건을 의미한다. 예를 들어, 2×SSC에서 50℃ 등의 조건을 들 수 있다. 당업자라면 이러한 버퍼의 염 농도, 온도 등의 조건 외에, 기타의 프로브 농도, 프로브의 길이, 반응 시간 등의 여러 조건을 가미하여, 본 발명의 니트릴 히드라타제를 코드하는 DNA를 얻기 위한 조건을 적절히 설정할 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 수순에 대해서는, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))] 등을 참조할 수 있다. 하이브리다이즈하는 DNA로는, 본 발명의 유전자 DNA에 대하여 적어도 40% 이상, 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 염기 배열을 포함하는 DNA 또는 그 부분 단편을 들 수 있다.

야성형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열 중 특정한 아미노산 잔기를 치환하는 아미노산(치환 후의 아미노산)의 종류는, 모두 치환 후의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드(단백질)가 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 범위에서 적절히 선택할 수 있으며, 한정되지는 않는다.

(c) 재조합 벡터, 형질 전환체

니트릴 히드라타제 유전자는, 형질 전환되는 숙주 생물에서 발현 가능하도록 벡터에 내장할 필요가 있다. 예를 들어, 벡터로는 플라스미드 DNA, 박테리오파지 DNA, 레트로트랜스포존 DNA, 인공 염색체 DNA 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 숙주는, 상기 재조합 벡터가 도입된 후, 원하는 니트릴 히드라타제를 발현하는 것이 가능한 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 대장균 및 고초균 등의 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 사용할 수 있다. 대장균을 숙주로 할 경우, 발현 효율이 높은 발현 벡터, 예를 들어 trc 프로모터를 갖는 발현 벡터 pkk233-2(아머샴 바이오사이언스사 제조) 또는 pTrc99A(아머샴 바이오사이언스사 제조) 등을 사용하는 것이 바람직하다.

벡터에는, 니트릴 히드라타제 유전자 이외에, 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합 배열(SD 배열) 등을 연결할 수 있다. 또한, 선택 마커로는, 예를 들어 카나마이신 내성 유전자, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 들 수 있다.

세균을 숙주로 할 경우, 예를 들어 대장균(Escherichia coli)을 들 수 있고, 로도코커스균으로는, 예를 들어 로도코커스·로도크로우스 ATCC12674, 로도코커스·로도크로우스 ATCC17895, 로도코커스·로도크로우스 ATCC19140 등을 들 수 있다. 이들 ATCC주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수할 수 있다.

니트릴 히드라타제를 발현하는 형질 전환체의 제작시에, 숙주에 대장균을 사용한 경우, 발현한 대부분의 니트릴 히드라타제가 인클루전 바디가 되어 불용화하기 때문에, 균체 활성이 낮은 형질 전환체가 얻어진다. 한편, 로도코커스균을 숙주로서 사용한 경우, 니트릴 히드라타제는 가용성 획분에 존재하기 때문에, 고활성의 형질 전환체가 얻어진다. 이들 형질 전환체는 목적에 따라서 선택하면 되는데, 엄격한 조건에서 개량형 효소를 선발하는 경우에는 고활성의 로도코커스균의 형질 전환체를 사용하는 것이 바람직하다.

세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 세균에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 경우에는, 예를 들어 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로미세스·폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피히아·파스토리스(Pichia pastoris) 등이 사용된다. 효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산 리튬법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 원숭이 세포 COS-7, Vero, CHO 세포, 마우스 L 세포, 래트 GH3, 인간 FL 세포 등이 사용된다. 동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 일렉트로포레이션법, 인산칼슘법, 리포펙션법 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로 하는 경우에는, Sf9 세포, Sf21 세포 등이 사용된다. 곤충 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다.

식물 세포를 숙주로 하는 경우에는, 담배 BY-2 세포 등을 들 수 있는데, 이것들에 한정되는 것은 아니다. 식물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예를 들어 아그로박테리아법, 파티클건법, PEG법, 일렉트로포레이션법 등이 사용된다.

(d) 배양물 및 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법

본 발명에서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 상기 형질 전환체를 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 채취함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은 당해 배양물로부터 개량형 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 개량형 니트릴 히드라타제의 제조 방법도 포함한다.

본 발명에서, "배양물"이란, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 모두를 의미하는 것이다. 본 발명의 형질 전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 원하는 개량형 니트릴 히드라타제는, 상기 배양물 중에 축적된다.

본 발명의 형질 전환체를 배양하는 배지는, 숙주균이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하며, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 된다. 탄소원으로는, 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 전분 등의 탄수화물, 아세트산 및 프로피온산 등의 유기산, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올류를 들 수 있다. 질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄 등의 무기산, 또는 유기산의 암모늄염, 또는 그 밖의 질소 함유 화합물을 들 수 있다.

그 외, 펩톤, 효모 엑기스, 육 엑기스, 옥수수 침지액, 각종 아미노산 등을 사용해도 된다. 무기물로는, 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 황산아연, 황산구리, 탄산칼슘 등을 들 수 있다. 또한, 필요에 따라, 배양 중의 발포를 방지하기 위하여 소포제를 첨가해도 된다. 또한, 배지에는 니트릴 히드라타제의 보결 분자인 코발트 이온이나 철 이온을 첨가하고, 효소의 유도제가 되는 니트릴류나 아미드류를 첨가해도 된다.

배양 중, 벡터 및 목적 유전자의 탈락을 방지하기 위하여 선택압을 건 상태에서 배양해도 된다. 즉, 선택 마커가 약제 내성 유전자일 경우에 상당하는 약제를 배지에 첨가하거나, 선택 마커가 영양 요구성 상보 유전자일 경우에 상당하는 영양 인자를 배지로부터 제거해도 된다.

또한, 선택 마커가 자화성 부여 유전자인 경우에는, 상당하는 자화 인자를 필요에 따라서 유일 인자로서 첨가할 수 있다. 예를 들어, 암피실린 내성 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환한 대장균을 배양할 경우, 배양 중, 필요에 따라 암피실린을 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양하는 경우에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예를 들어, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도 가능한 프로모터를 갖는 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IPTG 등을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 인돌 아세트산(IAA)으로 유도 가능한 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질 전환한 형질 전환체를 배양할 때에는, IAA 등을 배지에 첨가할 수 있다.

형질 전환체의 배양 조건은, 원하는 개량형 니트릴 히드라타제의 생산성 및 숙주의 생육이 방해되지 않는 조건이면 특별히 한정되는 것이 아니지만, 통상, 10℃ 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 37℃에서 5 내지 100시간 행한다. pH의 제조는, 무기 또는 유기산, 알칼리 용액 등을 사용해서 행하고, 예를 들어 대장균이면 6 내지 9로 제조한다.

배양 방법으로는, 고체 배양, 정치 배양, 진탕 배양, 통기 교반 배양 등을 들 수 있는데, 특히 대장균 형질 전환체를 배양할 경우에는, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양(자 퍼멘터(jar fermenter))에 의해 호기적 조건하에서 배양하는 것이 바람직하다.

상기 배양 조건에서 배양하면, 고수율로 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제를 상기 배양물 중, 즉, 배양 상청, 배양 세포, 배양 균체, 또는 세포 또는 균체의 파쇄물 중 적어도 어느 하나에 축적할 수 있다.

배양 후, 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우에는, 균체 또는 세포를 파쇄함으로써, 원하는 개량형 니트릴 히드라타제를 채취할 수 있다. 균체 또는 세포의 파쇄 방법으로는, 프렌치 프레스 또는 호모게나이저에 의한 고압 처리, 초음파 처리, 유리 비즈 등에 의한 마쇄 처리, 리소자임, 셀룰라아제 또는 펙티나아제 등을 사용하는 효소 처리, 동결 융해 처리, 저장액 처리, 파지에 의한 용균 유도 처리 등을 이용할 수 있다.

파쇄 후, 필요에 따라 균체 또는 세포의 파쇄 잔사(세포 추출액 불용성 획분을 포함함)를 제거할 수 있다. 잔사를 제거하는 방법으로는, 예를 들어, 원심 분리나 여과 등을 들 수 있고, 필요에 따라, 응집제나 여과 조제 등을 사용하여 잔사 제거 효율을 높일 수도 있다. 잔사를 제거한 후에 얻어진 상청은, 세포 추출액 가용성 획분이며, 조 정제한 개량형 니트릴 히드라타제 용액으로 할 수 있다.

또한, 개량형 니트릴 히드라타제가 균체 내 또는 세포 내에 생산되는 경우, 균체나 세포 그 자체를 원심 분리, 막 분리 등으로 회수하여, 미파쇄인 상태로 사용하는 것도 가능하다.

개량형 니트릴 히드라타제가 균체 외 또는 세포 외에 생산되는 경우에는, 배양액을 그대로 사용하거나, 원심 분리나 여과 등에 의해 균체 또는 세포를 제거한다. 그 후, 필요에 따라 유안 침전에 의한 추출 등에 의해 상기 배양물 중에서 개량형 니트릴 히드라타제를 채취하고, 또한 필요에 따라 투석, 각종 크로마토그래피(겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등)를 사용하여 단리 정제할 수도 있다.

형질 전환체를 배양하여 얻어진 니트릴 히드라타제의 생산 수율은, 예를 들어 배양액당, 균체 습중량 또는 건조 중량당, 조 효소액 단백질당 등의 단위로, SDS-PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)나 니트릴 히드라타제 활성 측정 등에 의해 확인할 수 있는데, 특별히 한정되는 것은 아니다. SDS-PAGE는 당업자라면 공지된 방법을 사용하여 행할 수 있다. 또한, 니트릴 히드라타제 활성은, 상술한 활성 값을 적용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 생 세포를 전혀 사용하지 않고, 무세포 단백질 합성계를 채용하여 개량형 니트릴 히드라타제를 산생하는 것이 가능하다.

무세포 단백질 합성계란, 세포 추출액을 사용하여 시험관 등의 인공 용기 내에서 단백질을 합성하는 계이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 무세포 단백질 합성계에는, DNA를 주형으로 해서 RNA를 합성하는 무세포 전사계도 포함된다.

이 경우, 상기의 숙주에 대응하는 생물은, 하기의 세포 추출액이 유래하는 생물에 상당한다. 여기서, 상기 세포 추출액은, 진핵 세포 유래 또는 원핵 세포 유래의 추출액, 예를 들어 소맥 배아, 대장균 등의 추출액을 사용할 수 있다. 또한, 이들 세포 추출액은 농축된 것이나 농축되어 있지 않은 것이어도 된다.

세포 추출액은, 예를 들어 한외 여과, 투석, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전 등에 의해 얻을 수 있다. 또한 본 발명에서, 무세포 단백질 합성은, 시판하고 있는 키트를 사용하여 행할 수도 있다. 그러한 키트로는, 예를 들어 시약 키트 PROTEIOSTM(도요보), TNTTM System(프로메가), 합성 장치인 PG-MateTM(도요보), RTS(로슈·다이아그나스틱스) 등을 들 수 있다.

상기와 같이 무세포 단백질 합성에 의해 얻어지는 개량형 니트릴 히드라타제는, 상술한 바와 같이 적절히 크로마토그래피를 선택하여 정제할 수 있다.

2. 아미드 화합물의 제조 방법

상술한 바와 같이 제조된 개량형 니트릴 히드라타제는, 효소 촉매로서 물질 생산에 이용할 수 있다. 예를 들어, 니트릴 화합물에, 상기 개량형 니트릴 히드라타제를 접촉시킴으로써 아미드 화합물을 생성한다. 그리고, 접촉에 의해 생성되는 아미드 화합물을 채취한다. 이에 의해, 아미드 화합물을 제조할 수 있다.

효소 촉매로는, 상술한 바와 같이 분리 정제된 니트릴 히드라타제를 사용할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 적당한 숙주 내에서 개량형 니트릴 히드라타제 유전자가 발현하도록 유전자 도입을 행하여, 숙주를 배양한 후의 배양물, 또는 당해 배양물의 처리물을 이용할 수 있다. 처리물로는, 예를 들어 배양 후의 세포를 아크릴아미드 등의 겔로 포함한 것, 글루타르알데히드로 처리한 것, 알루미나, 실리카, 제올라이트 및 규조토 등의 무기 담체에 담지한 것 등을 들 수 있다.

여기서, "접촉"이란, 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 동일한 반응계 또는 배양계에 존재시키는 것을 의미하며, 예를 들어 분리 정제한 개량형 니트릴 히드라타제와 니트릴 화합물을 혼합하는 것, 개량형 니트릴 히드라타제 유전자를 발현하는 세포의 배양 용기에 니트릴 화합물을 첨가하는 것, 당해 세포를 니트릴 화합물의 존재하에서 배양하는 것, 당해 세포의 추출액을 니트릴 화합물과 혼합하는 것 등이 포함된다.

기질로서 사용되는 니트릴 화합물은, 효소의 기질 특이성, 효소의 기질에 대한 안정성 등을 고려하여 선택된다. 니트릴 화합물로는, 아크릴로니트릴이 바람직하다. 반응 방법 및 반응 종료 후의 아미드 화합물의 채취 방법은, 기질 및 효소 촉매의 특성에 의해 적절히 선택된다.

효소 촉매는, 그 활성이 실활되지 않는 한, 리사이클 사용하는 것이 바람직하다. 실활의 방지나 리사이클을 용이하게 하는 것을 감안하여, 효소 촉매는 처리물의 형태로 사용되는 것이 바람직하다.

실시예

이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

개량형 니트릴 히드라타제 유전자의 취득과 평가 (1)

(1) 변이 유전자 라이브러리의 구축

주형으로 한 플라스미드로는, β 서브유닛의 아미노산 배열(배열 번호 2)의 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 167 잔기 하류의 아미노산 잔기가 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 219 잔기 하류의 아미노산 잔기가 발린(V)에서 알라닌(A)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 57 잔기 하류의 아미노산 잔기가 세린(S)에서 메티오닌(M)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 114 잔기 하류의 아미노산 잔기가 리신(K)에서 티오신(Y)으로 변이하고, 또한, 상기 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 107 잔기 하류의 아미노산 잔기가 트레오닌(T)에서 리신(K)으로 변이한 플라스미드 pER855(일본 특허 공개 제2010-172295호 참조)의 개변물인 pER855A(도 1)를 사용하였다.

벡터로서 사용한 pSJ034는 로도코커스균에 있어서 니트릴 히드라타제를 발현하는 플라스미드이며, pSJ023으로부터 일본 특허 공개 평 10-337185호 공보에 나타내는 방법으로 제작하였다. 또한, pSJ023은 형질 전환체 "R. rhodochrous ATCC12674/pSJ023"이며, 수탁 번호 FERM BP-6232로서 독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(이바라기현 쯔쿠바시 동 1초메 1번지 1 중앙 제6)에 1997년 3월 4일자로 국제 기탁되어 있다.

우선, 니트릴 히드라타제 유전자로의 변이 도입을 하기의 방법으로 행하였다.

멸균수 20μl

pER855A(1ng/ml) 1μl

전방향 프라이머(Forward Primer)(10mM) 2μl

역방향 프라이머(Reverse Primer)(10mM) 2μl

PrimeSTAR MAX(2×) 25μl

50μl

(98℃ 10초, 55℃ 5초, 72℃에서 90초)×30 사이클

<프라이머> β17의 포화 변이 프라이머

β17RM-F ggatacggaccggtcNNStatcagaaggacgag (배열 번호 5)

β17RM-R ctcgtccttctgataSNNgaccggtccgtatcc (배열 번호 6)

<반응 조건>

(94℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 3분)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 11kb의 증폭 단편을 확인하고, 1μl의 DpnI(키트에 부속)를 PCR 반응액에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜, 주형 플라스미드의 제거를 행하였다. 반응 종료액을 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste(프로메가 가부시끼가이샤)로 정제하고, 정제한 PCR 반응물을 사용하여 JM109로 형질 전환하였다. 얻어진 콜로니 수천 개를 플레이트로부터 회수하여, QIAprep Spin Miniprep Kit(퀴아젠사)를 사용해서 플라스미드 DNA를 추출, 변이 유전자 라이브러리로 하였다.

(2) 로도코커스균 형질 전환체의 제작

로도코커스·로도크로우스 ATCC12674주의 대수 증식기의 세포를 원심 분리기에 의해 집균하고, 빙냉한 멸균수로 3회 세정하여, 멸균수에 현탁하였다. 상기 (1)에서 제조한 플라스미드 1μl와 균체 현탁액 10μl를 혼합하여 빙냉하고, 큐벳트에 플라스미드 DNA와 균체의 현탁액을 넣어, 유전자 도입 장치 Gene Pulser II(BIO RAD)에 의해 2.0KV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다.

전기 펄스 처리액이 들어간 큐벳트를 빙냉하에 10분간 정치하고, 37℃에서 10분간 히트 쇼크를 행하였다. 그 후, 큐벳트에 MYK 배지(0.5% 폴리펩톤, 0.3% 백토 이스트 엑기스, 0.3% 백토 몰트 엑기스, 0.2% K₂HPO₄, 0.2% KH₂PO₄) 500μl를 첨가하고, 30℃, 5시간 정치한 후, 50μg/ml 카나마이신이 들어간 MYK 한천 배지에 도포하였다. 30℃, 3일간 배양 후의 콜로니를 형질 전환체로 하였다. 마찬가지로 비교주로서 pER855A의 형질 전환체를 제작하였다.

(3) 로도코커스균 형질 전환체의 아미드 처리

스크리닝에는, 상기 (2)에서 얻어진 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 로도코커스균 형질 전환체 및 비교주인 ATCC12674/pER855A를 사용하였다. GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH7.2)를 1ml씩 넣은 96 구멍 딥웰 플레이트에 상기 균주를 각각 접종하고, 30℃에서 3일간 액체 배양하였다.

이어서, 얻어진 배양액 30μl를 96 구멍 플레이트에 나누어 부어, 원심 분리에 의해 배지를 제거하고, 마지막으로 50% 아크릴아미드 용액을 40μl 첨가하여, 균을 현탁하였다. 고농도 아크릴아미드 용액에 현탁한 형질 전환체를 인큐베이터 중에 두고, 50℃의 온도하에, 30분간의 가열 처리로 비교가 되는 비교주를 완전히 실활시켰다. 잔존 니트릴 히드라타제 활성은 하기의 방법으로 측정하였다.

우선, 아크릴아미드 처리를 한 형질 전환체를 50mM 인산 완충액(pH7.0)으로 세정하고, 이하의 방법으로 활성 측정을 행하였다. 시험관에 세정한 형질 전환체와 50mM 인산 완충액(pH7.0)을 첨가해서, 30℃에서 10분간 프리 인큐베이트하고, 등량의 5% 아크릴로니트릴 용액(pH7.0)을 첨가하여 10분간 반응시키고, 1M 인산을 1/10양 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 다음으로 정지시킨 반응액으로부터 원심 분리에 의해 형질 전환체를 제거하고, 적당한 농도로 희석하여 HPLC에 의해 분석했다(WAKOSIL 5C8(와꼬 쥰야꾸사) 250mm, 5mM 인산을 포함한 10% 아세토니트릴, 이동상의 유속 1ml/min 및 자외 흡수 검출기 파장 260nm). 또한, 비교 대조로서 아크릴아미드 처리를 행하지 않은 각각의 무처리균을 사용하여 활성 측정을 행하여, 얻어진 활성 값을 기준으로 해서, 아크릴아미드 처리 후의 잔존 활성을 구하였다.

상기의 방법으로 변이 도입한 니트릴 히드라타제 유전자를 갖는 수백 개의 형질 전환체 중에서 표 3에 나타내는 고농도 아크릴아미드에 내성을 갖는 변이 효소를 4주 선발하였다.

<표 3>

(4) 염기 배열의 확인

니트릴 히드라타제 유전자의 염기 배열의 확인을 하기 위해서, 얻어진 선발주로부터 플라스미드를 회수하였다. 로도코커스 형질 전환체를, 10ml의 MYK 배지(폴리펩톤 0.5%, 백토 이스트 엑기스 0.3%, 맥아 추출물 0.3%, 글루코오스 1%, 카나마이신 50μg/ml)에 식균하였다. 24시간 배양한 후에 최종 농도 2%가 되도록 멸균한 20% 글리신 용액을 첨가하여 24시간 더 배양하였다. 그 후, 원심 분리에 의해 균체를 회수하고, 균체를 TES(10mM Tris-HCl(pH8)-10mM NaCl-1mM EDTA) 완충액으로 세정한 후, 2ml의 50mM Tris-HCl(pH8)-12.5% 수크로오스-100mM NaCl-1mg/ml 리소자임에 현탁하여, 37℃에서 3시간 진탕하였다. 이것에 0.4ml의 10% SDS를 첨가해서 실온에서 부드럽게 1시간 진탕하고, 또한 2.1ml의 5M 아세트산 나트륨 완충액(pH5.2)을 첨가해서 얼음 중에서 1시간 정치하였다. 그 후, 4℃에서 10,000xg, 1시간 원심해서 상청을 얻었다. 이것에 5배량의 에탄올을 첨가하고, -20℃에서 30분 정치한 후, 10,000xg, 20분간 원심하였다. 침전물을 10ml의 70% 에탄올로 세정한 후, 100μl의 TE 완충액에 용해해서 DNA 용액을 얻었다.

이어서, 니트릴 히드라타제를 포함하는 배열을 PCR법으로 증폭하였다.

주형 플라스미드 1μl

10×PCR Buffer(NEB사 제조) 10μl

프라이머 NH-19(50μM) 1μl

프라이머 NH-20(50μM) 1μl

2.5mM dNTPmix 8μl

멸균수 79μl

Taq DNA 폴리메라제(NEB사 제조) 1μl

<프라이머>

NH-19 GCCTCTAGATATCGCCATTCCGTTGCCGG (배열 번호 7)

NH-20 ACCCTGCAGGCTCGGCGCACCGGATGCCCAC (배열 번호 8)

<반응 조건>

(94℃에서 30초, 65에서 30초, 72℃에서 3분)×30 사이클

PCR 종료 후, 반응액 5μl를 0.7% 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 2.5kb의 PCR 증폭 산물의 검출을 행하였다. PCR 반응액은 Exo-SAP 처리(아머샴 파마시아) 후, 사이클 시퀀싱법에 의해 배열 해석용 샘플을 제조하고, Beckman CEQ-2000XL로 해석을 행하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

<표 4>

(5) 아미드 화합물 내성의 평가

(4)에서 취득한 개량형 니트릴 히드라타제의 아미드 화합물 내성을 이하의 방법으로 실시하였다.

ATCC12674/pER855A와, 상기 (2)의 공정에서 얻어진 각 형질 전환체를 10ml의 MYK 배지(50μg/ml 카나마이신)에 각각 접종하여, 30℃에서 2일간 진탕 배양하고, 100ml의 GGPK 배지(1.5% 글루코오스, 1% 글루탐산나트륨, 0.1% 효모 엑기스, 0.05% K₂HPO₄, 0.05% KH₂PO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 1% CoCl₂, 0.1% 요소, 50μg/ml 카나마이신, pH7.2)에 1% 식균을 행하였다. 30℃에서 3일간 진탕 배양하고, 원심 분리에 의해 집균하였다.

얻어진 배양 균체의 효소 활성은 하기의 방법으로 행하였다. 균체액 0.2ml와 50mM 인산 완충액(pH7.0) 4.8ml를 혼합하고, 또한 5.0%(w/v)의 아크릴로니트릴을 포함하는 50mM 인산 완충액(pH7.0) 5ml를 혼합액에 가하여, 10℃에서 10분간 진탕하면서 반응시켰다. 계속해서, 균체를 여과 분별하고, 가스 크로마토그래피를 사용해서 생성한 아크릴아미드의 양을 정량하였다.

<분석 조건>

분석 기기: 가스 크로마토그래프 GC-14B(시마즈 세이사꾸쇼 제조)

검출기: FID(검출 200℃)

칼럼: 포라팩 PS(워터스사 제조 칼럼 충전제)를 충전한 1m 유리 칼럼

칼럼 온도: 190℃

아크릴아미드의 양으로부터 니트릴 히드라타제 활성을 환산하였다. 여기서, 니트릴 히드라타제 활성은, 1분간에 1㎛ol의 아크릴아미드를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다.

이어서, 하기 반응액 조성 및 반응 조건에서 실험을 행하였다. 또한, 반응에 사용하는 각 균체 현탁액은, 사전에 측정한 효소 활성으로부터 동일한 활성량이 되도록 100mM 인산 완충액(pH7.0)으로 적절히 희석하였다. 비교 대조로서, 비교주인 ATCC12674/pER855A를 사용하였다.

<반응액 조성>

50% 아크릴아미드 용액 94g

아크릴로니트릴 4g

1M 인산 완충액 1g

균액(동일한 효소 활성 단위(U)량)

<반응 조건>

교반하면서 5시간 반응(30℃)

반응 개시 전(0시간), 5시간 후에 각각 반응액 1ml를 샘플링하고, 0.45㎛의 필터를 사용해서 여과하여, 얻어진 여과액을 가스 크로마토그래피에 제공하였다. 잔존하는 아크릴로니트릴의 비율(%)의 분석 결과를 표 5에 나타냈다.

<표 5>

상기 결과로부터 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pER855A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 103%를 초과하였다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 고농도의 아크릴아미드 존재하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되고 있는 점에서, 아크릴아미드에 대한 내성이 향상되었다고 할 수 있다.

실시예 2

개량형 니트릴 히드라타제 유전자의 취득과 평가 (2)

(1) 니트릴 히드라타제로의 변이 도입과 선발

실시예 1에서 취득한 pFR005를 주형으로 해서, 더욱 아크릴아미드 내성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제의 취득을 시도하였다. 사용한 프라이머만을 변경하여, 실시예 1과 마찬가지의 방법(변이 도입, 로도코커스 형질 전환체의 제작, 로도코커스균 형질 전환체의 아미드 처리 방법, 염기 배열의 확인)을 실시해서, 표 6에 선발된 변이 효소를 취득하였다.

<프라이머>

β15의 포화 변이 프라이머

β15RM-F: atgaccggatacggaNNSgtcccctatcagaag (배열 9)

β15RM-R: cttctgataggggacSNNtccgtatccggtcat (배열 10)

β95의 포화 변이 프라이머

β95RM-F: accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag (배열 11)

β95RM-R: ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt (배열 12)

β105의 포화 변이 프라이머

β105RM-F: GAGATCCTTGAGGGTNNSTACACGGACAGG (배열 13)

β105RM-R: CCTGTCCGTGTASNNACCCTCAAGGATCTC (배열 14)

β133의 포화 변이 프라이머

β133RM-F: cacgagccccactccNNSgcgcttccaggagcg (배열 15)

β133RM-R: cgctcctggaagcgcSNNggagtggggctcgtg (배열 16)

β144의 포화 변이 프라이머

β144RM-F: ggagccgagtttctctNNSggtgacaagatc (배열 17)

β144RM-R: gatcttgtcaccSNNagagaaactcggctcc (배열 18)

β168의 포화 변이 프라이머

β168RM-FcgaaatatgtgcggagcNNSatcggggaaatcg (배열 19)

β168RM-RcgatttccccgatSNNgctccgcacatatttcg (배열 20)

β190의 포화 변이 프라이머

β190RM-F: gagcagctccgccggcctcNNSgacgatcctcg (배열 21)

β190RM-R: cgaggatcgtcSNNgaggccggcggagctgctc (배열 22)

α124의 포화 변이 프라이머

α124RM-F: gtacaagagcatgNNStaccggtcccgagtgg (배열 23)

α124RM-R: ccactcgggaccggtaSNNcatgctcttgtac (배열 24)

<표 6>

(2) 성능 평가

취득한 개량형 니트릴 히드라타제의 성능 평가를 실시예 1(5)와 마찬가지의 방법으로 실시하였다.

<표 7>

상기 결과로부터, 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pER855A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 117%를 초과하였다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 고농도의 아크릴아미드 존재하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되고 있는 점에서, 아크릴아미드에 대한 내성이 향상되었다고 할 수 있다.

실시예 3

개량형 니트릴 히드라타제 유전자의 취득과 평가 (3)

(1) 니트릴 히드라타제로의 변이 도입과 선발

실시예 2에서 취득한 pFR108A를 주형으로 해서, 더욱 아크릴아미드 내성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제의 취득을 시도하였다. 사용한 프라이머만을 변경하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법(변이 도입, 로도코커스 형질 전환체의 제작, 로도코커스균 형질 전환체의 아미드 처리 방법, 염기 배열의 확인)을 실시하여, 표 8에 선발된 변이 효소를 취득하였다. 또한, 개량형 니트릴 히드라타제를 갖는 형질 전환체의 선발은, 55℃의 온도하에, 60분간의 열처리를 행하고, 그 이외는 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 행하였다.

<프라이머>

α174의 포화 변이 프라이머

α174RM-F: gccggcaccgacNNStggtccgaggag (배열 25)

α174RM-R: ctcctcggaccaSNNgtcggtgccggc (배열 26)

<표 8>

(2) 성능 평가

<표 9>

상기 결과로부터, 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pER855A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 124%를 초과하였다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 고농도의 아크릴아미드 존재하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되고 있는 점에서, 아크릴아미드에 대한 내성이 향상되었다고 할 수 있다.

실시예 4

(1) 니트릴 히드라타제로의 변이 도입과 선발

실시예 2에서 취득한 pFR211을 주형으로 해서, 더욱 아크릴아미드 내성이 향상된 개량형 니트릴 히드라타제의 취득을 시도하였다. 사용한 프라이머만을 변경하고, 실시예 3과 마찬가지의 방법(변이 도입, 로도코커스 형질 전환체의 제작, 로도코커스균 형질 전환체의 아미드 처리 방법, 염기 배열의 확인)을 실시하여, 표 10에 선발된 변이 효소를 취득하였다.

<프라이머>

β95의 포화 변이 프라이머

β95RM-F: accgaagaagagcgaNNScaccgtgtgcaagag (배열 27)

β95RM-R: ctcttgcacacggtgSNNtcgctcttcttcggt (배열 28)

β112의 포화 변이 프라이머

β112RM-F: GACAGGAAGCCGNNSCGGAAGTTCGATCCG (배열 29)

β112RM-R: CGGATCGAACTTCCGSNNCGGCTTCCTGTC (배열 30)

β218의 포화 변이 프라이머

β218RM-F: gggaaagacgtagtgNNSgccgatctctgggaa (배열 31)

β218RM-R: ttcccagagatcggcSNNcactacgtctttccc (배열 32)

<표 10>

(2) 성능 평가

취득한 개량형 니트릴 히드라타제의 성능 평가를 실시예 1(5)와 마찬가지의 방법으로 실시하였다. 결과를 표 11에 나타내었다.

<표 11>

상기 결과로부터, 모든 개량형 니트릴 히드라타제는, 비교예인 pER855A보다도 아크릴로니트릴의 소비율이 125%를 초과하였다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제는, 고농도의 아크릴아미드 존재하에서도 니트릴 히드라타제 활성이 유지되고 있는 점에서, 아크릴아미드에 대한 내성이 향상되었다.

실시예 5

(1) pFR306A의 제작

실시예 4에서 취득한 pFR306을 주형으로 해서, Lβ144S를 야생형 아미노산으로 치환한 개량형 니트릴 히드라타제를 제작하였다. 방법으로는, 하기의 프라이머를 사용하고, 실시예 1과 마찬가지의 방법으로 로도코커스 형질 전환체를 제작하였다.

<프라이머>

β144의 변이를 야생형으로 복귀시킨다

F_Sβ144L-F: TTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG (배열 33)

F_Sβ144L-R: GTCACCGAGAGAGAAACTCGGCTCCGC (배열 34)

<표 12>

(2) 내열성의 평가

본 발명에서 취득한 개량형 니트릴 히드라타제의 성능 평가를 하기의 방법으로 실시하였다.

표 13에 나타내는 변이 니트릴 히드라타제 유전자를 포함하는 형질 전환체를 실시예 1(5)의 방법으로 배양하여, 내열성의 평가에 사용하였다. 얻어진 배양물을 50mM 인산 완충액으로 적절히 희석하고, 70℃의 워터 배스에서 10분간 열처리를 한 후, 잔존 니트릴 히드라타제 활성의 측정을 행하였다. 활성 측정은 실시예 1(5)에 기재된 방법에 따랐다. 비교 대조로서 열처리를 행하지 않고 4℃에서 보냉한 것을 각각의 무처리균으로 해서 잔존 활성을 구하였다.

<표 13>

비교예의 pER855A의 잔존 활성을 1(11%)로 했을 때, 개량형 니트릴 히드라타제의 잔존 활성은 모두 3배(30%)를 초과하였다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제의 내열성은 향상되었다.

실시예 6

실시예 5에서 얻은 하기의 형질 전환체를 사용하여, 고온 반응시의 아크릴아미드 축적성을 평가하였다.

뚜껑이 달린 플라스틱 튜브에 10ml의 50mM 인산 완충액과, 투입 활성량을 합쳐서 형질 전환체를 첨가하고, 40℃의 워터 배스 중에서 진탕하면서 10분간 프리 인큐베이트를 행하였다. 다음으로 아크릴로니트릴을 각 반응액에 1ml 첨가하여 반응을 개시하고, 이후는 소정의 시간(20분, 40분, 시간, 1시간 30분, 2시간)에 1ml씩 아크릴로니트릴을 차차 첨가하면서 반응을 계속하여, 반응 3시간 후의 반응액을 필터 여과하고, 여과액의 아크릴아미드 농도를 가스 크로마토그래피로 측정하였다.

실험 결과, 비교예의 pER855A는 32%의 아크릴아미드가 축적된 것에 반해, 어느 개량형 니트릴 히드라타제든 40%를 초과하는 아크릴아미드가 축적되었다. 따라서, 개량형 니트릴 히드라타제는 고온 축적성이 향상되었다.

산업상 이용가능성

본 발명에 의해, 개량형 니트릴 히드라타제가 제공된다. 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제는, 내열성, 아미드 화합물 내성 및 고온 축적성이 향상되었다. 이로 인해, 본 발명의 개량형 니트릴 히드라타제를 사용함으로써 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.

[배열표의 설명]

배열 번호 1: J1균 유래의 니트릴 히드라타제 β 서브유닛의 염기 배열

배열 번호 2: J1균 유래의 니트릴 히드라타제 β 서브유닛의 아미노산 배열

배열 번호 3: J1균 유래의 니트릴 히드라타제 α 서브유닛의 염기 배열

배열 번호 4: J1균 유래의 니트릴 히드라타제 α 서브유닛의 아미노산 배열

배열 번호 5: β17의 포화 변이 프라이머

배열 번호 6: β17의 포화 변이 프라이머

배열 번호 7: NH-19 프라이머

배열 번호 8: NH-20 프라이머

배열 번호 9: β15의 포화 변이 프라이머

배열 번호 10: β15의 포화 변이 프라이머

배열 번호 11: β95의 포화 변이 프라이머

배열 번호 12: β95의 포화 변이 프라이머

배열 번호 13: β105의 포화 변이 프라이머

배열 번호 14: β105의 포화 변이 프라이머

배열 번호 15: β133의 포화 변이 프라이머

배열 번호 16: β133의 포화 변이 프라이머

배열 번호 17: β144의 포화 변이 프라이머

배열 번호 18: β144의 포화 변이 프라이머

배열 번호 19: β168의 포화 변이 프라이머

배열 번호 20: β168의 포화 변이 프라이머

배열 번호 21: β190의 포화 변이 프라이머

배열 번호 22: β190의 포화 변이 프라이머

배열 번호 23: α124의 포화 변이 프라이머

배열 번호 24: α124의 포화 변이 프라이머

배열 번호 25: α174의 포화 변이 프라이머

배열 번호 26: α174의 포화 변이 프라이머

배열 번호 27: β95의 포화 변이 프라이머

배열 번호 28: β95의 포화 변이 프라이머

배열 번호 29: β112의 포화 변이 프라이머

배열 번호 30: β112의 포화 변이 프라이머

배열 번호 31: β218의 포화 변이 프라이머

배열 번호 32: β218의 포화 변이 프라이머

배열 번호 33: β144의 변이를 야생형으로 복귀시키는 프라이머

배열 번호 34: β144의 변이를 야생형으로 복귀시키는 프라이머

배열 번호 35: Rhodococcus M8의 β 서브유닛

배열 번호 36: Rhodococcus ruber TH의 β 서브유닛

배열 번호 37: R. pyridinovorans MW3의 β 서브유닛

배열 번호 38: R. pyridinovorans S85-2의 β 서브유닛

배열 번호 39: R. pyridinovorans MS-38의 β 서브유닛

배열 번호 40: Nocardia sp JBRs의 β 서브유닛

배열 번호 41: Nocardia YS-2002의 β 서브유닛

배열 번호 42: R. rhodocrous ATCC39384의 β 서브유닛

배열 번호 43: uncultured bacterium SP1의 β 서브유닛

배열 번호 44: uncultured bacterium BD2의 β 서브유닛

배열 번호 45: Comamonas testosteroni의 β 서브유닛

배열 번호 46: G. thermoglucosidasius Q6의 β 서브유닛

배열 번호 47: P. thermophila JCM3095의 β 서브유닛

배열 번호 48: R. rhodocrous Cr4의 β 서브유닛

배열 번호 49: Rhodococcus M8의 α 서브유닛

배열 번호 50: Rhodococcus ruber TH α 서브유닛

배열 번호 51: R. pyridinovorans MW3의 α 서브유닛

배열 번호 52: R. pyridinovorans S85-2의 α 서브유닛

배열 번호 53: Nocardia sp JBRs의 α 서브유닛

배열 번호 54: Nocardia YS-2002의 α 서브유닛

배열 번호 55: uncultured bacterium BD2의 α 서브유닛

배열 번호 56: uncultured bacterium SP1의 α 서브유닛

배열 번호 57: R. rhodocrou ATCC39484의 α 서브유닛

배열 번호 58: Sinorhizobium medicae WSM419의 α 서브유닛

배열 번호 59: P. thermophila JCM3095의 α 서브유닛

배열 번호 60: R. rhodocrous Cr4의 α 서브유닛

배열 번호 61: 로도코커스속 N-771주 유래의 철형 니트릴 히드라타제 α 서브유닛의 시스테인 클러스터

배열 번호 62: J1균 유래의 코발트형 니트릴 히드라타제 α 서브유닛의 시스테인 클러스터

SEQUENCE LISTING <110> Dia-Nitrix Co., Ltd. <120> improved nitrilehydratase <130> PMR-9006WO <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Rhodococcus J1-H <400> 1 atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60 gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcaattct gacttggatg 120 catctcaagg gcatatcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180 gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240 cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaagag 300 atccttgagg gtcggtacac ggacaggaag ccgtcgcgga agttcgatcc ggcccagatc 360 gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cgcttccagg agcggagccg 420 agtttctctc tcggtgacaa gatcaaagtg aagagtatga acccgctggg acacacacgg 480 tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtcg cctaccacgg ctgccagatc 540 tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcctc gcccgctcta cacggtcgcg 600 ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660 ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga 690 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus J1-H <400> 2 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 3 <211> 612 <212> DNA <213> Rhodococcus J1-H <400> 3 gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc gatcgaaacc 60 ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt ttcgtactac 120 gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg ccaagtcctg ggtggaccct 180 gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt gggctatgcc 240 ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca tcacgtggtg 300 gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc cgcctggtac 360 aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct caagcgcgat 420 ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag ctccgaaatc 480 cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga ggaggagctg 540 acgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac accgcaggaa 600 gtgatcgtat ga 612 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus J1-H <400> 4 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 ggatacggac cggtcnnsta tcagaaggac gag 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 6 ctcgtccttc tgatasnnga ccggtccgta tcc 33 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gcctctagat atcgccattc cgttgccgg 29 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 accctgcagg ctcggcgcac cggatgccca c 31 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 atgaccggat acggannsgt cccctatcag aag 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 cttctgatag gggacsnntc cgtatccggt cat 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 accgaagaag agcgannsca ccgtgtgcaa gag 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 12 ctcttgcaca cggtgsnntc gctcttcttc ggt 33 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 gagatccttg agggtnnsta cacggacagg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 cctgtccgtg tasnnaccct caaggatctc 30 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 cacgagcccc actccnnsgc gcttccagga gcg 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 16 cgctcctgga agcgcsnngg agtggggctc gtg 33 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 ggagccgagt ttctctnnsg gtgacaagat c 31 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 gatcttgtca ccsnnagaga aactcggctc c 31 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 cgaaatatgt gcggagcnns atcggggaaa tcg 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, c, g, or t <400> 20 cgatttcccc gatsnngctc cgcacatatt tcg 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 21 gagcagctcc gccggcctcn nsgacgatcc tcg 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 22 cgaggatcgt csnngaggcc ggcggagctg ctc 33 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 gtacaagagc atgnnstacc ggtcccgagt gg 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(19) <223> n is a, c, g, or t <400> 24 ccactcggga ccggtasnnc atgctcttgt ac 32 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 gccggcaccg acnnstggtc cgaggag 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 ctcctcggac casnngtcgg tgccggc 27 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 accgaagaag agcgannsca ccgtgtgcaa gag 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 28 ctcttgcaca cggtgsnntc gctcttcttc ggt 33 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 gacaggaagc cgnnscggaa gttcgatccg 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 30 cggatcgaac ttccgsnncg gcttcctgtc 30 <210> 31 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> n is a, c, g, or t <400> 31 gggaaagacg tagtgnnsgc gatctctggg aa 32 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 32 ttcccagaga tcggcsnnca ctacgtcttt ccc 33 <210> 33 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 ttctctctcg gtgacaagat caaagtg 27 <210> 34 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 gtcaccgaga gagaaactcg gctccgc 27 <210> 35 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus M8 <400> 35 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 36 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus ruber TH <400> 36 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Ala Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 37 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinovorans MW3 <400> 37 Met Asp Gly Ile His Gly Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Glu His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Tyr His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 38 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus pyridinovorans S85-2 <400> 38 Met Asp Gly Ile His Gly Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp 35 40 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Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 55 <211> 203 <212> PRT <213> Bacterium BD2 <400> 55 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 56 <211> 180 <212> PRT <213> Bacterium SP1 <400> 56 Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Val Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr 85 90 95 Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu 100 105 110 Tyr Arg Ser Arg Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Phe Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser 130 135 140 Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr 145 150 155 160 Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser 165 170 175 Ile Ile Gly Val 180 <210> 57 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous ATCC39484 <400> 57 Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys 1 5 10 15 Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala 20 25 30 Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly 35 40 45 Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala 65 70 75 80 Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr 85 90 95 His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val 100 105 110 Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg 115 120 125 Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp 130 135 140 Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile 145 150 155 160 Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser 165 170 175 Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val 180 185 190 Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 58 <211> 213 <212> PRT <213> Sinorhizobium medicae WSM419 <400> 58 Met Ser Glu His Arg His Gly Pro Gly Glu Glu His Gly His His His 1 5 10 15 Asp Asn His Leu Thr Asp Met Glu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Thr 20 25 30 Val Leu Thr Glu Lys Gly Leu Ile Asp Pro Ala Ala Ile Asp Ala Ile 35 40 45 Val Asp Thr Tyr Glu Thr Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Arg Val 50 55 60 Val Ala Lys Ala Trp Ser Asp Pro Asp Phe Ala Asp Trp Leu Arg Arg 65 70 75 80 Asp Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Thr Gly Arg Gln Gly 85 90 95 Glu His Met Arg Ala Val Phe Asn Thr Ser Glu Thr His Asn Leu Ile 100 105 110 Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Ala Val Leu Gly Leu Pro 115 120 125 Pro Val Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Ala Val Ile Asp 130 135 140 Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Leu Pro Ala Glu Lys 145 150 155 160 Lys Ile Arg Val Trp Asp Ser Thr Ala Glu Leu Arg Tyr Leu Val Val 165 170 175 Pro Glu Arg Pro Ala Ala Thr Asp Asp Leu Gly Glu Asp Ala Leu Ala 180 185 190 Lys Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Ala Leu Ser 195 200 205 Pro Glu Ala Phe Arg 210 <210> 59 <211> 205 <212> PRT <213> Pseudonocardia thermophila JCM3095 <400> 59 Met Thr Glu Asn Ile Leu Arg Lys Ser Asp Glu Glu Ile Gln Lys Glu 1 5 10 15 Ile Thr Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Met Leu Ile Glu Gln Gly 20 25 30 Ile Leu Thr Thr Ser Met Ile Asp Arg Met Ala Glu Ile Tyr Glu Asn 35 40 45 Glu Val Gly Pro His Leu Gly Ala Lys Val Val Val Lys Ala Trp Thr 50 55 60 Asp Pro Glu Phe Lys Lys Arg Leu Leu Ala Asp Gly Thr Glu Ala Cys 65 70 75 80 Lys Glu Leu Gly Ile Gly Gly Leu Gln Gly Glu Asp Met Met Trp Val 85 90 95 Glu Asn Thr Asp Glu Val His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser 100 105 110 Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Phe Lys Glu 115 120 125 Pro Gln Tyr Arg Ser Arg Val Val Arg Glu Pro Arg Gln Leu Leu Lys 130 135 140 Glu Glu Phe Gly Phe Glu Val Pro Pro Ser Lys Glu Ile Lys Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ser Glu Met Arg Phe Val Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Ala Thr Leu Val Thr Arg 180 185 190 Glu Ser Met Ile Gly Val Glu Pro Ala Lys Ala Val Ala 195 200 205 <210> 60 <211> 207 <212> PRT <213> Rhodococcus rhodochrous Cr4 <400> 60 Met Thr Ala His Asn Pro Val Gln Gly Thr Phe Pro Arg Ser Asn Glu 1 5 10 15 Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys 20 25 30 Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp Tyr Met Ser Ser Val Tyr Glu 35 40 45 Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala Lys Ile Ala Ala His Ala Trp 50 55 60 Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu Leu Ala Asp Ala Thr Gly Ala 65 70 75 80 Cys Lys Glu Met Gly Val Gly Gly Met Gln Gly Glu Glu Met Val Val 85 90 95 Leu Glu Asn Thr Asp Thr Val Asn Asn Met Val Val Cys Thr Leu Cys 100 105 110 Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys 115 120 125 Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Ala Arg Asp Pro Arg Gly Val Met 130 135 140 Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Ala Ser Asp Val Glu Ile Arg Val Trp 145 150 155 160 Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala 165 170 175 Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln Leu Ala Ala Leu Val Thr Arg 180 185 190 Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Pro Thr Ala Pro Asn Lys Ala 195 200 205 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus <400> 61 Cys Ser Leu Cys Ser Cys 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Rhodococcus J1-H <400> 62 Cys Thr Leu Cys Ser Cys 1 5

Claims

이하의 (A) 또는 (B)의 단백질;
(A) 야생형 니트릴 히드라타제의 아미노산 배열에서, 하기 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되고, 또한, 하기 (f) 내지 (q)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1개의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질,
(a) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 167 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(b) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 219 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(c) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 57 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(d) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 114 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(e) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 107 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(f) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 218 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(g) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 190 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(h) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 168 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(i) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 144 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(j) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 133 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(k) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 112 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(l) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 105 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(m) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 95 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(n) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 17 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(o) β 서브유닛의 아미노산 배열에서 N 말단의 아미노산 잔기부터 세서 15 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(p) α 서브유닛의 아미노산 배열에서, 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T) LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 67 잔기 하류의 아미노산 잔기,
(q) α 서브유닛의 아미노산 배열에서, 보결 분자 결합 영역을 구성하는 아미노산 배열 C(S/T) LCSC의 가장 하류측의 C 잔기보다 17 잔기 하류의 아미노산 잔기.
(B) (A)의 단백질의 아미노산 배열에서, 상기 치환 후의 아미노산 잔기를 제외하고, 1 또는 수개의 아미노산 잔기가 결실, 치환 및/또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
제1항의 단백질을 코드하는 DNA.
제2항의 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한, 니트릴 히드라타제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.
제2항 또는 제3항의 유전자 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터를 포함하는 형질 전환체.
제5항의 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 채취되는 니트릴 히드라타제.
제5항의 형질 전환체를 배양하고, 얻어지는 배양물로부터 니트릴 히드라타제를 채취하는 것을 특징으로 하는, 니트릴 히드라타제의 제조 방법.
제1항의 단백질 또는 제5항의 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물 또는 당해 배양물의 처리물을 니트릴 화합물에 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 아미드 화합물의 제조 방법.