SU1731814A1 - Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы - Google Patents
Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы Download PDFInfo
- Publication number
- SU1731814A1 SU1731814A1 SU4826513A SU4826513A SU1731814A1 SU 1731814 A1 SU1731814 A1 SU 1731814A1 SU 4826513 A SU4826513 A SU 4826513A SU 4826513 A SU4826513 A SU 4826513A SU 1731814 A1 SU1731814 A1 SU 1731814A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- strain
- nitrile hydratase
- rhodococcus rhodochrous
- activity
- rhodochrous
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Использование: биотехнологи . Сущность изобретени : получение нового штамма бактерий - продуцента фермента нит- рилгидратазы, выделенного из почвы производства акрилонитрила, с использованием в качестве селектирующего агента изобутиронитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 обладает следующими признаками: грампо- зитивный, неподвижный, спор не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные слабоветв щиес нити, которые через 48-72 ч распадаютс на палочковидные и кокковид- ные элементы. Штамм Rhodococcus rhodochrous 926 обладает высокой активностью нитрилгидратазы, достигающей 140 ммоль мг/мин в отношении изобутиронитрила , 220 ммоль/мг/мин в отношении аце- тонитрила, 150 ммоль/мг/мин в отношении акрилонитрила. Штамм Rhodococcus rhodochrous ВКПМЗ-926 может быть использован в биотехнологическом процессе получени акриламида и других амидов кар- боновых кислот. 3 табл.
Description
Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс получени нового штамма, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью .
Нитрилгидратаза - фермент, катализирующий процесс гидролиза нитрилов кар- боновых кислот в амиды.
Известны микроорганизмы, продуцирующие фермент нитрилгидратазу, относ щиес к родам Corynebacterium, Nocardia, Brevibacterium, Bacillus, Bacteridium,
Micrococcus, Pseudumonas Rhodococcus.
Одним из примеров использовани этого фермента вл етс получение акриламида из акрилонитрила.,
Известны штаммы, способные к трансформации акрилонитрила в акриламид: Corynebacterium N 771, Corynebacterium N 774, Nocardia N 775, Pseudomonas chlororophis B23, Rhodococcus rhodochrous 1-1.
Недостатком данных штаммов вл етс низка ферментативна активность нитрилгидратазы. В случае штамма Corynebacterium N 774 удельна активность нитрилгидратазы не превышала 38,5 ед.
Х|
iCJ
5
4
Известен штамм Pseudomonas chlororaphis B23, который при выращивании на среде, содержащей аминокислоту L-цистеин (2 г/л), про вл л ферментативную активность 105,7 ед,
Недостатком данного штамма вл етс использование в культуральной среде дорогосто щей аминокислоты.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности вл етс штамм Ат-324, мутант Pseudomonas chlororaphis В23, который обладает удельной нитрилгид- ратазной активностью 141 ед.
Недостатками данного штамма вл ютс использование в среде культивировани дорогосто щих аминокислот L-пролина и L- цистеина, дробное введение индуктора - метакриламида.
Целью изобретени вл етс получение штамма с более высокой нитрилгидратаз- ной активностью, не требующего использовани аминокислот при выращивании, культивирование на простой синтетической среде,
За вл емый штамм Rhodococcus rhodochrous M8 депонирован под номером S-226 и характеризуетс следующими мор- фолого-культуральными и физиолого-биохи- мическими признаками.
Морфологические признаки: штамм грамположительный, неподвижный, спор и капсул не образует, некислотоустойчив, аэроб. Клетки в возрасте 18-20 ч образуют длинные по 20 мкм, слабо ветв щиес нити, которые через 48-72 ч распадаютс на па- лочковидные и кокковидные элементы.
Палочковидные клетки имеют размеры 0,9-1,2 х 2,0-20,0 мкм. Деление клеток происходит как по раскалывающемус , так и по сгибающемус типу. В протоплазме клеток видны внутриклеточные включени в виде зерен (гранул рность протоплазмы).
Культуральные свойства: при росте на м сопептонном агаре штамм образует круглые гладкие колонии диаметром 1 мм (48-72 ч), поверхность суха , матова , розового цвета. При росте на м сопептонном бульоне образует пленку и осадок. Лакмусовое молоко не измен ет.
Физиологические свойства: штамм редуцирует нитраты. Тест с метиловым красным, реакци Фогес-Проскауэра отрицательные . Образует сероводород. Штамм оксида за отрицательный, каталаза- и фос- фатазаположительный. Растет при рН 6-9, оптимальное значение рН 7,0, при температуре 5-45°С, оптимальное значение температуры 30°С. В качестве источников азота использует соединени аммони и нитраты,
Штамм дает кислую реакцию при росте на глюкозе, фруктозе, сорбите, манните и глицерине. Газообразование ни на одном сахаре не обнаружено. В качестве единственного источника углерода использует инозит, маннит, мальтозу, сорбит, глюкозу, глицерин, лактат, пируват, не использует рамнозу, галактозу. Крахмал и целлюлозу не гидролизует, твин 60 и твин 80 гидролизует. Аденин не утилизирует.
Химический состав клеток: в клеточной стенке содержитс meso-диаминопимели- нова кислота, арабиноза и галактоза. Содержитс липид A (LCN), характерный дл родококков.
Чувствительность к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к канами- цину, хлорамфениколу, ампициллину, пенициллину , мономициину, тетрациклину, рифампицину.
Патогенность: штамм непатогенный. Ферментативную активность определ ли с использованием в качестве субстратов нитрилов карбоновых кислот. За единицу удельной нитрилгидратазной активности принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль амида в одну минуту, содержащегос в 1 мг сухого веса клеток.
Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 обладает более высокой активностью нитрилгидратазы (150 ед.) по сравнению со штаммом прототипом Ат-324 (141 ед.) и не требует использовани в культуральной среде дорогосто щих аминокислот. П р и м е р 1. Выделение штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926. За вл емый штамм был выделен из почвы с производства акрилонитрила. Навеску почвы 1,0 г ресуспендировали в 10 мл физиологического раствора и отстаивали в течение 1 ч. Надосадочную жидкость в количестве 2 мл вносили в среду следующего состава, г:
К2НР040,5
КН2Р040,5
MgS04 7H200,5
FeSCV7H200,01
Глюкоза1,0
Изобутиро нитрил1,0
Вода водопроводна , мл1000 рН 7,2 ±0,2 50 мл суспензии инкубировали в 300 мл колбе Эрленмейера при 28-30°С, при круговом перемешивании (число качаний 180-200 ). Через двое суток отбирали 1 мл культуральной жидкости, серийно разводили в физиологическом растворе и высевали на чашки Петри с агаризованной средой (1,5% агар-агара) вышеуказанного состава . Посевы инкубировали 48-72 ч при 28-30°С, после чего отбирали наиболее крупные колонии, которые использовали в дальнейших исследовани х. Колонии пересевали на чашки Петри с м сопептонным агаром. Выделенные культуры изучали на способность к трансформации акрилонит- рила в акриламид.
Микроорганизмы выращивали в течение двух суток на среде выделени , отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали , клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, ресуспендировали в 2 мл буфера того же состава, содержащего акрилонитрил в концентрации 1 г/л. Реакцию останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. HCI. Количественное определение акрила- мида осуществл ли методом газожидкост- ной хроматографии на хроматографе ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором . В качестве неподвижной фазы использовали Reoplex 400.
В результате была выделена культура Rhodococcus rhodochrous М8 с высокой нит- рилгидратазной активностью.
П р и м е р 2. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 дл трансформации изобутиронитрила в изобутирамид.
Полученный штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 предкультиви- ровали в колбах Эрленмейера, заполненных на 1/10 часть бульоном Хоттингера в течение суток, на качалке (число качаний 120 ) при 30°С. Культуральную жидкость в объеме 10 мл инокулировали в 1,5 л ферментер. Состав среды, г:
КаНРСМ0,5
КНаРСМ0,5
MgS04 7H200,5
CoCi2 7H200,02
Глюкоза10,0
Изобутирамид2,5
Дистиллированна вода, мл1000
рН7,2±0,2
Услови культивировани : Объем культуральной
среды, мл1000
Скорость перемешивани , об/мин600 Аэраци , мин 11:2 Температура, °С30 рН 7,2 Ферментацию вели при контролируемом значении рН. Подтитровку осуществл ли 1 н. 1 н. КОН.
0
5 0
5
0
5
0
5
0
5
Из реакционной среды периодически отбирали пробы дл определени концентрации клеток и их нитрилгидратазной активности . Концентрацию клеток определ ли фотокалориметрически при длине волны 540 нм, толщине сло 5,07 мм.
Активность нитрилгидратазы оценивали следующим образом.
1 мл культуральной жидкости центрифугировали , клетки отмывали 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6. Буферную емкость и значение рН подбирали экспериментально. Клетки ресуспендировали в буфере указанного состава до значени оптической плотности 0,2-0,5 (А 540 нм). К 2 мл клеточной взвеси в фосфатном буфере добавл ли изобу- тиронитрил в количестве 25 мкл. Реакцию проводили при 20°С в течение 10 мин, а затем останавливали добавлением 0,1 мл 1 н. HCI. Бактериальные клетки отдел ли центрифугированием . Концентрацию изобутирамида в надосадочной жидкости анализировали методом газожидкостной хроматографии.
Удельна активность нитрилгидратазы в отношении изобутиронитрила достигала 140ед.
П р и м е р 3. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 дл трансформации ацетонитрила в ацета- мид.
Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации по примеру 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавл ли ацетонитрил в количестве 25 мкл.
Активность нитрилгидратазы в отношении ацетонитрила достигала 220 ед.
П р и м е р 4. Использование штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 дл трансформации акрилонитрила в акриламид .
Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 подготавливали к процессу трансформации как в примере 2. Активность нитрилгидратазы оценивали аналогично примеру 2. В качестве субстрата добавл ли акрилонитрил в количестве 25 мкл.
Изменение ферментативной активности в зависимости от стадии роста клеток представлена в табл.1.
Активность нитрилгидратазы в отношении акрилонитрила достигала 150 ед.
П р и м е р 5. Вли ние температуры на активность нитрилгидратазы штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926.
Бактерии Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 выращивали в течение 70 ч и подготавливали к трансформации по примеру 2. Образцы с реакционной смесью, содержащие 25 мкл акрилонитрила и 0,04 мг клеток по сухому весу в 2 мл 0,025 М фосфатного буфера, рН 7,6, инкубировали в течение 5 мин при различных температурах. Концентрацию образовавшегос в реакционной смеси акриламида определ ли с помощью газожидкостной хроматографии. Изменение активности нитрилгидратазы в зависимости от температуры проведени реакции трансформации представлено в табл. 2.
Таким образом нитрилгидратаза из штамма Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 обладает более высокой термо- стабильностью, чем аналогичный фермент из Pseudomonas chlororaphis B23 (температурный оптимум 20°С) и Rhodococcus sp. N 774 (температурный оптимум 35°С).
П р и м е р 6. Индукци нитрилгидратазы при росте штамма Rhodococcus rhodochrous М8, ВКПМ S-926 на мочевине.
Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 предкультивировали в колбах Эрленмейера, содержащих бульон Хоттин- гера в течение суток на качалке при 30°С. 10 мл культуральной жидкости инокулиро- вали в колбы Эрленмейера, содержащие 200 мл синтетической среды с различным количеством мочевины. Состав синтетиче
ской среды, г:
К2НР04
NaH2P04 MgS04 7H20 CoCl2 6HiO FeS04- 7H20 Глюкоза
Дистиллированна вода, мл
Клетки растили в течение Активность нитрилгидратазы примеру 2. Изменение активгидратазы в зависимости от мочевины в среде представле
5 10
15
0
5
0
5
0
5
Результаты табл. 3 показывают, что уровень индукции нитрилгидратазы возрастает с ростом концентрации мочевины в среде и удельна активность достигает максимального значени при концентрации мочевины 16 г/л.
За вл емый бактериальный штамм М8, ВКПМ S-926 на основании таксономического изучени отнесен к виду Rhodococcus rhodochrous. Штамм обладает индуцибель- ной нитрилгидратазой, осуществл ющей гидролиз алифатических нитрилов в амиды. Индукци нитрилгидратазы достигаетс при выращивании клеток Rhodococcus rhodochrous M8 на минеральной среде с ионами кобальта, содержащей в качестве источника азота и индуктора нитрилы и амиды органических кислот, например изобути- ронитрил или изобутирамид, а в качестве источника углерода - глюкозу. Максимальна активность нитрилгидратазы (удельна активность 300 и обща активность 2400) наблюдаетс при использовании в качестве источника азота и индуктора мочевины ко- мерчески доступного соединени , что особенно важно в случае промышленного использовани штамма. Еще одним важным технологическим преимуществом использовани штамма Rhodococcus rhodochrous M8 в качестве катализатора при гидролизе нитрилов вл етс высока термостабильность нитрилгидратазы. Максимальна активность фермента (1000 ед.) наблюдаетс при 53°С.
Штамм Rhodococcus rhodochrous M8, ВКПМ S-926 может быть рекомендован как продуцент фермента нитрилгидратазы и использован в биотехнологическом процессе получени акриламида и других амидов кар- боновых кислот.
Claims (1)
- Формула изобретениШтамм бактерий Rhodococcus rhodochrous ВКПМ S-926-продуцент нитрилгидратазы .Таблица 1Указанные величины оптической плотности промер ли после соответствующих разведений.Таблица 2Таблица 3
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4826513A SU1731814A1 (ru) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU4826513A SU1731814A1 (ru) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1731814A1 true SU1731814A1 (ru) | 1992-05-07 |
Family
ID=21514873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4826513A SU1731814A1 (ru) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| SU (1) | SU1731814A1 (ru) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005054488A2 (en) | 2003-12-02 | 2005-06-16 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Process for producing polymers |
| US7575912B2 (en) | 2003-12-02 | 2009-08-18 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Strain-of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 and its use as producer of nitrile hydratase |
| WO2012164933A1 (ja) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| WO2012169203A1 (ja) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| US9434969B2 (en) | 2003-12-02 | 2016-09-06 | Basf Se | Manufacture of amides |
| US9518279B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-12-13 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
-
1990
- 1990-05-17 SU SU4826513A patent/SU1731814A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЕР № 0204555, кл. С 12 Р 13/02, опублик. 1986. Agric.Biolog.Chem., 1988, v. 52, № 7, р. 1813-1816. * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005054488A2 (en) | 2003-12-02 | 2005-06-16 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Process for producing polymers |
| US7575912B2 (en) | 2003-12-02 | 2009-08-18 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Strain-of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 and its use as producer of nitrile hydratase |
| US8067215B2 (en) | 2003-12-02 | 2011-11-29 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Process of producing polymers |
| US8153406B2 (en) | 2003-12-02 | 2012-04-10 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Microorganism |
| EP2796475A1 (en) | 2003-12-02 | 2014-10-29 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Process for producing polymers |
| US9434969B2 (en) | 2003-12-02 | 2016-09-06 | Basf Se | Manufacture of amides |
| WO2012164933A1 (ja) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| WO2012169203A1 (ja) | 2011-06-07 | 2012-12-13 | ダイヤニトリックス株式会社 | 改良型ニトリルヒドラターゼ |
| US9518279B2 (en) | 2012-12-27 | 2016-12-13 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
| US10138459B2 (en) | 2012-12-27 | 2018-11-27 | Kemira Oyj | Bacterial strain Rhodococcus aetherivorans VKM Ac-2610D producing nitrile hydratase, method of its cultivation and method for producing acrylamide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nagasawa et al. | Nitrile hydratase-catalyzed production of nicotinamide from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 | |
| FI93858C (fi) | Menetelmä amidin valmistamiseksi mikrobiologisesti | |
| FI87579C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av amider anvaendande mikroorganismer | |
| CA2155635C (en) | Strain of rhodococcus rhodochrous as a producer of nitrile hydratase | |
| KR100187512B1 (ko) | 박테리아의 배양방법 | |
| AU719269B2 (en) | Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate | |
| Zheng et al. | Isolation, identification and characterization of Bacillus subtilis ZJB-063, a versatile nitrile-converting bacterium | |
| Willenbacher et al. | Foam-free production of Surfactin via anaerobic fermentation of Bacillus subtilis DSM 10 T | |
| Gilligan et al. | Production of S-(+)-2-phenylpropionic acid from (R, S)-2-phenylpropionitrile by the combination of nitrile hydratase and stereoselective amidase in Rhodococcus equi TG328 | |
| Bonjour et al. | Bacillus tusciae, a new species of thermoacidophilic, facultatively chemolithoautotrophic hydrogen oxidizing sporeformer from a geothermal area | |
| SU1731814A1 (ru) | Штамм бактерий RноDососсUS RноDоснRоUS - продуцент нитрилгидратазы | |
| Fischer-Colbrie et al. | Surface hydrolysis of polyacrylonitrile with nitrile hydrolysing enzymes from Micrococcus luteus BST20 | |
| KR100339723B1 (ko) | 미생물을사용한아미드화합물의제조방법 | |
| RU2304165C1 (ru) | Способ получения акриловых мономеров и штамм бактерий rhodococcus rhodochrous для его осуществления | |
| KR850001533B1 (ko) | 세팔로스포린 메틸 에스테르의 탈에스테르화법 | |
| Daumy et al. | Repression of penicillin G acylase of Proteus rettgeri by tricarboxylic acid cycle intermediates | |
| Rogacheva et al. | The Respiratory Activity of Rhodococcus rhodochrousM8 Cells Producing Nitrile-Hydrolyzing Enzymes | |
| JPH04304892A (ja) | グリシンの生物学的製造法 | |
| Ogawa et al. | Evaluation of pyrimidine-and hydantoin-degrading enzyme activities in aerobic bacteria | |
| RU2196822C1 (ru) | Штамм бактерий rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы | |
| RU2160778C1 (ru) | Штамм бактерий bacillus сereus-продуцент нитрилгидратазы | |
| RU2731289C2 (ru) | Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора | |
| RU2081169C1 (ru) | Штамм бактерий alcaligenes species - продуцент нитрилазы | |
| RU2223316C2 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ rhodococcus ruber - ПРОДУЦЕНТ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ | |
| JPH03277292A (ja) | 光学活性な２―ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: QB4A Effective date: 20070130 |
|
| REG | Reference to a code of a succession state |
Ref country code: RU Ref legal event code: QB4A Effective date: 20080414 |