KR850001533B1 - 세팔로스포린 메틸 에스테르의 탈에스테르화법 - Google Patents

세팔로스포린 메틸 에스테르의 탈에스테르화법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

세팔로스포린 메틸 에스테르의 탈에스테르화법
본 발명은 일반식(I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를 발효에 의해 생성된 효소로 탈에스테르화시키는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서
R은 수소 또는 R3CH(NH2) CO-이고 ;
R1은 메틸, 클로로, 아세톡시메틸, 메톡시, 메톡시메틸, 아미노카보닐옥시메틸, 메틸티아디아졸릴티오메틸 또는 메틸테트라졸릴티오메틸이며 ;
R2는 수소 또는 메톡시이고 ;
R3는 페닐, 사이클로헥사디에닐, 하이드록시에 의해 일치환된 사이클로헥사디에닐, 또는 할로, 하이드록시, (C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시에 의해 일-또는 이-치환된 페닐이다.
본 발명은 또한 효소 화학 분야 및 항생물질의 합성에 관한 것이다.
유기 화합물의 합성 또는 분해에 여러 효소가 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를들면, 다께다 케미칼 인더스트리스(Takeda Chemical Industries)의 미합중국 특허 제3,749,641호에는 수많은 미생물중의 어느 것에서 유도된 효소가 세팔로스포린 화합물을 탈에스테르화 및 탈아실화 시킬 수 있음이 기술되어 있다. 일반적으로 에스테르 분해효소에 관한 문헌이 마이어스 및 호프스티(Myers 및 Hofstee)에 의해 조사되었다[참조:chapters 28 and 29 of the Enzymes, Boyer, Lardy and Myrback, Eds, Vol.4 (Academic Press 1960)].
본 발명은 또한 효소 생성조건하에서 스트렙토마이세스 카필리스피라(Streptomyces capillispira) A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981년 11월 26일)를 배양하여 생성된 신규의 효소를 제공한다. 이 효소는 일반식(I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를 탈에스테르화시켜 상응하는 카복실산을 제조한다.
본 발명에 따르면, 일반식 (I)의 메틸 에스테르를, 효소 생성 조건하에서 스트렙토마이세스 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)를 배양하여 제조한 효소와 반응시킴을 특징으로 하여, 일반식 (I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를 탈에스테르화시키는 방법이 제공된다.
본 명세서중 모든 온도는 섭씨로 표시한다.
상기의 일반적인 화학용어는 유기화학에서 통상적으로 유용되는 의미를 지닌다. 용어"할로"는 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 나타낸다. 용어 "(C1-C3)알킬"및 "(C1-C3)알콕시"는 메틸, 메톡시, 에틸, 에톡시, 프로필 및 이소프로폭시와 같은 그룹을 나타낸다.
상기 일반식 (I)로 본발명의 방법에 의해 탈에스테르화되는 기질 화합물이 명백해진다. 그러나, 대표적인 화합물 그룹을 다음에 표시하여, 본 발며의 효소와 반응하는 이들 화합물에 대해 이해가 용이하도록 한다 :
메틸 7-아미노-3-아세톡시메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노-(2-클로로페닐)아세트아미도-3-클로로-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노-(2,6-디클로로페닐)아세트아미도-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸7-아미노-(2,5-사이클로헥사디에닐)아세트아미도-3,7-디(메톡시)-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노-(페닐)아세트아미도-3-메톡시메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노-(4-브로모페닐)아세트아미도-3-아미노카보닐 옥시메틸-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트.
메틸 7-아미노-아미노(3-플루오로페닐)아세트아미도-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일티오메틸)-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노-(3-요도페닐)아세트아미도-7-메톡시-3-(1-메틸테트라졸-5-일-티오메틸)-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 3-아세톡시메틸-7-아미노(2-클로로-4-플루오로페닐)아세트아미도-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(4-메틸페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(3-프로필페닐)아세트아미도-7-메톡시-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(3,5-디메틸페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(5-브로모-2-메틸페닐)-아세트아미도-3-클로로-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(4-요도-3-이소프로필페닐)-아세트아미도-3-아미노카보닐 옥시메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(4-에톡시페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노[2,4-디(프로폭시)페닐]아세트아미도-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 3-아세톡시메틸-7-아미노(3-브로모-5-메톡시페닐)아세트아미도-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(2-에틸-6-프로폭시페닐)-아세트아미도-3-메톡시메틸-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(4-하이드록시-2,5-사이클로헥사디에닐)-아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(2-하이드록시-2,4-사이클로헥사디에닐)-아세트아미도-3-(5-메틸-1,3,4-티아디아졸-2-일-티오메틸)-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(4-하이드록시페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트
메틸 7-아미노(2,5-디하이드록시페닐)아세트아미도-3-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 3-아세톡시메틸-7-아미노(3-클로로-4-하이드록시페닐)아세트아미도-7-메톡시-3-세펨-4-카복실레이트,
메틸 7-아미노(3-에틸-5-하이드록시페닐)-아세트아미도-7-메톡시-3-(5-메틸테트라졸-1-일-티오메틸)-3-세펨-4-카복실레이트.
일반식 (I)의 기질 화합물중 특정 그룹이 바람직하며, 탈에스테르화법의 바람직한 반응 조건도 특정적인 조건이다. 하기표에서는 바람직한 기질 및 조건을 기술하였다. 하기의 여러 조건이 합하여 본 발명의 더욱 제한된 바람직한 방법이 이루어질 수 있을 것이다 :
(A) R1이 메틸인 경우 ; (H) R3가 페틸, 하이드록시페닐,
(B) R1이 클로로인 경우 ; 사이클로헥사디에닐, 또는
(C) R1이 메틸 또는 클로로인 경우 ; 하이드록시사이클로헥사디에닐인 경우;
(D) R1이 아세톡시메틸, 메틸 또는 (I) R이 수소이거나, R3가 페닐인 경우 ;
클로로인 경우 ; (J) 효소를 고정화시킨 경우 ;
(E) R2가 수소인 경우 ; (K) pH가 약 7 내지 9인 경우 ;
(F) R이 수소인 경우 ; (L) 온도가 약 15 내지 약 45℃인 경우.
(G) R3이 페틸인 경우 ;
일반식 (I)의 바람직한 개별적 기질 화합물은 메틸 7-아미노(페닐)아세트아미도-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트, 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트, 메틸 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트 및 메틸 7-아미노(페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트이다.
본 발명의 효소를 생성하는 미생물은 A49492로 명명된 신규의 스트렙토마이세스 카필리스피라[기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 :1981.11.26.]이다. 이 균주는 스웨덴에서 포집된 토양 표본으로부터 거의 생물학적으로 순수한 배양물로 분리되어 기탁번호 NPPL 12279로서 기탁되었다[기탁기관 : Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois].
스트렙토마이세스 카필리스피라 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26.)는 ISP(International Streptomyces Project)에서 스트렙토마이세스 종에 대해 권하는 방법[Shirling and Gottlieb, Int. J. Syst, Bacteriol. 16, 313-40 (1966)에 기술된 방법] 및 특정의 보조 시험법에 의해 특징지워진다.
세포벽 분석법은 효모-맥아육즘(ISP No.2) 중, 30℃에서 24시간동안 성장된 배양물에 대해서 이루어진다. 원심분리하여 균사를 모으고, 증류수로 3회 세척한다. 세축된 세포를 동결건조시킨 후, 세포벽의 당(sugar)을 실질적으로 문헌에 보고된 방법에 따라 측정한다[참조 : Method of Lechavalier, 1971, Chemical Methods as Criteria fot the Separation of Actinomyces ito Genera, Workshop sponsored by the Subcommittee on Actinomyces of the American Society for Microbiology, T.G. Pridham, Convener, held at the Institute of Microbiology, Rutgers Univ., The Stae Univ. of New Jersey, New Brunswick, New Jersey]. 디아미노피멜산 이성체는 문헌[참조 : Becker et al., Appl. Microbiol. 12. 421-423(1964)]에 기술된 방법에 의해 측정한다. 그 결과는 하기표에 나타낸다.
성장을 위한 pH범위는 ISP No.2. 한천배지중의 0.05M 농도에서 다음 완충제를 사용하여 측정한다 : 시트르산, pH 3,4,5, ; 2-모르폴리노에탄설폰산, pH6 ; 3-모르폴리노프로판설폰산, pH7 ; N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신, pH8 ; 2-사이클로헥실아미노에탄설폰산, pH8.5,9.0,9.5;3-사이클로헥실아미노프로판설폰산, pH10,10.5. 한천 플레이트의 pH가는 접종시키기 전에 평면전극으로 측정한다.
탄소 이용도는 탄소공급원의 최종농도가 1.0%가 되도록 여과-멸균시킨 탄소공급원을 가한 ISP No.9 기본배지에서측정한다. 플레이트를 30℃에서 배양시키고 14일 후에 판독한다.
멜라노이드 색소 생성은 ISP No.1 육즙(트립톤-효모 즙), ISP No.6 한천(펩톤-효모 즙 및 철), ISP No.7 한천(타이로신) 및 변형 ISP No.7(타이로신 함유무) 중에서 측정한다.
전분 가수분해는 ISP No.4한천 플레이트[Blazevic 및 Ederer에 의해 Principles of Biochemical Tests In Diagnostic Microbiolgy, John Wiley and Sons, New York, 1975에 기술된 바와 같은 무기염-전분]상에서 요드와 전분의 존재에 대해 시험하여 측정한다.
라이소자임 저항성과 카제인, 에스쿨린, 하이포크산틴, 타이로신 및 크산틴의 부내ㅎ는 문헌[참조 : Berd, Appl. Microbiol. 25, 665-81 (1973)]에 기술된 방법으로 측정한다.
염화나트륨 및 슈크로즈 내성을 ISP No.2한천을 사용하여 측정한다. 항생물질 감수성은 2% 영약 접종물을 씨딩한 ISP No.2 한천 플레이트 표면에 감수성 디스크를 놓고 측정한다.
상기에 기술된 블라제빅 및 에더러의 방법은 카탈라제, 포스파타제 및 우레아제 분석법에도 사용된다. 표준번호 2106의 ISCC-NBS 센트로이드 칼라챠트[ISCC-NBS Centroid Color Charts, National Bureau of Standards에서 1958년에 간행됨]를 사용하여 색이 명칭을 붙인다.
스트렙토마이세스 카필리스피라 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 잘 발육된 코일상의 기 균사를 생성하므로, 프리드햄 식[참조 : Pridham et al., Appl. Microbiol 6, 52-79 (1958)]에 따라 나선균(Spirales section)항에 포함시킨다. 이러한 양상은 기 균사의 생성을 돕는 모든 매질 상에서 용이하게 관찰된다. 오우트밀 한천(ISP No.3), ISP No.7, 토마토 페이스트오우트밀 한천 및 유수 한천에서 나선균의 모양을 잘 관찰할 수 있다. 나선균은 단순하며 개방된 2 또는 3회 회전된 헐거운 코일이다. 포자병에는 10 내지 50개의 포자가 함유되어 있다. 포자의 모양은 주사전자형미경 사진에서 구형이었으며, 포자의 크기는 0.96×0.54 내지 1.19×0.71μm 범위이다. 평균크기는 1.05×0.624μm이다. 포자표면에는 털이 많다. 핵의 모양을 ISP No.2 한천상에서 관찰한다.
기 균사는 트레스너 및 바커스[참조 : Tresner and Backus, Appl. Microbiol. 11, 3335-338(1963)]의 회색 계열에 속하며, 연갈색을 띤 회색이 우세하다. A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 무편이 기질 또는 성장 배지에 따라 황갈색 내지 갈색을 띤 흑색인 1차 균사를 생성한다. 때로는 갈색의 용성색소가 생성된다. 이 배지에서는 멜라노이드 색소가 생성되지 않는다.
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 생리학적 특징은 다음과 같다 :
상기의 배지에서 카탈라제, 포스파타제 및 우레아제가 생성되고, 카제인, 하이포크산틴, 타이로신 및 크산틴은 분해된다. 이 배지에서는 젤라틴이 액체화되거나, 전분이 가수분해되거나, 니트레이트가 환원되거나 밀크가 펩톤화되거나, 라이소자임이 저항성을 갖게되거나 에스쿨린이 분해되지 않는다. 아세테이트, D-아라비노즈, 멜리비오즈, 라피노우즈, 살리신 및 슈크로즈는 이 배지에서 이용되지 않는다. A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 10 내지 45℃의 온도 범위에서 성장하며, 최적온도는 30℃이다. A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 6내지 9.5의 pH범위, 6%까지의 염화나트륨 및 35%까지의 슈크로즈 농도에 내성을 지닌다.
종이 크로마토그라피에 의한 세포벽 가수분해산물의 분석방법으로 디아미노피멜산의 존재가 밝혀졌다. 메조 이성체는 검지되지 않았다. 당측정법으로는 단지 글루코즈 및 리보즈만이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 상기의 내용으로 타입 I의 세포벽 및 타입 C의 당인 것으로 밝혀졌다[참조 : Bergey's Manual of Deter minative Booterlogy, Buchanan and Gibbons (Eds), 8th Edition, page 658, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1974]. A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 형태학적 및 화학적 특성으로 이 균주가 스트렙토마이세스 속에 속한 것으로 밝혀졌다.
하기표는 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술월, 기탁일 :1981.11.26)의 배지특성을 요약한 것이다.
Figure kpo00002
다음표에서는 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)가 통상의 여러 탄소공급원을 이용할 수 있음을 보고하고 있다. 하기표중 +는 탄수화물 이용을 나타내고, -는 이용하지 않는 것을 나타내며, 물음표는 이용이 의심스러운 것을 나타낸다.
[표 2]
Figure kpo00003
다음 표는 디스크 감수성 시험법에 의해 측정한 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 여러 통상의 항생물질에 대한 감수성을 나타낸다. 하기표에서는 +는 억제대가 생성된 것을 나타내며, -는 억제대가 없음을 나타낸다. 하기표에서 "양"은 각 디스크마다 사용된 항생물질의 양을 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00004
다음 표에는 스트렙토마이세스 카필리스피라 A49492균주(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)에 대한 여러 측정 결과를 요액하였다 :
[표 4]
Figure kpo00005
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 적절한 효소 생성 조건하에서 배양시 본 발명의 효소를 생성한다. 상기에 기술된 바와 같이, 이 균주는 여러 탄수화물 공급원을 이용할 수 있으며, 이 균주를 정의된 여러 복합배지 및 상기 언급한 배지중의 어느 것 중에서 배양시키면 효소가 생성된다. 하기 실시예에서는 성공적으로 사용되는 여러 배지를 기술한다.
전화당, 옥수수시럽, 글루코즈, 프럭토즈, 말토즈, 전분 및 기타를 포함하는 탄수화물 공급원이 성공적으로 사용된다.
이용될 수 있는 질소공급원으로는 펩톤, 대두분, 아미노산 혼합물 등이 포함된다. 통상의 용성 무기염이 배지중에 미량원소 공급원으로써 사용될 수 있으며, 이러한 염에는 철, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 포스페이트, 클로라이드, 카보네이트 및 기타의 이온을 생성할 수 있는 염이 포함된다.
그러나 이들 균을 상기 언급한 배지중에서 성장시킬 대 최상의 효소가 생성된다. 특히, 최상이 효소를 제조하기 위해서는 질소공급원 및 그 양을 주의하여 선택하여야 한다. 프롤린, 세린, 클리신 등의 아미노산을 사용할 수 있으나 암모늄 이온이 질소공급원으로 더욱 만족스러운 것으로 밖혀졌다. 어떠한 형태의 질소공급원이든 과량을 사용하면 효소의 생성이 억제되며, 따라서 성장배지에 질소공급원을 서서히 가하여 배지의 요구량보다 과량의 질소공급원이 함유되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
배지의 pH는 약 6 내지 약 8, 바람직하게는 pH 약 6.5 내지 약 7.5, 가장 바람직하게는 약 6.9 내지 약 7.1의 범위로 고정시켜야 한다. 배지의 pH는 일반적으로 성장이 진행됨에 따라 저하되므로, 성장배지에 염기를 가하여 바람직한 pH로 조정하고, 바람직하게는 자동조절기를 사용하여 전 발효공정동안 바람직한 pH가 유지되도록 하는 것이 좋다. 특히 유리한 방법은 수산화암모늄 용액을 pH를 조정함으로써 질소공급원의 첨가와 pH의 조정을 겸하도록 하는 것이다.
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 성장에는 공기의 충분한 공금이 요구된다. 소규모 배지는 진창 플라스크중에서 통기시키고, 대규모의 경우에는 액침 호기성 배양시키는 것이 가장 편리하다. 물론 이 균주를 사면 한천 및 평면 한천상에서 성장시킬 수 있다.
발효 배지에 포자 현탁액을 직접 접종시킬 수 있으나, 영양 접종물을 사용하는 것이 바람직하다. 영양접종물은 소용적의 배지에 포자형의 균 또는 균의 균사편을 접종시켜 활성성장 배지로 만든 것이다. 영양접종물은 대형 탱크 접종에 사용된다.
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)는 약25℃ 내지 40℃의 온도범위에서 성장이 잘된다. 그러나 균주를 약 30 내지 37℃의 온도에서 성장시키는 것이 바람직하다.
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 배지중에서 효소를 생성시키는데 필요한 발효시간에는 차이가 있으나, 통상 2 내지 7일이면 우수하게 효소를 생성할 수 있다. 더욱 장기간이 소요될 수도 있으나, 불필요하게 장시간동안 성장시킬 때는 흔히 효소의 수율이 감소되는 것으로 밖혀졌다.
A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)를 배양시켜 효소를 생성할 경우, 기질화합물을 간단히 발효혼합물에 가하거나, 본 발명의 방법에서 사용하기위해 수집하여, 정제시킬 수 있는. 하기 실시예는 단순히 발효혼합물에 기질화물을 가할 경우의 효과를 설명하고 있다.
그러나 배지로부터 효소를 분리시키고, 효소를 부분적으로 정제된 형태로 사용하는 것이 더욱 효율적이다 효소는 발효혼합물중의 세포와 관련된 것으로 나타났다. 따라서 배지중에서 세포를 회수하고, 분리한 세포로부터 수집하여야 한다. 세포의 분쇄는 균질화, 초음파 처리, 라이소자이과 같은 효소에 의한 세포용해 및 동결시킨 후 동결된 물질을 분쇄시키는 방법 등으로 수행한다. 초음파처리가 바람직한 세포분쇄법이다. 이 효소는 세포 균등물을 중성 또는 거의 중성인 완충액에 현탁시키고, 현탁액을 여과 또는 원심분리하여 분쇄된 세포편을 회수함으로써 분쇄된 세포로부터 분리시킨다. 생성된 효소용액은 본 발명의 방법에서 사용할수 있거나, 더 정제하거나 농축시켜 사용할 수 있다.
이 효소는 효소용액을 용액중의 단백질을 여러 획분으로 분리시키는 크로마토그라피 컬럼에 통과시킴으로써 정제할 수 있다. 정제된 효소는 경우에 따라 한외여과시켜 더 농축시킬 수 있다.
효소는 승온에서는 신속히 분해되므로, 0℃와 같은 비교적 저온에서 보관하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서의 반응 혼합물의 분석은 종이 또는 박층 크로마토그라피의 생물학적 분석법에 의해 용이하게 할 수 있으며, 본 발명의 생성물인 세팔로스포린산에 비해 기질 에스테르가 항생물질로써 비교적 불활성인 점을 이용한다. 예를들면 반응혼합물을 박층 크로마토그라피판상에 또는 여과지상에 점적시키고 적절한 용매로 전개시켜 적절한 미생물을 접종시킨 영양 한천판으로 옮긴다. 크로마토그램상의 세팔로스포린산의 양은 크로마토그램상에서 공지량의 동일 세팔로스포린산에 의해 생성된 억제대와 그 크기를 비교하여 측정할 수 있다. 기질화합물이 세팔로스포린핵(R이 수소)일 경우에는, 분석전에 이 생성물 산을 아실화시켜야 하며, 이는 세팔로스포린 기술분야의 숙련자에는 잘 인지될 것이다.
이러한 분석법을 사용하여 수집, 정제 및 농축된 효소용액의 활성도를 측정한다.
이 효소는 기질화합물과 효소를 간단히 접촉시키는 본 발명의 방법에서 사용된다. 효소 기술분야에서는 이 반응을 수성매질중에서 시행하는 것이 바람직하고 통상적이다. 효소가 순수한 형태로 분리되지 않기 때문에, 기질화합물 특정량을 탈에스테르화시키는데 필요한 효소의 절대량을 기술할 수가 없다. 하기 실시예는 효소용액의 활성도를 측정하는 방법을 나타낸다. 조작자는 표준분석 조건하에서 효소의 활성도를 측정할 수 있으며, 활성도에 의해 주어진 시간동안 일정량의 기질을 탈에스테르화시키는데 필요한 용액의 양을 용이하게 계산할 수 있다.
효소를 수회 재사용하고 효소의 안전성을 높이기 위해서는 적절한 방법에 의해 효소를 고정화시키는 것이 바람직하다. 효소를 고정화시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 통상의 방법이 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)에 의해 생성된 효소로도 유효한 것으로 밝혀졌다. 바람직한 고정화방법은 디에틸 아미노에틸 셀룰로즈[상품명 : DEAE Sehpacel; Pharmacia Fine Chemicals Corp., Piscataway, New Jersey]에 대한 이온성 결합방법이다. 기타의 바람직한 고정화방법은 챠오 및 첸(Tsao and chen)에 의한 미합중국 특허 제4,063,017호의 방법으로 제조된 비드형태의 DEAE셀룰로즈에 대한 이온성 결합방법이다.
고정화된 효소는 컬럼 또는 교반탱크법에 이해 기질화합물과 효율적으로 접촉된다. 컬럼을 사용할 경우, 고정화시킨 효소를 충진시키고 기질화합물의 수용액 또는 현탁액을 컬럼에 통과시킨다. 교반탱크를 사용할 경우, 본 분야의 통상의 방법에 따라 연속적으로 또는 배치식으로 수행할 수 있다.
기질화합물과 고정화시킨 또는 그렇지 않은 효소를 세팔로스포린산을 바람직한 양으로 수득하기에 충분한 시간동안 접촉시킨 후 이 산을 통상적인 유기화학 방법으로 분리시킨다. 예를들면 산을 적절한 염, 특히 치료용의 나트륨 또는 캄륨염으로 전환시키고, 진공하중등도 온도에서 생성물 용액으로부터 물을 증발시켜 분리시킬 수 있다.
탈에스테르화 방법은 pH 약 7 내지 9, 가장 바람직하게는 약 7.5 내지 8.5에서 시행할 수 있다. 이 방법에서 최적온도는 25 내지 30℃이나, 약 15 내지 45℃의 온도를 사용할 수도 있다. 상기에 언급된 바와 같이, 효소는 특히 승온에서는 안정하지 못하며, 따라서 본 명세서에서 기술된 최적온도를 사용하는것이 바람직하다. 이 효소의 km치는 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트에 대해 약 2.3mg/ml이며, 반응혼합물중의 기질화합물의 농도는 약 1 내지 10mg/ ml범위내이어야 한다.
부분적으로 정제된 상태의 요소는 동결시키거나 동결건조시켜 장시간동안 저장할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 효소가 생성되는 발효액 및 발효액으로부터 분리시킨 세포물질은 동결시켜 보관할 수 있다.
다음 실시예는 에스. 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)를 발효시켜 효소를 생성시키고, 효소를 분리 및 정제시키며, 이 효소를 사용하여 탈에스테르화 반응을 수행하는 방법을 설명한다. 탈에스테르화 반응의 기질 및 생성물은 공지의 화합물이며, 따라서 생성물동정에 상세한 분석적 동정법이 필요하지 않다. 대신에 반응혼합물중의 산의 양을 측정하는 분석방법으로 탈에스테르화 정도를 측정한다. 몇몇 경우에는 분석방법이 생물학적 방법이며, 기타의 경우에는 역가측정법이다. 또한, 생성물이 제조되었음은 여러가지의 표준 세팔로스포린산과 크로마토그라피로 비교하여 확인한다.
통상의 방법은 용매로써 4/1 아세토니트릴 물을 사용하는, 여지 크로마토그라피법이다. 크로마토그램이 나타나면, 감수성 미생물, 통상 바실루스 섭틸리스를 접종시킨 한천판 상에 놓고 활성항생물질산의 양을 동일한 계에서 기지량의 항생물질에 의해 생성된 억제대의 크기와 비교하여 측정한다.
기질에스테르가 7-위치에 아미노그룹만을 지닌 세팔로스포린 핵에스테르일 경우에는 핵산이 시험균에 대해 불활성이기 때문에 산의 양을 직접 측정할 수 없다. 이러한 경우에는, 전개된 크로마토그램에 아실화제, 통상적으로 페녹시아세틸 클로라이드의 희용액을 분무시켜 추가로 아실화 단계를 시행함으로써 불활성핵을 활성화합물로 전환시킨다.
점적 판법이라 불리우는 기타의 확인방법은 면밀히 측정한 양, 통상적으로 10㎕의 분석용 혼합물을 대(zone)상의 액체가 서로 분리되도록 라커(lacquer)로 경계를 두른 작은 대를 갖는 여지상에 피페팅하여 시행한다. 기질화합물이 핵 에스테르일 경우로 아실화가 필요한 경우에는 각 대에 10㎕의 2% 중탄산나트륨용액 및 석유에테르중의 2.5% 페녹시아세틸 클로라이드 20㎕를 점적한다. 스포트를 공기건조시키고 여지를 비. 섭틸리스(B. Subtilis)의 포자 현탁액을 접종시킨 분석판의 한천 표면에 놓는다. 여지를 한천판상에 약 45분간 방치한 후 이를 제거시키고 한천판을 25℃에서 밤새 배양한다. 다음에는 억제대 크기를 측정한후 표본중의 세팔로스포린산의 양을 탈에스테르화 생성물인 세팔로스포린산의 기지량에 의해 생성된 억제대 크기와 비교하여 측정한다.
상기 생물학적 분석방법은 정제하지 않은 발효혼합물 및 정제한 효소제제 모두에 유용하다. 정제한 제제는 반응중 일정 pH를 유지시키는데 필요한 염기양을 측정함으로써 생성된 산의 양을 측정하는 역가측정법으로 분석하는 것이 용이하다. 따라서 탈에스테르화반응은 적절한 기질용액에 효소제제를 가한 후 자동적정기로 표본에 염기를 가하여 탈에스테르화시킴으로써 자동 적정기로 용이하게 모니터할 수 있다.
다음 실시예중의 효소제제의 활성도는 통상적으로(탈에스테르화된 기질의 몰수)/(단백질 또는 세포의mg)(분)으로 측정한 비율로 표시한다. 몇몇 경우의 예에서는, 효소 활성도를 다른 방법으로 나타냈으며, 이들 예는 관련 실시예중에서 설명한다.
달리 언급된 바가 없다면, 효소활성도 측정시 사용된 기질은 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트이다.
기질에스테르는 알카리 조건하에서 가수분해시키면 자연적으로 탈에스테르화된다. 따라서 효소제제의 활성도를 측정할 경우에는 알카리조건을 피하거나, 측정된 비율을 비효소화 가수분해 비율에 대해 보정하는 것이 가장 중요하다.
하기 실시예에서는 통상적으로 인산수소칼륨 완충제를 사용한다. 이들 완충제는 특정 pH를 지닌다. 완충제는, 인산이수소칼륨을 제조하고 수산화칼륨 또는 인산을 사용하여 원하는 pH로 조정함으로써 제조할 수 있다.
발효 배지는 통상적으로 증기멸균한다. 글루코즈 및 암모늄염을 사용할 경우에는 이들은 여과-멸균된 수용액으로 멸균한 후 첨가한다.
[실시예 1]
에스. 카필리스피라 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 영약 배양물을 25ml의 하기 배지에 접종시켜 효소를 생성시킨다.
글루코즈 25g/l 페당밀 5
옥수수전분 10 MgSO4·7H2O 0.5
액체육즙 펩톤 10 CaCO32
효소로 분해된 카제인 4 쟈펙 무기물* 2m/l
*(KCl 100g/l FeSO4·7H2O 2g/l를 농염산 2ml/l
MgSO4·7H2O 100g/l 및 에 용해시켜 제조한 것)
접종한 튜브를 30℃에서 3일간 진탕하고 4ml의 배양물을 50ml 플라스크로 옮긴다. 상기 플라스크에 pH가 7.0인 5mg/ml의 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트를 함유하는 1ml의 여과-멸균된 기질용액을 가한다.
이어서 효소에 의해 기질화합물이 탈에스테르화되도록 30℃에서 16 내지 20시간 진탕시켜 플라스크에 접종한다.
반응완료시, 배양물을 원심분리하면 이때의 pH는 6.4이다. 원심분리액으로부터 상등액을 용매로서 4/1아세토니트릴/물을 사용하여 상술한 방법으로 종이 크로마토그라피시킨다. 크로마토그램을 석유에테르중의 페녹시아세틸 클로라이드의 용액으로 아실화시키고, 비. 섭틸리스로 접종한 영양배지상에 깔아준 다음, 억제대가 생성되는 것을 관찰한다. 탈에스테라화 효소를 생성하지 않는 미생물은 억제대를 생성하지 못한다.
[실시예 2]
본 실험에서는 내면층 스퍼저(Sparger)로 통기되는 10l들이 교반탱그중, 실시예 1에서 사용된 동일한 배지중에서 미생물을 성장시킨다. 탱크용 접종물은 에스. 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 사면 배양물을 250ml들이 플라스크에 접종하고, 플라스크를 30℃에서 2일간 진탕시키면서 배양한다.
효소 생성을 위해 미생물을 성장시키는 배지를 제조하고, 실리콘 소포제 3ml를 보충한다음 pH를 6.7로 조정한다. 배지를 함유하는 탱크를 121℃에서(1.05kg/cm2) 1시간동안 오토클레이브하여 멸균시킨다. 탱크 및 배지를 냉각시킨다음, 접종물을 가하고 통기 및 교반을 시작한다. 전 발효공정중에 배지에 공기를 약 5l/분으로 퍼즈하고, 온도를 30℃로 조정한다. 107시간동안 계속해서 발효시킨다. pH를 주기적으로 측정하고, 배양이 계속됨에 따라 증가되는 것을 관찰한다. 17시간이 경과한 후, 또한 89,99 및 101시간이 경과한 후에 인산을 가하여 pH를 6.7로 재조정한다.
매일 작업시작전과 작업종료후에 탱크에서 시료를 채취하여 동결시키고 효소 활성 그룹으로 평가한다. 시료를 해동시키고, 원심분리한다음 실시예 1에서 사용한 동일한 기질화합물과 혼합하고 16시간동안 반응시킨 후에 종이 크로마토그라피로 평가한다. 67시간이 경과한 후에 발효조에서 채취한 시료를 분석한 결과 탈에스테르화 활성이 가장 높은 것으로 밝혀졌다. 41시간 경과후에 처음으로 활성이 나타나고, 67시간 경과후에 채취한 시료는 최대 활성도보다 다소 낮은 것으로 나타났다.
[실시예 3]
본 실험을 수행하여 탈에스테르화 효소의 생성 및 미생물의 성장을 지지하는 여러 복합배지 및 지정된 배지를 평가한다. 하기 배지를 사용한다.
Figure kpo00006
Figure kpo00007
Figure kpo00008
상기배지 50ml씩을 250mι의 플라스크에 넣고 오토클레이브한다. 냉각한 후, 각 플라스크를 에스. 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 영양 배양물로 접종시키고 30°에서 3일간 진탕 배양시킨다. 이어서, 각 배양물의 분취량 4ml를,5mg/ml의 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트를 0.5몰의 KH2PO4완충제(pH7.0)에 용해시켜 제조한 기질원액 1ml와 혼합한다.
반응 혼합물을 30°에서 16시간동안 진탕시키고, 이어서 실시예 1에 기술된 바와 같이 종이 크로마토그라피로 평가한다.
미생물들은 상기 배지에서 모두 잘 배양되고 있는 것으로 밝혀졌다. 탈에스테르화효소는 배지 H를 제외한 모든 배지에서 생성되었으며, H배지에는 다량의 중금속염과 (NH4)2HPO4? 함유되어 있다.
[실시예 4]
본 실시예를 실질적으로 실시예 3의 방법에 따라 수행하여, 다음과 같은 조성을 갖는 배지를 평가한다.
Figure kpo00009
Figure kpo00010
각 배지 50ml씩 들어있는 250ml플라스크를 실시예 3의 방법에 따라 멸균하고 냉각하여 접종하고 배양한 후 각 배양물을 시료로 하여 기질화합물과 반응시킨다.
종이크로마토그라피로 반응 혼합물을 분석한 결과 배지 A,C,D,E 또는 F에서는 효소가 잘 생성되지 않았으며, 거대한 억제대로 입증된 바와 같이, 배지 B,G 및 H 에서는 생성되었다.
[실시예 5]
본 실험은 미생물의 성장 및 효소의 생성에 아미노산이 미치는 영향에 대해서 평가하는 것이다. 하기조성을 갖는 기본 배지를 다량 제조한다.
MgSO4·7H2O 0.5g/l CaCO31
K2HPO42 쟈펙무기물 2ml/l
상기 배지를 정량으로 나누고, 한가지 아미노산을 각각의 분취액에 가하여 시험 배지를 제조하는데, 각각의 배지에는 다음의 아미노산 2g/l이 함유되어 잇다.
1) L-글루탐산 6) L- 히스티딘염산염
2) L-알라닌 7) L-프롤린
3) L-알기닌 8) L-세린
4) L-아스파르트산 9) L-트레오닌
5) L-글라이신
면균후에, 멸균된 글루코즈 10g/l를 각 배지에 첨가한다.
멸균된 배지 50ml씩이 들어있는 250ml의 플라스크를 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 영양접종물로 접종하고 배양시킨다. 각 배양물로부터 41 및 65시간에 시료를 재취하고 상술한 점적판 법으로 탈에스테르화 효소의 활성을 측정한다.
하기표에는 시료 채위 시간에 있어서 각 배양물의 pH 및, 효소의 비활성도를 기록하였으며, 이 비활성도는 (가수분해된 에스테르 몰×10-10)/(건조 세포중량 mg)(분)로 표시한다.
Figure kpo00011
[실시예 6]
여러 아미노산으로 다른 실험을 수행하여 효소생성을 위한 적당한 배지를 측정한다. 본 실험에서 기본배지의 조성은 다음과 같다.
MgSO4·7H2o 0.5g/l 글루코즈 10
K2HPO42 쟈펙무기물 2ml/l
CaCO31
기본 배지의 분취액을 하기의 아미노산 2g/l로 처리한다.
배지의 pH를 7.0으로 조정하고, 멸균하고 배양물로 접종시키고 상기 실시예에서 행한 바와 같이 배양시킨다. 배양한지 44시간후, 각 배양물의 시료 4ml를 채취하고, 0.5몰의 K2HPO4완충액(pH 7.0)중의 5mg/ml의 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트의 용액 1ml와 혼합한다. 기질용액에 1ml당 나트륨 아지드 20μg을 가하여 세포의 성장을 지연시킬 수 있다. 반응 혼합물을 30°에서 5시간동안 온화하게 교반하고 점적 판법으로 에스테라제의 활성을 평가한다. 에스테라제의 활성은 하기와 같다 :
비활성도 비활성도
1) 알기닌 24 12) 아스파르트산 4.4
2) 히스티딘 5.1 13) 시스틴 0
3) 이소로이신 9.0 14) 글루탐산 6.7
4) 로이신 10 15) 글라이신 22
5) 라이신 9.0 16) 하이드록시프롤린 11
6) 메티오닌 13 17) 프롤린 17
7) 페닐알라닌 5.2 18) 세린 24
8) 트레오닌 18 19) 티로신 13
9) 트립토판 13 20) 글루타민 4.8
10) 발린 7.4 21) 아스파라긴 7.1
11) 알라닌 4.4
[실시예 7]
배지내에서 아미노산의 농도를 달리하여 그 효과에 대해 평가한다. 기본 배지의 조성은 실시예 6에서 사용한 것과 동일하다. 기본 배지를 분취하고, 각각의 분취액에 L-프롤린 또는 L-세린을 하기 표에 기재된 농도로 가한다. 배지를 실시예 6에 기술된 바와 같이 현탁시키고, 멸균한 다음, 냉각시키고 접종하여 배양하고 48시간후 시료를 취하여 실시예 6에 기술된 바와 같은 방법으로 에스테라제의 활성을 측정한다. 그 결과는 다음과 같다 :
Figure kpo00012
[실시예 8]
발효배지중에서 암모늄 이온의 양을 달리하여 실험을 수행하여 그 효과에 대해 평가한다. 본 실시예에서 사용한 기본 배지는 상기 실시예 6에서 사용한 배지와 동일하다. 각각의 배지 50ml를 250ml들이 플라스크에 가하고 멸균한다. 멸균한 후 멸균한 여과 원액에 염화암모늄을 가하여 암모늄 이온의 양이 0.6g/l내지 0.05g/l가 되도록 한다. 상기 플라스크를 에스. 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 배양물로 접종하고 30℃에서 44시간 일정하게 진탕 배양한다. 이어서 플라스크로부터 시료를 채취하여 배양액 1ml당 세포의 건조 중량을 측정하고 상기 실시예에 기술된 바와 같은 방법으로 배양물의 에스테라제 활성을 측정하는데 단, 반응 배지에는 나트륨 아지드를 사용하지 않는다.
각 발효에 있어서 세포의 건조중량(mg/ml)과 비활성도 및 총활성도 즉, (가수분해된 에스테르몰×10-7)/(배양물/l)(분)은 다음과 같다.
Figure kpo00013
본 실험의 결과로 발효에 있어서 과량의 질소공급원을 공급해주는 것보다는, 충분한 질소 공급원을 공급해 주는 것이 중요한 것임을 알 수 있다.
[실시예 9]
본 실험은 A49492(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 성장 및 효소 생성에 있어서 미량 금속 이온이 미치는 영향을 평가하는 것이다.
Figure kpo00014
인산으로 배지의 pH를 7.0으로 조정하고, 멸균한다음, 글루코즈를 멸균한 후에 첨가한다.
상기의 기본 배지주으이하나를 사용하여 하기표에서 보는 바와 같이 염을 첨가한다. 첨가하는 염의 농도는 mg/l로 나타낸다. 플라스크를 각각의 배지로 채우고 상기 실시예의 방법에 따라 접종하고 48시간 배양한후 시료를 취하여 점적판 방법으로 분석하고, 그 결과를 다음표에 기재하였다. 활성도 자료는 상기 실시예 8에 기술된 바와 같다.
Figure kpo00015
[실시예 10]
본 실험에서, 여러가지의 다른 탄수화물을 배지에 가하여 각종 탄소공급원이 에스테라제 생성에 미치는 영향에 대해서 평가한다. 기본 배지의 조성은 다음과 같다.
L-세린 3g/l CaCO31
MgSO4·7H2O 0.5 재펙무기물 2ml/l
K2HPO42 인산으로 pH 7.0으로 조정
배지에 사용된 탄수화물의 농도는 10g/l로 하기 표와 같다. 상술한 바와 같이 실험을 수행하고, 그 결과는 다음에 기재하였다.
Figure kpo00016
[실시예 11]
본 실험에 있어서, 식용유를 포함하여 수종의 탄수화물이 미치는 영향에 대해 평가한다. 2종류의 기본 배지를 사용하였으며, 배지 조성은 다음과 같다 :
배지 I 배지 II
L-세린 2g/l L-세린2g/l
MgSO4·7H2O 0.5 MgSO4·7H2O 0.5
K2HPO42 K2HPO42
CaCO31 CaCO31
t-15
인산으로 pH 7.0으로 조정
상기 기본 배지 각각에 하기표에 기재된 당 또는 오일중 하나를 가한다. 당은 10g/l의 농도로 가하고, 오일은 3용적%로 가한다.
배지를 상기 실시예에 기술된 바와 같이 멸균하고 접종한후 배양한다. 배양시간은 48시간이다. 오일을 사용한 본 발효에 있어서는 오일상의 잔사 때문에 정확한 건조 세포 중량을 얻기가 불가능하다. 이의 시료에 있어서 건조중량은 오일을 함유한 발효 혼합물의 시료를 원심분리시켜 측정한 고체의 용적%로부터 측정할 수 있다.
실험 결과는 다음과 같다 :
Figure kpo00017
[실시예 12]
내면층 공기 버블러(bubbler)가 부착되어 잇는 5ι들이 교반 발효기를 사용하여 탱크 발효를 수행한다. 사용된 배지의 조성은 다음과 같다 :
NH4CL 0.2g/l KCL 0.2
MgSPO4·7H2O 0.5 CoCl2·6H2O 0.004
K2HO42.0 FeSO4·7H2O 0.004
CaCl2·2H2O 0.2 글루코즈 10
ZnSO4·7H2O 0.016
멸균하기전 인산으로 배지의 pH를 7.0으로 조정하고, 멸균한 후 여과 멸균된 원용액에 글루코즈와 NH4Cl를 가하여 원하는 농도로 만든다. 상기 배지의 3l를 5l의 발효조에 가하고 자동 pH 조정기로 0.5N NH4OH를 가함으로써 pH 6.95로 조정한다. 멸균 공기는 분단 1.5내지 2리터로 공급하고, 거품을 억제시킬 필요가 있을 때마다 소량의 실리콘 소포제를 가한다.
93시간동안 발효시키며, 이동안 가끔씩 300ml의 20% 글루코즈용액과 200ml이 0.5몰 K2HPO4를 가해준다. 발효중 온도는 30℃로 자동저으로 조정된다. 22,45,69 및 93시간에 시료를 취하여 5시간동안 상기 언급한 바와같이 점적판 법으로 분석한다. 분석 결과는 다음과 같다 :
Figure kpo00018
[실시예 13]
본실험에서는 스피지젠(Spizizen)이 염 배지로 알려진 배지를 사용한다. 이 배지의 구성 성분은 다음과 같다 :
K2HPO414g/l 글루코즈 10
KH2PO46 염용액* 1ml/l
구연산나트륨 1 *FeSO4·7H2O 100mg/l
(NH4)2SO42 MnCl2·4H2O 100
MgSO4·7H2O 0.2 ZnSO4·7H2O 100
CaCO32
배지를 담은 플라스크를 제조하고, 멸균한 후 여과-멸균된 원용액으로 글루코즈를 가한다. 이 플라스크를 영양 배양물로 접종하고 30°에서 48시간동안 진탕하여 배양한 후, 상기 실시예에 기술된 바와 같이 5시간동안 점적판 법으로 분석한다. 발효 혼합물중 세포의 건조중량은 3.26mg/ml이고, 비활성도는 (가수분해된 에스테르 6.81×10-10몰/(건조세포 mg)(분) 또는, 가수분해된 에스테르 2.2×10-6몰(발효혼합물 l)(분)이다.
[실시예 14]
본 실험은 실시예 12의 탱크 발효와 유사하게 수행하는데 단, 배지에는 10g/l 대신 15g/l의 글루코즈가 포함되며, 1/1 NH4OH/NaOH(모두 0.5N이다)를 가하여 첨가된 암모늄 이온의 양을 감소시킴으로써 pH를 조정하고, 발효탱크를 영양배양물 대신 에스, 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 사면으로부터 얻어진 포자현탁액으로 접종한다.
다른 관점에서는 실시예 12와 마찬가지로 발효시키고, 71시간동안 발효시킨다. 발효가 종결될 때, 시료를 취하고 점적판 법으로 분석하면 비활성도는 가수분해된 에스테르 6.5×10-10몰/(분)(건조세포 mg)이며, 이는 가수분해된 에스테르 2.6×10-6몰/(분)(발효혼합물 l)에 상당한다.
[실시예 15]
다음 배지를 사용하여 10l 발효를 수행한다 :
NH4CL 0.1g/l KCL 2.0
MgSO4·7H2O 0.5 COCl2·6H2O 0.004
K2HPO42 FeSO4·7H2O 0.04
CaCl2·2H2O 0.2 글루코즈 15
ZnSO4·7H2O 0.16
배지의 pH는 인산을 사용하여 7.0으로 조정하고, 탱크 및 배지를 증기 멸균한후 글루코즈를 가한다. 배지를 에스. 카필리스피라(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)의 영양 배양물로 접종하고 30℃에서 교반하면서 발효를 시작하고, 멸균기류를 분당 내면층 공기유량 2.5리터로 유입시킨다. 발효 혼합물의 pH는 2N 수산화 암모늄을 자동적으로 가하여 7.0으로 조정한다.
67시간후에 각량의 암모니아를 제거하기 위해 공기의 유량을 5l/분으로 바꿔준다, 과량 거품을 방지하기 이해 6ml의 실리콘 소포제가 필요하다.
91.5시간후에 발효 혼합물을 취하여 분석하면 비활성도가 가수분해된 에스태르 7.48×10-10몰/(분)(건조세포 mg)(이는 가수분해된 에스테르 2.5×10-6몰/(분)(발효혼합물 l)에 상당한다)인 건조세포 3.28mg/ml가 함유되어 있는 것을 알 수 있다. 탱크를 97시간후에 수거하여 여과한 후 습식세포(wet cells)510g을 수득한다.
습식세포 8g pH 8에서 2mM K2HPO4로 희석하여 20mι로 만든 다음 균질화하고 초음파로 분쇄한후 원심분리하여 상등액을 얻음 다음, 이를 워버그 및 크리스티안의 자외선 분석방법[Warburg and Christian, Biochem. Z. 384-421 (1942)]에 의해 분석하면 단백질 14.4mg/ml가 함유되어 있고, 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트에 대해 측정한 활성도가 가수분해된 에스테르 2.2×10-5몰/(분)(l)이었다.
습식세포 120g을 pH 8.0에서 2mM K2HPO4로 240ml로 희석하고, 수동식 피스톤 균질기로 균질화한다. 균질물을 7개의 30초 파열의 초음파 에너지를 사용하여, 프로브(probe)-형 초음파 발생기로 음파파괴에 의해 분쇄한다음, 음파파쇄물을 0℃에서 36,000G하에 30분간 원심분리한다. 건조 상등액 200ml도 동결건조하여 3.76g의 건조 효소 제제를 얻는다.
동결건조분말 1g을 pH 8.0에서 2mM K2HPO415ml에 현탁시키고, 상기한 바와 동일한 조건에서 원심분리한다. 상등액 약 14ml를 가교결합된 알릴 덱스트란-메틸렌 비스 아크릴아미드[Sephacryl, Pharmacia Fione chemicals 제품 : Piscataway, Hew, Jersey]의 2.5cm×8cm 칼럼상에서 크로마토그라피한다. 칼럼을, 동결건조된 분말을 현탁시키는데 사용된 동일한 완충제로 용출시키고, 대략 5ml의 분획을 모은다. 용출액200 내지 250ml의 획분에서 에스테라제 활성이 확인되었다. 에스테라제 함유 분획이 단백질 함량은 0.42mg/ml 내지 1.13mg/ml의 범위이며, 활성획분의 에스테라제 활성도는 가수분해된 에스테르 1.1×10-4내지 1.9×10-6몰/(분)(l)의 범위이다.
[실시예 16]
발효 혼합물로부터 여과하여 K2HPO4로 세척한후 동결 건조시킨, 세척한 습식 세포 34g을 해동시키고, 1.5mM 디티오스레이톨을 함유하는 pH 7.0의 1mM K2HPO4완충제로 170ml로 희석한다. 현탁액을 수동식 피스톤 균질기로 균질화한후, 균질물을 0℃, 36,000G에서 20분간 원심분리한다. 상등액 140ml를 단백질에 대해 분석한 결과, 8.1mg/ml가 함유되어 있고, 점적판 법에 의해 측정된 활성도가 가수분해된 에스테르 1.9×10-5몰/(분)(l)인 것으로 밝혀졌다.
효소 용액을 황산암모늄으로 침전시키고, 여기에 황산암모늄 31.2g을 가한다음 교반시켜 용해시키고 0℃, 36,000G에서 20분간 원심분리함으로써 더 정제한다. 원심분리에서 얻어진 펠렛을 버리고, 상등액에 황산암모늄 30.6g을 더 가한다음, 현탁액을 상술한 바와 같이 원심분리한다.
제2차 원심분리에서 얻은 펠렛을 상기에서 사용한 동일한 완충제 30ml에 용해시키고, 용액을 pH 7.2의 1mM K2HPO44l씩에 대해 2회 투석한다. 이 용액에는 단백질 7.5mg/ml가 함유되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이를 더 투석하여 용적이 65ml인 용액을 수득하고 동결시켜 저장한다.
약 2mg/ml의 메틸 7-아미노(페닐)아세트아미도-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트(메틸 세팔렉신)을 함유한 기질용액을 pH 7.2에서 물에서 제조한다. 이 용액 1.25ml를 상기의 정제된 효소용액 3ml 및 0.5MK2HPO4완충제 0.75ml와 혼합하여 pH 7.2에서 단백질 농도가 4.5mg/ml인 용액을 제조한다. 이 혼합물을 30℃에서 4시간동안 진탕한후, 자르시나 루테아(Sarcina lutea)로 접종된 영양한천 판상에서 크로마토그램을 중첩시키면서 종이크로마토그라피로 분석한다. 이 플레이트 위에서는 거대한 억제대가 관찰되는데, 이는 세팔렉신 에스테르가 탈에스테르화되어 항생제 세팔렉신이 수득되는 것을 나타낸다.
[실시예 17]
본 실험에서는 실시예 16의 효소제제를 사용하여 메틸세파렉신을 탈에스테르화하고, pH-고정 적정에 의해 가수분해 속도르 측정한다. 1ml의 효소제제와 2ml의 기질용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 16에서와 같이 반응을 수행하여 최종 반응혼합물이 2.5mg/ml의 단백질을 함유하도록 반응혼합물을 제조한다.
반응은 pH 7 및 pH 8에서 수행한다. pH 7에서 탈에스테르와 속도는 반응혼합물 4.0×10-6몰/(분)(l)이고, pH 8에서의 속도는 1.36×10-5몰/(분)(l)이다.
[실시예 18]
단백질 0.66mg/ml를 함유하며, 실시예 15에서 제조된 정제효소제제를 사용하여 메틸 7-아미노(페닐)아세트아미도-3-클로로-3-세펨-4-카복시레이트(메틸 세파클로르)를 탈에스테르화한다. 반응혼합물은 효소 제제 0.5ml, 물 1.25ml 및 메틸 세프클로르 10mg/ml의 용액 0.25ml로 이루어진다. 반응은 pH8 및 24℃에서 10분간 이루어진다. pH-고정 적정으로 측정한 결과, 반응속도는 가수분해된 에스테르 5.8×10-5몰/반응 혼합물(l)(분)으로 나타났다.
[실시예 19]
상기 실시예 15에 기술된 바와 같이 세파크릴 칼럼상에서 정제한, 단백질 1.27mg/ml를 함유하는 효소제제를 사용하여 15° 내지 35℃의 여러 온도에서 효소에 의한 메틸 7-아미노-3-메틸-3-세펨-4-카복실레이트의 탈에스테르와 속도를 측정한다. 반응 혼합물은 효소용액 0.4ml, 물 0.6ml 및 기질 20mg/ml의 용액 1ml로 이루어진다. 반응 혼합물의 pH는 8.0이다.
반응은 자동적정기 상에서 행하고, 효소부재시에는 가수분해 속도에 대해 적절히 보정해주며, 최고의 반응속도는 30℃에서 가수분해된 에스테르 1.9×10-5몰/(분)(반응혼합물 l)이다. 최저 반응속도는 15℃에서 1.0×10-5몰/(분)(l)이다. 35℃에서는 효소가 불안정하며, 탈에스테르화 속도를 측정할 수 없는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 20]
다음 실험은 본 발명의 에스테라제를 고정화하는 가능성에 대해 평가하는 것이다. 효소용액을 실시예15와 같은 방법으로 세파크릴 정제법으로 제조하고, 효소용액에는 활성도가(가수분해된 에스테르 3.5×10-4몰)/(분)(l)인 단백질 0.75mg/ml이 함유되어 있다. 이 제제 30ml를 아미콘(Amicon: Lexington, Mass.)PM 30막을 사용하여 562g/cm2의 질소압을 효소쪽에 가해주면서 한외여과한다. 한외여과함에 따라 총 315ml의 액체가 모아질 때가지 필요한만큼 물을 부가적으로 가한다. 투석된 효소의 최종 부피는 30ml로, 활성도가 (가수분해된 에스테르 7.2×10-5몰)/(분)(l)인 0.34mg/ml의 단백질을 함유하고 있다.
다음의 효소지지체를 사용하여 효소를 고정화한다:
1) DEAE-세파덱스(디에틸아미노에틸 약염기성 이온교환수지, Pharmacia Fine Chemicals 제품)
2) DEAE-세파셀(디에틸아미노에틸 셀룰로즈 비드 이온교환수지, Pharmacia Fine Chemicals 제품)
3) DEAE-셀룰로즈[Sigma Chenmical사 제품, St. Louis, Mo.]
4) 셀렉스-CM[Bio-Rad Laboratories, Richmond, Cal.]
5) 벤토나이트
6) DEAE-셀룰로즈 비즈(Tsao와 Chen에 의한 미합중국 특허 제4,063,017호)
상기 지지체 각각 1.5mg(건조중량)을 pH 8의 K2HPO4완충제로 세척한 다음, 물로 세척하여 3.53ml의 효소제제와 혼합한후, 지지체와 합하기 전에 pH를 8.0으로 조정한다. 혼합물은 4℃에서 28시간동안 온화하게 교반한다.
각 지지체-효소계를 pH7.0의 K2HPO4완충제로 세척하여 지지체상에 고정화되지않는 효소를 제거하고, 세액과 세축된 지지효소를 메틸 7-아미노-3-메틸-4-카복실레이트와 반응시켜 담체상에 고정화된 효소의 양을 측정한다. 다음 분석치는 고정화되는 효소 활성도를 나타낸다 :
1) 24% 4) 8%
2) 33% 5) 6%
3) 34% 6) 40%
고정화된 효소제제를 40℃로 유지하고, 자주 분석하여 효소의 반감기를 측정한다. 수득된 결과는 다음과 같다 :
지지되지 않는 효소 5분
1) 4분 4) 저활성도에 의해 측정불가
2) 3.5분 5) 저활성도에 의해 측정불가
3) 5.5분 6) 13분

Claims (13)

  1. 일반식(I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를, 효소 생성 조건하에 스트렙토마이세스 카필리스피라(Streptomyces capillispira)(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)를 배양하여 생성된 효소와 접촉시킴을 특징으로 하여, 일반식(I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를 탈에스테르화시키는 방법
    Figure kpo00019
    상기식에서 R은 수소 또는 R3CH(NH2)CO-이고 ; R1은 메틸, 클로로, 아세톡시메틸, 메톡시, 메톡시메틸, 아미노카보닐옥시메틸, 메틸티아디아졸릴티오메틸 또는 메틸테트라졸리티오메틸이며 ; R2는 수소 또는 메톡시이고 ; R3는 페닐, 사이클로헥사디에닐, 하이드록시에 의해 일-치환된 사이클로헥사디에닐, 또는 할로, 하이드록시, (C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시에 의해 일-또는 이-치환된 페닐이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 메틸 또는 클로로인 방법.
  3. 제1항에 있어서, R2가 수소인 방법.
  4. 제1항에 있어서, R이 수소인 방법.
  5. 제1항에 있어서, R이 R3CH(NH2)CO-이고 , R3가 페닐인 방법.
  6. 제1항 내지 5항중의 어느 하나에 있어서, 온도가 약 15 내지 45℃인 방법.
  7. 제6항에 있어서, pH가 약 7 내지 약 9인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 메틸 에스테르의 농도가 약 1 내지 10mg/ml인 방법.
  9. 스트렙토마이세스 카필리스피라 균주(기탁번호 : 811126-00312, 기탁기관 : 한국과학기술원, 기탁일 : 1981.11.26)를 효소 생성 조건하에서 배양시킴을 특징으로 하여, 일반식 (I)의 세팔로스포린 메틸 에스테르를 탈에스테르화시키는 효소를 생성시키는 방법.
    Figure kpo00020
    상기식에서 R은 수소 또는 R3CH(NH2)CO-이고 ; R1은 메틸, 클로로, 아세톡시메틸, 메톡시, 메톡시메틸, 아미노카보닐옥시메틸, 메틸 티아디아졸릴티오메틸 또는 메틸테트라졸리티오 메틸이며 ; R2는 수소 또는 메톡시이고 ; R3는 페닐, 사이클로헥사디에닐, 하이드록시에 의해 일-치환된 사이클로헥사디에닐, 또는 할로, 하이드록시, (C1-C3)알킬 또는 (C1-C3)알콕시에 의해 일-또는 이-치환된 페닐이다.
  10. 제9항에 있어서, 배양을 약 25 내지 40℃의 온도에서 행하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 배양을 약 6내지 8의 pH에서 행하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 배지에 암모늄 이온이 함유된 방법.
  13. 제12항에 있어서, 수산화암모늄을 조절하여 가함으로써, 배지의 pH를 약 6.5 내지 7.5로 유지시키는 방법.
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