HU188709B - Process for the enzymatic deest rification of cephalosporin methyl esters - Google Patents

Process for the enzymatic deest rification of cephalosporin methyl esters Download PDF

Info

Publication number
HU188709B
HU188709B HU813346A HU334681A HU188709B HU 188709 B HU188709 B HU 188709B HU 813346 A HU813346 A HU 813346A HU 334681 A HU334681 A HU 334681A HU 188709 B HU188709 B HU 188709B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
enzyme
medium
culture
solution
liter
Prior art date
Application number
HU813346A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard J Abbott
Dennis Berry
Original Assignee
Eli Lilly And Co,Us
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co,Us filed Critical Eli Lilly And Co,Us
Publication of HU188709B publication Critical patent/HU188709B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás fermentációs úton nyert enzimmel cefalosporin-metil-észterek észterhasítására.
Több enzimet találtak alkalmasnak szerves vegyületek szintézisére vagy hasítására. így például a 5 3 749 641 számú amerikai [Takeda Chemical Industries] szabadalmi leírásban arról olvashatunk, hogy nagyszámú mikroorganizmusból nyert enzimekkel lehetséges cefalosporin-származékok észterhasitása és acilhasítása. Az eszterázok irodalmát 1 θ Myers és Hofstee foglalja össze [The Enzymes, Boyer, Lardy és Myrback szerkesztésében, 4. kötet, 28-29. fejezet, Academic Press (1960)].
A találmány további tárgya új enzim előállítása Streptomyces capillispira A49492 mikroorganizmussal. Az enzim megfelelő tenyésztési körülmények között keletkezik. A találmány szerinti enzimmel az (I) általános képletű cefalosporin-metilésztereket észterhasithatjuk, ahol az általános képletben : 20
R hidrogénatom, fenil-glicil- vagy p-hidroxifenil-glicil-csoport; és
R1 metilcsoport vagy klóratom.
Az észterhasítást követően a megfelelő karbonsavak keletkeznek.
A találmány tárgya eljárás a fenti általános képletű cefalosporin-metilészterek észterhasítására.
A találmány szerint úgy járunk el, hogy a meíi'észtert a Streptomyces capillispira tenyésztésekor ka- 3Q pott enzimmel hozzuk érintkezésbe.
A leírás során az összes hőmérsékletet Celsius fokban adjuk meg.
A találmány szerinti eljárás során használt enzimet termelő mikroorganizmus új faj, neve: Strepto- 35 myces capillispira, sorszáma: A49492. A mikroorganizmust biológiailag tiszta tenyészet alakjában egy olyan földmintából izoláltuk, amit Svédországban gyűjtöttünk. A mikroorganizmust a Northern Régiónál Research Laboratory, Agricultural Rese- 40 arch Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois törzsgyüjteményébe letétbe helyeztük, ahol az NRLL 12279 sorszámot kapta.
Az A49492 számú törzset az International Slreptomyces Project (ISP) javaslatai alapján jellemez- 45 tűk [Shirling és Gottlieb, Int. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-40., (1966)]. Bizonyos kiegészítő vizsgálatokat is végeztünk.
A sejtfal analízisét olyan tenyészettel végeztük, amely 24 órán át 30, °C hőmérsékleten növekedett 50 élesztő -malátakivonat-levesen (ISP no. 2) [Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (3), 313-340(1966)]. A micéliumokat centrifugálással összegyűjtöttük és háromszor desztillált vízzel mostuk. A mosott sejteket fagyasztva szárítottuk, a sejtfalban lévő cukrokat 55 Lechavaliert módszere szerint határoztuk meg [Chemical Methods as Criteria fór the Separation of Actinomyces intő Genera, Workshop sponsored by the subcommittee on Actinomyces of the American Society fór Microbiology, T. G. Pridham, Con- 60 vener, beid al the Inslilute opf Microbiology, Rutgers Univ., The State Unive. of New Jersey, New Brunswick, New Jersey (1971)]. A diamino-pimelinsav izomereket Becker és munkatársai szerint határoztuk meg [Appl. Microbiol., 12, 421 -423.
(1964)]. Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg.
A növekedés pH-optimumának meghatározására 0,05 mólos puffereket használtunk ISP no. 2. agarlemezeken: citromsav, pH 3,4, 5; 2-morfolinoetán-szulfonsav, pH 6; 3-morfolino-propán-szulfonsav, pH 7; N-trisz-(hidroxi-metil)-metil-glicin, pH 8; 2-cikIohexil-amino-etánszulfonsav, pH 8,5, 9,0, 9,5; 3-ciklohexil-amino-propán-szulfonsav, pH 10, 10,5. Az agarlemezek pH-értékeit lapos felületi elektróddal határoztuk meg oltás előtt.
A szénforrás-hasznositást ISP no. 9. alap-táptalajon vizsgáltuk, a táptalajokhoz szűrővel sterilizált szénforrást adtunk, minden esetben 1,0 %-os végkoncentrációban. A lemezeket 30 °C-on inkubáltuk és 14 nap után olvastuk le az eredményeket.
A melanoid-tipusú színanyag termelését ISP no.
1. levesen (tripton-élesztőkivonat), ISP. no. 6. agaron (pepton-élesztőkivonat és vas), ISP no. 7. agaron (tirozin) és módosított (tirozin nélküli) ISP no. 7. agaron vizsgáltuk.
A keményítő hidrolízisét ISP 4 agarlemezeken (szervetlen só - keményítő, ahogy azt Blazevic és Ederer leírja a Principles of Biochemical Tests In Diagnoslic Microbiology, John Wiley és Sons, New York, 1975 irodalmi helyen) határoztuk meg, jóddal.
A lizozimmal szembeni rezisztenciát és a kazein, eszkulin, hipoxantin, tirozin és xantin bontását Berd módszere szerint vizsgáltuk [Appl. Microbiol., 25, 665-81 (1973)].
A nátrium-klorid és a szacharóz-toleranciát ISP
2. agaron határoztuk meg. Az antibiotikumokkal szembeni érzékenységet olyan ISP 2. agarlemezeken mértük, amelyekre antibiotikum-tartalmú korongokat helyeztünk és amelyet 2 % vegetatív inokulummal oltottunk be.
A kataláz-, foszfatáz- és ureáz-analízist Blazevic és Ederer módszere szerint (lásd fentebb) végeztük.
A színek neveit az ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard mintaszám 2106 [National Bureau of Standards (1958)] szerint határoztuk meg.
Az A49402 jól fejlett, felcsavarodott légmicéliumokat fejleszt, így a Spirales-szekcióba sorolható Pridham és munkatársai szerint [Appl. Microbiol., 6, 52- 79 (1978)]. Ezt a morfológiát az összes olyan táptalajon megfigyeltük, amely lehetővé teszi a Iégmicéliumok fejlődését. Zabliszt-agaron (ISP 3.), ISP 7. agaron, paradicsom-paszta-zabliszt-agaron és csapvíz-agaron a spirális morfológia kitűnően megfigyelhető. A spirálisok egyszerűek, nyitottak, laza, kél vagy három fordulatból álló gördület látható. A spóratartók 10-50 spórából álló láncot hordoznak. A spórák alakja oválistól gömbszerüig változik, az elektromikroszkópos vizsgálatok szerint, a spórák mérete: 0,96 x 0,54 - 1,19 x0,71 pm. Az átlagos nagyság: 1,05 x 0,62 pm. A spórák felületének szerkezete szőrös. ISP no. 2. agaron korémia figyelhető meg.
A légmicéliumok a szürke színű sorozatba tartoznak Tresmer és Backus szerint [Appl. Microbiol., 11, 335-38. (1963)]. A szín általánosan barnásszürke. Az A49492 törzs nem-fragmentáló szubszlrátumot vagy primer micéliumot fejleszt;
188 709 ennek színe sárga-barnától barnás-feketéig változik, függően attól, hogy a törzs milyen táptalajon növekszik. Esetenként barna színű, oldódó színanyag jelenik meg. A tenyészet melanoid színanyagokat nem termel.
Az A49492 élettani tulajdonságait az alábbiakban írjuk le. A tenyészetben kataláz, foszfatáz és ureáz mutatható ki, a kazein, a hipoxantin, a tirozin és a xantin bomlik. A tenyészet nem folyósítja el a zselatint, a keményítőt hidrolizálja, a nitrátot 10 redukálja, a tejet peptonizálja, a lizozimnak ellenáll és az eszkulint bontja. A tenyészet az acetátot, a D-arabinózt, a melibiózt, a raffinózt, a szalícint és a szacharózt nem hasznosítja. Az A49492 növekedése 10 °C és 45 °C között megfigyelhető, az opli- 15 malis növekedési hőmérséklet 30 °C. Az A49492 6 és 9,5 közötti pH-értéken 6 % nátrium-kloridot és % szacharózt képes tolerálni. ________
A papírkromatográfiával végzett sejtfal-analízis szerint a sejtfal hidrolizátuma diamino-pimelinsa5 val tartalmaz. Mezo-izomer nem volt kimutatható. A cukor-meghatározás szerint a sejtfal hidrolizátumában csak glükóz és ribóz van jelen. A fenti információk alapján a törzs I típusú sejtfallal és C-tipusú cukorképpel rendelkezik [lásd Bergey’s, Manual of Determinative Bacteriology, Buchanan és Gibbons kiadása, 8. kiadás, 658. oldal; The Williams and Wilkins Co., Baltimore (1974)]. Az A49492 morfológiai és kémiai jellemzői szerint tipikusan Streptomyces genusba tartozó mikroorganizmus.
Az alábbi táblázatban összefoglaljuk az A49492 tenyésztési sajátságait.
I. táblázat
Táptalaj Növekedés Hátoldal1 Lég- micélium Oldódó színanyag
ISP 2 jó 77. m. yBr gyenge: 631. brGy nincs
ISP 3 megfelelő 63. 1. br Gy jó: 22. Rgy nincs
ISP 4 jó 91. d. gy. Y jó: 63.1. brGy nincs
ISP 5 bőséges 61. gyBr bőséges: 63. 1. brGy világosszürke
ISP 7 bőséges 59. d. Br bőséges: 10. pkGy szürkésbarna
Bennett jó 72. d. OY nincs nincs
kalciutn-malát jó 62. d. gy. Br nyomok barna
Czapek bőséges 47. d. gy. rBr bőséges: 264. 1. Gy barna
glükóz-aszparagin jó 95. m. 01 Br nyomok nincs
TPO3 bőséges 65. br fekete bőséges 63. 1. BrGy sötétbarna
csapvíz-agar gyenge tiszta gyenge nincs
1. Meghatározás: Color Harmony Manual 4. kiadás Container Corp. of America, Chicago
2. Meghatározás: Prauser, H.; Zeitschrift f. Alig. Mikrobiologie 4 95-98 (1964)
3. 20 g/1 paradicsompüré 20 g/1 zabliszt g/1 agar
188 709
IV. táblázat
A következő táblázatban megadjuk az A49492 jelű mikroorganizmus növekedését különböző szénforrásokon. A táblázatban a + jel azt jelenti, hogy a szénhidrátot a sejtek felhasználják, a - jel pedig azt, hogy nem. A ? azt jelenti, hogy a hasznosítás kérdéses.
II. táblázat
acetát __ D-maltöz +
D-arabinóz - D-mannit +
L-arabinóz 4 melibióz —
cellobióz 4 raffinóz -
citrát + ramnóz +
D-fruktóz + D-ribóz +
D-galaktóz + szalicin 7
D-glükóz + szacharóz -
i-inozit + D-xilóz +
A következő táblázatban megadjuk az A49492 törzs érzékenységét különböző antibiotikumokkal szemben. A mérést korongérzékenységi vizsgálattal végeztük. A táblázatban a + jelek azt jelentik, hogy gátlási zóna volt megfigyelhető, a - jel pedig azt, hogy ilyen gátlási zónát nem láttunk. A táblázatban az összeg feliratú oszlopban az egyes korongokon lévő antibiotikum mennyiségét adjuk meg.
III. táblázat
Anti- biotikum Típus Összeg Ered- mény
eritromicin makrolid 15 gg _
keflin béta-laktám 30 gg -
linkomicin linkóz- aminid 2 pg —
misztatin polién 100 egység -
polimixin B peptid 300 egység -
sztrepto- micin amino- glükozid 10 Pg 4
tetraciklin perhidro- naftacén 30 mg 4
vankomicin glikopeptid 5 pg +
A következő táblázatban megadjuk a Streptomyces capillispira A49492 mikroorganizmus többi tulajdonságát.
Hőmérséklet-érték 10-45 ’C
pH-érték 6-9,5
nátrium-klorid-tolerancia 6 %
szacharóz-tolerancia 35 %
kataláz 4
foszfatáz +
ureáz +
nitrát-reduktáz -
zselatin-elfolyósítás - .
melanoid-színanyagok —
fölözött tej (részlegesen használja)
keményítő-hidrolízis —
lizozim-rezisztencia —
kazein-bontás +
eszkulin-bontás
hipoxantin-bontás +
tirozin-bontás +
xantin-bontás +
+ = pozitív reakció. — = negatív reakció.
Az A49492 akkor termeli a találmány szerinti
enzimet, ha azt megfelelő, az enzim termelésének kedvező körülménye között tenyésztjük. Ahogy azt az előzőekben megadtuk, a mikroorganizmus több szénforrást képes hasznosítani, és az enzim, ahogy az várható is, több komplex és meghatározott táp35 talajon való tenyésztéskor bioszintetizálódik. Az alábbi példákban több, sikeresen használt táptalajt sorolunk fel.
Szénhidrát-forrásként felhasználhatunk például 4Q invert cukrot, kukoricaszirupot, glükózt, fruktózt, maltózt, keményítőt és más vegyületeket.
Nitrogénforrásként például peptonokat, szójalisztet, aminosav-keverékeket használhatunk. A nyomelemek forrásaként felhasználhatjuk a kö45 zönséges oldódó szervetlen sókat, például a vas-, nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, klorid-, karbonát- és hasonló ionokra disszociáló sókat.
Úgy találtuk, hogy a mikroorganizmus akkor 50 szintetizálja legnagyobb mennyiségben az enzimet, ha meghatározott összetételű táptalajon növesztjük. A megfelelő enzimtermeléshez a nitrogénforrás minőségét és mennyiségét meghatározott határok között kell megválasztanunk. Úgy találtuk, hogy· 55 aminosavakat, például prolint, szerint, glicint és másokat használhatunk; de az ammónium-ionok előnyösebb nitrogénforrást képviselnek. Úgy látszik, hogy fölös mennyiségben jelenlévő nitrogénforrás, ha egyáltalán ilyen körülmények között ke60 letkezik is, gátolja az enzim termelését. így előnyös, ha a táptalajhoz a növekedés előrehaladtával folyamatosan adagoljuk a nitrogén forrást, amikor az soha sincs fölös mennyiségben jelen.
188 709
A táptalaj pH-ját 6 és 8 között, előnyösen 6,5 és
7,5 között, még előnyösebben 6,9 és 7,1 között kell tartanunk. Úgy találtuk, hogy a növekedés előrehaladtával a tenyészet pH-ja általában csökken; így a pH-t bázis adagolásával növelnünk kell. A pH adott szinten tartását előnyösen automatikus szabályozásával biztosítjuk. Különösen előnyös eljárást jelent az, ha a pH beállítását nitrogénforrás adagolásával kötjük egybe oly módon, hogy a pH-t ammónium-hidroxid-oldattal szabályozzuk.
Az A49492 jelű mikroorganizmus növekedéséhez levegőt igényel. Előnyösen úgy járunk el, hogy kisméretű tenyészeteket rázott lombikban levegőztetünk, nagy méretekben pedig süllyesztett, levegőztetett tenyésztést alkalmazunk. A mikroorganizmus természetesen bő ferde-agarokon és agarlemezeken is.
Lehetséges a főfermentációt közvetlenül spóraszuszpenzióval oltanunk; előnyösen azonban vegetatív inokulumot használunk. A vegetatív inokolum előállítására kismennyiségű táptalajt oltunk a mikroorganizmus spóráival vagy micélium fragmenseivel, amikor aktívan növekvő tenyészetet kapunk. A vegetatív inokulumot használjuk azután a nagytérfogatú fermentációs táptalaj oltására.
Az A49492 jelű mikroorganizmus 25 °C és 40 °C között jól növekszik. Előnyös azonban, hogy a mikroorganizmust 30 °C és 37 'C között tenyésztjük.
Az A49492 tenyészetben az enzim különböző időpontokban jelenik meg, általában azonban a
2—7. nap között mérhetünk jó enzimtermelést. Használhatunk hosszabb fermentációs időt is, a szükségtelennél hosszabb növesztési periódusokkor azonban gyakran csökken az enzim hozama.
Ha az enzimet az A49492 törzs tenyésztésével állítottuk elő, úgy járhatunk el, hogy az átalakítandó szubsztrátot hozzáadjuk a fermentléhez; eljárhatunk azonban oly módon is, hogy az enzimet elkülönítjük és tisztítjuk, majd ezután használjuk fel. Az alábbi példákban szemléltetjük azt az eljárást, amikor a szubsztrátot egyszerűen hozzáadjuk a fermentléhez.
A találmány egy másik előnyös kivitelezési változata szerint, gyakran hatásosabb, ha az enzimet elkülönítjük a tenyészetből és részlegesen tisztított alakban használjuk. Az enzim a fértmentlében a sejtekkel együtt van jelen. Ily módon a tenyészetből el kell különítenünk a sejteket, és a sejtekből az enzimet. A sejtek feltárását homogenizálással, ultrahangos kezeléssel, a sejtek lizozimes lízisével, fagyasztással és a fagyasztott massza roncsolásával érjük el. A sejtek feltárásához előnyösen ultrahangos kezelést használunk. Az enzimet a feltárt sejtekből úgy izoláljuk, hogy a sejthomogenizátumot semleges vagy közel semleges pufferben szuszpendáljuk, a szuszpenziót szűrjük vagy centrifugáljuk a sejttörmelékek eltávolítására. A kapott enzim-oldatot felhasználhatjuk a találmány szerinti eljárás során, de tovább tisztíthatjuk vagy töményithetjük.
Az enzim tisztítására az enzimet tartalmazó oldatot oszlop-kromatográfiásan kezeljük, ekkor a különböző, oldatban lévő fehérjék elkülönülnek. A tisztított enzimet tovább töményítheljük, ha ez szükséges, például ultraszűréssel.
Az enzim magasabb hőmérsékleten gyorsan bomlik, így előnyösen viszonylag alacsony hőmérsékleten, példáyl 0 °C-on tároljuk.
A találmány szerinti eljárás reakciójának analízisét bioautográfiával követjük, végezhetünk papirvagy vékpnyréteg-kromatográfiát is. A vizsgálat során felhasználjuk azt a tényt, hogy a szubsztrátészterek viszonylag inaktív antibiotikumok, míg a találmány szerinti eljárás során keletkező cefaktsporin-savak aktívak. Például úgy járunk el, hogy a reakcióelegyet vékonyréteg-kromatográfiás lemezen vagy szűrőpapíron futtatjuk, a futtatást megfelelő oldószerrel végezve. Ezután megfelelő mikroorganizmussal beoltott agar-tartalmú táptalajra helyezzük a kromatogramot. A kt-omatogramon lévő cefalosporinsav mennyiségét az adott kísérletben szintén vizsgált, hasonló cefalosporin ismert mennyisége által kapott gátlási zónákkal való öszszehasonlítás alapján becsüljük. Ha a szubsztrát vegyület cefalosporin-nukleusz, ahol R hidrogénatom, úgy a termékként képződött savat analízis előtt acileznünk kell. Ezt a cefalosporin-technológiában jártas szakemberek megértik.
Ilyen analitikai módszereket használunk az enzim oldatok vizsgálatára, amelyeket elkülönítés, tisztítás és töményítés során nyerünk.
Az enzimet a találmány szerinti eljárás értelmében úgy használjuk, hogy a szubsztrát vegyületet érintkezésbe hozzuk vele. Előnyös és gazdaságos, ha az enzimes reakciót vizes reakcióelegyben végezzük. Mivel az enzimet nem izoláljuk tiszta alakban, nem tudjuk megadni bizonyos mennyiségű szubsztrát vegyület észter-hasításához szükséges enzim mennyiségét. Az alábbiakban ismertetett példákban bemutatjuk azt a módszert, amellyel az enzimet tartalmazó oldatok aktivitása mérhető. A vizsgáló mérheti az enzim aktivitását a megadott standard mérési körülmények között, és kiszámíthatja az adott mennyiségű szubsztrát adott idő alatt való észter-hasításához szükséges enzim-oldat mennyiségét.
Az enzim újra-felhasználhatóságának és stabilitásának növelése érdekében előnyös, ha az enzimet megfelelő módszerekkel szilárd fázishoz kötjük. Az enzimek szilárd fázishoz való kötése ismeretes a szakemberek körében, általánosan használt módszerek alkalmazhatok az A49492 jelű törzzsel előállított enzim kapcsán is. Előnyösen úgy kötjük az enzimet szilárd fázishoz, hogy dietil-amino-etilcellulózhoz kötjük ionosán. Ezt a polimert a DEAE Sephacel állítja elő [Pharmacia Fine Chemicals Corp., Piscataway, New Jersey]. A DEAE-cellulózhoz való ionos kötéssel végzett immobilizáció további előnyös módszereit Tsao és Chen írja le a 4 063 017. sorszámú amerikai szabadalmi leírásban.
A szilárd fázishoz kötött enzimet hatékonyan érintkezésbe hozzuk a szubsztráttal, vagy kromatografáló oszlopban, vagy tartályban, ahol keverjük a szuszpenziót. Ha oszlopot használunk, úgy
188 709 azt megtöltjük a szilárd fázishoz kötött enzimmel, és a szubsztrát vizes oldatát vagy szuszpenzióját vezetjük át. Ha kevert tartályt használunk, úgy azt folyamatosan vagy szakaszonként használhatjuk, a gyakorlatból ismert módon.
Amikor a szubsztrát vegyület érintkezésbe kerül az enzimmel, a szilárd fázishoz kötötten, vagy a nem-kötött enzimmel, megfelelő idő eltelte után megkapjuk a cefalosporinsavat. A savat ismert, szerves kémiai módszerekkel izoláljuk. Eljárhatunk például oly módon, hogy a terméket megfelelő sóvá alakítjuk, előnyösen terápiásán használható nátrium- vagy káliumsóvá, majd a vizet desztillációval eltávolítva, izoláljuk a terméket. A desztillációt csökkentett nyomású térben, és közepes hőmérséklet-tartományban végezzük.
Úgy találtuk, hogy az észter-hasítási reakciót 7 és 9 pH-értéken, előnyösebben 7,5 és 8,5 közötti pH-η végezhetjük. A reakció optimális hőmérséklete 25 ’C és 30 ’C közé esik, alkalmazhatunk azonban 15 ’C és 45 °C közötti hőmérsékletű reakcióelegyet is. Ahogy azt az előzőekben ismertettük, az enzim magasabb hőmérsékleteken nem különösebben stabil, így a fentiekben megadott hőmérsékleteken célszerű dolgoznunk. Az enzim Kn-értéke 2,3 mg/ml, a 7-ainino-3-metil-3-cefém-4-karboxiIál esetében; a szubsztrát koncentrációja a reakcióelegyben 1 mg és 10 mg/ml közé keli, hogy essen.
Ügy találtuk, hogy az enzimet részlegesen tisztított alakban, fagyasztva vagy fagyasztva szárítva hosszú időn át tárolhatjuk. A fermentlevei, amelyben az enzimet előállítottuk, és a fermentléből izolált sejteket fagyasztva tárolhatjuk.
Az alábbi példákban szemléltetjük az enzim előállítását S. capillispira mikroorganizmus fermentációjával, az enzim izolálását és tisztítását, továbbá az enzimmel végzett észter-hasítási reakciókat. A szubsztrátok és az észter-hasítási reakciók termékei ismert vegyületek, a termékek azonosításának bizonyítására szolgáló analitikai módszereket így nem részletezzük. Ehelyett olyan analitikai módszerekkel mértük az észter-hasítási reakció lefolyását, amely lehetővé tette a reakcióelegyben lévő sav mennyiségének meghatározását. Egyes esetekben az analitikai módszer biológiai, más esetben kémiai titrálás végeztünk. A'termék képződését ezen kívül autentikus cefalosporinsavakkal való kromatográfiás, összehasonlítással is bizonyítottuk.
Általában szűrőpapírral kivitelezett kromatográfiai végeztünk, oldószer-elegyként acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyét használva. Amikor a kromatográfia befejeződött, a papírlapot érzékeny mikroorganizmussal, általában Bacillus subtilisszel beoltott agar-lemezre helyeztük, majd a jelenlévő aktív antibiotikum-sav mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a gátlási zóna nagyságát összehasonlítottuk hasonló rendszerben futtatott, ismert mennyiségű antibiotikum által okozott gátlási zóna nagyságával.
Ha szubsztrát-észterként a 7-es helyzetben csak egy arninocsoportot tartalmazó cefalosporinésztert használtunk, úgy a keletkező sav mennyisége közvetlenül nem volt mérhető, mivel az alapsav 6 nem aktív a teszt-organizmussal szemben. Ilyen esetekben egy acilezési reakciót végeztünk oly módon, hogy a futtatott kromatogramot acilezőszerrel permeteztük be. Acilezőszerként általában híg fenoxi-acetil-klorid-oldatot használtunk; ez az inaktív alapvegyületet aktív vegyületté alakítja át.
Egy másik kimutatási módszer, az úgynevezett korong-módszer szerint eljárva, úgy végeztünk méréseket, hogy meghatározott mennyiségű, általában 10 μϊ analizálandó mintát pipettáztunk olyan szürőpapír-csíkra, amely lakkréteggel körülrajzolt zónákat tartalmazott; így a zónákba csepegtetett folyadékok egymástól elkülönültek. Ha a szubsztrát vegyület alap-észter, úgy acilezésre volt szükség. Az acilezési reakciót úgy végeztük, hogy a zónákba 10 μϊ, 2 %-os nátrium-bikarbonát-oldatot és 20 1,
2,5 %-os, petroléterrel készített fenoxi-acetil-klorid-oldatot csepegtettünk. Levegővel szárítottuk a korongokat, és a papírcsíkot B. subtilis mikroorganizmus spóra szuszpenziójával beoltott agar-mérőiemezre helyeztük. 45 percen át az agaron hagytuk a csíkokat, majd eltávolítottuk, és az agar-tenyészetet 25 ’C hőmérsékleten inkubáltuk egy éjszakán át. Ezután mértük a gátlási zónák nagyságát, és a mintában lévő cefalosporinsav mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy észter-hasitási reakcióból származó cefalosporinsav ismert mennyisége áltállétrehozott gátlási zónák nagyságával hasonlítottuk össze.
A fenti biológiai analitikai módszereket felhasz- Hálhatjuk nem-tisztított fermentációs elegyek és tisztított enzimkészítmények mérésére is. A tisztított készítményeket könnyen analizálhatjuk titrálással is, a titrálás során mérjük a jelenlevő sav mennyiségét. A mérést úgy végezzük, hogy meghatározzuk annak a bázisnak a mennyiségét, amely szükséges ahhoz, hogy a reakció során a reakcióelegy pH-ja állandó maradjon. így az észter-hasítási reakciót könnyen követhetjük például automatikus titrálóval. Úgy járunk el, hogy az enzim-készítményt megfelelő szubsztrát oldathoz adjuk, majd az észter-hasítási reakció követését úgy oldjuk meg, hogy automata titráló által a mintához adott bázis mennyiségét meghatározzuk.
Az enzim-készítmények aktivitását az alábbi példákban bizonyos meghatározás alapján adjuk meg; ez a következő:
az észter-hasított szubsztrátok móljainak száma/ mg fehérje vagy sejt x perc.
Egyes esetekben az enzim aktivitását más módon írjuk le, ebben az esetben ezt részletesen magyarázzuk.
Az enzim aktivitásának meghatározásához használt szubsztrát a metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 eefém - 4 - karboxilát, kivéve, ha másként adjuk meg.
A szubsztrát észterek alkalikus körülmények között hidrolízissel spontán deésztereződnek.
így nagyon fontos, hogy az enzim-készítmény aktivitásának mérésekor elkerüljük az alkalikus körülményeket, vagy figyelembe vegyük a nemznzimatikus hidrolízis mértékét.
Az alábbi példák során általában kálium-hidro-61
188 709 gén-foszfút-puffereket használunk. Ezeknek a puffereknek bizonyos pH-értékük van. A puffereket úgy állítjuk elő, hogy kálium-dihidrogén-foszfátoldatokat készítünk, és a kívánt pH-értéket kálium-hidroxiddal vagy foszforsavval állítjuk be.
A fermentációs táptalajokat rutinszerűen, gőzzel sterilizáljuk. A glükózt és az ammónium-sókat, használatuk esetén, sterilizálást követően adagoljuk, és vizes oldatként szűrővel sterilizáljuk.
1. példa
Az enzim előállítására a S. capillispira A49492 jelű tenyészetével vegetatív inokulumot indítunk 251 ml, alábbi összetételű táptalajban:
glükóz 25 g/liter
kukoricakeményítő 10 g/liter
folyékony húspepton 10 g/liter
enzimesen hidrolizált kazein 4 g/liter
melasz 5 g/liter
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g/liler
kalcium-karbonát g/üter 25
Czapek sóoldat* 2 ml/liter
*A Czapek-oldat összetétele:
kálium-klorid 100 g/liter 30
magnézium-szulfát · 7 H2O 100 g/liter
vas-szulfát 7 H,0 2 g/liter
tömény hidrogén-klorid 2 ml/liler.
A beoltott tenyészetet 3 napon át 30 °C hőmér- 35 sékleten rázzuk, majd 4 ml tenyészetet átpipettázunk egy 50 ml térfogatú lombikba. Ehhez a lombikhoz I ml, szűrővel sterilizált, ml-enként 5 mg metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 karboxilátot tartalmazó, 7,0 pH-jú szubszlrát olda- 40 tót adunk.
Az oldatot rázás közben 30 ’C hőmérsékleten, — 20 órán át inkubáljuk, amialatt az enzim észter-hasitja a szubsztrát vegyületet.
A reakcióidő letelte után centrifugáljuk a tényé-45 szetet, ekkor pH-ja 6,4. A felülúszót az előzőekben megadottak szerint papír-kromatográfiásan vizsgáljuk, a futtatást acetonitril és víz 4 : 1 arányú elegyével végezzük. A kromatográfiás papírra acilezőszert szórunk, acilezőszerként petroléterben oldott fenoxi-acetil-kloridot használunk. Ezután B. subtilis mikroorganizmussal beoltott agarlemezre helyezzük a kromatografáló papírt, majd inkubációt követően gátlási zónát találunk. Gátlási zónát nem figyelhetünk meg észter-hasítást katalizáló enzimet nem termelő mikroorganizmussal.
előállítására az S. capillispira ferdeagar tenyészetével 250 ml táptalajt oltunk, majd ezt a tenyészetet 2 napon át 30 ’C hőmérsékleten rázzuk. Előállítjuk a főfermentációs táptalajt: ehhez 3 ml szilikon habzásgátlót adunk és pH-ját 6,7-re állítjuk be. A táptalajt tartalmazó fermentort 1 órán át 121 °C hőmérsékleten (1,05 kg/cm2) sterilizáljuk. Ezután lehűtjük a fermentort és a táptalajt, hozzáadjuk az inokulumot, majd elindítjuk a keverőt és a levegőáramot. A bevezetett levegő mennyisége az egész fermentáció során 5 liter/perc; a fermentlé hőmérséklete pedig 30 ’C. 107 órán át végezzük a tenyésztést. A fermentlé pH-ját időnként megmérjük, a fermentáció során emelkedik. A 17., a 89., a 99. és a 101. órában foszforsav adagolásával 6,7-re állítjuk vissza a pH-t.
A tenyészetből a tenyésztés kezdetekor és minden nap mintát veszünk, a mintákat lefagyasztjuk és enzimaktivitás mérésére félretesszük. A fermentáció végén felolvasztjuk a mintákat, centrifugáljuk, majd az 1. példában megadott szubsztrátot adjuk hozzá. 16 órás reakciót követően papírkromatográfiával vizsgáljuk azokat. A legmagasabb észter-hasítási aktivitást a fermentáció 67. órájában vett mintában találjuk. Az aktivitás a 41. órában jelenik meg, a 67. órát követően pedig a maximális aktivitásnál alacsonyabb aktivitást mértünk.
3. példa
Kísérleteket végzünk néhány komplex, és kémiailag meghatározott összetételű táptalajjal, annak megállapítására, hogy a mikroorganizmus növekedése és az észter-hasítást katalizáló enzim termelése hogyan változik.
Az alábbi táptalajokat használjuk:
A glükóz 15 g szójababdara 15 g kukoricalekvár 10 g tápiókadcxtrin 20 g kalcium-karbonát 2 g
Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját 6,8-re állítjuk be.
2. példa 60
Az 1. példában megadott táptalajon tenyésztjük a mikroorganizmust; a tenyésztést azonban 10 literes keverővei felszerelt fermentorban végezzük; a táptalajon át pedig levegőt vezetünk. Az inokulum 55 glükóz melasz pepton kalcium-karbonát Czapek oldata víz
A táptalaj pH-ját g 20 g g 2g 2 ml
1000 ml-re kiegészítve. 7,0-ra állítjuk be.
188 709 melasz 5 g desztillációs maradék (Nadrisol,
National Distiller’s Products Company,
New York) 5 g szójababliszt 5 g mogyoróliszt 5 g előfőzött zabliszt 5 g glicerin 10 g
Czapek oldata 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját 7,3-ra állítjuk be.
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 0,25 g (NH4)6Mo,O24 · H2O 0,1 g víz 1000 ml-re kiegészítve,
A táptalaj pH-ját 7,0-ra állítjuk be.
szójababdara kazein glükóz melasz kalcium-karbonát Czapek oldata víz
A táptalaj pH-ját 7,4-re állítjuk be.
g
1,0 g g
g 2,5 g 2 ml
1000 ml-re kiegészítve.
glükóz kukoricakeményitő folyékony húspepton enzimatikusan emésztett kazein melasz magnézium-szulfát · 7 H2O kalcium-karbonát Czapek oldata víz g 10 g 10 g 4 g g 0,5 g 2 g 2 ml
H
10 diammónium-hidrogén-foszfát 10 g
nátrium-szulfát 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 0,5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,4 g
vas-szulfát · 7 H2O 0,02 g
15 mangán-szulfát · 4H2O 0,02 g
nátrium-klorid. 0,02 g
élesztökivonat 1 g
glükóz 10 g
bórsav 0,5 mg
20 réz-szulfát · 5 H2O 0,04 mg
nátrium-molibdenát · 2 H2O 0,2 mg
cink-szulfát · 7 H2O 8 mg
kalcium-klorid 50 mg
OR kobalt-klorid · 6 H2O 0,2 mg
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját 7-re állítjuk be.
30 I
glutaminsav 1 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2 g
35 kalcium-karbonát 1 g
glükóz 10 g
Czapek oldata 2 ml
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,0-ra ál40 Htjuk be.
Bacto-Trypton (Difeo) élesztökivonat dikálium-hidrogén-foszfát burgonyadextrin magnézium-szulfát · 7 H2O glükóz
Czapek oldata glicerin víz
1000 ml-re kiegészítve g 5 g 5 g 5 g 2 g 10 g 2 ml 1 g;
1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be, raffinóz szacharóz galaktóz oldható keményítő pankreatinnal emésztett kazein (Humko Sheffield gyártmány) g 2 g 2 g 10 g g
élesztökivonat magnézium-szulfát
H,0 g 0,5 g 2 g dikálium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát 1 g glükóz 10 g
Czapek oldata' , 2 ml víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
K szacharóz pepton dikálium-hidrogén-foszfát magnézium-szulfát · 7 H2O Czapek oldata víz g 0,5 g 2 ml 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
188 709
A fenti táptalajok 50 — 50 ml-ét 250 ml térfogatú lombikokban autoklávozzuk. A táptalaj lehűlése után beoltjuk a tenyészeteket az S. capillispira vegetatív tenyészetével, és 3 napon át 30 ’C hőmérsékleten rázógépen folytatjuk a tenyésztést. Ezután 4 —4 ml-t mindegyik tenyészetből kiveszünk, és 1 ml szubsztrát-oldattal keverünk. A szubsztrát-oldatot úgy állítjuk elő, hogy 5 ml/mg-os oldatot készítünk 0,5 mólos, 7 pH-jú kálium-dihidrogén-foszfáttal, és metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 karboxiláttal.
A reakcióelegyeket 16 órán át 30 °C hőmérsékleten rázatjuk, majd az 1. példában megadottak szerint eljárva papír-kromatográfiás analízist végzünk.
Úgy találtuk, hogy a mikroorganizmus az összes fenti táptalajon jól nő. A kromatográfiás analízis szerint az észter-hasítást katalizáló enzim a H. táptalajt kivéve, az összes táptalajon termelődik. A H. táptalaj több nehézfémsót tartalmaz, és igen magas koncentrációban tartalmaz diammónium hidrogén-foszfátot.
4. példa
A 3. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy több, más kémiailag meghatározott összetételű táptalajt vizsgálunk. Az alábbi táptalajokat készítjük el:
diammónium-hidrogén-foszfát 10 g nátrium-szulfát 0,5 g dikálium-hidrogén-szulfát 5 g magnézium-szulfát · 7 H2O 0,4 g élesztőkivonat 1 g glükóz 10 g víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
B
kálium-dihidrogén-foszfát 10 g
nátrium-szulfát 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,4 g
élesztőkivonat 1 g
glükóz 10 g
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk be.
C
diammónium-hidrogén-foszfát 10 g
nátrium-szulfát 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,4 g
vas-szulfát · 7 H2O 0,02 g mangán-szulfát · 4 H2O 0,02 g nátrium-klorid 0,02 g élesztőkivonat lg glükóz 10 g víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
diammónium-hidrogén-foszfát 10 g nátrium-szulfát 0,5 g dikálium-hidrogén-foszfát 5 g magnézium-szulfát · 7 H2O 0,4 g réz-szulfát · 5 H2O 0,04 g nátrium-molibdenát · 2 H2O 0,2 g cink-szulfát 7 H2O 8 g kobalt-klorid · 6 H2O 0,2 g élesztőkivonat 1 g glükóz 10 g bórsav 0,5 mg víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
E
glutaminsav 5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2 g
kalcium-karbonát 1 g
glükóz 10 g
Czapek oldata 2 ml
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk be.
F
glutaminsav 5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 5 g
kalcium-karbonát 1 g
glükóz 10 g
Czapek oldata 2 ml
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állít-
juk be. •
G
éleszlőkivonat 5 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2 g
kalcium-karbonát 1 g
glükóz 10 g
Czapek oldata 2 ml
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
g 0,5 g 2 g g
g ml
1S8 709
I. táblázat élesztőkivonat magnézium-szulfát · 7 H2O dikálium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát glükóz
Czapek oldata víz 1000 ml-re kiegészítve.
250 ml térfogatú lombikokba 50 ml-t löltünk, mindegyik táptalajból, majd sterilizáljuk, lehűtjük és a 3. példában megadottak szerint beoltjuk és inkubáljuk. Az egyes táptalajokkal készített tenyészetekből vett mintákat a 3. példában megadottak szerint szubsztrát vegyülettel reagáltatjuk.
A reakcióeiegyeket papír-kromatográfiásan analizálva azt találtuk, hogy az A, C, D, E és F táptalajokon az enzim termelése gyenge. A nagyméretű gátlási zóna jelentkezése alapján az enzim a B, G és H táptalajokban jelent meg.
TáppH
Specifikus aktivitás
UlldJ - 41 óra 65 óra 41 óra 65 óra
1 7,5 7,3 3,7 3,2
2 7,4 6,1 1,8 3,2
3 6,8 6,7 3,1 1,6
4 7,9 7,1 3,4 4,7
5 7,3 6,8 4,3 3,8
6 7,4 6,6 2,2 10,2
7 6,8 6,6 5,0 0,8
8 7,2 6,6 5,0 5,7
9 6,8 6,5 8,2 5,7
6. példa
5. példa
Vizsgáljuk néhány aminosav hatását a mikroorganizmus növekedésére és az enzim termelésére. Nagymennyiségű, alábbi összetételű alap-táptalajt készítünk:
További kísérletet végzünk néhány aminosavval az enzimtermelésre nézve optimális táptalaj meghatározására. A kísérlet során az alábbi összetételű 25 alaptáptalajt használjuk:
magnézium-szülfát · 7 H2O dikálium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát
Czapek oldata víz
0,5 g 2 g g
ml
1000 ml-re kiegészítve.
magnézium-szulfát · 7 H2O dikálium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát glükóz
Czapek oldata víz
0,5 g 2 g 1 g 10 g 2 ml
1000 ml-re kiegészítve.
A fenti táptalajt részekre osztjuk, és mindegyikhez egy aminosavat adunk, literenként 2 g-ot. Az alábbi aminosavakat vizsgáljuk:
1) L-glutaminsav
2) L-alanin
3) L-arginin
4) L-aszparaginsav
5) L-glicin
6) L-hisztidin-hidrogén-klorid
7) L-prolin
8) L-szerin
9) L-treonin.
Mindegyik táptalajhoz literenként 10 g steril glükózt adunk, sterilizálás után.
50-50 ml táptalajokat 250 ml térfogatú lombikokba töltünk, és az előző példákban megadottak szerint beoltjuk és tenyésztjük. A 41. és 65. órában mindegyik tenyészetből mintát veszünk, és az előzőekben ismertetett korong-módszerrel meghatározzuk észter-hasítási aktivitásukat.
A következő táblázatban megadjuk a mintavétel idején mért pH-értékeket, az enzim specifikus aktivitását (mól x 10~ιθ észter hidrolizálva/mg száraz sejt · perc).
Az alaptáptalajt elosztjuk és literenként 2 g, az előzőekben megadott aminosavat adunk hozzá.
A táptalajok pH-ját 7,0-ra állítjuk be, majd sterilezzük, és az előzőekben megadott módon, a mikroorganizmus vegetatív tenyészetével beoltjuk és inkubáljuk. 44 órás tenyésztést követően mindegyik fermentléből 4 ml mintát veszünk, és 1 ml, 0,5 mólos dikálium-hidrogén-foszfát pufferrel készült (pH = 7,0), 5 mg/ml koncentrációjú metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefém - 4 - karboxilát - oldattal keverjük. A szubsztrát-oldat a sejtek növekedésének gátlására 20 pg/ml nátrium-azidot is tartalmaz. 5 órán át 30 ”C hőmérsékleten keverjük a reakcióelegyeket, majd korong-módszerrel vizsgáljuk eszleráz-aktivitásukat. Az eszteráz-aktivitásokat a 11. táblázatban adjuk meg.
II. táblázat
Specifikus aktivitás
i) arginin 24
2) hisztidin 5,1
3) izoleucin 9,0
4) leucin 10
5) lizin 9,0
-101
188 709
Specifikus aktivitás
6) metionin 7) fenilalanin ---------13 5,2
8) treonin 18
9) triptofán 13
10) valin 7,5
11) alanin 4,4
12) aszparaginsav 4,4
13) cisztein 0
14) glutaminsav 6,7
15) glicin 22
16) hidroxi-prolin 11
17) prolin 17
18) szerin 24
19) tirozin 13
20) glutamin 4,8
21) aszparagin 7,1
7. példa
A tenyészethez adagolt aminosavak hatását vizsgáljuk. A 6. példában ismertetett alaptáptalajt ké- 25 szítjuk el. Ezt az alaptáptalajt részekre osztjuk, és az alábbi, III. táblázatban megadott koncentrációban L-prolint és L-szerint adunk hozzá. Elosztjuk a táptalajokat, sterilizáljuk, lehűtjük, és a 6. példában megadott módon beoltjuk és tenyésztjük. 30 óra múlva mintákat veszünk, és a példákban megadottak szerint meghatározzuk a minták eszteráz-aktivitását.
Az eredményeket a III. táblázatban adjuk meg.
III. táblázat
Aminosav Koncentráció Specifikus aktivitás
L-prolin 2 g/Iiter 9,7
4 g/liter 6,3
6 g/liter 3,1
8 g/liter 1,7
10 g/liter 1,5
L-szerin 2 g/liter 14
4 g/liter 0
6 g/liter 5,7
8 g/liter 3,2
10 g/liter 3,1
----— 55
8. példa
Különböző mennyiségű ammónium-ionok hatá- 60 sát vizsgáljuk. A 6. példában megadott összetételű alaptáptalajt készítjük el. 250 ml térfogatú lombikokba 50-50 ml táptalajt mérünk és sterilizáljuk. Ammónium-klorid törzsoldatot állítunk elő, az oldatot szűrővel sterilizáljuk és 0,6 g/liter-től 0,05 55 g/literig csökkenő koncentrációban adagolunk. A táptalajokat beoltjuk a S. capillispira vegetatív tenyészetével és 30 °C hőmérsékleten, állandó rázás közben 44 órán át folytatjuk a tenyésztést. Mintákat veszünk a tenyészetekből, meghatározzuk a tenyészetek ml-enkénti száraz sejtlartalmát, az előző példákban megadottak szerint megmérjük a tenyészetek eszteráz-aktivitását. Ebben az esetben nátrium-azidot nem használunk.
Az alábbi, IV. táblázatban megadjuk az egyes táptalajokban mért sejt szárazsúlyt (mg/ml), a specifikus aktivitást és a teljes aktivitást mól · 10~7 észter hidrolizálva/liter tenyészet · percben.
IV. táblázat
Ammóni- um-ion koncentrá- ció Sejt szárazsúly (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
0,05 0,56 9,3 5,2
0,1 1,04 9,0 9,4
0,2 1,18 7,0 8,3
0,3 1,48 6,8 10,0.
0,4 1,62 4,3 7,0
0,5 2,16 2,4 5,2
0,6 2,24 1,9 4,2
A fenti kísérlet eredményei világosan jelzik, hogy megfelelő mennyiségű nitrogénforrást kell adnunk a táptalajhoz; de a fölös mennyiség nem előnyös.
9. példa
Kísérleteket végzünk a nyomokban jelenlévő fém-ionok hatásának vizsgálatára az A49492 jelű mikroorganizmus növekedésére és az enzim termelésére. A kísérlet során két alaptáptalajt használtunk. Ezek összetétele a következő;
I II
L-szerin 3,0 g 3,0 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 0,5
dikálium-hidrogén-foszfát 2 2
kalcium-karbonát 1 1
glükóz 10 10
Czapek oldata 2 ml -
viz mindkét esetben 1000 ml-re kiegészítve
A táptalajok pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be, sterilizáljuk, majd sterilizálást követően glükózt adunk hozzá.
Ezután elkészítjük az V. táblázatban megadottak szerint a megfelelő mennyiségű fémsót tartalmazó táptalajokat. A sók koncentrációját mg/literben
-11188 709 adjuk meg. A táptalajokat lombikokba osztjuk el, beoltjuk a táptalajokat, és 48 órán át az előző példákban megadott módon folytatjuk a tenyésztést. A kivett mintákat korong-módszerrel analizáljuk.
Az eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg.
Az aktivitásokat a 8. példához hasonló egységekben ábrázoljuk.
V. táblázat
Táptalaj -- a b c d Sók e f g h Sejt - száraz súly i (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
I x x x x X X 3,66 1,4 5,1
I x 1,88 1,8 3,4
I x 2,22 2,2 4,9
I x 2,56 2,0 5,1
I x 3,62 3,2 11,6
I X 1,96 3,2 6,3
I X 2,2 2,0 4,4
I X 1,08 3,1 3,4
II X 1,76 3,5 6,2
II X 2,32 0,66 1,5
II x 0,78 11 8,6
a = H3BO3: 1 mg/liter
b = CuSO4: 1 mg/liter
c = Na2MoO4: 0,4 mg/liter
d = ZnSO4 · 7 H2O: 16 mg/liter
e = CoCl2 · 6 H20: 0,4 mg/liter
f =MiiS04 · H2O: 0,4 mg/iiter
g = KCl: 200 mg/liter
h-FeSO4· 7 H2O: 4 mg/liter
i = MgSO4 · 7 H,O: 200 mg/liter
10. példa kalcium-karbonát '1 g
Czapek oldata 2 ml
A kísérlet során különböző szénhidrátokat víz 1000 ml- re kiegészítve
adunk a táptalajhoz, annak meghatározására, hogy a különböző szénforrások hogyan befolyásolják az eszteráz termelését. Az alábbi összetételű alaptáptalajt használjuk:
L-szerin magnézium-szulfát · 7 H2O dikálium-hidrogén-foszfát
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
A VI. táblázatban megadjuk a 10 g/liter koncentrációban használt különböző szénhidrátokat. A kísérletet minden szempontból az előzőek szerint vé50 gezzük. Az eredményeket az előzőekben megadott egységek alapján ismertetjük.
g 0,5 g 2 g
VI. táblázat
Sejt szárazsúly (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
D-glükóz 1,98 1,9 3,8
szacharóz 1,1 0 0
oldódó keményítő 1,72 2,0 3,4
burgonyadextrin 2,3 2,5 5,8
glicerin 2,08 2,1 4,4
12
-121
188 709
Sejt szárazsúly (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
fruktóz 1,66 4,9 8,1
D + mannóz 0,64 5,8 3,7
D + laktóz 1,08 <2,8 <3,0
maltóz 0,66 23 15
D-ribóz 1,68 11 18,5
D-szorbit 0,62 5,0 3,1
11. példa 15 kálium-klorid 0,2 g
kobalt-klorid · 6 H2O 0,004 g
A kísérlet során több szénforrás, közte emészthe- vas-szulfát · 7 H2O 0,004 g
tő olajok hatását vizsgáljuk. Az alábbi összetételű víz 1000 ml-re kiegészítve két alaptáptalajhoz adjuk a szénforrásokat:
A táptalajok pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be.
I táptalaj
L-szerin 2 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2 g
kalcium-karbonát 1 8
víz 1000 ml-re kiegészítve
A fenti alaptáptalajok mindegyikéhez az alábbi 25 táblázatban megadott egyik cukrot vagy olajat adjuk. Az adagolt cukor koncentrációja 10 g/liter; az olajokat 3 %-os koncentrációban használjuk.
A táptalajokat kisterilezzük, beoltjuk és az előző példákban megadottak szerint tenyésztjük. Az inkubációs idő 48 óra. Az olajat tartalmazó fermentlevekből a száraz súlyt nem tudtuk pontosan meghatározni, mivel a fermentlében lévő olajmajadék
II táptalaj
L-szerin magnézium-szulfát · 7 H2O dikálium-hidrogén-foszfát kalcium-karbonát cink-szulfát · 7 H2O 2 g °-5 g 35 2 g 1 g 0,016 g VII. tábi ezt nem tette lehetővé. A sejtek száraz súlyát ezekben az esetekben az olajtartalmú fermentléből vett minta centrifugálását követően kapott szilárd anyagból számítottuk. A kísérlet eredményeit a VII. táblázatban adjuk meg. lázai
Alap- táptalaj Szénhidrát Sejtek száraz súlya (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
I __ 0,48 0 0
11 — 0,33 0 0
I glükóz 1,43. 6,0 8,6
II glükóz 1,85 4,9 9,1
I ribóz 2,0 5,0 10,0
II ribóz 2,42 2,0 4,8
I maltóz 1,55 1,7 2,6
II maltóz 1,35 1,8 2,4
I gyapotmagolaj 1,78 0 0
II gyapotmagolaj 4,15 1,2 5,0
I kukoricaolaj 1,78 1,2 2,1
II kukoricaolaj 1,78 0 0
I szójaolaj L19 1,8 2,1
II szójaolaj 2,96 2,0 5,9
I mogyoróolaj 1,78 3,8 6,8
II mogyoróolaj 3,56 1,7 6,1
-13188 709
72. példa liter térfogatú, keverővei és a táptalaj felülete
alá bevezetett levegőcsővel felszerelt tankfermentorban tenyésztünk. Az alábbi összetételű táptalajt
használjuk:
ammónium-klorid 0,2 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2,0 g
kalcium-klorid · 2 H2O 0,2 g
cink-szulfát 7 H2O 0,016 g
kálium-klorid 0,2 g
kobalt-klorid · 6 H2O 0,0004 g
vas-szulfát · 7 H2O 0,004 g
glükóz 10 g
víz 1000 ml-re kiegészítve
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt foszforsavval 7,0-ra állítjuk be, majd annyi szűrővel előzőleg sterilizált glükózt és ammónium-kloridot adunk, hogy beálljon a megfelelő koncentráció.
liter fenti összetételű táptalajt adunk az 5 liter térfogatú fermentorba, majd automatikus pHszabályozássul 0,5 normál ammónium-hidroxidoldat adagolásával 6,95-ön tartjuk a táptalaj pHját. A táptalajon 1,5 — 2 liter/perc térfogatnyi steril levegőt buborékoltatunk át, és - ha a habzás ezt megkívánja — kevés szilikon-alapú habzásgátlőt csepegtetünk hozzá.
órán át folytatjuk a fermentációt; ezalatt 300 ml 20 %o-os glükóz-oldat és 200 ml 0,5 mólos dikálium-hidrogcn-foszfát-oldat adagolása szükséges. A táptalaj hőmérsékletét az egész fermentáció során automatikus szabályozással 30 °C-on tartjuk.
A fermentáció 22., 45., 69. és 93. órájában mintákat veszünk, a mintákat a korong-lemez módszerrel analizáljuk (lásd előbb). A reakcióidő 5 óra. Az analitikai mérés eredményeit a 8. táblázatban adjuk meg.
VIII táblázat
Sejtek szárazsúlya (mg/ml) Specifikus aktivitás Teljes aktivitás
22. óra 0,73 <4,6 3,4
45. óra 1,79 5,0 9,0
69. óra 4,23 4,8 20
93. óra 5,72 4,7 27
13. példa
A kísérlet során az úgynevezett Spizizen-sóoldatot használjuk táptalajként. Ennek összetétele a következő:
dikálium-hidrogén-foszfát 14 g
kálium-dihidrogén-foszfát 6 g
nátrium-citrát 1 g
diammónium-szulfát 2 g
magnézium-szulfát 7 H2O 0,2 g
kalcium-karbonát 2 g
glükóz 10 g
sóoldat 1 ml
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A sóoldat összetétele a következő:
vas-szulfát 7 H2O 100 mg
nrangán-klorid · 4 H2O 100 mg
cink-szulfát · 7 H2O 100 mg
víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalajt lombikokban osztjuk el és sterilizál„0 juk, majd előre sterilezett (szűrővel) glükózt adunk hozzá. A táptalajokat vegetatív tenyészettel oltjuk be, és 30 °C hőmérsékleten 48 órán át rázóasztalon tenyésztjük. Az előzőekben megadott módon analizáljuk a mintákat (korong-lemez-módszer), a reakcióidő 5 óra. A fermentlében lévő sejtek szárazsúlya 3,26 mg/ml, a specifikus aktivitás 6,8 x 10“19 mól hídrólizált észter/mg szárazsejt x perc. Ez ekvivalens 2,2xl0'6 mól hidrolizált észter/liter fermentlé x perc aktivitással.
14. példa
A 12. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a táptalajba nem 10 g/liter, hanem 15 g/liter glükózt adagolunk. A tenyészet pH-ját 0,5 normál ammónium-hidroxid és 0,5 normál nátrium-hidroxid-oldat 1 : 1 arányú elegyével szabályozzuk. Ily módon csökkent40 jük az adagolt ammónium-ionok mennyiségét. A fernientlevet nem vegetatív tenyészettel oltjuk, hanem a S. capillispira ferdeagarról nyert spóraszuszpenziójával.
Más tekintetben a fermentációt a 12. példában megadottak szerint végezzük, 71 órán át. A fermentáció végén mintát veszünk, és korong-lemezmódszerrel analizáljuk. A minta ml-enként 4 mg szárazsejtet tartalmaz, a specifikus aktivitás
6,54x 10_,° mól hidrolizált észter/percxmg szárazsejt. Ez ekvivalens 2,6 x 10~6 mól hidrolizált észter/perc x liter fermentlé aktivitással.
75. példa literes fermentációt végzünk az alábbi összetételű táptalajon:
ammónium-klorid 0,1 g
magnézium-szulfát · 7 H2O 0,5 g
dikálium-hidrogén-foszfát 2 g
kalcium-klorid · 2 H2O 0,2 g
cink-szulfát 7 H2O 0,16 g
-141
188 709 kálium-klorid 2,0 g kobalt-klorid · 6 H2O 0,004 g vas-szulfát · 7 H2O 0,04 g glükóz 15 g .víz 1000 ml-re kiegészítve.
A táptalaj pH-ját foszforsavval 7,0-ra állítjuk be, majd hozzáadjuk a glükózt a fermentor és a táptalaj sterilezését követően. Beoltjuk a tenyészetet a S. capillispira vegetatív tenyészetével, majd a fermentációt 30 °C hőmérsékleten, keverés közben és a táptalajon át percenként 2,5 liter levegőt átvezetve kezdjük. A fermentációs elegy pH-ját 2 normál ammónium-hidroxid-oldat automatikus adagolásával 7,0 értéken tartjuk.
A 67. órában 5 liter/percre emeljük az átvezeteti levegő mennyiségét, ezáltal a fölös mennyiségű ammóniagázt kilevegőztetjük. A habzás gátlására 6 ml szilikon habzásgátlót adagolunk.
A fermentáció 91,5 órájában mintát veszünk, és analizáljuk; a mintában ml-enként 3,28 mg száraz sejt található, a specifikus aktivitás 7,48 x 1010 mól hidrolizált észter/perc x mg szárazsejt. Ez ekvivalens 2,5 x 106 mól hidrolizált észter/perc x liter fermentlé aktivitással. A 97. órában leállítjuk a fermentációt, a táptalajt szűrjük, amikor 510 g nedves sejtet kapunk.
g nedves sejtet 20 ml 8,0 pH-jú, 2 mmólos dikálium-hidrogén-foszfát-oldattal hígítunk, homogenizáljuk a szuszpenziót, a sejteket ultrahanggal feltárjuk és centrifugáljuk. A felülúszó az ultraibolya analitikai módszer (Warburg és Christian, Biochem. Z., 310, 384-421, 1942) ml-enként 14,4 mg proteint tartalmaz. A metil - 7 - amino - 3 - metil - 3 - cefem - 4 - karboxilát szubsztráttal szemben mért aktivitás: 2,2x 10~5 mól hidrolizált észter/ perc x liter.
120 g nedves sejtet 240 ml 2 mmólos, 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-oldattal hígítunk, kézi homogenizátorral homogenizáljuk a szuszpenziót. A homogenizátuniot ultrahanggal feltárjuk, a feltárást 30 másodpercen át végezzük. A feltárást követően centrifugáljuk a szuszpenziót, a cenlrifugálásl 30 percen át 0 °C hőmérsékleten 36 000 g-n végezzük. A 200 ml térfogatú felülúszót fagyasztva szárítva 3,76 g nyers enzimkészítményt kapunk.
g fagyasztva szárított port 15 ml, 2 mmólos, 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-oldalban szuszpendálunk, és az előzőekben ismertetett paraméterek mellett centrifugálunk. A 14 ml térfogatú felülúszót 2,5 cm x 8 cm méretű, keresztkötéseket tartalmazó allil-dextrán - metilén-bisz-akrilamid oszlopon kromatografáljuk (Sephacryl, Pharmacia Fine Chemicals, Escataway, New Jersey). Az oszlopot a fagyasztva szárított por szuszpendálásakor használt pufferrel eluáljuk, egyenként 5 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A 200 ml-től a 250 ml-ig terjedő frakciókban mérjük az eszteráz-aktivitást. Az eszterázt tartalmazó frakció fehérjetartalma 0,42 mg/ml és 1,13 mg/ml között változik, eszterázaktivitásuk I ’ x 104-l,9x 106 mól hidrolizált észter/perc x lir,r.
16. példa
A fermentléből nyert 34 g nedves sejtet, amit előzőleg dikálium-hidrogén-foszfát pufferral mostunk és fagyasztottunk, felolvasztunk, és 170 ml,
1,5 mmól ditio-treitolt tartalmazó 7,0 pH-jú, 1 mmólos dikáílium-hidrogén-foszfát pufferral hígítunk. Kézi homogenizátorral homogenizáljuk a szuszpenziót, majd 0 °C hőmérsékleten 20 percen át 36 000 g-n centrifugáljuk. A 140 ml térfogatú felülúszót analizáljuk, ml-enként 8,1 mg fehérjét tartalmaz. A korong-lemez-mödszerrel mért aktivitása:
1,9 x 10~5 mól hidrolizált észter/perc x liter.
Az enzim-oldatot ammónium-szulfátos' kicsapással tovább tisztítjuk. Úgy járunk el, hogy 31,2 g ammónium-szulfátot adunk a szuszpenzióhoz, addig keverjük, míg felolvad, majd 20 percen át 0 °C hőmérsékleten 36 000 g-n centrifugáljuk. Az üledéket kidobjuk, a felülúszóhoz további 30,6 g ammónium-szuifátot adagolunk, majd a fentiek szerint centrifugáljuk a szuszpenziót.
A második centrifugálás után kapott üledéket 30 ml fenti összetételű pufferban oldjuk, az oldatot 4 liter, 1 mmólos, 7,2 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral szemben dializáljuk két alkalommal. Az oldat 7,5 mg/ml proteint tartalmaz. Tovább dializálva az oldatot, 65 ml térfogatú terméket kapunk, ezt fagyasztva tároljuk.
7,2 pH-jú vízben ml-enként 2 mg metil -7-(2amino - 2 - fenil) - acetil - amino - 3 - metil - 3 cefem - 4 - karboxilátot (mctil-cefalexint) oldunk. Az oldat 1,25 ml-éhez 3 ml fenti, tisztított enzimoldatot és 0,75 ml, 0,5 mólos dikálium-hidrogénfoszfát-puffert adunk, amikor olyan oldatot kapunk, amely 7,2 pH-jú és ml-enként 4,5 mg fehérjét tartalmaz. Az elegyet 30 °C hőmérsékleten 4 órán át rázzuk, majd papirkromatográfiát végzünk, és a krcmatogramot Sarcina lutea mikroorganizmussal beoltott tápagar felületére helyezzük. A lemezen nagyméretű gátlási zónák látszanak, ami azt jelenti, hogy a cefalexin-észterről lehasadt az észtercsoport, és megkaptuk a cefalexin antibiotikumot.
17. példa
A példában a 16. példában megadottak szerint előállított enzim-készítményt használjuk, a metilcefalexin észterhasitására. A hidrolízis mértékét pH-sztát titrálással követjük. A reakcióelegyet a
16. példában megadottak szerint állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy 1 ml enzim-készítményt és 2 ml szubsztrát-oldatot használunk, így a reakcióelegy végül ml-enként 2,5 mg proteint tartalmaz.
Λ reakciót pH 7-en és pH 8-on végezzük. pH
7-en az észterhasítás mértéke 4,0 x 106 mól/ perc x liter reakcióelegy, pH 8-on pedig 1,36 x 105 mól/perc x liter.
-151
188 709
18. példa
A 15. példában megadottak szerint előállított, és ml-enként 0,66 mg proteint tartalmazó, tisztított enzim-készítményt használjuk a metil -7-(2amino - 2 - fenil) - acetil - amino - 3 - klór - 3 - cefem - 4 - karboxilát (metil-cefaklór) észterhasítására. A reakcióelegy előállítására 0,5 ml enzim-készítményt, 1,25 ml vizet és 0,25 ml, ml-enként 10 mg metil-cefaklórt tartalmazó oldatot keverünk össze. A reakciót pH 8-on 10 percen át végezzük 24 °C hőmérsékleten.
A pH-sztát titrálás szerint a hidrolízis mértéke 5,8xl0~5 mól hidrolizált észter/perc x liter reakcióelegy.
A keletkezett 7 - (2 - amino - 2 - fenil) - acetil amino - 3 - klór - 3 - cefem - 4 - karbonsav UV maximuma pH = 7 púderban: UVmax = 265 nm (ε = 6800).
19. példa ml-enként 1,27 mg fehérjét tartalmazó, a 15. példában megadottak szerint Sephacryl-oszlopon tisztított enzim-készítményt használunk a metil-7amino-3-metiI-3-cefem-4-karboxiiát észterhasítására. Az enzim által katalizált reakciót különböző hőmérsékleteken, 15 °C-tól 35 °C-ig mérjük. A reakcióelegyet úgy állítjuk elő, hogy 0,4 ml enzim-oldatot, 0,6 ml vizet és 1 ml, 20 mg/ml koncentrációjú szubsztrát-oldatot keverjük. A reakcióelegy pH-ja 8,0.
A reakciót olyan automatikus titrálóval végezzük, amely az enzim'távollétében megfelelően korrigálja a hidrolízis mértékét. A legmagasabb reakciósebesség 30 °C hőmérsékleten mérhető; ez
1,9 x 10”5 mól hidrolizált észter/perc x liter reakcióelegy. A legalacsonyabb reakciósebességet 15 °C hőmérsékleten mértük, ez 1,0 x 10~5 mól/ perc x liter. 35 °C hőmérsékleten az enzim nem stabil, észterhasítás gyakorlatilag nem mérhető.
20. példa
A következő kísérletet a találmány szerinti eszteráz enzim szilárd fázishoz kötésére végezzük. A 15. példában megadottak szerint eljárva Sephacryl— gyantán tisztítjuk az enzim-oldatot, a kapott készít mény ml-enként 0,75 mg proteint tartalmaz, aktivitása pedig 3,5 x 10*4 mól hidrolizált észter/perc x liter. A készítmény 30 ml-ét Amicon uítraszürőn (Lexington, Mass.) PM 30 membránt használva szűrjük. A szűréskor az enzim oldalán emsénként 562 g nyomást biztosítunk nitrogénnel. Ahogy a szűrés folyik, vizet adunk mindaddig, míg 315 ml folyadékot gyűjtünk össze. A dializált enzimkészítmény végső térfogata 30 ml, a készítmény ml-enként 0,34 mg proteint tártál iaz, aktivitása pedig 7,2 x 10~5 mól hidrolizált és;, er/perc* liter.
Az enzim szilárd fázishoz kötéséhez a következő anyagokat használjuk:
1. DEAE-Sephadex (dietilamino-etil, gyengén bázikus ioncserélő gyanta, Pharmacia Fine Chemicals).
2. DEAE-Sephacel (dietil-amino-eti< cellulóz ioncserélő gyanta, Pharmacia Fine Chen/cals).
3. DEAE-cellulóz, Sigma Chemical Co St. Louis, Mo., USA. _
4. Cellex-CM, Bio-Rad Laborato 'es, Richmond, California, USA.
5. Bentonit.
6. DEAE-Cellulóz, ezt Tsao és Che 5 által közreadott 4 063 017 számú amerikai szabadalmi leírás szerint állítottuk elő.
1,5 mg (szárazsúly) fenti anyagot 8,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral mosunk, majd a mosást vízzel megismételjük. Ezután 3,53 ml enzim-készítménnyel keverjük, a készítmény pH-ját keverés előtt 8,0-ra állítjuk be. A keveréket 18 órán át 4 °C hőmérsékleten enyhén keverjük.
Mindegyik szilárd fázishoz kötött enzim-készítményt 7,0 pH-jú dikálium-hidrogén-foszfát-pufferral mosunk a nem-kötött enzim eltávolítására. A mosófolyadékokat és a mosott, szilárd fázisú enzim-készítményt a szilárd fázishoz kötődő enzim mennyiségének meghatározására metil-7-amino-3metil-4-karboxiláttal reagáltatunk. Az analízis szerint a következő mennyiségű enzim kötődött a szilárd fázishoz:
1. 24 %
2. 33 %
3. 34 %
4. 8 3
5. 6 %
6. 40 %.
A szilárd fázishoz kötött enzim-készítményt 40 °C hőmérsékleten tartjuk, és az enzim felezési idejének meghatározására időnként analizáljuk. A következő eredményeket kapjuk:
Szilárd fázishoz nem kötött enzim 5 perc
1. 4 perc
2. 3,5 perc
3. 5,5 perc
4. az alacsony aktivitás miatt nem mérhető
5. az alacsony aktivitás miatt nem mérhető
6. 13 perc.
21. példa
A 17. példában leírtak szerint eljárva 7 - [D - a - (4 - hidroxi - fenil) - acetil - amino] - 3 - metil 3 - cefem - 4 - karbonsav - metil - észtert észterhasításnak alávetve a megfelelő szabad savat kapunk. A termék olvadáspontja 197 °C (bomlás közben).

Claims (9)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás az (I) általános képletű cefalosporin.metil-észterek észteresoportjának lehasítására, ahol az általános képletben:
    R hidrogénatoni vagy fenil-gliai- vagy p-hidroxi-fenil-csoport, és R1 metilcsoport vagy klóratom, azzal jellemezve, hogy a metil-észtert a Streptomy- 1 ces capillispira, előnyösen Streptomyces capillispira NRRL 12279 törzs tenyésztésekor termelt enzimmel reagáltatjuk, és a képződött, savtjdtegű vegyületet kinyerjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 1 ve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol
    R hidrogénatom.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez- 2 ve, hogy olyan (I) általános képletű vegyületből indulunk ki, ahol
    R fenil-glicil-csoport.
  4. 4. Az 1 - 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 15 °C és 45 ’C 2 közötti hőmérsékleten végezzük.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegy pH-ját 7 és ,9 közé állítjuk be
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve. hogy a metil-észtert 1 mg/ml és 10 mg/ml közötti koncentrációban alkalmazzuk.
  7. 7. Eljárás az (I) általános képletű cefalosporin-metil-észterekről az észtercsoportot lehasító, és a megfelelő karbonsavat kialakító enzim előállítására, ahol az általános képletben:
    R · hidrogénatom, fenil-glicil- vagy p-hidroxiferil-glicil-csoport, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces capillispira mikroorganizplust, előnyösen a Streptomyces capillispira NRRL 12279 törzset 25 °C és 40 °C közötti hőmérsékleten, 6 és 8 közötti pH-η tenyésztjük, majd kívánt esetben a kapott teljes tenyészléből az enzimet elválasztjuk.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést ammónium-ionokat tartalmazó táptalajon végezzük.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészet pH-ját ammóniumhidroxid szabályozott adagolásával 6,5 és 7,5 pH közötti értéken tartjuk.
HU813346A 1980-11-10 1981-11-09 Process for the enzymatic deest rification of cephalosporin methyl esters HU188709B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/205,538 US4316955A (en) 1980-11-10 1980-11-10 Enzymatic deesterification of cephalosporin methyl esters

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU188709B true HU188709B (en) 1986-05-28

Family

ID=22762616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU813346A HU188709B (en) 1980-11-10 1981-11-09 Process for the enzymatic deest rification of cephalosporin methyl esters

Country Status (11)

Country Link
US (1) US4316955A (hu)
EP (1) EP0052974B1 (hu)
JP (1) JPS57110189A (hu)
KR (1) KR850001533B1 (hu)
CA (1) CA1177423A (hu)
DE (1) DE3169101D1 (hu)
GB (1) GB2086913B (hu)
GR (1) GR75383B (hu)
HU (1) HU188709B (hu)
IE (1) IE51825B1 (hu)
IL (1) IL64205A (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0744775Y2 (ja) * 1987-03-26 1995-10-11 三菱重工業株式会社 圧縮機の容量制御装置
IT1224252B (it) * 1988-04-08 1990-09-26 Sclavo Spa Metodo di protezione del gruppo carbossilico nella chimica dei composti beta lattamici
JPH0714342B2 (ja) * 1990-08-10 1995-02-22 田辺製薬株式会社 エステラーゼの製法
DE4218785A1 (de) * 1992-06-06 1993-12-09 Hoechst Ag 7-Amino-3-methoxy-3-cephem-4-carbonsäureester - Hydrolase, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
US5604222A (en) * 1993-12-27 1997-02-18 Lupin Laboratories, Ltd. Method for the preparation of 2-chloro sulfinyl azetidinones
US5578721A (en) * 1994-07-11 1996-11-26 Lupin Laboratories Limited Process for preparation of 3-exomethylene cepham sulfoxide esters
US5695951A (en) * 1994-12-20 1997-12-09 Biopure Corporation Chlorination of cephalexin with chloroperoxidase from Rathayibacter biopuresis
US5589354A (en) * 1994-12-20 1996-12-31 Biopure Corporation Halogenation of cephalexin with haloperoxidase from Rathayibacter biopuresis

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH504473A (de) * 1967-11-03 1971-03-15 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Cephalosporansäurederivaten
JPS4948760B1 (hu) * 1970-12-25 1974-12-23
US3761356A (en) * 1972-01-10 1973-09-25 Upjohn Co Process for producing an esterase
US3972774A (en) * 1975-07-28 1976-08-03 Eli Lilly And Company Enzymatic de-esterification of cephalosporin para-nitrobenzyl esters

Also Published As

Publication number Publication date
GR75383B (hu) 1984-07-13
DE3169101D1 (en) 1985-03-28
IL64205A (en) 1984-10-31
GB2086913B (en) 1984-04-18
KR850001533B1 (ko) 1985-10-16
KR830007839A (ko) 1983-11-07
EP0052974B1 (en) 1985-02-20
IE51825B1 (en) 1987-04-01
CA1177423A (en) 1984-11-06
IE812615L (en) 1982-05-10
IL64205A0 (en) 1982-02-28
EP0052974A1 (en) 1982-06-02
US4316955A (en) 1982-02-23
GB2086913A (en) 1982-05-19
JPS57110189A (en) 1982-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Murao et al. Isolation of amylase inhibitor-producing microorganism
KR970000185B1 (ko) 아실아미노산 라세마제, 그의 제조방법 및 용도
US4226941A (en) Process for the optical resolution of d,l-2-amino-4-methylphosphinobutyric acid
HU188709B (en) Process for the enzymatic deest rification of cephalosporin methyl esters
AU615661B2 (en) Acid urease and production thereof
CA1195272A (en) Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters
JPH038197B2 (hu)
EP0358428B1 (en) Process for producing optically active compounds
EP0414914B1 (en) New substance trehalostatin and production thereof
JP3586684B1 (ja) バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換する新規微生物
JP3799784B2 (ja) ２，６−ジアミノプリン−２’−デオキシリボシドおよび２’−デオキシグアノシンの製造法
US4587214A (en) Process for preparation of aspartylphenylalanine alkyl esters
JPH01199576A (ja) α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
Murao et al. Isolation of metallo-proteinase inhibitor (FMPI) producing microorganism
OGAWARA et al. A NEW 5'-NUCLEOTIDASE INHIBITOR, NUCLEOTICIDIN I. TAXONOMY, FERMENTATION, ISOLATION AND BIOLOGICAL PROPERTIES
JPH06292578A (ja) 耐熱性マンノースイソメラーゼ及びその製造法並びにこれを用いたマンノースの製造法
EP0159866B1 (en) Process for production of l-amino acids
JPH0669380B2 (ja) バリエナミンおよびバリダミンの製造法
JPH0515387A (ja) 細菌によるアルギン酸の分解法
US4264734A (en) Process for producing antibiotic desacetyl 890A10
JPS60995B2 (ja) ７−アミノ−セフアロスポラン酸およびその誘導体の新規製造法
EP0275065A2 (en) New phosphorylase producing microorganism
US3933790A (en) Phosphorylxylostasin
JPH01228495A (ja) 酵素阻害剤、その製法並びに用途
KR960007741B1 (ko) 신규 α-1, 6-글루코시다제 및 그의 제조방법