JPS60995B2 - ７−アミノ−セフアロスポラン酸およびその誘導体の新規製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は７−アミノーセフアロスポラン酸を初めとする
一般式

〔０〕（式中、ｎは０又は１であり、Ｒは水素原
子又は金属原子であり、Ｘは水素原子、水酸基、アセト
キシ基又はチオ硫酸塩基である）で表わされる７ーァミ
ノーセフェム化合物又はこれの塩の製法に関する。 さらにその目的とするところは抗菌作用を有する合成セ
フアロスポリン類の製造において重要な中間原料物質と
して使用される７−アミノーセフアロスポラン酸を新規
で簡単な操作で効率よく製造する方法を提供せんとする
ものである。優れた抗菌剤として使用されている合成セ
フアロスボリン類の中間原料物質である７−アミノ−セ
フアロスポラン酸（以下７一ＡＣＡと省略）は、醗鍵蓬
法で得られるセフアロスポリンＣを、これの７位アミノ
基に結合したアシル基を脱除する反応（以下、脱アシル
化と省略）にかけることにより合成されている。セフア
ロスポリンＣの脱アシル化は化学的に行なう方法が多数
報告され、現在化学的方法で工業的に行なわれている。 セフアロスポリンＣの化学的脱ァシル化法は工業的に色
々欠点が多い。例えば代表的な特許として特公昭４１−
１３８６２号及び特公昭４５−４０８９ｙ号の方法があ
り、これらはそれぞれ「ィミノハライド法」および「シ
リルクロライド法」としてよく知られているが、これら
の公知方法の欠点を要約して挙げれば以下の通りである
。【１｝ 反応工程が多く、一連の工程を行なうのに操
作が繁雑で長時間を要する。 （２’一４０ｑｏまたは−６０ｑｏの極度な低温、反応
条件を必要とし、また強酸性物質を反応に用いるため、
低温や腐蝕に耐える装置が必要で、反応装置のコストが
高くつく。 ｛３｝ 反応に用いる試薬のコストが高い。 ‘４｝ 一連の化学反応の結果、大量の化学物質が排出
され、その処理が問題となる。【５｝ 原料物質のセフ
アロスポリンＣが高純度であることが必要で、その純度
が低いと反応収率が著しく低下する。 これに対して、セフアロスポリンＣの脱アシル化を微生
物または酵素で行なうことが可能であれば工業的に極め
て有利であることは予測されていた。 すなわち「ペニシリンから６−アミノーベニシラン酸（
６一ＡＰＡ）の製法における成功例から類推されること
であるが、微生物または酵素でのセフア。スポリンＣの
脱アシル化法の開発に成功するならば、その方法は、反
応が一工程でよく、しかも酵素作用に通した温和な反応
条件で実施でき、簡単な反応装置で操作が可能であり、
更に原料のセフアロスポリンＣが低純度であっても効率
よく使用出来るであろうから、化学的脱アシル化法に較
べ工業的に極めて有利であろうと予測される。従来、セ
フアロスポリンＣの微生物ないし酵素的脱アシル化方法
の探索は多くの研究者によって行なわれて釆たが全て不
成功に終り、現在迄信頼すべき報告は見当らない。 この詳細はフリン著「セフアロスポリンズ アンドベニ
シリンズ」（Ｅ，日，Ｆｌｙｎｎ；ＣｅｐｈａｌｏＳｐ
ｏｎ船 ａｎｄＰｅｎｉＣｉｌｌｍＳ、Ａｃａｄｅｍｅ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ．、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌ
ｏｎｄｏｎ、１９７２王）の３刀貢以下に記載されてい
る。それはセフアロスポリンＣの７位側鎖の特異な構造
（Ｄ−５−アミノー５ーカルポキシバレリルアミノ基）
のため酵素的に直接この脱アシル化を行なうことが極め
て困難であることに困るとされている。ごく最近、セフ
アロスポリンＣの７位側鎖であるＤ−５ーアミノー５ー
カルボキシバレリルアミノ基を微生物酵素（Ｄーアミノ
酸酸化酵素）で−旦５−カルボキシ−５−オキソバレリ
ルアミノ基または５−カルポキシーブチリルアミノ基に
変換した後（特関昭４７−３９５９５号）、そのアシル
基を微生物酵素で脱除する方法、即ち二段階の酵素反応
で目的の脱アシル化を行ない７一ＡＣＡを得る方法が報
告されている（侍開昭５０−１０１５８４号、特関昭５
１−７０機４号）。本発明者らは長年、セフアロスポリ
ンＣの脱アシル化を直接に行ない得る酵素の給源を広く
微生物に求め探索した結果、先に糸状菌酵素を用いる脱
アシル化法を見出した（特磯昭５１−５９１９８号）。 更に今回、シュードモナス属に属する一細菌が強力な脱
アシル化酵素を生産し、セフアロスポリンＣ及びその誘
導体に作用すると、これらから７−ＡＣＡ及びその誘導
体を生成する能力を有することを見出し本発明を完成し
た。この脱アシル化酵素はセフアロスポリンＣの７位ア
シルァミノ基におけるアミド結合を特異的に加水分解に
より分解させる酵素（セフアロスポリンＣ・アシラーゼ
）であって、このセフアロスポリンＣ・アシラーゼ生産
菌の一例としてシュードモナス属に属する細菌シュード
モナス・ェスピーＢＮ−１腿（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ．ＢＮ−１８８）を発見した。 この細菌の生産する酵素が行なう加水分解反応を利用し
てセフアロスポリンＣから７−アミノ−セフアロスポラ
ン酸を生成する方法は簡単に次のように示される。 セフアロポリスンＣ・アシラーゼ による酵素反応 ここでシュードモナスｓｐ．ＢＮ−１８８が産生する酵
素、セフアロスポリンＣ・アシラーゼは、セフアロスポ
リンＣの７位アシルアミノ基を特異的に水解するばかり
でなく、セフアロスポリンＣの種々な譲導体に作用した
場合にも、それの７位アシルアミノ基のアミド結合を加
水分解して、対応の７ーアミノーセフアロスポラン酸誘
導体を生成せしめる能力をも有することが見出された。 すなわち、シュードモナスｓｐ．ＢＮ−１８８の脱アシ
ル化酵素は、セフアロスポリンＣの各種Ｎ−誘導体にも
作用して対応の７ーアミノーセフェム化．繁合物を生成
する。またセフアロスポリンＣの３位がヒドロキシメチ
ル基であるデアセチルセフアロスポリンＣ及び同じく３
位がメチル基であるデスアセトキシセフアロスポリンＣ
に対しても脱アシル化作用を示すのみならず、同じく３
位メチル基がチオ硫酸基で置換された化合物に相当する
セフアロスポリンＣブンテソルトに対しても脱アシル化
作用を示すことを知った。従って、本発明の要旨とする
ところはし一般式〔１〕（式中ｎは０又は１であり、Ｒ
，は水素原子、アセチル基で置換されていてもよいアル
カノィル基、アルコキシカルボニル基、置換されていて
もよいァロィル基、Ｎ−アリールカルバモィル基、置換
されていてもよいアリール基、又は置換されていてもよ
いアリールスルホニル基であり、Ｒは水素原子又は金属
原子であり、×は水素原子、水酸基、アセトキシ基、又
はチオ硫酸基であり、但しｎが１である場合にはＲ，は
ニトロ置換されていてもよいアリール基である）で示さ
れるセフアロスポリンＣ化合物またはこれと金属あるい
は有機塩基との塩にシュードモナス・ェスピーＢＮ−１
８８株（徴工研菌寄第３５６ぴ号）の培養物またはその
処理物を水性媒体中で作用させることを特徴とする、７
−ァミノーセフアロスポラン酸を含めて−般式〔ロ〕（
式中ｎ、Ｒおよび×は前記と同じ意味を有する）で表わ
される７−アミノーセフヱム化合物又はこれの塩の製造
法にある。 本法で使用される原料化合物〔１〕において、Ｒ，、Ｒ
および×について前記した基は核酵素反応に関与せず、
実質的に酵素反応を阻害しない基である。 Ｒ，は水素原子；アルカノィル基、例えばホルミル基、
ドデカノィル基；アセチル基を置換されたァルカノィル
基、例えばアセトアセチル基：アルコキシカルボニル基
、例えばィソプチルオキシカルボニル基；置換または置
換されないアロィル基、例えばペンゾイル基；ｐ−ニト
ロベンゾィル基：Ｎ−アリールカルバモィル基、置換ま
たは置換されないアリール基例えば２・４ージニトロフ
ェニル基；又は置換または置換されていないアリールス
ルホニル基例えばベンゼンスルホニル基、トシル基であ
ることができる。Ｒは水素原子又は金属原子を意味する
。 Ｒが例えばアルカリ又はアルカリ士類金属の場合は化合
物〔１〕はアルカリ金属又はアルカリ士類金属塩の形で
あり、またＲが水素の場合は化合物〔１〕は遊離カルボ
ン酸の形であり、またこれは有機塩基、例えばトリメチ
ルアミン、トリェチルアミンの如き第３級ァミンとの塩
の形であってもよい。Ｘは水素原子、水酸基；アセトキ
シ基、又はチオ硫酸基（ブンテソルト）である。本発明
で使用する細菌は本発明者らが和歌山県の土壌より新ら
たに分離したシュードモナス・ェスピーＢＮ−１８８で
あり、その菌学的性状を示せば以下の通りである。 ＢＮ−１８８珠の菌学的性状 ‘ａ｝ 形態的性質 肉汁寒天上で培養した細胞は０．４〜０．６×０．８〜
１．５ミクロンの樺菌であり、極毛性のペン毛で運動す
る。 胞子は作らず多形性も示さない。グラム染色性、抗酸性
はともに陰性である。｛ｂ｝ 培養的性質 ‘１’ 肉汁寒天平板培養及び肉汁寒天斜面培養：菌体
は黄茶色を呈して増殖する。 集落は顕著なシワ様増殖、粘榊性、遊走性を示さず、拡
散性色素の生産も認められない。■ 肉汁液体培養：塔
地全体が濁り液面に薄い菌膜を形成する。 ‘３’肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンの液化は認めら
れない。 ‘４１ リトマスミルク培養：カゼインの液化、色調な
どに顕著な変化は認められない。 ｛ｃ）生理的性質 ｛１’ 硝酸塩の還元：陽性 【２）脱窒反応：陰性 ■ ＭＲテスト：陰性 ■ ＶＰテスト：陰性 ‘５１ インドールの生成：腸性 ■ 硫化水素の生成：陰性 ‘７’デンプンの加水分解：陰性 棚 クエン酸の利用：陽性 ｛９｝ 無機窒素源の利用：アンモニウム塩を唯一のＮ
源として利用する。 肌 色素の生成；キングＢ培地でわずかに黄緑色の蜜光
色素を生成する。 ＯＵ オキシダーゼ：腸性 ０２ 生育温度；１０ｑｏ〜３０つ０でよく増殖するが
４０℃では増殖しない。 ０３ 栄養要求性：醸し 肌 嫌気下の増殖は認められない。 ０３ ０Ｆテスト（ヒューレィフソン法）：流動パラフ
ィンの有無に関係なく酸生成は認められない。 ■ 炭素源の利用性 ｉ）利用するＣ源：グルコース、グリセリン、クエン酸
、酢酸、２ケトグルコン酸、アルギニン、バリン ｉｉ）利用できないＣ源：○ーフコース、マルトース、
スターチ、セロビオース、ノルロイシン、ラクトース ０７）以下の糖類から酸及びガスの生成は認められない
。 Ｌ−アラビノース、Ｄーキシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース」○ーガラクトース
、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビツ
ト、Ｄ−マンニツト、イノシツト、グリセリン、デンプ
ン。 ■ ウレァーゼ：陰性 脚 力タラーゼ：陽性 以上の函学的性質を有するＢＮ−１８群券をパージーズ
・マニュアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ′ｓ Ｍａｎ肌ｌ ｏｆＤｅ企て
ｍｉ岬ｔｉｖｅ母ｃｔｅｒｂｌｏｇｙ）第８版（１９７
４）の記載と比較し次の結論を得た。 １ グラム陰性樟菌で胞子を作らず極毛によって運動す
るという形態的性質を有し絶対好気性であることから、
この菌株はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属に所属すると同定できる。 ２ ゼラチン水解陰性、受光色素の生成、炭素源の利用
能パターン、脱窒反応陰性、生育温度などの性質からこ
の菌株はシュードモナス属の中でもシユードモナス・ブ
チダ（ＰｓｅｕｄｏｍｏＭｓｐｕｔｉ雌）種に近縁であ
ると判定できる。 なお本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所にＦＥ
ＲＭ一Ｐ Ｎｏ．３５６０として寄託されている。上記
に示した菌株は、他の一般微生物の菌株の場合に見られ
るようにその性状が変化しやすく、例えば紫外線、高周
波、放射線や化学変異剤等を用いる人工変異手段で変異
しうるものであり、このような変異株であっても目的の
セフアロスポリンＣ・ァシラーゼ生産能を有する菌株は
全て本発明の方法に使用することが出来る。 目的の７ーアミノセフェム化合物

〔０〕を製造するため
に本発明の方法を実施するに当っては、先ずシュードモ
ナス・ェスピーＢＮ−１８玖珠（セフアロスポリンＣ’
アシラーゼ生産菌）を培養し、得られる培養物またはそ
れらの処理物を、原料化合物〔１〕に酵素反応に適当な
条件の下で水性媒体中で作用させるのがよい。 ＢＮ−１８筑紫細菌の培養物を得るための培養方法とし
ては、通常微生物が利用しうる栄養物を含有する培地で
培養することが出釆る。 栄養源としては一般微生物培養に利用される公知のもの
が使用出来る。例えば炭素源としてグルコース、シュ−
クｑース、澱粉、グリセリン、水飴、糟蜜、大豆油等を
使用しうる。また窒素源としては大豆粉、小麦歴芽、肉
エキス、ベプトン、コーンステープリカ−、乾燥酵母、
硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等を使用しうる。そ
の他必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カリシウム、燐
酸塩等の無機塩のほか、菌の発育を助け、前記脱ァシル
化館、即ちセファロスポリンＣアシラーゼの生産促進に
必要な添加物を適宜組合せ使用することが出来る。培養
方法としては微生物一般に用いられる培養法則ち固型培
養方法ならびに液体培養法が可能であり、工業的には深
部培養法が適している。培養は好気的条件で行なわれ、
培養温度は２５〜３７０の範囲で選ばれるが、多くの場
合２８ｑｏ付近で行なうのが適当である。培養時間は培
養条件等に、培養装置、培地組成、培地温度などにより
異なるが、脱アシル化能が最大になる時点に培養を終了
するのが良い。例えば培地の種類や濃度によって多少異
なるが、培養１日目からアシラーゼ活性が見られ２〜３
日でその活性は最大となり、それ以後活性は低下し消失
する。従って通常２〜４日間が適当である。上記の方法
で得られた細菌培養物またはその処理物が式〔１〕の原
料化合物の脱アシル化反応に利用されるが、ここでいう
培養処理物とは、培養物に適当な処理を加えて目的の７
−アミノセフアム化合物の生成能率を高め、目的物の製
造に有利な形にしたものを指し、例えば培養物から集菌
洗浄された菌体又は菌体の砕砕物、若しくはこれから分
離された粗製又は精製の脱ァシル化酵素液又は当該酵素
であるのがよい。 本法において、脱アシル化反応によって〔ロ〕の化合物
を製造する場合、通常、反応は水性媒体中で行なわれる
。その場合の反応条件であるが、培養菌体内に存在して
脱ァシル化能の本体をなす菌体内酵素、即ち「セフアロ
スポリンＣ・アシラーゼ」のおよその性質を示せば、反
応はｐＨ６〜８で脱アシル化作用があり、ｐＨ５以下又
は９以上では活性が低下するか又は認められない。作用
温度は２８〜４０℃であるが、５０℃以上では失活する
。従って反応ｐＨは６．５〜７．ふ反応温度は２８〜４
０℃が好適である。原料化合物〔１〕を含有する液中に
菌体を分散した懸濁液の中で反応が実施されるのが好ま
しいが、この際、適当な振濠または凝拝を伴なわせる方
が効果的である。あるいは培養物またはその処理物を一
日力ラムに充填し、原料化合物〔１〕の水溶液がこのカ
ラム内を通過する際に脱アシル化反応が連続して行なわ
れるような形で実施することも可能である。反応時間は
基質（原料化合物〔１））濃度、脱アシル化酵素活性の
強さや反応温度などに左右されるが、通常２〜２畑時間
であって、目的の７−ァミノーセフェム化合物〔ｎ〕が
最高に生成される時間を検討し、適当な時間で反応を終
了すればよい。基質濃度は主として脱ァシル化活性の強
さとの関係で決められるが０．１〜１０％の範囲で適当
に選ばれる。一方、反応中、反応液が他の微生物に汚染
されることを防ぐ目的で適当な汚染防止剤を用いること
も可能である。以上のごとくして生成される７−アミノ
ーセフェム化合物〔ｎ〕は、既知の手法を用い精製され
る。 例えばイオン交樹樹脂を用いる方法、カラムクロマトグ
ラフィー、等雷点沈澱法、あるいは反応終了液またはそ
の精製途中の段階で適当な有機酸等を反応させ、目的物
の誘導体を形成させたり、水不溶性の塩を形成させ有機
溶媒で抽出したり、反応液から分離される形にして精製
する方法等、またそれらの方法を適宜組合せて用い目的
物を精製することが出来る。なお本発明の方法において
、原料化合物〔１〕としてのセフアロスポリンＣ類に微
生物菌体を作用させて得られる反応縁液中に生成した７
ーアミノセフェム化合物は後記の方法〔Ａ〕又は〔Ｂ〕
で定量できる。 ７ーァミノーセフェム化合物の定量法 〔Ａ〕使用基質（式〔１〕の原料化合物）が有機溶剤に
可溶性である場合試薬：Ａ液；２％フェニルアセチルク
ロラィドーアセトン溶液Ｂ液；５％重炭酸ナトリウム水
溶液 基質溶液と培養菌体との反応濠液１の‘をＩＮ塩酸でｐ
Ｈ２．５に調節し「等量の酢酸エチルで２回抽出洗浄し
たのち、ＩＮ苛性ソーダでｐＨ７に調節し、０℃でＢ液
０．６私を添加し、直ちにＡ液２の‘を加え、６０分０
℃に保つ。 次にこの反応濠液の抗菌活性を、検定菌としてバチルス
，ズブチリスＡＴＣＣ６６３３を用いた検定シャーレを
用い、ペーパーディスク法により微生物検定（３７００
、１筋時間）法で測定する。一方、標準品の７−アミノ
−セフェム化合物の適当な既知濃度段階の水溶液を数種
調製し、これら水溶液を上記と全く同機にフェニルアセ
チルクロラィドと反応させ、このものの抗菌活性と７−
アミノーセフェム化合物の濃度との関係曲線から７−ア
ミノーセフェム化合物の検量線を求め、これと比較によ
り反応溝液中の７−アミノーセフェム化合物の生成量を
算出することが出来る。その生成量は基質に対する目的
生成物の量の百分率を表わす生成率で表わすことができ
る。〔Ｂ〕使用基質が有機溶媒に不溶性である場合試薬
類その他；べーパ÷クロマトグラフイー 炉紙；東洋炉紙ＮＯ．５０２肌×４０肌 溶媒系；アセトニトリル；水＝４こ１ 高圧炉紙電気泳動 緩衝溶液；ギ酸：酢酸＝１：４の梶液 （ｐＨＩ．９） 炉紙；東洋炉紙ＮＯ．５１ 電圧；１６０Ｖ′伽、泳動時間３０分 基質と菌体との反応混液またはその濃縮液の一定量をマ
イクロピペットで東洋炉紙Ｎｏ．５０に付し、上記溶媒
系を用い室温で４時間下降展開する。 炉紙を風乾後、原点より７．５弧のところおよび１３．
５伽のところを中心として、それぞれ３伽中に切り取り
、ｐＨ７、０．０８Ｍの燐酸緩衝液２叫でよく抽出し、
その１の‘を前記１の方法でフェニルアセチルクロライ
ドと反応させ、その抗菌括性を測定する。この方法によ
り原点より７．５弧の部分はデアセチル−７ーアミノー
セフアロスポラン酸（Ｄ一７一ＡＣＡ）またはデスアセ
トキシー７−アミノーセフアロスポラン酸（７−ＡＤＣ
Ａ）が、また原点より１３．５肋のところは７−ＡＣＡ
が分別定量されそれぞれの生産率が算出される。基質が
セフアロスポリンＣブンテソルト〔式〔１〕のＸがＳ・
Ｓ０３Ｍである場合を指し（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｍ
ｓａｎｄＰｅｎｉｃｉｌｌｈｓ、２０頁、１９７２年、
Ｅ．日．Ｆｌｙｎｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
、ＮｅｗＹｏｒｋａｎｄ功ｎｄｏｎ参照）、但しＭは無
機又は有機塩基を意味する〕の場合は反応猿液またはそ
の濃縮液の一定量を前記と同様にフェニル酢酸と反応さ
せ、その一定量を東洋炉紙ＮＯ．５１に付し、高圧炉紙
電気泳動を行ない、炉紙を風乾後、原点より陽極側６弧
のところを中心に中３伽に切取り、前記と同様に抽出し
、抗菌活性を測定することにより生成した７一ＡＣＡ−
ブンテソルトをそのフェニルアセチル化物の抗菌活性よ
り定量出来る。 実施例 １ グルコース１％、肉エキス０．３％、ベプトン０．５％
、グルタミン酸ソーダ０．２％及び硫酸マグネシウム０
．００５％の組成からなる培地（ｐＨ７．０）２０そを
３０そ容量ジャーファーメンターに仕込み殺菌後、予め
同培地で前培養したシュードモナスｓｐ．ＢＮ−１８８
（徴工研菌寄第３５６ぴ号）を２％になるように殖菌し
、２８ｑｏで４幼時間通気縄梓培養した。 培養終了後、菌体を連続遠心機で集菌し、３００の‘の
生理食塩水で洗浄して洗浄菌体４５夕（湿潤重量、以下
同称）を得た。この菌体５夕を２００の‘のＭ／２０リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にけん濁し、これにセフアロ
スポリンＣ（純度８４％）１夕を添加して、３７０で振
浸しながら７時間反応した。 この反応液中の７−ＡＣＡの生成率（前記の定量法で測
定）は３７．１％であった。反応液を遠心分離し菌体を
除き、蒸溜水で４倍に希釈し５０の‘のＤＥＡＥーセフ
アデツクスＡ−２５（ＣＩ−型、ファルマシア社製）の
カラムを通した後、約１５０叫の蒸溜水でカラムを水洗
する。 次に０−０弧の食塩水を通すと７−ＡＣＡが溶出され、
更にｏ．ＩＭの食塩水で未反応のセフアロスポリンＣが
溶出された。７−ＡＣＡの溶出画分３０の‘を州水酸化
ナトリウム溶液でｐＨ６．８に調節して、予めＭ／１５
リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で緩衝化したダイヤイオン
Ｈｐ−２０（三菱化成製）３０のとのカラムを通過させ
、次に蒸溜水を通し充分カラムを水洗した後、５０％メ
タノール水を通すと始めの３０Ｍに７‐ＡＣＡが溶出さ
れた。 この熔出液を州塩酸でｐＨ３。２‘こ調節し「約５の‘
に減圧濃縮した後、５℃に一夜静暦すると４一ＡＣＡが
析出した。 沈澱物を遠心分離して集め少量の冷水で水洗し真空乾燥
して１２０の９の７一ＡＣＡを得た。定量の結果得られ
た７−ＡＣＡは純度８５％であり、用いたセフアロスポ
リンＣに対するＡＣＡの実収率は１８．４％であつた。
実施例 ２ 実施例１で得た菌体２夕を５０のＺの生理食塩水にけん
濁し、トルヱン２．５の‘添加し、２がｏで６０分振浸
した。 遠０分離にて菌体を集め、５０の‘のＭ／２０リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）にけん濁させ、セフアロスポリンＣ
（純度８４％）１夕を添加し３７０で５時間振濠反応さ
せた。この場合の７−ＡＣＡの生成率は７５．２％であ
った。反応終了液を遠心分離して除菌し蒸溜水を液量４
倍になるよう加え希釈後、実施例１の場合と同機に操作
して純度８３％の７一ＡＣＡ１５８の９を得た。 実収率は２３．８％であった。実施例 １ Ｎ−（２・４ージニトロフエニル）セフアロスポリンＣ
Ｉ夕を１００の‘のＭ／２０リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に溶解し、実施例１で得た菌体２夕を添加しよく縄
拝し、３７０で５時間振盤反応させた。 遠心分離にて除菌した反応混液を州塩酸でｐＨ３．５に
調節した後、１００泌の酢酸エチルで３回抽出して未反
応のＮ−（２・４ージニトロフェニル）セフアロスポリ
ンＣを除去した。 水層部分をｐＨ４．２に調節後１０の‘まで減圧濃縮し
て５００に一夜静遣した。析出した７一ＡＣＡを集め真
空乾燥して純度８２％の７−ＡＣＡ２０５雌を得た。実
収率は３５．９％であった。実施例 ４ 実施例１で得た菌体１夕を５０泌のＭノ２０リン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）にけん濁し、デアセチルセフアロスポ
リンＣ５００の‘を添加して燭拝しながら３７℃、５時
間反応させた。 遠心分離にて除菌した反応液を蒸溜水で２倍に希釈して
５０の‘のＤＥＡＥ−セフアデックスＡ−２５（ＣＩ‐
型）のカラムを通し、カラムを蒸溜水で水洗後、０．２
Ｍ食塩水を通すとＤ−７ＡＣＡが溶出された。 この画分２０の‘を５の【まで減圧濃縮して、則塩酸で
ｐＨ４．２に調節し５℃に一夜静瞳した。析出したＤ−
７ＡＣＡを遠心分離にて集め１の‘の冷水で洗浄後、更
にメタノール水（メタノール：水＝２：１）２地で洗浄
後真空乾燥して、純度８６．２％のＤ−７ＡＣＡ６５の
９を得た。実収率は１８．２％であつた。実施例 ５ シュードモナスｓｐ．ＢＮ−１８８を実施例１と同じ方
法で培養して得た洗練菌体０．２夕（湿潤重量）と各種
の基質の１％水溶液（ｐＨ７．０、Ｍ／２０リン酸緩衝
液）５風【を試験管にとり、チューブシェーカーにて３
７ｑ０で５時間振盤反応させ、その反応液中の生成物を
前記の定量方法で測定した。 各生成率の値は「用いた基質に対する目的生成物の百分
率で示した。結果は次表に示す通りである。 第１表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式〔I〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｎは０又は１であり、Ｒ＿１は水素原子、アセチ
   ル基で置換されてもよいアルカノイル基、アルコキシカ
   ルボニル基、置換されていてもよいアロイル基、Ｎ−ア
   リールカルバモイル基、置換されていてもよいアリール
   基、又は置換されていてもよいアリールスルホニル基で
   あり、Ｒは水素原子又は金属原子であり、Ｘは水素原子
   、水酸基、アセトキシ基、又はチオ硫酸基であり、但し
   ｎが１である場合にはＲ＿１はニトロ置換されてもよい
   アリール基である）で示されるセフアロスポリンＣ化合
   物またはこれと金属あるいは有機塩基との塩にシユード
   モナス・エスピーＢＮ−１８８株（微工研菌寄第３５６
   ０号）の培養物またはその処理物を水性媒体中で作用さ
   せることを特徴とする、７−アミノ−セフアロスポラン
   酸を含めて一般式〔II〕▲数式、化学式、表等がありま
   す▼（式中ｎ、ＲおよびＸは前記と同じ意味を有する）
   で表わされる７−アミノ−セフエム化合物又はこれの塩
   の製造法。