SU958498A1 - Способ получени @ -маннаназы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а -МАННАНАЗЫ

1

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к производству ферментных препаратов, и касаетс  фермента а маннаназы, котора  может быть использована в научно-исследовательских биохимических и химических лаборатори х в качестве аналитического препарата при устаиовлении структуры маннанов, а также дл  гищ)олиза маннанов и маннозосодержащих биополимеров при различных технологических процессах, когда их присутст- , вие нежелательно, в частности при получении биологически активных веществ их дрожжей, при гидролизе высокополимериых углеводсодер-. жащих веществ в винах и пр.

Известен способ получени  фермента, расщепл ющего дрожжевой машин, с помощью культуры Arthrobacter G-IM, .хран щейс  в коллекции живых культур лаборатории биохимии Калифорнийского университета (Беркли, 20 США), питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в уо лови х аэрации. Продуцент синтезирует внеклеточную маннаназу на среде состава, в г/л:

Дрожжевой маннан1,0

Аммоний сернокисль1й0,5

Магний сернокислый0,2

Железо сернокислое закисное 0,01

Кальций хлористый

0,05

двухводный 0,5

Дрожжевой экстракт

Калий фосфорнокислый

7,54

даузамещенный

Калий, фосфорнокислый

2,32

однозамещенный До 1 л и

Вода

Ферментаци  проводитс  при 30 С на качалке в течение 36 ч. Маннаназна  активность культуральной жидкости составл ет 5-6 ед/мл.

15

Недостатком этого способа  вл етс  применение в качестве продуцеита «-маннаназы недоступного дл  Использовани  в нащей стране штамма микроорганизма из рода Arthrobacter,

Цель изобретени  - повышение активности целевого продукта и его удешевление.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  а-маннаназы путем культивировани  микроорга1дазма продуцента 3, 958 на питательной феде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и воду, в услови х аэрации, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropolis ИМВ-19 а в качестве источника углерода - клетки пекарских дрожжей в количестве 10-20 г/л. Штамм ИМВ-19 выделен из лесной почвы в районе г. Киева. Хранитс  в центральном музее промышленных микроорганизмов, ВНИИГенетика под номером ЦМПМ S-555. Штамм имеет следующую характеристику. Морфологические признаки. Культура N.ery- thropolis ИМВ-19 не образует воздушного мицели . При росте на органических средах клетки 14-16-часовой культуры представл оот собой длинные тонкие пр мые или слегка нскривленные палошси, иногда разветвленные. К 24 часам роста клетки станов тс  палочками средних размеров (6-8 мк х 0,6-1,0) „ по шл ютс  кокки. К 36 часам роста наблюдаетс  преобладание кокковидных клеток. Клетки ве имеют капсул и эндоспор, неподвижные, грамположительные, слабо кислотоустойчивые. На агаризованных органических средах рост культуры N.erythropolis ИМ1В-19 обильный, колонии гладкие, блест щие, пастообргсвные, бледнорозовые. При росте в МПБ культура образует муть и обильный осадок. Культуральные и биохимические свойства к Штамм N.erythropolis ИМВ-19 растет при 10-40°С (оптимальна  температура 28°С при значени х рН среды 6,0-10,0 в аэробных услови х. Предлагаемый в качестве продуцента а -маннаназы микроорганизм способен расти на средах с 5% NaCt, но не растет при 7% зтой соли в среде. В гидролизатах клеток этого штамма обна-. ружены в больших количествах арабиноза, галактоза и глюкоза, а также мезодиаминопимели нова  кислота и характерный гщ  нокардий липид LCN-A. Культура N.erythropolis ИМВ-19 (Жраживаетс образованием кислоты глюкозу, сахарозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, фруктозу, глицерин маннит, сорбит и не сбраживает арабинозу, галактозу, лактозу, мальтозу, раффинозу, сорбо зу, салицин, дульцит и метил-D-глюкозид. Штамм N.erythropolis ИМВ-19 способен использовать в качестве единственного источ1шка углерода натриевые соли лимонной, молочной, пировиноградной, уксусной,  нтарной и бензойной кислот, а также дрожжевые а -маннаны.. Найтрий виннокислый и и авелевокисльш культурой не утилизируютс . Микроорганизм растет на средах с аммонийными сол ми в качестве истоадика азота, Штамм не пептонизнрует молоко, не разжижает желатину, не гищ)олизует крахмал, нитрат йосстанавливает до Нитритов слабо, образует ирозиназу, каталазу, р-нитрофенолоксидазу. На звестной полусинтетической среде при глубином выращивании синтезирует внеклеточную маннаназу. . Активность к 36 часам выращиани  составл ет 10-17 ед/мл культуральной идкости. Сущность способа состоит в том, что штамм .erythroJMjIis ИМВ-19 вырагцивают на среде, тличающейс  от описанной выше и использоавшейс  дл  выращивани  продуцента в-мананазы из рода Arthrobacter, а именно на среде, одержанхей вместо дрожжевого маннана в каестве источника углерода клетки пекарских рожжей и имеющей состав, г/л: Клетки пекарских дрожжей10-20 Аммоний сернокислый0,2-0 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,03-0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7 4 Калий фосфорнокислый однозамещенньга .. Вода водопроводна До 1 л рН7,0-7 Замена в среде дс огосго щего и трудно нарабатываемого в лаборатортшпс услови х маннана клетками пекарских дрожжей и устранение из нее дрожжевого экстракта делает среду экономически более выгодной и более доступной дл  изготовлений. Предлагаемый, способ полуэдни  а-маннаназы состоит из двух стадий. Стади  i . Выращивание инокулюма. Питательную среду засевают 1маточной культурой N.erythropolis ИМВ-19, выращенной на плотной среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей /3,0 . Аммоний сернокислый0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый .0,05 Железо .сернокислое закисное0,01 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный2 ,32 Дрожжевойжстракт .0,5 Агар-агар15-20 Выращивание инокулюма провод т в жидкой среде, состава, г/л воды: Клетки пекарских щюжжей10,0 Аммоний сернокислый0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 5958498 Калий фосфорнокиотый одиозамещенный2,32 рН7,0-7.2 Выращивание провод т в 0,5-литровых колбах со 100 мл феды на качалке с 220 -. 240 об/мин в течегае 24-30 ч при 27-29°С. Стади  2. Биосинтез а-маннаназы. В 0,5-литровые колбы, содержащие 100125 мл аналогичной среды с дрожжевыми кцетками (состав ее приведен выше), внос т 5% fo к объему среды инокулюма. Ферментацию ведут на. качалке с 220-240 об/мин при 27-29° С в течение 36-40 ч. Активность культуральной жидкости к этому времени составл ет 10- 17 ед/мл, в 5-7 ч она остаетс  ста- is . бильной, затем начинает медленно снижатьс . Активность а-маннаназы определ ют по нарастанию количества редуцир5тощего сахара (маннозы) в инкубационной смеси, содержащей исследуемый материал (культуральную 20 жидаость), субстрат (маннан пекарских (дрожжей ) и соответствующий Зуфер. За едию1цу активности принимают такое количество фермента , которое обуславливает образование 1 мкмол  маннозы при гидролизе маннана в услови х опьпа за 1 ч. Количество редуцирующего сахара (маннозу) определ ют по методу Нельсона-Сомоги. Фермент из культуральной жидкости выдел ют известным способом. Полученный с помощью N.erythropolis ИМВ-19 препарат а-маннаназы катализирует гидролшз а-мананов по св з м 1,2 и 13 с отщеплением маннозы. Использование предлагаемого способа может бь1ть проиллюстрировано следующими примерами. Пример 1. Выращивание инокулюма щтамма N.erythropolis ИМВ-19 и ферментацию провод т на среде, предложенной дл  синтеза маннаназы микроорганизмом из рода Arthrobacter в 0,5-литровых колбах, содержащих по 100 мл среды, на качалке с 240 об/мин. Колбы дл  выращивани  инокулюма засевают 2-суточной культурой N.erythropolis ИМВ-19 выращенной на агаризованной среде того же состава, и инкубируют их 24 ч при 28° С. За- . тем посевной материал (инокулюм) в количестве 5% к объему среды внос т в ферментацнонные колбы и ведут инкубацию 36 ч при той же температуре. К концу ферментафсн активность культуральной жидкости составл ет 2,6 ед/мл. Вь1деление а-маннаназы из культуральной жидкости осуществл ют известным способом. П р и м е р 2. Выращивание инокулюма провод т на той же среде и в тех же услови х , что и в примере 1. Ферментацию провод т на феде состава, г/л воды: ви жи 13 ра ( п и ны ки в ко и на цу пр в 1 th тав но на N. ре Сухие клетки пекарскнх дрожжей10,0 Аммоний сернокислый.0,5 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,05 Калий фосфорнокислый двузамещенный7 ,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 рН7,0 Выращивание культуры провод т в услох примера 1. .Активность культуральной дкости к концу ферментации составл ет ,7 ед/мл, т. е. в 5 раз выше, чем при выивании прод пдента на среде с маннансм имер 1). Пример 3. Выращивание инокулюма ерментацию провод т в услови х, приведенх в примере 1, на среде, содержащей клетпекарских дрожжей (состав среды приведен римере 2). Активность культуральной жидсти к концу ферментации составл ет 17 ед/мл. П р и м е р 4. Вьфащивание инокулюма ерментацию провод т в услови х примера 1 среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей10,0 Аммоний сернокислый0,2 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый двухводный0,03 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 Активность культуральной жидкости к конферментации (40 ч) составл ет 10,6 ед/мл. Пример 5. Выращивание инокулюма вод т на среде, приведенной в примере 2, слови х примера 1. Ферментацию провод т в услови х примера а среде состава, г/л воды: Клетки пекарских дрожжей20,0 Аммоний сернокислый0,2 Магний сернокислый0,2 Кальций хлористый0,03 Калий фосфорнокислый двузамещенный7,54 Калий фосфорнокислый однозамещенный232 Активность культуральной . жидкости N.ery- opolis ИМВ-19к концу ферментации сосл ет ед/мл. Сравнительна  характеристика а -маннаназактивности щтамма N.erythropolis ИМВ-19 различных средах приведена в таблице. Таким образом, предлагаемый штамм rythropolis ИМВ-19 при выращивании на омендованной среде с дрожжевыми клетками

7958498g

про вл ет более высокую (в 2-3 раза) ог-ман- по сравнению г известным в литературе пронаназнуго активность при удешгёвленни сретл,центом этого фермента Arthrobacter G-IM-1.

Ф о р м ула изобретени 

Способ получени  а-маннаназы путем культивировани  микроорганизма продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода, 25 азота, минеральные соли и воду, в усцрви х аэрации, отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности целевого про/дукта и его удеигевлени , в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropolis ИМВ-19, а в качестве источника углеродаклетки пекарских дрожжей в количестве 10- 20 г/л.

Источника информации, прин тые во внима гае при экспертизе 1. Jones G. Н., Ballon С. Е. Isolation of an a-mannosidase whichhidroltsed yeast mannan . Structure of the backbone of yeast mannan .- J. Bfol. Chem. 1968, 243, 9, p. 24422446 .

Claims (1)

1. Ф о р м ула изобретения

   Способ получения α-маннаназы путем культивирования микроорганизма продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода, 25 азота, минеральные соли и воду, в усдрвиях аэрации, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого про дукта и его удешевления, в качестве продуцента используют штамм Nocardia erythropolis ИМВ—19, а в качестве источника углеродаклетки пекарских дрожжей в количестве 1020 г/л.

   Источника информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Jones G. Н., Ballon С. Е. Isolation of an α-mannosidase whiclrhidrol ised yeast mannan. Structure of the backbone of yeast mannan.- J. Biol. Chem. 1968, 243, 9, p. 24422446.