RU2001949C1 - Штамм гриба TRICHODERMA REESEI - продуцент целлюлолитических ферментов - Google Patents

Abstract

Использование: в микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма- -продуцента внеклеточных цеплюпаз, используемых в пищевой промышленности, спиртовой и пивоварении, дл  экстракции растительных внутриклеточных ве- щеав дл  силосовани  кормов Сущность изобретени : получен штамм-продуцент с повышенной продуктивностью, позвол ющий при одностадийной ферментации обеспечить высокую активность фермента в ферментационной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованного субстрата Мутант Trichoderma reesei BCM 182/КК (ВГНКИ-28) получен с помощью парасексуальных процессов из исходной культуры T/eesei krtet 43803. Мезофипек Оптимальна  температура роста мицели  32° С. оптимум образовани  целлюлозы 28° С. Штамм имеет ферментные системы, позвол ющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине , пектине, ксмлане, паминарине, лихенине. Способен утилизировать молочную кислоту. Катабопитна  репресси  биосинтеза цеплюлаз практически отсутствует . При росте на среде, содержащей 1% аморфной целлюлозы, относительна  активность цеппюлаэ не измен етс  при внесении в среду до 5% глюкозы или 5% глицерина При культивировании на жидкой питательной среде на основе свекловичного жома достигаетс  уровень активности в 3,5 - 42 ед/мл FPA (врем  культивировани  110 ч), при культивировании на лактозе - 18J2 ед/мп (81 ч), при культивировании на концентрированной молочной сыворотке - 12 - 14 ед мл (100 - 110 ч) 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма продуцента внеклеточных целлюлаз и других ферментов, лизирующих клеточную стенку. Получаемые целлюлазы и/или мультиферментные комплексы могут быть использованы дл  биодеградации целлюлоза- и гемицеллюлозосодержащих субстратов , в том числе отходов промышленности и сельского хоз йства, дл  биодеградации живых и мертвых клеточных стенок растений, использоватьс  в качестве добавок в кормах, а также в пищевой промышленности, спиртовой промышленности и пивоварении, дл  экстракции растительных внутриклеточных веществ, дл  силосовани  кормов в сельском хоз йстве.

Известны штаммы - продуценты целлюлаз и способы их аэробного культивировани .

Известные способы различаютс  главным образом видами примен емых штаммов грибов, субстратами, используемыми дл  ферментации, и услови ми проведени  процесса. Стоимость полученных ферментов главным образом определ етс  уровнем активности целлюлаз в ферментационной гкогзгтыо (поодуктивносЛю) образован ферментов, выходом ферментов с един 1.ы массы использованного субстрата. стси, елью субстрата.

Lu I зммы грибов рода Trichouerma  вл ть наиболее ктивными продуцентами цел ; члгз. 2 целью говышени  их способности к прсдукц ш целлюлаз и адаптации к Сопее дешев; IM средам были получены различные мутанты T.reesel. Например, в авт. св. СССР № 591502 и № 745933 описаны штаммы Trlcholderma vlride 6-7 и 44, предназначенные преимущественно дл  куготириро jann на средах на основе свек- лпьишого жома В патенте США N 4472504 описано получение целлюлаз мутантом T.reesei MCG 80, который получен из мутан- а T.ieesel RutC30. При использовании питательной среды с 8%-ной целлюлозой и ..пбас ением биотина при непрерывной фс-рмрнтас,ии достигаетс  активность цел- очаз 17 е/д/мл FPA (здесь и далее по е. НА - чкти-рчость целлюлазного «омплексй, определенна  по фильтровальной бума; е и выраженна  в международных единицах согласно рекомендаци м IUPAC: Т К.Chose., Pure ana Appl, Chem., vol. 59.1МО.Г op. 257-268), что соответствует вы- 2 К- лд t-PA на 1 г целлюлазы.

,i-r,, мугзты T.reesel. которые |фи использовании в качестве источника уг- перода глюкозы образуют целлюлазы. С помощью (лтэнта Т reesel V1T-O-79125 на

питательной среде, содержащей 4% глюкозы и 4% твердого остатка зерна после эта- нольной ферментации, достигалась целлюлазна  активность 6,4 ед/мл FPA. Если вместо глюкозы примен лась целлюлоза , то достигалась примерно та же активность целлюлаз (Материалы 3-го Европейского конгресса по биотехнологии, Мюнхен, ФРГ, 10-14.09.84: M.Ballz.

0 Cellulase production by Mutant strains of Trlchoderma reesel on non-celluloslc media). Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению  вл етс  мутант T.reesel IMET 43803 (патент ГДР

5 DD 291673). который обеспечивает высокую продуктивность по целлюлаэам и высокий (до 10 ед/мл FPA при культивировании на лактозе) уровень активности целлюлаэы вследствие частичного уменьшени  катабо0 литной репрессии биосинтеза ферментов.

Этот штамм характеризуетс  следующими признаками. Культивируетс  типичным дл  всех штаммов Trlchoderma образом (например, на картофельно-декстрозном

5 агаре или на агаре спорул ции). Агар Чапе- ка-Доукса не подходит, т.к. использование нитратов как источника азота данным штаммом не осусдества етс . Температурный оптимум Kynbtt зир -лани  28-30°С, врем 

0 культивировани  5-6 сут. плюс 5-7 сут при комнатной температуре до полного развити  штамма. «йересероют с помощью конидий , цвет к о ч ид и и еленый, изначально желто-зегэннй При культивировании на

5 картофельно-декстрозном агаре после 5-6 сут роста диаметр колонии 70-80 мм. Колонии рыхлые, концентрические.

Мутант  вл етс  прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, гли0 церин, ксичозу, Фруктозу в комбинации с аморфной цеп юлозой.

Целью изоорэтени   вл етс  получение высокоактивного дерепрессированного штамма - продуцента целлюлаз, пригодно5 го дл  культивировани  на дешевом сырье в присутствии высоких концентраций саха- ров, в том числе на молочной сыворотке, и обеспечивающего высокие уровень активности целлюлаз в ферментационной среде

0 и выход ферментов с единицы массы использованного субстрата.

Сущность изобретени  заключаетс  в том, что достижени  поставленной цели получен мутант с повышенной продуктивно5 стью, по «о нющий при одностадийной фер- f.emauni. обеспечить высокую активность фермента е ферментационной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованного субстрата При этом в процессе Ферментации скорость образовани  ферментов сохран етс  посто нной и высокой, а дл  культивировани  мутанта используютс  дешевые субстраты.

Мутант T.reesel BCM 18 2/КК получен с помощью парасексуальных процессов из исходной культуры T.reesel IMET 43803. В результате трехступенчатой селекции с последующим отбором клонов.

Мицелий септирован и сильно разветвлен , формируютс  после 30-32 ч роста в виде боковых ответвлений гиф.

На комплексных средах агара (карто- фельно-декстрозный агар, агар дл  спорул - ции. СМ-агар) колонии растут быстро, До начала спорул иии (2 сут.) котонин белые (прозрачные), плоские, с гладкой поверхностью . В дальнейшем образование конидий (фиалоспор) происходит после слабого индуцировани  видимым светом, и на 3 сут колони  приобретает зеленоватую окраску. Образование воздушного (объемного) мицели  не наблюдаетс .

СМ-агар. Через 5-6 сут роста при 30°С диаметр колоний около 40 мм, колонии достаточно плотные, компактные, концентрические , с неровными кра ми, наблюдаетс  выделение в среду желтого пигмента. Прорастание на всю поверхность чашки Петри не происходит.

Картофельно-декстрозный агар. На 5-6 сут роста диаметр колонии 7Q-80 мм. Колонии более рыхлые, концентрические, неровность краев менее выражена. Наблюдаетс  слабое выделение желтого пигмента в сое- ду. Через 10-12 сут. роста колони  занимает всю поверхность чашки Петри.

Минимальна  среда с 2% глюкозы или 2% фруктозы, или 2% глицерина. Слой мицели  существенно тоньше, чем на картофельном агаре, диаметр колоний 70-80 мм, конидии образуютс  через 4 сут роста, спо- рул ци  слаба , выделение пигмента не наблюдаетс . Через 10-12 сут. роста колони  занимает всю поверхность чашки Петри.

Минимальна  среда с 1 %-ной аморфной целлюлазой. Мицелий тоньше, более рыхлый, пигмент в среду не выдел етс . Через 4 сут. роста диаметр колоний 70-80 мм,

При культивировании в глубинных услови х с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуетс  рыхлый разветвленный мицелий без пеллетизации, удельна  начальна  скорость роста мицели  составл ет 0,3 ч , в конце культивировани  0,1ч .

Физиолого-биохимические признаки.

Мезофилен. Оптимальна  температура роста мицели  32°С (30-34°С), оптимум дл  образовани  целлюлазы 28°С(26-30°С). Оптимальный рН роста и секреции целлюлаз

3,5-5,0. Рост мицели  наблюдаетс  и при рН 2,5, но образование целлюлаэ не происходит .

Реэистенци  к нистатину слаба . При 5 поверхностном культивировании устойчив до концентраций 0,5 мкг/мл, при концентрации 2 мкг/мл рост полностью подавл етс . При добавлении в среду дигитонина (4 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 10 мкг/мл) размер колоний уменьшаетс .

Явл етс  прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу , ксилозу, D-маннит, маннозу, трегаллозу, L- и D-арабинозу, сорбозу, сор- 15 бит, 2-дезокси-О-глюкозу (в присутствии глюкозы), рибозу, дезоксирибозу (в присутствии глюкозы), 5-тио-О-глюкозу (в присутствии глюкозы и 2-дезокси-О-глюкозы).

Не ассимилирует: L-рамнозу. D-глюко- 0 замин, 2-дезокси-О-глюкозу, дезоксирибозу , дезоксигалактозу, 5-тио-О-глюкозу.

Использует аммонийную и белковую формы азота, не использует нитратную форму .

5 Имеет соответствующие ферментные системы, позвол ющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине, ксилане, ламинарине, ли- хенине. Способен разжижать желатину. Способен утилизировать молочную кислоту 0 (быстрее, чем лактозу) при концентраци х ниже ингибирующих.

Катаболитна  репресси  биосинтеза целлюлаз практически отсутствует. Проверка катаболитной репрессии биосинтеза цел- 5 люлаз заключаетс  в следующем.

Конидии пересеваютс  в пробирку с минимальной средой, содержащей аморфную целлюлозу и исследуемый репрессор или антиметаболит. Диаметр пробирки - 9 мм, 0 высота столбика агара 50-60 мм. Пробирка инкубируетс  96 ч при 30°С и 20 ч при 45°С. Мерой уровн  биосинтеза целлюлазы  вл етс  глубина расщеплени  целлюлазы в пробирке.

5 Табл. 1 показывает действие антиметаболитов и легко утилизируемых субстратов на образование целлюлаз.

Trichoderma reesel BCM 18.2/КК культивируетс  в аэробных услови х методом глу- 0 бинной ферментации в питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - индукторов биосинтеза целлюлаз и/или образовани  ферментов, лизирующих клеточную стенку. Задача может достигатьс  и 5 в случае наличи  в питательной среде субстратов , не  вл ющихс  индукторами Мутант способен при подход щем проведрнии процесса на основе использовани  растворимых субстратов, например глюкозы или

лактозы, выдел ть в культуральную среду полный ферментный комплекс целлюлаз.

Характерным и отличительным признаком штамма  вл етс  состав внеклеточных белков, определ емый поданным изоэлект- рофокусировани  в полиакриламидном геле в диапазоне рН 3,0-10,0 (готова  пластина фирмы Серва, ФРГ. краситель - Кумассси 43-250), табл. 2.

Примеры использовани  штамма Trlchoderma reesel BCM 18.2/КК дл  получени  целлюлолитических ферментов.

Дл  получени  исходного посевного материала культуру штамма выращивают на картофельно-декстрозном агаре При 30°С в течение 6-8 сут.

Приготовление исходного посевного материала возможно и на сыпучей среде следующего состава, г:

Свекловичный жом190

Солодовые ростки150

Пшеничные отруби 410 Водопроводна  вода 750 В каждую из колб объемом 750 мм внос т 25-30 г указанной среды и культивируют при 30°С в течение 5-6сут без перемешивани .

П р и м е р 1, Культивирование осуществл ют на жидкой питательной среде следующего состава: 40 г/л свекловичного жома; 14 г/л солодовых ростков; 6 г/л (Nl-UfcSO ; 2 г/л КНгРСч; 0.6 г/л MgS04 7НгО; водопроводна  вода рН 5,4.

Засев ферментационной среды осуществл ют водной суспензией конидий культуры, выращенной на картофельно-декстрозном агаре из расчета 106 конидий на 100мл среды.

Процесс ферментации провод т в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл при объеме среды 100 мл на качалке при 30°С и 200 об/мин.

Через 110 ч культивировани  уровень активности составл ет 3,5-4,2 ед/мл по фильтровальной бумаге.

П р и м е р 2. Культивирование осуществл ют на жидкой питательной среде следующего состава:

20.0 г/л молочного сахара (96% лактозы ); 3.0 г/л КН2РСм: 4.8 г/  (NtafeSO 0.4

г/л МдЗСм х 7Н20; 0.4 г/л CaCh: 30 г/л экстракта пшеничных отрубей (3%); 4,0 г/л целлюлазы микрокристаллической; 5 мг/л FeS04 x 7HzO; 1,6 мг/л MgSCM x 7НгО;

1,4 мг/л ZnSCM x 7H2O; 2,0 мг/л CoSCM x 7Н20.

Начальное значение рН 5,45. Процесс ферментации провод т в ферментере объемом 200 л при 30°С. Рабочий

объем ферментера в начале ферментации 110 л, к 81 ч 150 л. Режим ферментации - дробное добавление лактозы; начальна  концентраци  лактозы 20 г/л, после утилизации лактозы на начальной фазе ферментации (после 24 ч) уровень лактозы контролируетс  автоматически и поддерживаетс  посто нным на уровне 1-3 t/ь. Общий расход лактозы за врем  ферментации (81 ч) составл ет 44,8 л раствора концентрацией20% .

Уровень активности составл ет 18,2 ед/мл FPA при времени культивировани  81 ч. Это соответствует выходу 245 ед. FRA с 1 г лактозы.

П р и м е р 3. Культивирование осуществл ют на среде и услови х, аналогичных описанным в примере 2, однако вместо раствора лактозы используют концентрированную молочную сыворотку с содержанием

лактозы на уровн« 20% и с предварительно отделенными 6tr. чми сыворотки путем нагрева и коагул ции или путем ультрафильтрации .

Уровень активности зависит от концентрации молочной кислоты в сыворотке и составл ет 10-14 ед/мл при времени культивировани  100-110 ч.

(56) Авторское свидетельство СССР № 591502. кл. С 12 N 9/42. 1978.

Патент CLLA Г 4472504. кл. С 12 N 9/42. опублик. 1984.

M.Ballz. Celluiase production by Mutant stroins of Trlchoderma reesel on non- cellulosic Media.

Материалы 3-го Европейского конгресса по биотехнологии Мюнхен, ФРГ, 10- 14.09.84.

Патент ГДР № 291673, кл. С 12 N 9/42, опублик. 1991.

Таблица 1

Репресси  образовани  целлюлаэ субстратами/антиметаболитами: относительна  активность целлюлаэ (в мм расщепленной целлюлозы ) при росте на 1 %-ной аморфной целлюлозе

Н.Р.-нет расщеплени .

Спектр характеристических внеклеточных белков Trlchoderma reesei ВСМ 18.2/КК при культивировании на лактозе в услови х примера 2.

Таблица 2

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм гриба Trlchoderma reesel ВГНКИПродолжение табл. 2

   28-продуцент целлюлолитических ферментов .