SU1643608A1

SU1643608A1 - Штамм гриба АLLеSснеRIа теRRеSтRIS - продуцент целлюлаз

Info

Publication number: SU1643608A1
Application number: SU894418174A
Authority: SU
Inventors: Георгий Иванович Квеситадзе; Ламара Левановна Квачадзе; Нино Нодаровна Кватадзе
Original assignee: Институт Биохимии Растений Ан Гсср
Priority date: 1989-04-29
Filing date: 1989-04-29
Publication date: 1991-04-23

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к получению нового продуцента термостабильных целлюлоз. Цель изобретени - получение штамма гриба Allescheria terres- tris ВКПМ F-364 (H-l) - продуцента термостабильных целлкшаз с более высокой активностью, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5-4,6. Изобретение позвол ет получить целлюлазы, в частности эндо- глюканазу - 3,3 ед/мл, целлобиазу - 1,5 ед/мл, активность по NaKMU. - 5,8 ед/мл, активность по фильтровальной бумаге - 0,5 ед/мл. Ферментный препарат, выделенный из Allescheria terrestris H-l, обладает термоста- бильностью. Штамм быстрорастущий. Растет на синтетических средах, признаки штамма устойчивы. Образует богатую белком биомассу (35-40 мас.%). Дл получени целлюлаз используетс сравнительно дешева синтетическа среда. (Л

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к получению целлюлаз микробного происхождени , используемых в процессе осахаривани целлюлозы.

Цель изобретени - получение штамма гриба Allescheria terrestris ВКПМ F-364 (Н-1) - продуцента термостабильных с более высокой активностью целлюлаз, катализирующих превращение целлюлозы в глюкозу и работающих в оптимальном диапазоне рН 4,5- 4,6.

Штамм A.terrestris H-l получен в результате ультрафиолетового облучени исходного штамма Allescheria terrestris дозой 20 Дж/м21.

Культурально-морфологические признаки . Культура хорошо развиваетс на 8%-ном кислом сусло-агаре с полоской фильтровальной бумаги на поверхности скошенного агара, на видоизмененной твердой среде Чапека (0,22% пептона вместо NaN03), на модифицированной твердой среде Чапека-Докса с добавлением кукурузного экстракта и полоской фильтровальной бумаги на поверхности агара.

Кислый 8%-ный сусло-агар, рН 4,5, колони быстрорастуща , мииелий плот- нопушистый, белый, обратна сторона колоний бесцветна , гифы тонкие, ровные, гладкие, диаметром 4-5 мк, спороношение очень обильное, кони05 Јь

ОО

с&

о

00

диеносцы простые, как правило, оди- ночные, конидии чаще круглые диаметром 4,3-5,0 мк, удлиненные, обратно грушевидные, размером 3-3,5x5-6 мк,

Физиологе-биохимические признаки Штамм хорошо усваивает лактозу, глю- козу, ксилозу, галактозу, крахмал, маннит Не усваивает рамнозу, рафи- нозу, маннозу и сорбит Из источни- ков азота хорошо усваивает органические и неорганические соединени азота. Наиболее интенсивный рост наблюдаетс на нитратах Усваивает разнообразные фосфорные соединени , однако более интенсивно одно- и двух замещенный фосфорнокислый калий Штамм высокие эндоглюканазную (экдо- -1,4#-глюканаза) и целлобиазну.ю активности вы вл ет в пределах рН 4,5- 4; 6 Оптимальна температура дл роста и биосинтеза 40°С Штамм гидро- лизует целлюлозу (разные целлюлозные субстраты) Наблюдаетс эндоглюка- назна и высока целлобиазна актив- ности на среде, содержащей микрокристаллическую целлюлозу ЛТ в качестве единственного источника углерода .

Целлюлаза данного штамма термо- стабильна, после ведени ферментативной реакции при 70°С в течение 3 ч активность почти полностью сохран етс .

Дл размножени штамма примен ют 8%-ный кислый сусло-агар с полоской фильтровальной бумаги на поверхности скошенного агара, рН среды 4,5

Посевным материалом служит 10-ти суточна культура штамма. Дл полу- чени целлюлаз используют жидкую питательную среду следующего состава г/л: KHfcPO. 6,8; (NH4)S04 1,3; MgS04 7Hj 0 0,5; микрокристаллическа целлюлоза ЛТ 1%; СаС12 0,2; пептон 1,5; кукурузный экстракт 1,5%, рН среды 5;5

150 мл питательной среды в кони- ческих колбах емкостью 750 мл сте- j рилизуют 40 мин при 1 ати Максимальна активность целлюлаз отмечаетс ; при выращивании штамма на термоста- ; тированной качалке, делающей 220 об/, /мин, при 40°С в течение 96 ч Активность биосинтезируемой штаммом целлюлазы следующа , ед/мл: по NaKMU, 5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиозе 1,5

Q 5 0 5

Q

,.

о

0

5

Эндоглюканазную активность целлит- лазного комплекса определ ют виско- зиметрическим методом, в основе которого лежит определение начальной скорости уменьшени относительной в зкости раствора карбоксиметилцеллкг лозы при добавлении культуральной жидкости

Дл определени активности по NaKMU. 1 мл 1,5%-ного раствора субстрата в 0,05 М ацетат ном буфере (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в течение 30 мин при 60°С За единицу активности принимают количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров при 1%-ной концентрации субстрата в минуту. Количество восстанавливающих Сахаров определ ют по методу Сомоджи-Нельсона

Дл определени активности по фильтровальной бумаге 50 мг фильтровальной бумаги Ватман № 1 (1x6 см) в 1 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 мл культуральной жидкости инкубируют в течение 1 ч при 55 С За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров в минуту Количество восстанавливающих Сахаров определ ют.по методу Сомод- жи-Нельсона

Дл определени целлобиазной активности 0,2 мл М целлобиозы, 1,6 мл 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,7) и 0,2 мл раствора культуральной жидкости инкубируют в течение 10 мин при 55°С. За единиц активности принимают количество фермента, образующее 2 мкм глюкозы (провод т глюкозооксидазным методом).

Кроме высокоактивных целлюлаз, продуцент образует богатую белком (35-40%) биомассу.

Пример 1 Штамм Allescheria terrestris. H-1 выращивают на агари- зованном 8%-ном кислом сусло-агаре с подоской фильтровальной бумаги на поверхности агара, рН среды

Культивирование провод т в течение 98 ч при 40°С Суспензией спор, полученной смывом с указанной среды, засевают колбы емкостью 750 мл, содержащей 150 мл среды следующего состава , г/л: микрокристаллическа целлюлоза ЛТ 1,0%; (. 1,3; пептон 1,5%; КНаР04 6,8; MgS04-7 0 0,5; CaCl-2 0,2; кукурузный экстракт

1,5%; pH среды 5,Ь. Выращивание культуры провод т на круговой качалке, делающей 220 об/мин при 40° С в течение 96 ч. Биомассу отдел ют фильтро- ванием и в культуральной жидкости определ ют активности целлюлаз по указанным методам. Активность биосин- тезируемой штаммом целлюлазы следую- ща , ед/мп: по эндоглюканазе 3,3; по NaKMU 5,8; по фильтровальной бумаге 0,5; по целлобиазе 1,5.

При выдерживании препарата при в течение 3 ч активности целлнг- лаз почти полностью сохран ютс

Способность штамма расти при повышенной температуре (40дС) ограничивает возможность заражени посторонней микрофлорой.

64J

10

15

086

Получены опытные партии целлюпаз Allescheria terrestris H-l в двухсот- литровых и двухкубовых ферментерах.

Claims

При выращивании на лигно-целлкг лоэных отходах пищевой промышленности и сельского хоз йства штамм Allescheria terrestris H-l образует богатую белком биомассу и может служить источником белка дл кормлени крупного рогатого скота и птиц. В научных цел х, в особенности в генной инженерии, целлюлазы указанного штам ма могут быть применены дл разрушени клеточной стенки. Формула изобретени

Штамм гриба Allescheria terrestris ВКПМ F-364 - продуцент целлюлаз.