JPH0217159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グル
シトールからの６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−
ソルボースの製造のための新規微生物学的方法に
関するものである。 式 を有する６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボ
ースは、従来は、純粋に化学的な道程により、８
段階の合成でソルボースから製造されている
〔H.Paulsen、I.SangsterおよびH.Heins、Chem.
Ber.100、802〜815（1967）〕。 ６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースは
酸性媒体中ではフラノース形態（ａ）で存在
し、アルカリ性媒体中ではピペリジノース形態
（ｂ）で存在しており、後者は化合物（ｃ）
と平衡にある。 化合物（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、き
わめて不安定であつて、水溶液中で、特に酸性の
PH範囲で、水の脱離により、下式のピリジン誘導
体への不可逆的な転位を受ける。 ６−デオキシ−６−Ｎ−メチルアセトアミド−
Ｌ−ソルボースは、１−デオキシ−１−Ｎ−メチ
ルアセトアミド−Ｄ−グルシトールから、アセト
バクテルスボキシダンス（Acetobacter
suboxidans）による19日間の微生物学的酸化に
よつて、36％の収率で製造することができるとい
うことも公知である〔J.K.N.Jones、M.B.Perry
およびJ.C.Turner、Can.J.Chem.39、2400〜2410
（1961）〕。この反応の欠点は、一方においては、
長い反応時間であり、他方においては、アミノ基
をアセチル化によつて保護しなければならないと
いう事実である。（）の化学的不安定性のため
に、６−デオキシ−６−Ｎ−メチル−アセトアミ
ド−Ｌ−ソルボースを、保護してない６−デオキ
シ−６−Ｎ−メチル−アミノ−Ｌ−ソルボースに
転化させることは、不可能であると考えるべきで
ある。それ故、この方法によつては６−アミノ−
６−デオキシ−Ｌ−ソルボース（）を調製する
ことはできない。 本発明によつて、われわれは、１−アミノ−１
−デオキシ−Ｄ−グルシトールまたはその塩を、
適当な媒体中で、且つ適当な条件下に、酸化を接
触的に促進することができる好気性微生物または
好気性微生物から得た抽出物の何れかによつて酸
化することにより、６−アミノ−６−デオキシ−
Ｌ−ソルボースを取得する方法を提供する。この
反応は下記のように表わすことができる。 好都合な条件下では、１−アミノ−１−デオキ
シ−Ｄ−グルシトールの６−アミノ−６−デオキ
シ−Ｌ−ソルボースへの微生物学的／酸素的酸化
は、数時間の中に完了する。この短かい反応時間
によつて、６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソル
ボースの分解は、無視できるほど僅かにすぎな
い。 所望の生成物は、そのまま単離してもよいし、
あるいは、たとえば接触的な水素化によつて１−
デオキシ−ノジリマイシン（）へと更に反応さ
せることもできる。 ６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボース
が、本発明による微生物学的／酵素的方法によつ
て、簡単に、短時間に、且つ高収率で、取得でき
るということは、きわめて驚くべきこととみなす
べきである。この分野の現状からみれば、従来の
文献に記されている数日間にわたる醗酵時間の間
に、使用するPH範囲の水性の媒体中で、６−アミ
ノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースは更に反応し
て、望ましくないピリジン誘導体（）を与える
から、窒素が、たとえばアセチルによつて、保護
してある１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシ
トールのみが、それを微生物によつて酸化して、
窒素が保護してある相当するアミノ−Ｌ−ソルボ
ースとし、次いで生成物を単離することが可能で
あると考えるのが普通であつた〔J.K.N.Jones、
M.B.PerryおよびJ.C.Turber、Can.J.Chem.39、
2400〜2410（1961）〕。 本発明の方法において使用する出発材料、すな
わち１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトー
ル、は公知である；たとえばこれはＤ−グルコー
スからアンモニア、水素および触媒としてのニツ
ケルを使用する還元的アミノ化によつて調製する
ことができる。出発材料は、そのままで、あるい
はその塩の形態として、たとえば塩酸、硫酸、硝
酸、酢酸シユウ酸または二水素燐酸の塩の形態
で、使用することができる。 本発明の方法を遂行するために適する微生物、
あるいは、それから本発明による方法を遂行する
ための活性抽出物を取得することができる微生物
は、プロカリオテス（Procaryotes）、すなわち
細菌（バクテリア）、またはユーカリオテス
（Eucaryotes）、たとえば菌類（fungi）、とする
ことができ、且つ何れの場合においても、きわめ
て多様な系統学的群に属することができる。微生
物学の分野における熟達者は、たとえば公的な蒐
集所から入手することができような、比較的多く
の好気性または条件好気性微生物を、１−アミノ
−１−デオキシ−Ｄ−グルシトールを含有する相
当する栄養培地中で培養することによつて、本発
明による酸化反応を促進して６−アミノ−６−デ
オキシ−Ｌ−ソルボースを蓄積するためのそれら
の能力を試験することにより、容易に適当な微生
物を見出すことができる。 この手順に従つて、たとえば、ブソイドモナス
目（order Pseudomonadales）の細菌、および
この目の内で特に代表的なものとしてプソイドモ
ナス料（family Pseudomonada−ceae）のも
の、またその中でも特にグルコノバクテリル属
（genus Glucnobacter）の細菌、が本発明の方法
のために適する細菌であることが見出された。そ
の上、コリネ形（coryneform）細菌の群からの
細菌、特にコリネバクテリウム属（genus
Corynebacterium）のものもまた、適当であるこ
とが認められた。本発明の方法は、菌類を用い
て、たとえば有胞子酵母目（order
Endomycetales）の酵母、特にスペルモフトラセ
アエ科（family Spermophthora−ceae）のも
の、その中でも主としてメトシユニコビア属
（genus Metschnikowia）の標本を用いて遂行す
ることが可能であることもまた、見出されてい
る。 挙げることができる特に好適な例は、次のもの
である：グルコノバクテルオキシダンス低酸化性
亜種（Gluconobacter oxidans ssp.suboxidans）
（DSM50049）、公的なDSA−目録に記載
（ATCC621と同一）〔ATCC621（DSM50049）菌
株に関しては、ATCCカタログにその紹介文献名
が記載されているほかに、M.Landy and D.M.
Dicken、J.biol.chem.161（1942）、109及びK.B.
Rape.J.biol.Chem.174（1948）、273等にも紹介さ
れている〕、コリネバクテリウムベタエ（Coryne
−bacterium betae）DSM20141）、公的な
ATCC−目録に記載（ATCC13437と同一）
〔ATCC13437（DSM20141）菌株に関しては、W.
G.Keyworth、J.S.Howell、W.J.Dowson、Plant
Phth−ology、５（1965）88−90に紹介されてい
る〕、およびメトシユニコビア・プルチエリマ
（Metschnikowia pulcherrima）（ATCC20515）。
これらの微生物は、生長培養物、濃縮細胞懸濁
液、非分別粗抽出物または精製した抽出分屑の形
態で使用することができる。 DSM番号は、ドイツ微生物蒐集所（Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen）、ゲツチン
ゲン、中に、その番号によつて該微生物が保管さ
れている番号である。メトシユニコビアブルチエ
リマは、アメリカ模式菌培養蒐集所（American
Type Culture Collection）、ロツクビル、メリ
ーランド、アメリカ合衆国、に保管されている。 該菌株はまた、微工研菌寄第5042号（FERM
−Ｐ No.5042）として工業技術院微生物工業研究
所に保管されている。 上記メトシユニコピア・ブルチエリマ
（ATCC20515）はイーストであつて、その菌学的
性質は下記のとおりである。 (a) 麦芽抽出物液体培地、ポテト抽出物液体培
地、人参汁液体培地、麦芽抽出物・イースト抽
出物寒天、ポテト抽出物寒天及び人参汁寒天に
28℃で２〜４日好気的に培養した後、下記形態
学的性質を示す。 細胞：レモン形、屡々球形； ３〜6μ×４〜11μ； 多側生出芽により増殖； ６〜８細胞の偽菌系； (b) 人参汁液体培地中で培養後嚢胞子の形成顕
著、ゴールドコバー（Goldkova−）、ポテト−
又は麦芽−抽出物・イースト抽出物液体培地中
で好気的に培養した後は、その形成やや顕著
（Less significant）。ゴールドコバー、ポテト
−又は麦芽抽出物寒天上では嚢胞子なし。 子嚢：ホース状、2μφで長さ20μ。 ２〜４嚢胞子を生成、玉子形乃至球形 (c) 有麦胞子（再生子）、内胞子（endospores）
もしくはバリスト胞子（ballistospores）を生
成せず。 (d)１ 生育至適条件 PH5.0；28℃。 ２ PH及び温度範囲 PH 生育 2.0 − 3.0 ＋＋ 4.0 ＋＋＋ 5.0 ＋＋＋ 6.0 ＋＋＋ 7.0 ＋＋ 8.0 ＋ 9.0 ＋ 10.0 ＋ 温度（℃） ４ ＋ 18 ＋＋ 24 ＋＋＋ 28 ＋＋＋ 37 （＋） 45 − 50 − ３ 硝酸塩類同化：＋ ４ 脂肪分散 ：（テストせず） ５ 尿素分解 ：＋ ６ ゼラチン液化：− ７ NaCl−及びシユクラーゼ（sucrase）−耐
性 NaCl（％） 生育 0 ＋＋＋ 2 ＋＋＋ 4 ＋＋ 6 ＋＋ 8 ＋ 12 （＋） 16 − 20 − シユクラーゼ（％） 生育 0 ＋＋＋ 2 ＋＋＋ 4 ＋＋ 6 ＋＋ 8 ＋＋ 12 ＋＋ 16 − 20 − 8 カロチノイド生成 ：− 9 有機酸生成 ：＋ 10 澱粉様物質生成 ：６ 11 ビタミン要求 ：＋ 12 その他の生理学的性質 ：− (e) 炭素源利用

【表】

【表】 本発明による方法を生長培養物中の自然のまま
の微生物を用いて行なう場合は、固体、半固体ま
たは液体の栄養培地を使用することができる。水
性の液状栄養培地を使用することが好ましい。 培養は、前記の部類の微生物の培養に対する使
用が公知であり、且つ本発明の方法によつて酸化
させるべき１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グル
シトールを含有している、あらゆる栄養培地中
で、行なうことができる。栄養培地は、同化可能
な炭素および窒素源、ならびに無機塩類を含有し
ていなければならない。適当な同化性炭素および
窒素源は、特に、たとえば、特に多様な起原の生
物学的生成物から成るもののような複合混合物、
たとえば、大豆粉、綿実粉、レンズ豆粉、エンド
ウ豆粉、可溶性および不溶性植物蛋白質、とうも
ろこし浸出液、酵母エキス、ペプトンならびに肉
エキスである。追加的な窒素源はアンモニウム塩
および硝酸塩、たとえば塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウ、硝酸ナトリウムおよび硝酸カリウム
である。栄養培地中に含有せしめるべき無機塩
は、たとえば、以下のイオンを提供する：
Mg⁺⁺、Na⁺、K⁺、Ca⁺⁺、NH₄ ⁺⁺、Cl^-、SO₄ ^--、
PO₄ ^---およびNO₃ ^-、且つまた、たとえばCu、
Fe、Mn、Mo、Zn、CoおよびNiのような通常の
痕跡元素のイオン。 これらの塩類および痕跡元素が、使用する栄養
培地の該複合成分中または水中に、充分な量で存
在していない場合には、それに応じて栄養培地に
補充することが適当である。 本発明の方法によつて酸化せしめるべき１−ア
ミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトールは、それ
自体として、または１種以上の酸化可能な化合物
との混合物として、基礎栄養培地に添加すること
ができる。使用することができる付加的な酸化可
能な化合物は、第一アルコール、たとえば、エタ
ノール、第二アルコール、たとえばイソプロパノ
ール、ポリオール、たとえばソルビトールまたは
グリセリン、アルデヒド類たとえばグリコールア
ルデヒド、アルドース類、たとえばグリコールあ
るいはグリコン酸類である。 １種以上の該化合物を栄養溶液に加える場合
は、酸化せしめるべき１−アミノ−１−デオキシ
−Ｄ−グルシトールは、接種前にまたは初期の対
数相と後の定常的生長相の間の任意の望ましい時
点の何れかで、加えることができる。このような
場合に、加える特定の酸化可能な化合物上で、特
定の有機体を予備培養する。 本発明の方法に対しては、２〜10のPH範囲が適
当である。たとえば燐酸塩緩衝剤または酢酸塩緩
衝剤を用いて、培養物をこの範囲に緩衝すること
が好都合である。 醗酵技術において一般的であるように、PHは、
培養液に対して間隔を置いて滅菌した有機または
無機酸、たとえば硫酸、あるいは滅菌したアルカ
リ、たとえば水酸化ナトリウム、を添加して、自
動的に調節することもできる。 微生物学的な方法に対して一般的であるよう
に、培養基の異物による汚染は避けなくてはなら
ない。そのためには、たとえば栄養培地、培養容
器および通気に要する空気の滅菌のような、一般
的な注意をはらわなければならない。培養容器の
滅菌には、たとえば蒸気滅菌または乾式滅菌を用
いることが可能であり、空気および培養基は、同
様に蒸気によつて、あるいは過によつても、滅
菌することができる。 栄養培地の接種は一般に、通常の方法によつ
て、たとえば斜面管培養、またはフラスコ培養に
よつて、行なう。 培養は好気的な条件下に行ない且つ全般的に通
常の方法に従つて、たとえば振とう培養を用い
て、たとえば振とうフラスコ、空気撹拌培養また
は液内培養により、行なうことができる。培養は
通気醗酵槽中の好気性液内培養方法により、たと
えば通常の液内醗酵槽中で、行なうことが好まし
い。培養は、連続的に、または不連続的に、行な
うことができる。不連続的方法を用いることが好
ましい。 微生物は酸素と栄養物との具合の良い接触に確
実に持ちきたすことが必要である。これは一般
に、たとえば振とうおよび撹拌のような、通常の
方法によつて行なうことができる。 培養中に望ましくない量で泡が生ずる場合に
は、通常の化学的泡立ち防止剤、たとえば液状の
脂肪および油、水中油形乳剤、パラフイン類、高
級アルコール、たとえばオクタデカノール、シリ
コーン油、ポリオキシエチレン化合物およびポリ
オキシプロピレン化合物を、添加すればよい。泡
立ちは、一般的は機械的装置を用いて、抑制また
は防止することもできる。 培養温度は約20乃至約45℃とすることができ
る。倍養時間は大きく変えることができ且つ培養
温度が関係する。 特定の場合における最適条件は、微生物学の分
野における専門家によれば、容易に決定すること
ができる。 培養液中に蓄積する６−アミノ−６−デオキシ
−Ｌ−ソルボースの量は一般に１−アミノ−１−
デオキシ−Ｄ−グルシトールの添加後５時間乃至
５日の間に最適に達する。 適当な微生物の濃縮した細胞懸濁液を用いて、
本発明による酸化反応を遂行することも可能であ
る。濃縮した細胞懸濁液は、次のようにして調製
する：使用することができる微生物を適当な栄養
溶液中で培養し、次いで、たとえば遠心分離によ
つて取り入れたのち、少量の同一栄養溶液中、ま
たは塩あるいは緩衝剤溶液、たとえば生理的塩化
ナトリウム溶液またはKH₂PO₄、酢酸ナトリウム
あるいはマレイン酸ナトリウムの水溶液中、ある
いは単に水道水または蒸留水中に、懸濁させる。
次いでこの種の細胞懸濁液に１−アミノ−１−デ
オキシ−Ｄ−グルシトールを加えて、生長培養物
に対する前記の条件下に、本発明による酸化反応
を遂行する。 この方法の利点は、本発明による方法の反応時
間を数時間に短縮することにあり、それは比較的
高い濃度の微生物によつて可能となる。 本発明による方法は、微生物の生長培養物を用
いて、またはそれから取得した濃縮細胞懸濁液を
用いてばかりでなく、これらの細菌から調製した
抽出物または抽出物分屑を用いて、遂行すること
もできる。抽出物は、たとえば微生物細胞の通常
の温浸によつて取得するもののような、粗製抽出
物とすることができる。使用することができる細
胞を分解するための方法は、次のものである：超
音波処理、フレンチ圧力セルの通過、石英砂によ
る摩砕、崩壊を誘導するための酵素による倍養、
自己分解または繰返しの凍結および解凍。 １−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトール
の６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースへ
の酸化のために分別してない粗製の抽出物を用い
る場合には、有利であることが認められている反
応条件は、大体において、生長または試験微生物
細胞による本発明の方法の遂行に対して先に記し
たものと同様である。 本発明による方法を、部分的に精製した抽出物
調製品（酵素）を用いて行なう場合には、蛋白質
化学において一般的な在来の方法、たとえば遠心
分離、沈殿反応、イオン交換クロマトグラフイ
ー、または吸着クロマトグラフイー、ゲル過、、
あるいは電気泳動方法、を用いて、このような調
製品を取得することができる。これらの方法の中
の何れかによつて取得したいくつかの分屑の中の
どれが、本発明による酸化反応の触媒として適当
であるかという問題を明らかにするためには、こ
の分屑の部分標本を、20〜45℃の温度と２〜10の
PHにおいて、１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グ
ルシトールと混合し、その混合物を庶糖酵素抑制
活性（後記参照）の増大の助けをかりて、６−ア
ミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースの生成を定
量するために試験する。分別した細胞抽出物を用
いて本発明の方法を遂行するためには、評価分析
系に対して、たとえば生理学的または合成電子受
容体、たとえばNAD⁺、NADP⁺、メチレンブル
ー、ジクロロフエノール−インドフエノール、テ
トラゾリウム塩などのような、付加的な反応物を
加える必要があると思われる。このような付加的
な反応物を加えなければならない場合にはそれら
を、基質量で、すなわち使用する１−アミノ−１
−デオキシ−Ｄ−グルシトールの濃度に相当する
濃度で、または触媒量で、すなわち１−アミノ−
１−デオキシ−Ｄ−グルシトールの選択した濃度
よりも著しく低い濃度で、の何れかで、使用する
ことができる。 第二の場合において、本発明による方法をほぼ
定量的に行なうことを確実にしようとする場合
は、触媒量でのみ存在する反応物を連続的に再生
する系をも、反応混合物に添加しなければならな
い。この系は、たとえば、酸素またはその他の酸
化剤の存在において、本発明による反応の過程で
還元される電子受容体の再酸化を確実にする、酵
素とすることができる。 その他の点に関しては、生長微生物培養物また
は濃縮細胞懸濁液による１−アミノ−１−デオキ
シ−Ｄ−グルシトールの６−アミノ−６−デオキ
シ−Ｌ−ソルボースへの酸化に対して先に記した
ものと同一の条件が、分別した細胞抽出物による
本発明の方法の遂行に対しても、好都合であるこ
とが認められている。この場合にもまた、特に温
度範囲は20〜45℃、PH範囲は２〜10である。しか
しながら、生成する６−アミノ−６−デオキシ−
Ｌ−ソルボースの量は、短時間でその最高値に達
する。抽出物の濃度に依存して、２時間乃至３日
間の培養時間で十分である。 培養基中における６−アミノ−６−デオキシ−
Ｌ−ソルボースの時間に依在する生成は、薄層ク
ロマトグラフイーによつてまたは庶糖酵素抑制試
験における抑制活性の増大の助けをかりて、の何
れかで追求することができるが、第二の方法が好
適である。 試験管内の庶糖酵素抑制試験は、抑制剤の存在
および不在（いわゆる100％値）における可溶化
した腸の二糖類分解酵素複合体の活性の比較によ
つて、当該物質の酵素抑制活性の定量を可能とす
る。抑制剤試験の特異性を決定する基質として、
ほとんどグルコースを含まないスクロース（グル
コース＜100ピ−ピ−エム）を用いる。酵素活性
の定量は、グルコースデヒドロゲナーゼおよび助
因子としてのニコチンアミド／アデニンジヌクレ
オチドを用いる遊離したグルコースの分光測光に
よる定量に基づいている。 腸内二糖類分解酵素複合体は、豚の小腸粘膜か
らトリプシンによる消化、濃度66％のエタノール
からの−20℃における沈殿、100ｍＭ燐酸塩緩衝
液（PH7.0）中への沈殿の取上げ、および最後に
同一緩衝液に対する透析の遂行によつて取得す
る。 0.1Mマレイン酸塩緩衝液（PH6.25）中におけ
る腸の二糖類分解酵素複合体の希薄溶液100μ
を、10μの試験溶液に加え、それを試験混合物
の吸光が100％値よりも少なくとも10％低いが25
％よりも低くはないように仕上げ、次いで混合物
を37℃で10分間予備培養する。二糖類分解酵素複
合体の希薄溶液の活性は0.1SU／mlに調節しなけ
ればならない。 １庶糖酵素単位（SU）は、37℃において１分
間当りに1μモルのスクロースを開裂し、かくし
て試験で定量する1μモルのグルコースと試験で
定量しない1μモルのフルクトースの遊離をもた
らす酵素活性として定義する。 次いで、0.1Mマレイン酸塩緩衝液（PH6.25）
中のスクロースの0.4M溶液10μを加えることに
よつて庶糖分解反応を開始させ、37℃における20
分間の培養時間後に、１mlのグルコースデヒドロ
ゲナーゼ試薬〔250mlのPH7.6の0.5Mトリス緩衝
液中に溶解した、凍結乾燥したグルコースデヒド
ロゲナーゼ／変旋光酵素混合物および331.7mgの
β−ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド
（遊離酸）〕の添加によつて停止させる。グルコー
スを検出するためには、混合物を37℃で30分間培
養したのち、試薬盲験（酵素は存在するがスクロ
ースは存在しない）に対比した340nｍにおける
測光によつて、分析する。 培養物の上澄液中の本発明による酸化生成物、
すなわち６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボ
ース、の含量を、庶糖酵素抑制試験において見出
される抑制値から定量することを可能とするため
に、他は同一の条件下に、増大する種々の量の純
６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースを庶
糖酵素抑制試験において使用し、且つ認められる
抑制値を、試験中の６−アミノ−６−デオキシ−
Ｌ−ソルボースの濃度に対して百分率としてプロ
ツトした。双曲線的な抑制曲線が得られた。豚の
小腸粘膜からの庶糖酵素の50％抑制をもたらす抑
制剤濃度を、この標準曲線から、1.2μｇの６−ア
ミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボース／ml試験バ
ツチ、として決定した。培養物の上澄液中の６−
アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースの含量の
測定に対する基準として、この標準曲線を用い
た。 本発明によつて取得した６−アミノ−６−デオ
キシ−Ｌ−ソルボースは、次のようにして、培養
溶液から単離する：細胞体を別または遠心分離
し、酸性イオン交換体を含有するカラム中に上澄
液を通じ且つ水で洗浄する。次いで0.3N塩酸を
用いて溶出を行ない、溶出液を濃縮する。エタノ
ールの添加後に、６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ
−ソルボースの塩酸塩が晶出する。本発明によつ
て取得した化合物は、文献に引用されているもの
と同一の物理的データを有している：融点：127
〜129℃（分解を伴なう）。 本発明に従つて調製した化合物の１−デオキシ
−ノジリマイシンへのそれ以上の加工を遂行しよ
うとする場合には、単離を省略することができ
る。そのためには、細胞体の除去後の透明な溶液
を、たとえば炭素上のPd、ラネーニツケルまた
はPtO₂のような触媒と１〜80バールの圧力下の
水素を用いて水素化する。触媒の除去後に、酸性
イオン交換体上のクロマトグラフイーによつて、
１−デオキシ−ノジリマイシンを単離する。かく
して取得した１−デオキシ−ノジリマイシンは、
あらゆる物理的特性に関して、基準試料と一致す
る。 何れの仕上げ処理においても、未転化の１−ア
ミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトールまたはそ
の塩をイオン交換体上のクロマトグラフイーによ
つて回収して、本発明による方法のための出発材
料として再使用することができる。 実施例 １ 醗酵槽中の生長培養物中のグルコノバクテル低
級化性亜種（DSM50049）による１−アミノ−
１−デオキシ−Ｄ−グルシトールの酸化 グルコノバクテル低酸化性亜種を斜面培養管上
で予備培養した。水道水中に溶解した１当り10
ｇの酵母エキス、100ｇのソルビトールおよび２
ｇのKH₂PO₄を含有する栄養培地を用いた。良好
な増殖を示す管を用いて、１の円錐フラスコ中
の、寒天を含まないほかは同一の培地の250mlの
液体培養物に接種して、280回転／分の円形振と
う機上で、28℃において終夜培養した。１当り
に10ｇの酵母エキス、100ｇのソルビトール、２
ｇのKH₂PO₄および10ｇの１−アミノ−１−デオ
キシ−Ｄ−グルシトール（HCl塩）を含有する液
体培養地を入れた10の醗酵槽に、この第二の予
備培養物を接種した。PH値を6.2に調節した。培
地は予め125℃における60分の加熱によつて殺菌
してあつた。１分間当り５の空気を醗酵槽中に
吹込んだ。培養温度は28℃であつた。種々の時間
に滅菌条件下に試料を取出して、６−アミノ−６
−デオキシ−Ｌ−ソルボースの含量を庶糖酵素抑
制活性の助けをかりて測定した。１ 1/2時間後
に、2.6ｇ／の６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ
−ソルボースが存在した。これは26％の転化率に
相当した。細胞を培養液から遠心分離し、上澄液
を次のように処理した： 細胞を遠心分離によつて分け、液を強酸性の
イオン交換樹脂レワチツト（Lewatit）TSW40
を詰めたカラム（長さ40cm、直径２cm）中に流
し、カラムを水で洗浄したのち、生成物を0.3N
の塩酸で溶出した。溶出物を低粘度のシロツプ状
に濃縮したのち、混合物が濁るまでエタノールを
加えた。氷浴中で６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ
−ソルボースの塩酸塩が結晶化した。 融点：127〜129℃（分解を伴なう）；ハンスポ
ールセン、イアンサングスターおよびクルトハイ
ンス、ヒエミツシエベリヒテ、100、802〜815
（1967）：融点：127〜129℃（分解を伴なう）。 実施例 ２ 生長培養物中のコリネバクテリウムベタエ
（Co−rynebacterium betae、DSM20141）に
よる１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシト
ールの酸化 コリネバクテリウムベタエを、下記栄養培地を
含有する斜面培養管上で予備培養した：脱塩水中
の10ｇ／のトリプシンで消化したカゼインペプ
トン、６ｇ／の酵母エキス、５ｇ／のソルビ
トール、５ｇ／のNaClおよび20ｇ／の寒天。
良好な増殖を有する斜面培養管を用いて、１当
りに10ｇのトリプシン消化カゼインペプトン、５
ｇの酵母エキス、５ｇのソルビトール、５ｇの
NaClおよび２ｇの１−アミノ−１−デオキシ−
Ｄ−グルシトール（シユウ酸塩）を含有する250
mlの液体栄養培地（１の円錐フラスコ中）に接
種した。栄養培地の各成分は、脱塩した水中に溶
解して121℃のオートクレーブ中で20分間加熱す
ることによつて、殺菌した。培養物は200回転／
分の回転振とう機上で37℃で培養した。培養汁中
の６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースの
含量を庶糖酵素抑制活性の測定によつて追求し
た。１ 1/2時間後に、0.15ｇ／が存在した。こ
れは7.5％の転化率に相当する。この時点で醗酵
を中止して細胞を遠心分離によつて分離し、培養
物の透明な上澄液を実施例１に記したようにして
処理した。 実施例 ３ 生長培養物中のメトシユニコビアプルチエリマ
（ATCC20515）による１−アミノ−１−デオキ
シ−Ｄ−グルシトールの酸化 メトシユニコビアプルチエリマを、脱塩水中の
１当り３ｇの酵母エキス、６ｇのペプトン、10
ｇのグルコース、８ｇのNaClおよび20ｇの寒天
を含有する培地上で、斜面培養管中で予備培養し
た。良好な増殖を有する斜面培養管を使用して、
脱塩水に溶解した、１当り３ｇの酵母エキス、
６ｇのペプトン、10ｇのソルビトールおよび８ｇ
のNaClを含有する250mlの液体培地（１の円錐
フラスコ中）に接種した。培養物を200回転／分
の回転振とう機上で35℃で培養した。培養汁中の
６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースの含
量を庶糖酵素抑制活性の助けをかりて追求した。
２日後に0.1ｇ／が存在した。これは５％の転
化率に相当した。この時点で醗酵を中止し、遠心
分離によつて細胞を分離し、培養物の透明な上澄
液を実施例１に記すようにして仕上げ処理した。 実施例 ４ グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種
（DSM50049）の濃縮した細胞懸濁液による１
−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトールの
酸化 グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種
を、10の容量の醗酵槽により、水道水中に溶解
した１当り100ｇのソルビトール、20ｇの酵母
エキスおよび２ｇのKH₂PO₄を含有する培地中で
培養した。醗酵槽中に１分間当り５の空気を吹
込み、且つ醗酵槽を500回転／分で撹拌しながら
30℃の温度に保つた。10時間の培養時間後に、培
養汁から細胞を遠心分離して、20ｇの酵母エキ
ス、２ｇのKH₂PO₄、および10ｇの１−アミノ−
１−デオキシ−Ｄ−グルシトール（シユウ酸塩）
を含有する１の培地中に懸濁させた。この10倍
に濃縮した細胞懸濁液を、１の醗酵槽中で30℃
において培養し、１分間当り５の空気を吹込み
なががら懸濁液を500回転／分で撹拌した。９時
間後に、細胞を遠心分離し、この時点で4.1ｇ／
の６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボース
（41％の転化率に相当するる）を含有する上澄液
を、実施例１に記すようにして仕上げ処理した。 実施例 ５ グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種の
細胞非含有抽出物による１−アミノ−１−デオ
キシ−Ｄ−グルシトールの酸化 グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種
を、10の容量の醗酵槽中で、水道水中に溶解し
た、１当り100ｇのソルビトール、20ｇの酵母
エキスおよび２ｇのKH₂PO₄を含有する培地中
で、培養した。１分当り５の空気を醗酵槽中に
吹込み且つ醗酵槽を500回転／分で撹拌しながら
30℃の温度に保つた。16時間の培養時間後に細胞
を培養汁から遠心分離し、10ｍＭのKH₂PO₄中に
懸濁させることによつて１回洗浄し、再び遠心分
離したのち、300mlの10ｍMKH₂PO₄中に懸濁さ
せた。かくして得た細胞懸濁液を８バールの圧力
下のフレンチ圧力セル中に２回通すことによつて
分離した。細胞を含まない抽出物を１の円錐フ
ラスコ中に導入し、１−アミノ−１−デオキシ−
Ｄ−グルシトール（シユウ酸塩）を加えて10ｇ／
の濃度としたのち、混合物を280回転／分の回
転振とう機上で30℃において培養した。７時間後
に、庶糖酵素抑制活性の助けをかりて、この抽出
物中に、37％の転化率に相当する。3.7ｇ／の
６−アミノ−６−デオキシ−Ｌ−ソルボースを検
出することができた。この時点で反応を中止し
て、実施例１に記すようにして抽出物を仕上げ処
理した。 実施例 ６ グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種の
細胞非含有抽出物中の規定した酵素反応におけ
る１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトー
ルの酸化 グルコノバクテルオキシダンス低酸化性亜種を
細胞を含有しない抽出物を実施例６に記すように
して調製した。この抽出物に次のものを加えた：
0.2ｍＭの濃度までのNADP（Na塩）、NADP再生
系としてのサツカロミセス・セルビシエからのミ
クロソー分画（１ml当りの１mgの蛋白質の濃度ま
で）、および10ｇ／の濃度までの１−アミノ−
１−オキシ−Ｄ−グルシトール（シユウ酸塩）。 この混合物を水浴中で、酸素を吹込みながら30
℃において培養した。６−アミノ−６−デオキシ
−Ｌ−ソルボースの生成を、サツカラーゼ阻害の
増大を用いて、測定した。７時間後に、37％の転
化率に相当する、１当り3.7ｇの６−アミノ−
６−デオキシ−Ｌ−ソルボースが検出できた。こ
の時点で反応を中止し、混合物を実施例１に記す
ようにして仕上げ処理した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ １−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルシトー
   ルまたはその塩を、好気性微生物または好気性微
   生物から取得した抽出物の何れかによつて酸化す
   ることを特徴とする、６−アミノ−６−デオキシ
   −Ｌ−ソルボースの製造方法。 ２ 使用する好気性微生物はプソイドモナス目
   （order Pseudomonadales）のもの、コリネ形
   （coryneform）バクテリアまたは有胞子酵母目
   （order Endomycetales）の酵母である、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 使用する微生物はグルコノバクテルオキシダ
   ンス低酸化性亜種（Gluconobacter oxidans ss
   p.suboxidans）（DSM50049）、コリネバクテリウ
   ムベタエ（Corynebacterium betae）
   （DSM20141）およびメトシユニコビア・プルチ
   エリマ（Metschnikowia pulcherrima）
   （ATCC20515）から選択し且つ増殖している培養
   物として使用する、特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ４ 特許請求の範囲第３項記載の微生物を濃縮し
   た細胞懸濁液の形態で使用する、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ５ 特許請求の範囲第３項記載の微生物を分別し
   てない粗製抽出物の形態において使用する、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 特許請求の範囲第３項記載の微生物を精製し
   た抽出分別物の形態で使用する、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。