CN1290168A - 膜相关病毒复制的抑制 - Google Patents

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Abstract

利用抑制宿主细胞葡糖苷酶或葡糖基转移酶的化合物来抑制宿主细胞膜芽生病毒的形态发生和由此导致的感染的方法。利用抑制葡糖基转移酶的化合物来治疗脂类存储疾病的方法。

Description

膜相关病毒复制的抑制
本申请要求享有下列优先权：1997年12月11日申请的美国临时申请，流水号60／069245。
发明领域
本发明涉及使用抑制宿主细胞的葡糖苷酶活性的化合物治疗病毒感染。也涉及使用抑制被感染细胞中葡糖基转移酶活性的化合物来治疗脂类存储疾病。特别涉及1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇及其衍生物的用途。
发明背景
全世界有超过4千万人被丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染，并且它代表了对发达国家公众健康的最严重的威胁之一(Hoofnagle等(1997)新英格兰医学杂志336：347-356)。在美国，每年丙型肝炎病毒感染导致超过10000人死亡(丙型肝炎的治疗，华盛顿邮报，1997年11月11日，A2中)，如缺乏有效干预措施，这个数字在未来二十年后将增加两倍。慢性的HCV还增加了身患肝癌的危险。在多达85％的HCV患者中将发展成为持续感染，并且在开始感染的二十年内，这些患者中至少有20％其慢性感染将导致肝硬变。在北美洲，估计有390万人受到慢性感染，在美国，目前丙型肝炎病毒导致的并发症是进行肝移植的首要原因。
HCV是属于黄病毒科的RNA病毒。个体分离物包括密切相关、但仍然异源的病毒基因组的群体。这种遗传多样性使得病毒能逃脱宿主的免疫系统，导致高比率的慢性感染。
对HCV感感染有效的治疗在数量和效率上有限。HCV感染的常规治疗包括使用α-干扰素。但是，α-干扰素在大约20％感染HCV的人群中使用受到限制(Hoofnagle等(1997)新英格兰医学杂志336：347-356)，并且使用这种化合物进行治疗只在5％的患者中取得长期改善。此外，α-干扰素的并发症和局限性严重地限制了这种治疗方法的应用。在复发HCV感染的患者中，只有一半在包括使用α-干扰素和病毒唑(1-α-D-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)的试验性治疗中取得长期改善。(丙型肝炎的治疗，华盛顿邮报，1997年11月11日，A2中)。很明显，使用干扰素的差强人意的结果促进了寻求更有效和毒性更低的疗法。因此，对有效治疗HCV感染的迫切需求仍然存在。
除了那些慢性感染HCV的人们，还有超过三亿五千万人慢性感染HBV。如缺乏有效的干预，可能会有超过一亿五千万人死于肝病。正如大多数HCV的携带者一样，多达两千万HBV的携带者居住在发达国家。
很多感染HCV的个体也感染了HBV。治疗HBV／HCV的复合感染极具挑战性，因为HBV和HCV病毒的治疗有明显区别。HBV是嗜肝DNA病毒，而HCV是瘟病毒。HBV是含有DNA的病毒，通过联合使用DNA依赖性RNA聚合酶和RNA依赖性DNA聚合酶(如逆转录酶)，在受感染细胞的细胞核中复制其基因组。HCV是含有RNA的病毒，通过使用一种或多种类型的RNA依赖性RNA聚合酶，在受感染细胞的细胞质中复制其基因组。尽管HBV和HCV的感染经常同时发生，已知的许多治疗HBV感感染有效的化合物对HCV无效。例如，lamivudine(核苷类似物3TC)有用于治疗HBV感染，但对HCV感染没有作用。毫无疑问，HBV和HCV对抗病毒试剂的不同敏感性与它们基于遗传的复制差异有关。对同时有效治疗HBV和HCV感染的特别迫切的需求仍然存在。
从与受感染的动物细胞的细胞内膜相关的膜中获得其包膜的动物病毒对家畜业造成了重要损失(Sullivan等(1995)病毒研究38：231-239)。这样的动物病毒包括瘟病毒和黄病毒，比如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、经典型猪瘟病毒(classical swine fever virus)、边境病病毒和猪瘟病毒。
已知HCV所属的黄病毒群体含有由节肢动物载体传播的许多人类疾病的起因物质。由黄病毒引起的人类疾病包括各种出血热、肝炎和脑炎。已经鉴定了已知引起人类这些疾病的病毒，其中包括，例如黄热病毒、登革病毒1-4、日本脑炎病毒、墨累溪谷脑炎病毒、Rocio病毒、西尼罗热病毒、圣·路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、羊跳跃病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血热病毒和Kyasanur森林出血热病毒。因此，同样存在治疗感染了黄病毒或瘟病毒的动物以及人类的迫切需求。
发明概述
本发明提供了一种抑制从受感染细胞之胞内膜的相关的膜获得其包膜的病毒的形态发生的方法，方法包括将有效量的葡糖苷酶抑制剂给药给细胞，从而抑制与细胞内质网相关的葡糖苷酶活性。一方面，病毒选自黄病毒和瘟病毒，如丙型肝炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、经典型猪瘟病毒、边界病病毒和猪瘟病毒。另一方面，膜选自围绕内质网腔的膜和围绕高尔基体腔的膜。
在本发明的一个优选实施方案中，葡糖苷酶抑制剂是1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇(1，5-dideoxy-1，5-imino-D-glucitol)或其选自N-烷基、N-酰基、N-芳酰基、N-芳烷基和O-酰基衍生物的衍生物。
本发明包括抑制从内质网(ER)相关的细胞内膜获得其包膜的病毒的形态发生的一种方法，方法包括将有效量的葡糖苷酶抑制剂给药给细胞，抑制与细胞内质网相关的葡糖苷酶活性，从而抑制病毒的形态发生。感染受试病毒的哺乳动物细胞是特别期望的治疗目标，它们包括，但不限于，人类肝细胞和牛单核细胞。
本发明还包括治疗感染有这样一种病毒的动物的方法，该病毒特征在于从病毒感染的细胞的ER相关膜中获得其包膜。方法包括将有效量的葡糖苷酶抑制剂给药给动物，以抑制感染有病毒的动物细胞的内质网葡糖苷酶活性，从而降低、切除或减少动物中的病毒感染。动物优选哺乳动物，比如猪或牛，特别优选人。
本发明的方法有用于抑制病毒的形态发生，或有用于治疗感染有从与内质网相关的膜中获得其包膜的病毒的动物。因为黄病毒和瘟病毒均从与内质网相关的膜中获得其包膜，预期本发明的方法对抑制黄病毒和瘟病毒的形态发生或治疗这两种病毒的感染特别有用。黄病毒引起的感染包括，但不限于由黄热病毒、登革病毒1-4、日本脑炎病毒、墨累溪谷脑炎病毒、Rocio病毒、西尼罗热病毒、圣·路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、羊跳跃病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血热病毒和Kyasanur森林出血热病毒引起的感染。瘟病毒引起的感染包括但不限于HCV、风疹病毒、BVDV、经典型猪瘟病毒、边界病病毒和猪瘟病毒引起的感染。
根据本发明的另一个方面，提供了一种通过用1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇的N-烷基衍生物靶向作用于动物的肝细胞，使葡糖苷酶抑制剂或葡糖基转移酶抑制剂靶向作用于所述肝细胞的方法。在一个优选实施方案中，衍生物是N-壬基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇。
根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗脂类存储疾病的方法，患病个体的细胞中累积了连接有葡糖基或半乳糖基的脂类。在本发明这一方面的一个实施方案中，该方法包括通过将有效抑制葡糖基转移酶的量的N-壬基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇给药给所述动物的病变细胞，由此限制细胞中糖脂的产生，从而治疗动物溶酶体存储疾病。在本发明这一方面的优选实施方案中，动物患有Tay-Sachs病、Gaucher氏病、Krabbe氏病或Fabry氏病。
根据本发明的再一个方面，提供了保护感染了从动物细胞的内膜获得病毒组份的病毒的哺乳动物免于形成癌症(所述病毒感染的后果之一)的预防方法，包括将有效抗病毒量的动物细胞葡糖苷糖抑制剂给药给感染病毒的细胞。在本发明这方面的优选实施方案中，抗病毒的葡糖苷糖抑制剂选自1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇及其衍生物。
附图简述
图1显示了DNJ衍生物N-丁基-DNJ(图1a)和N-壬基-DNJ“578”(图1b)在感染了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Madin Darby牛肾(MDBK)细胞中的抗病毒效果。
图2显示了在经DNJ衍生物处理的被感染的MDBK细胞的培养物中感染性BVDV的分泌。Y轴刻度代表了与无抑制剂上清感染所得的噬菌斑相比，经处理的系统中所测得噬菌斑的相对百分数。X轴刻度代表用于噬菌斑检测的抑制剂浓度。在图的底部给出了IC50。图2a：由N-丁基-DNJ抑制；图2b：由N-壬基-DNJ抑制。
图3显示了N-丁基-DGJ(N-丁基-deoxygalactonojirimycin)对BVDV噬菌斑形成的影响，N-丁基-DGJ的浓度达到了680μg。在此浓度下，神经酰胺特异性葡糖基转移酶的活性被完全抑制。Y轴刻度代表了与无抑制剂上清感染所得的噬菌斑相比，经抑制剂处理后所得噬菌斑的相对百分数。X轴刻度代表了在噬菌斑检测中使用的抑制剂浓度。
图4显示了在感染的细胞培养物中将deoxymannojirimycin(DMJ)的浓度提高到能保护处理细胞免受ECA(一种复合的糖结合的凝集素)的致死效应，其对噬菌斑形成的影响。Y轴刻度代表了与无抑制剂噬菌斑测试上清感染所得噬菌斑(Y=100％)相比，经抑制剂处理后所得噬菌斑的相对百分数。X轴表示了在检测中使用的抑制剂浓度。
图5显示了没有经过感染(图5a)、经BVDV感染但不经处理(图5b)和BVDV感染并经N-丁基-DNJ处理后，细胞中和细胞培养物的上清中病毒材料的相对感染性。
图6显示了取消N-丁基-DNJ(图6a)和N-壬基-DNJ处理后，在感染细胞中BVDV产生的反弹。◆=用药；■=取消用药。
图7显示了不同细胞类型对放射性标记的抑制剂的相对摄取：◆NN-DNJ在HepG2细胞中；■NN-DNJ在MDBK细胞中；▲NB-DNJ在MDBK细胞中；●NB-DNJ在HepG2细胞中。
图8显示了放射性标记的亚氨基糖N-壬基-DNJ和N-丁基-DNJ在给Balb C小鼠给药30，60和90分钟后，在鼠器官中的分布。Y轴数值表示沿X轴标记的各个器官的放射性。结果根据器官的重量进行了标准化。
图9显示了具代表性的黄病毒科病毒的多蛋白序列的组织结构：(a)与瘟病毒BVDV相关的序列；和(b)与丙型肝炎病毒相关的序列。
优选实施方案详述
由需要宿主细胞的糖苷酶来合成和正确折叠病毒包膜糖蛋白的病毒引起的感染可以通过将这些酶的抑制剂给药给宿主细胞予以治疗。靶病毒可以是任何在内质网(ER)相关性细胞内膜的合作下获得其包膜组分的病毒。优选的病毒是黄病毒或瘟病毒类型的成员。
一个细胞中“与内质网相关的膜”意味着围绕细胞内质网的腔的膜、围绕高尔基体(GA)的腔的膜、围绕从内质网到高尔基体的囊泡的腔的膜或者围绕由高尔基体到内质网的囊泡的腔的膜、围绕由内质网或高尔基体向细胞的细胞质膜的囊泡的腔的膜、围绕由内质网或高尔基体向细胞的核膜的囊泡的腔的膜或者围绕由从内质网或高尔基体向细胞的线粒体膜的囊泡的腔的膜。预期本发明的方法优先应用于抑制从宿主细胞的任何内膜获得形态发生组分的病毒的产生。
一个细胞中“与ER相关的葡糖苷酶”意味着嵌在细胞内质网内、结合在其腔侧面或包含于ER相关的膜中的葡糖苷酶。例如，哺乳动物的α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II是与哺乳动物细胞的内质网相关的葡糖苷酶。
根据本发明所述方法处理的病毒感染的动物细胞可以是含有与细胞内膜相关的葡糖苷酶的任何细胞，优选含有与内质网(ER)相关的酶的。特别优选处理哺乳动物细胞，包括但不限于人的肝细胞和牛的单核细胞的治疗。
据信对葡糖苷酶显示出抑制效果的试剂能发挥作用是因为它们是葡萄糖的结构类似物。其中一种试剂是被命名为1，5-二脱氧1，5-亚氨基-葡糖醇(或命名为deoxynojirimycin)的亚氨基糖，此后简称“DNJ”。已经描述了许多DNJ的衍生物。DNJ和它的烷基衍生物是N-连接的寡糖加工酶--α-葡糖苷酶I和α-葡糖苷酶II的强抑制剂(Saunier等(1982)生物化学杂志257：14155-14161；Elbein(1987)生物化学年度综述56：497-534)。这些葡糖苷酶与哺乳动物细胞的内质网相关。DNJ的N-丁基和N-壬基衍生物也可以抑制与高尔基体相关的葡糖基转移酶。
使用DNJ衍生物治疗被呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳动物的方法已有报导(授予Bryant等的美国专利5622972)。据信由于DNJ是葡萄糖的类似物因而表现出对葡糖苷酶的抑制性。但是，Bryant并没有解释DNJ衍生物表现出所观测的抗RSV活性的机制。RSV，一种副粘病毒，从RSV感染的细胞的质膜中获得其包膜。
已经发现了使用DNJ以及N-甲基-DNJ能干扰非缺陷性的逆转录病毒的复制，如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猫白血病病毒、马传染性贫血病毒和绵羊及山羊慢病毒(美国专利5643888和5264356；Acosta等(1994)美国医院制药杂志51：2251-2267)。
此前我们已经指出在不损伤宿主细胞的生存力的情况下，在组织培养基中由人肝胚细胞瘤细胞分泌的人乙型肝炎病毒(HBV)对内质网(ER)中α-葡糖苷酶活性的抑制剂敏感(Block等1994)。乙型肝炎病毒感染过的肝细胞分泌感染性的、含核衣壳的病毒粒子以及过量的不含DNA、非感染性的亚病毒颗粒。据认为所有这些颗粒都是从内质网区室或后期内质网区室如中间区室中芽生的(Huovila等(1992)细胞生物学杂志118：1305-1320；Patzer等(1986)病毒学杂志58：884-892)。抑制成熟HBV外运是由于2．15细胞(该细胞衍生自HepG2细胞)的内质网正常相关的一种或多种葡糖苷酶或葡糖基转移酶的活性被抑制引起的(Lu等(1995)病毒学213：660-665；Lu等(1997)美国科学院学报94：2380-2385)。
研究表明DNJ衍生物的抗-HIV的特性是HIV包膜蛋白的糖基加工异常的结果，而不是直接抑制HIV从细胞中芽生(Dedera等(1990)爱滋病研究及人类逆转录病毒6：785-794；Fischer等(1995)病毒学杂志69：5791-5797；Taylor等(1994)抗微生物试剂与化学疗法38：1780-1787)。
DNJ的一种衍生物，即N-丁基-1，5-双脱氧-1，5-亚氨-D-葡糖醇(NBDNJ)，阻碍了成熟的HBV病毒粒子从稳定转染的HepG2细胞中外运，但并不阻止亚病毒颗粒的外运(Block等(1994)美国科学院学报91：2235-2239)。因此，认为从细胞质膜芽生的HIV病毒粒子的形态发生似乎不受NBDNJ存在的影响。但是，从HIV感染过的、经NBDNJ处理的细胞释放的病毒粒子的感染性比从没有经NBDNJ处理的细胞释放的HIV颗粒降低很多(Dedera等，同前；Fisher等，同前；Taylor等，同前)。这些研究表明NBDNJ的抗HIV的性质是靶细胞中不正常的病毒融合所致，而不是直接抑制HIV从细胞中芽生。
最近我们证实了在HBV感染的旱獭动物模型中葡糖苷酶抑制剂的抗病毒效果。在慢性感感染有旱獭肝炎病毒(WHV)的旱獭中，使用内质网α-葡糖苷酶抑制剂进行治疗导致病毒包膜糖蛋白的正常折叠和运输被破坏，并且阻碍了感染性的有包膜病毒的分泌(Block等1998)。
与HIV和RSV的情况最有意义和明显的差别在于，只有适量的葡糖苷酶被抑制会导致HBV和BVDV的分泌被强烈抑制。这预示着，与HIV和RSV等不同，对于从内膜中芽生的病毒，仅仅一小部分的包膜病毒蛋白被破坏足以抑制病毒的分泌。这也许是基于这样一个事实，即我们的证据表明被破坏的HBV和BVDV病毒蛋白质作为病毒分泌的“显性阴性”毒剂，也许可以认为它们本身就是抗病毒药物，其效果不亚于药物本身。
ER的α-葡糖苷酶担负着从连接到新生糖蛋白的N-聚糖链上逐步除去末端的葡萄糖残基的任务。这样就使糖蛋白与内质网的伴侣蛋白-钙联接蛋白和钙网蛋白相互作用，这两种伴侣蛋白专一地与单葡糖基化的糖蛋白结合。与钙联接蛋白的相互作用对于某些但并非全部糖蛋白的正确折叠是很重要的，并且可以用葡糖苷酶的抑制剂特异性地靶向作用于依赖钙联接蛋白的蛋白质。N-连接的聚糖在糖蛋白的命运和功能中发挥了很多作用。其中一个功能是通过介导凝集素类的伴侣蛋白-钙联接蛋白和钙网蛋白与新生糖蛋白相互作用从而协助蛋白折叠。正是这样的相互作用能通过用试剂(比如N-丁基-DNJ和N-壬基-DNJ)抑制α-葡糖苷酶的活性，导致一些蛋白错误地折叠并滞留在内质网(ER)中来阻止。我们证实了N-壬基-DNJ诱导的一种乙型肝炎病毒(HBV)包膜糖蛋白的错误折叠防止了病毒形成和体外的分泌，并且这种抑制剂使糖基化发生改变，使慢性HBV感染的动物模型中的病毒水平降低。
HBV对由α-葡糖苷酶抑制引起的包膜蛋白的改变的极度敏感性以及无需为达到所观察的抗病毒效果而将这些酶高度地抑制的事实，让我们推测病毒的敏感性也许是基于这样的事实：发生折叠时，其需要在内质网中寡聚化并组装包膜。与HIV和RSV的情况不同，少数错误折叠的包膜蛋白可能足以破坏正常的包膜加工，并且与抑制剂对宿主细胞蛋白的影响(在抗病毒的抑制剂浓度时，宿主细胞的蛋白质并没有遭到破坏)相比，它们对病毒组装的破坏作用得以放大。我们对机制的研究使我们提出只要病毒的一种或多种糖蛋白依赖于钙联接蛋白介导的折叠，从内膜比如内质网中获得其包膜的其他病毒对ERα-葡糖苷酶抑制同样敏感。
虽然HBV和HCV有完全不同的生活周期，但它们以下三点相同：它们靶向于肝，从内质网和其它内膜中芽生并且它们的包膜糖蛋白通过依赖于钙联接蛋白的途径进行折叠。这促使我们研究对HBV有抗病毒效果的同一抑制剂是否以同样的假定机理抑制HCV。
两种HCV包膜糖蛋白E1和E2分别含有5或6以及11个N-连接的糖基化位点，在其生产性折叠过程中均与钙联接蛋白相互作用(Choukhi等1998)。由于缺乏有效的细胞培养复制系统，对HCV颗粒组装的了解极其有限。但是，复合聚糖的缺乏、表达的HCV糖蛋白在内质网中的定位，以及在细胞表面这些蛋白质缺少表明开始的病毒颗粒的形态发生是通过从内质网中芽生入细胞内的囊泡而发生的。另外，成熟的E1-E2异源二聚体不离开内质网，在E1和E2的C-端区域都发现了内质网滞留信号。
这引导我们去研究葡糖苷酶对另一种内质网芽生的病毒-牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的影响，BVDV是人丙型肝炎病毒(HCV)的组织培养替代物。由于缺乏适当的能支持人HCV复制的细胞培养系统，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为由FDA批准的HCV的模型生物(图1)，因为两者有相当程度的局部蛋白质区域同源性(Miller等1990)、共同的复制机制，病毒的包膜可能也有同样的亚细胞定位。强烈推荐使用所发现的对BVDV有抗病毒效果的化合物作为治疗HCV的潜在侯选物。
同HCV一样，BVDV是小的有包膜的正链RNA病毒，并且同所有的黄病毒科的病毒一样，在一个单一的、长开放阅读框(ORF)内编码其所有蛋白质，结构蛋白在多聚蛋白的氨基端而非结构蛋白或复制蛋白在羧基端。BVDV的多聚蛋白在编码形成异源二聚体的包膜蛋白-gp25(E1)和gp53(E2)的区域内有6个潜在的N-糖基化位点，在编码gp48(EO)-一种功能未知的亲水性分泌蛋白的区域内有8个潜在的N-糖基化位点。连接到这些糖蛋白的寡糖结构待测定。已证实了BVDV对ERα-葡糖苷酶抑制剂更敏感。这一点以及在体外使用的抑制剂被肝类型的细胞优先吸收和体内抑制剂在肝中表现出更长的滞留时间的事实表明了鼓舞人心的可能性：即葡糖苷酶抑制剂能被用作广谱抗肝炎病毒试剂。
在这里我们描述了BVDV对葡糖苷酶抑制剂的敏感性，并且讨论了选择性地依赖于聚糖加工的内质网芽生病毒的可能原因。我们已经发现组织培养中的哺乳动物细胞因暴露于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)导致的细胞毒性通过向组织培养基中加入葡糖苷酶抑制剂能得以抑制。在以下实施例中使用的葡糖苷酶抑制剂包括1，5-二脱氧1，5-亚氨基-葡糖醇(DNJ)的一种衍生物，特别是N-丁基-DNJ(NBDNJ)。并且BVDV诱发的细胞毒性的抑制是在几乎观察不到由NBDNJ介导的对宿主细胞的毒性的情况下取得的。因为BVDV是为人接受的丙型肝炎病毒(HCV)的组织培养模型(Henzler，H．J．和K．Kaiser(1998)自然生物技术16：1077-1078)，这里描述的用于抑制BVDV形态发生的组合物和方法也可应用于抑制HCV的形态发生。
在实施本发明方法中有效的组合物包括动物的葡糖苷酶抑制剂，优选哺乳动物的葡糖苷酶抑制剂。本发明所述方法尤其期望的葡糖苷酶抑制剂是DNJ，1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇及其衍生物，有如下结构式：其中R1选自下述基团：
(a)氢；
(b)烷基；
(c)链烯基；
(d)烷氧基；
(e)酰基；
(f)芳基；
(g)芳烷基；
(h)芳酰基；和
(i)芳烷氧基；和
(j)杂环基；和R3，R4，R5和R6可以相同或不同，选自下列基团
(k)酰基；和
(l)芳酰基；
其中所述烷基和链烯基基团具有1到14个碳原子、是线型或分支的、取代或非取代的，所述链烯基有1到6个双键；所述酰基、芳烷基和芳酰基有7到14个碳原子，杂环基任选被卤素、羟基、C1-10烷基、C1-10亚烷基、C1-10酰基和C1-10烷氧基取代；或者所述化合物的对映异构体或立体异构体，或者所述化合物、对映异构体或立体异构体的生理上可接受的盐、溶剂化物。
优选的是DNJ的N-烷基、N-酰基、N-芳酰基、N-芳烷基和O-酰基衍生物。特别优选的DNJ的衍生物是N-丁基-DNJ。另一种优选的DNJ衍生物是1，5-二脱氧-1，5-壬基亚氨基(nonylylimino)-葡糖醇，这里将其命名为N-壬基-DNJ或NN-DNJ。
在例如美国专利5622972中已经描述了DNJ的衍生物，包括
1，5-二脱氧-1，5-丁基亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-丁基亚氨-4R，6-O-苯亚甲基-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-甲基亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-己基亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-壬基亚氨(-nonylylimino)-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-(2-乙基丁基亚氨)-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-苄氧羰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-苯乙酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-苯甲酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-乙基丙二酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-氢化肉桂酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-甲基丙二酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-丁基亚氨-4R，6-O-苯亚甲基-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-(苯氧甲基)羰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-乙基丁基亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-己基亚氨-4R，6-O-苯亚甲基-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-(2-甲基戊基)亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-(3-烟酰)亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-肉桂酰亚氨-D-葡糖醇；
1，5-二脱氧-1，5-(4-氯苯基)乙酰亚氨-D-葡糖醇；和
1，5-二脱氧-1，5-(4-双苯基)乙酰亚氨-D-葡糖醇。
使用这些化合物的亚氨基保护的种类或亚氨基保护的种类的两个或四个乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸酯(盐)。
在例如美国专利5622972、4246345、4266025、4405714和4806650以及美国专利申请07／851818(1992年3月16日申请)中已知并描述了合成DNJ衍生物的方法。
在基本的1，5-二脱氧-1，5-亚氨-D-葡糖醇上进行替代可以影响作为抗病毒试剂的化合物的效力，另外也可以优先将该分子靶向作用于一种而非另一种器官。例如，对于抑制细胞内BVDV病毒的产生，N-丁基取代的DNJ的效果不如N-壬基-DNJ(图1和实施例2)。实施例1中提供了比较各种取代化合物效力的方法。肝细胞优先吸收N-壬基-取代的DNJ(图7和实施例7)。在实施例8和图8中提供了确定各种取代DNJ的优先靶向作用属性的方法。
这里所描述的DNJ衍生物可以以游离的胺形式或药用可接受的盐的形式使用。在Berge，S等(1977)制药科学杂志66(1)：1-18中提供了药用盐和用于制备盐形式的方法。以DNJ衍生物的盐酸盐为例阐述了盐形式。DNJ衍生物也可以以前药的形式使用，如美国专利5043273和5103008中描述的6-磷酸化衍生物。明确期望的是使用进一步包括药用可接受的载体的组合物和进一步包括有益于将组合物递送给动物的成分的组合物。许多有益于将组合物递送给人的可药用接受载体和有益于将该组合物递送给其它动物如牛的成分是本领域已知的。加入该载体和成分到本发明的组合物中是本领域普通技术人员力所能及的。
本发明的方法可进一步包括使用DNJ衍生物和补充的抗病毒剂。该补充的抗病毒剂可为任何已知的抗病毒剂，或者将被认识的任何抗病毒剂。例如，该补充的抗病毒剂化合物可是α-干扰素，病毒唑，lamivudine，蓝菌素，莫能菌素，TurirumabTM(Protein Design Labs)PeniclovirTM(Smithkline Beecham，philadelphia，PA)，FamcidovirTM(Smithkline Beecham，Philadephia，PA)，BetaseronTM(Chiron Corp．)，Theradigm-HBVTM(Cytel，La Jolla，CA)，AdefovirDipivoxil(GS 840，Gilead Sciences，Foster city，CA)，Intron ATM(Schering Plough)，RoferonTM(Roche Labs)，β-干扰素，BMS200，475(Bristol Myers Squibb)，LobucavirTM(Bristol Myers Squibb)，FTC(Triangle，Inc．)，DAPD(Triangle，Inc．)，胸腺素α肽，Glycovir(Block等(1994)美国国家科学院院刊91：2235-2240)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Martin等，(1993)Hepatology 18：775-780)，一种“免疫-细胞因子”(Guidotti等(1994)Jvirol 68：1265-1270)，CDG(Fourel等(1994)Jvirol 68：1059-1065)，或类似物。
治疗脂质贮存疾病
其中在组织中累积了掺入复合脂类的葡糖基和半乳糖基残基的一组脂沉积症或脂质贮存疾病可用本发明的葡糖基转移酶抑制化合物，尤其是根据本发明的方法的N-壬基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇治疗。其中的一些脂沉积症是：
Gaucher氏病
导致异常的葡糖脑苷脂在网状内皮细胞中累积且临床表现为肝脾肿大，皮肤色素沉着，骨骼损伤和结膜黄斑的脂代谢的家族性常染色体隐性紊乱。
此病的根本缺陷是缺乏葡糖脑苷脂酶活性，该酶在正常情况下能水解葡糖脑苷脂成葡萄糖和神经酰胺。典型的病理性发现是广泛的网状细胞增生。该细胞充有葡糖脑苷脂和纤维状细胞质，有不同的外型和一或几个位置特别的小核。在肝、脾、淋巴结和骨髓中可发现这些网状细胞。
Krabbe’s病(半乳糖神经酰胺脂沉积症)
继发于缺乏半乳糖脑苷脂β-半乳葡糖苷酶的一种家族性脂类储存病。以进行性迟滞发育、瘫痪、失明、聋症以及假延髓麻痹为特征的婴幼儿致死性疾病。
Fabry’s病(半乳糖基半乳糖基葡糖神经酰胺脂沉积症)
在许多组织中累积糖脂的一种家族性脂肪代谢异常。代谢的异常是由于缺乏三己糖基神经酰胺的代谢中所需的溶酶体酶α-半乳葡糖苷酶引起的，患有的个体有皮肤损伤和角膜混浊。
Tay-Sachs病：(GM2神经节苷脂沉积症)
由导致神经节苷脂(复合鞘脂，包含由葡萄糖和半乳糖组成的寡糖)在脑中的积累的氨基己糖苷酶A缺乏引起的家族性隐性异常。
根据本发明所述方法给药给动物或动物细胞的抗病毒试剂的量能有效抑制与细胞内的内质网或其它内膜相关的葡糖苷酶活性。根据本发明所述方法给药给动物或动物细胞的葡糖转移酶抑制剂的量能有效抑制与细胞中内质网或其它内膜相关的葡糖转移酶活性。此处所用术语“抑制”指在没有发明所述DNJ衍生化合物时表现出的生物活性的可检测降低或减少。术语“有效量”指达到指定效果所需的组合物的量。此处所用术语“治疗”指受试者症状的减轻或缓和，防止症状恶化或发展，对致病剂的抑制或降低，或给从此正常的受试者预防感染或异常。
因此，例如，治疗患有脂肪沉积症的患者可以是减少病变细胞中脂肪的积累，预防所治疗患者的病情发展。对于病毒感染的治疗包括破坏感染原、抑制或干扰它的生长或成熟，中和其病理学效应等。给药给细胞或动物的组合物的量优选在用药的同时不诱发超过其有利方面的任何毒性效果。
本发明所述药物组合物中的活性成分的实际剂量可以改变，以便活性化合物的用量能对特殊患者达到预期的治疗结果。
所选剂量水平取决于所选择的化合物的活性、用药途径、治疗情况的严重性和所治疗患者的情况和以前的病史。但是，本领域一般开始在低于达到预期治疗效果所需水平用药，然后逐步提高以达到预期效果。如果需要的话，为了给药，可将每天的有效剂量分为多次剂量，如每天服药2到4次。但是，应当理解对于任何具体患者，特殊的用药剂量取决于各种因素，包括体重、整体健康状况、膳食、用药时间及途径、与其它药物组合使用以及所治疗疾病的严重性。估计成人每天的剂量范围通常在每千克体重大约1微克到1克，优选大约10mg到100mg的葡糖苷酶抑制剂。当然，给药给细胞或动物的组合物的量取决于本领域技术人员熟知的许多因素，比如葡糖苷酶抑制剂的分子量，用药的途径等等。
用于本发明的药物组合物可以以固体口服剂、眼用剂、栓剂、气雾剂，局部或其它的类似剂型。除了葡糖苷酶或葡糖转移酶抑制剂外，这类药物组合物可以包括药用可接受的载体以及已知能增强和促进用药的其它成分。另外一些可能的剂型，如微小颗粒、脂质体，重封的红细胞，以及基于免疫的系统也可用于给药根据本发明的葡糖苷酶或葡糖转移酶的抑制剂。这类药物组合物可以通过任何已知的途径进行给药。文中所用术语“非肠道”包括皮下、静脉内、动脉内、鞘内和注射以及输注技术，没有任何限制。例如，药物组合物可以通过口服、局部、非肠道、全身性地或肺的途径进行给药。
根据本发明的方法这些组合物可以以单剂的形式或给药时间不同的多重药剂的形式进行给药。因为组合物对病毒的糖基化抑制作用的时效长于对正常的宿主细胞糖基化的抑制，用药的策略可以进行调整以便延缓病毒的增殖而最小程度地影响宿主细胞的蛋白糖基化。例如，可以每周一次将一剂本发明组合物对动物进行给药，在整个星期内病毒的繁殖被延缓，而宿主细胞的蛋白糖基化只在每周短时间内受到抑制。
使用这些药物组合物的一个有利方面是它们抑制了宿主细胞的酶，而不是病毒的功能。病毒能发生突变是众所周知的，对抗病毒试剂的抑制作用敏感的病毒功能会发生突变，使得子代病毒对该试剂的抑制作用具有抗性。例如，已有文献证明HIV病毒的变异能力，其变异导致特定的抗病毒试剂如AZT不能透过。本发明的方法优势在于本方法所用组合物靶向作用于作为病毒生活周期中的一部分的被病毒利用的宿主细胞的功能。这个宿主功能，即由与宿主细胞内质网相关的宿主葡糖苷酶催化的葡糖基化或与宿主细胞内质网相关的宿主葡糖基转移酶催化的葡萄糖基转移，不会因为病毒基因组的变异而改变。因此，不可能形成对本发明的组合物具有抗性的病毒株。
实验步骤
在本发明中，观察到NBDNJ抑制BVDV在组织培养中的MDBK单层细胞上形成噬菌斑的能力。例如，经BVDV感染而未经NBDNJ处理的两种培养物中，在含有感染细胞的孔内有16和25个病毒噬菌斑。经BVDV感染然后在感染后马上经NBDNJ处理的细胞培养物上没有产生可见的噬菌斑，通过中性红染色观察，单层细胞显得健康并有活性。
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在这些实验中被当作HCV的替代物使用。有必要在组织培养中使用HCV的替代物是因为HCV在组织培养基中、以及在除人和黑猩猩以外的动物中不能可靠地增殖。与HCV相类似，据认为BVDV是从内质网中芽生的瘟病毒(Harasawa等(1995)微生物与免疫学39：979-985)。病毒学家认为BVDV是用于组织培养中HCV最近的生化替代物(Suzich等(1993)病毒学杂志67：6152-6158；Donis(1995)北美兽医临床11：393-423)，并是权威专家的认可，包括美国食品和药物管理局的专家非正式声明的HCV可接受的替代物。
除当作HCV的替代物使用，BVDV也是重要的兽医病原体(Donis(1995)北美兽医临床11：393-423)。在美国重大的家畜损失要归咎于BVDV(Sullivan等(1995)病毒研究38：231-239)。
亚氨基糖衍生物N-丁基-deoxynojirimycin(NB-DNJ)和N-壬基deoxynojirimycin(NN-DNJ)强烈地抑制BVDV对在Madin Darby牛肾(MDBK)细胞的细胞病变作用。利用噬菌斑减少和产量检测，证明壬基化合物(IC50=2．5μM)的效果是丁基化合物的46倍(IC50=115μM)。
在基于细胞的检测中，N-壬基-DNJ对葡糖基转移酶活性的抑制比N-丁基-DNJ强烈地多，而对葡糖基转移酶的抑制有用于治疗很多溶酶体糖脂存储疾病(F．M．Platt，G．R．Neises，G．Reinkensmeier，M．J．Townsend，V．H．Perry，R．L．Proia，B．Winchester，R．A．Dwek，T．D．Butter(1997)科学276：428-431)，可以理解壬基DNJ和其它DNJ烷基链衍生物在治疗溶酶体糖脂存储疾病如Tay-Sachs、Gaucher’s病、Fabry’s等病中或许很有价值。由于NB-DNJ和NN-DNJ化合物不仅抑制内质网的α-葡糖苷酶，而且也抑制参与糖鞘脂生物合成的神经酰胺特异性葡糖基转移酶，因此有必要研究这些药物通过何种途径起到抗病毒的效果。使用N-丁基-deoxygalactonojirimycin(NB-DGJ)-一种只靶向作用于葡糖基转移酶的抑制剂将两种途径进行药理学区分。在噬菌斑减少检测中，NB-DGJ对BVDV的噬菌斑形成没有作用(图3)。正如通过14C-软脂酸-标记的NB-DGJ处理的MDBK细胞中Glc-神经酰胺和神经节苷脂剂量依赖性的减少(数据未发表)所显示的，所用NB-DGJ的浓度足以完全抑制葡糖基转移酶。这说明由NB-DNJ和NN-DNJ观察到的抗病毒效果是由于参与N-多聚糖加工的内质网α-葡糖苷酶受到抑制。
高尔基体的内-α-D-甘露葡糖苷酶是能提供替代的脱葡糖基途径的一种酶，从而使即便是葡糖苷酶受抑制的聚糖进一步加工为复合型寡糖，已表明这种酶在MDBK细胞中含量相当高。但是，并不是所有的蛋白质都必然能利用这条途径。例如，在MDBK细胞中由于castanospermine引起的葡糖苷酶被抑制期间，VSV-G蛋白仍保持对内-H敏感。因此，用NB-DNJ和NN-DNJ处理MDBK细胞也可以抑制BVDV包膜糖蛋白获得对病毒的分泌可能极为重要的复合型N-聚糖。为了检测这种可能性，在噬菌斑减少检测中使用高尔基体的甘露葡糖苷酶抑制剂deoxymannojirimycin(DMJ)(图4)。DMJ，能抑制复合型N-聚糖的形成，但不干扰N-聚糖生物合成的早期步骤，对BVDV的噬菌斑形成没有影响。这意味着NB-DNJ和NN-DNJ的抗病毒效果是由形成复合N-聚糖以前的步骤介导的。
正如NB-DNJ靶向作用于宿主细胞的酶，其它的N-葡糖基化宿主蛋白质，包括病毒的受体，其功能也许会受到损害。如果真是这样，可能会阻止病毒进入宿主细胞。为了验证这种可能性，在感染病毒之前让MDBK细胞在缺乏或存在1mg／ml NB-DNJ的情况下生长六天。用药物进行预处理并不能阻止病毒的入侵(数据未发表)，表明在葡糖苷酶受抑制的细胞中病毒的受体是有功能的。
在感染乙型肝炎病毒(BBV)、葡糖苷酶受到抑制的HepG2细胞中，有包膜的病毒的分泌被抑制，病毒DNA在细胞内积聚。但是，还不清楚感染性颗粒中是否含有累积的DNA，因为在组织培养物中很难确定HBV的感染性。
阻碍BVDV的分泌可能还导致病毒物质在细胞内积累，在这种情况下验证这些物质是否具有感染性较容易。将未经处理和经NB-DNJ处理的感染细胞彻底洗涤，两三天后的经冻融裂解细胞。进行产量检测以确定细胞裂解液和上清中噬菌斑形成单位(pfu)的数量(图5)。对于未经处理的细胞，两天后从细胞内得到大多数具有感染性的病毒物质(超过97％)，三天后在上清中能检测到1／3的具感染性的病毒物质。有意义的是，NB-DNJ处理的细胞两天后不含可检测的具感染性的物质，三天后也很少。在培养基中没有发现具感染性的物质。这些数据表明在感染状态下经抑制剂处理的细胞中不积累BVDV。
只要培养基中存在NB-DNJ，并且葡糖苷酶受到抑制，感感染有BVDV的细胞既不分泌也不积累感染性病毒。我们想确定在除去抑制剂后病毒需要多长时间从葡糖苷酶的抑制中恢复并重新进行分泌。在移去含有药物的培养基，并换用无药物(减药)或含药物的培养基(加药)之前，将感染过的细胞用1mg／ml NB-DNJ或30μg／ml NN-DNJ处理两天(即，直到未经处理的对照细胞中的噬菌斑完全形成)。定时从培养基中取样，利用噬菌斑减少和产量检测法检测具感染性的物质。直到除去药物后24小时内检测不到具感染性的物质，并且24和48小时之间病毒才开始反弹(图6)。
亚氨基糖是葡糖苷酶和葡糖基转移酶的可逆抑制剂，在除去药物的两小时内酶活性接近正常。但N-壬基-DNJ和N-丁基DNJ的抗病毒效果在除去两小时后持续长时间(图6)，特别是对于HBV(Lu等(1997))。因此我们提出亚氨基糖抑制剂的抗病毒效果实际上是由除去药物后长寿命的缺陷病毒糖蛋白在胞内持续存在引起的。这些长寿命的缺陷糖蛋白以显性阴性的形式发挥作用，因此它们本身可以看作是真正的抗病毒试剂。认识到这些缺陷糖蛋白作为抗病毒试剂是有创造性的，可以用来对这些病毒引起的感染进行治疗并开发新疗法。
以下参考下列实施例来描述本发明。这些实施例仅供阐述发明，不应解释为对发明的限制，而应认为发明包含了由本文提供的教导而显而易见的任何和所有变化。
实验
材料与方法
细胞、病毒与抑制剂非细胞病变(ncp)的无BVDV MDBK细胞和细胞病变(cp)的BVDV(NADL毒株)由John McCauley博士(动物卫生研究所，Compton，英国)惠赠。MDBK和HepG2细胞保存在含10％胎牛血清(PAA实验室，澳大利亚)的RPM1 1640培养基(GIBCO／BRL)中，已对细胞进行筛选，发现没有BVDV和BVDV特异性抗体的细胞。N-丁基-deoxynojirimycin(NB-DNJ)和N-壬基-deoxynojirimycin(NN-DNJ)由Monsanto Searle提供。将NB-DNJ溶于培养基中并在使用前过滤。在乙醇中配制NN-DNJ的13mg／ml储存液，使用前用培养基进行稀释。N-丁基-deoxygalactojirimycin(NB-DGJ)和deoxymannojirimycin(DMJ)购自Boehringer Mannheim(德国)，分别在水中配制成200mM和100mM的储液，使用前用培养基稀释并过滤。NB-[U-14C]deoxynojirimycin(比活4．4mCi／mmol)和deoxynojirimycin(DNJ)由G．D．Searle惠赠。
由于缺乏能支持人HCV进行复制的适合的细胞培养系统，牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为FDA批准的HCV的模型生物(图1)，因为它们有相当程度的局部蛋白区域同源性(Miuer等，1990)、相同的复制机制并且病毒包膜可能有相同的亚细胞定位。强烈推荐将发现对BVDV有抗病毒效果的化合物用作治疗HCV的潜在侯选物。
噬菌斑减少和产量检测MDBK细胞在存在或缺乏抑制剂的情况下(见图例)生长于六孔平板中，用cp BVDV(感染复数=0．005；每孔500pfu)于37℃感染一个小时，仅用生长培养基或用生长培养基和抗病毒试剂取代接种物，并在存在或缺乏抑制剂的情况下培养两或三天(噬菌斑减少检测)。在显微镜下用肉眼对噬菌斑进行计数，从孔中移去含有分泌的感染性病毒的上清，用它在六孔平板中感染新鲜的MDBK单层细胞。三天后，在显微镜下对所得的噬菌斑计数(产量检测)。
实施例1
抗病毒的抗葡糖苷酶的存在对暴露于BVDV的MDBK单层细胞
噬菌斑形成的影响
MDBK细胞(ATCC保藏号22 CCL F11859，无BVDV)在24-孔盘的每一孔中生长到半铺满状态，并形成单层细胞。所用培养基是含有10％(V／V)的马血清的Dulbecco改进的Eagle培养基。将BVDV的NADL病毒株(ATCC保藏号NADL 534VR)的储液稀释到每毫升大约500到1000噬菌斑形成单位(pfu)，悬浮于生长培养基中，在存在病毒时培养细胞一个小时，以小于1的感染复数(moi)(噬菌斑形成条件)感染大约105个细胞。单独用生长培养基或含有图5轴上标明量的药物(每毫升多达1000微克NBDNJ)的生长培养基取代接种物。感染后三天，在将单层细胞经溶于乙醇中的0．2％(W／V)的结晶紫染色之前和之后用显微镜进行观察，检测是否存在病毒诱发的噬菌斑并计数(图5)。通过锥虫染料外排和MTT检测，证实经NBDNJ处理的细胞是有活性的(以CC50显示结果，或导致MTT活性的存活力下降50％所需药物的数量)。在以下表格和图1中有这些实验的结果。
表1  经N-丁基-DNJ处理。暴露于BVDV的细胞经1000μgNBDNJ／ml处理。
病毒稀释度 　　未经NBDNJ处理的细胞中观察到的pfu 　　经NBDNJ处理的细胞中观察到的pfu
10-0 C -100s，100s
10-1 (100-1000)，400 0，0
10-2 50，45 0，0　
10-3 1？，10 0，0
10-4 0，0 0，0
没有病毒 0，0 0，0
注：“C”表示发现铺满的细胞裂解。
“1?”表示出现了也许是代表单个pfu的小的细胞裂解区。
“s”表示出现了比被BVDV PFU感染的MDBK单层细胞中通常观察到的噬菌斑小的噬菌斑。
实施例2
在有N-丁基-DNJ和N-壬基-DNJ的情况下感染性BVDV的分泌
MDBK细胞在24孔盘的每一孔中生长到半铺满状态。然后在生长培养基中悬浮有大约500pfu BVDV的NADL病毒株的情况下，将上述细胞于37℃培养1小时，使细胞感染BVDV。分别用生长培养基或含有如表2和表3所示浓度的NBDNJ和NNDNJ的生长培养基取代接种物。三天后取上清，用于感染六孔平板中的新鲜MDBK单层细胞。三天后，在将单层细胞经溶于乙醇中的0．2％(W／V)的结晶紫染色之前和之后用显微镜进行观察，检测是否存在噬菌斑，用0．2％中性红染色以检查存活性，检测是否存在病毒诱发的噬菌斑并计数。结果表示为用无抑制剂的噬菌斑检测上清进行感染时形成的噬菌斑(=100％)的百分数。在表2和表3以及图1A和图1B中列出了这些实验的结果
表2重复实验结果由逗号分开
μg/ml加入每孔的NBDNJ     0     10     50     200     1000     1000
每孔加入的pfu   ～500500,C500+,C     ～500200,500+500+,500+     ～50010,2020,40     ～5000,00,0     ～5000,00,0   00,00,0
每孔观察到的pfu
注：“C”表示观察到铺满细胞裂解
表3加入N-壬基-DNJ对BVDV导致的噬菌斑形成的影响
  μg/ml加入每孔的NNDNJ     0     0.4    2.0   10     50     50
每孔加入的pfu  ～500   ～500  ～500  ～500     ～500     0
每孔检测到的pfu  200,500+500+,C   50,100500,200  100,5050,50  0,00,0     0,00,0     0,00,0
注：“C”表示观察到铺满细胞裂解。N-壬基-DNJ葡糖苷酶抑制剂(糖生物学研究所，牛津大学“化合物578”)。重复实验结果由逗号隔开。
测定出抑制50％的噬菌斑形成的NB-DNJ的浓度(IC50)大约为20μg／ml。计算出NB-DNJ诱发50％MDBK死亡的浓度(CC50)大于1000μg／ml。N-壬基-DNJ的IC50值大约为0．75μg／ml，N-壬基-DNJ的CC50值约为100μg／ml。
对经NB-DNJ或NN-DNJ处理的细胞，病毒诱发的噬菌斑是数量减少或只是大小减少还不太清楚。BVDV感染的细胞经200μg／ml的NB-DNJ或10μg／ml的NN-DNJ处理后没有可见的细胞病变效果。经1000μg／ml的NB-DNJ处理的细胞没有产生可测的毒性。经50μg／ml NN-DNJ处理导致单层细胞呈现“胁迫的”的外观，尽管通过活性染色并没有观测到毒害效果。
实验结果表明NN-DNJ和NB-DNJ是高效的抗BVDV药物。因为BVDV的感染是组织培养中与HCV感染最相关的模型，还因为BVDV和HCV在生化、病毒学和遗传上非常相似，这些数据充分表明NN-DNJ和NB-DNJ也是高效的抗HCV的药物。
实施例3
NB-DGJ抑制神经酰胺特异性葡糖基转移酶的对照检测
MDBK细胞在14C-软脂酸N-丁基-deoxygalactojirimycin存在下生长至铺满。细胞用PBS洗涤三次，从培养瓶上刮下细胞，并用氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)于4℃抽提过夜。保存初次抽提液并再加入0．5ml氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)于室温抽提三个小时。合并抽提液并取小份进行闪烁计数。将样品调整到200000cpm，氮气下干燥，然后悬浮于10μl的氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)中，经TLC(氯仿∶甲醇(2∶1，V／V)进行分离。放射性标记的脂质通过荧光照相术进行检测，观察到的剂量依赖性的Glc-神经酰胺和神经节苷脂的降低(数据未发表)表明在没有抗病毒效果的浓度下神经酰胺特异性葡萄转移酶被抑制。
实施例4
DMJ抑制复合糖的形成的对照检测
MDBK细胞在缺乏或含有300μg／ml DGJ的情况下生长三天。用识别GalβGalNAc表位的鸡冠刺桐(ECA)的凝集素(28μg／ml和280μg／ml)将细胞染色，并经FACS进行分析。在较低的凝集素浓度下，染色强度的改变表明凝集素可得的的结合部位(即复合聚糖)减少。在较高凝集素浓度下，存在DMJ可以使细胞免于因与凝集素结合而死亡，结果见图4。
实施例5
感染后的、经NB-DNJ处理的细胞
胞内和胞外病毒物质的感染性
未感染的(A)和BVDV-感染的(B和C)MDBK细胞在缺少(A和B)或存在(C)1mg／ml的NB-DNJ的情况下生长2或3天。保存上清并将细胞洗涤，经冻融裂解。进行产量检测以便确定上清(S／N)和细胞裂解物中的噬菌斑形成单位(PFU)。结果示于图5。
实施例6
用NB-DNJ或NN-DNJ处理感染细胞后的BVDV的反弹
已感染的MDBK细胞(500pfu／孔)在有(A)1mg／ml的N-丁基-DNJ或(B)30μg／ml的N-壬基-DNJ的情况下培养两天。移去含有药物的培养基并换上无药物(减药)或含药物(加药)的培养基。定时从培养基中取样，通过噬菌斑减少和产量检测对感染性物质进行检测，结果见图6。
实施例7
不同细胞类型对放射性标记的抑制剂的吸收
MDBK和HepG2细胞在12孔板中生长直至铺满，并在有C14-NB-DNJ和H3-NN-DNJ(100000cpm／孔)的情况下培养指定时间，移取上清并予以保存。细胞经PBS(2×500μl)洗涤，用500μl冰预冷的10％高氯酸／2％磷钨酸固定，用冰预冷的乙醇洗涤两次并风干。使用500μl0．5M NaOH在室温下过夜裂解细胞。通过液体闪烁计数来计算上清、PBS洗液和裂解细胞中放射活性的百分比。结果见图7。
实施例8
N-[3H]N-DNJ的制备
在有1mol当量的氰硼[3H]氢化钠(Amersham，10Ci／mmol)的情况下用壬醛(1．2mol当量)将DNJ(61μmol)在室温还原胺化三个小时。通过阳离子交换和反相高效液相色谱(HPLC)从反应体系中纯化氚标记的NN-DNJ。该产品是大于95％的HPLC放射性纯的，通过质谱和1H-NMR验证化合物的结构。比活为145mCi／mmol。
实施例9
放射性标记的亚氨基糖在器官中的分布
放射性标记的NN-DNJ和NB-DNJ在真空下干燥，重悬于全鼠血清(Becton Dickenson)并在冰上超声处理一分钟。用0．2μm的滤器过滤悬浮液，在滤液中回收放射性物质，通常回收率为78％-95％。通过口腔管饲法将滤液给Balbc鼠用药(1-3μCi一只鼠)，30、60、90分钟后将鼠用颈脱位法处死并摘取器官。将器官称重并用Ultra-Turrax匀浆器在水中以浓度0．2-0．4g／ml进行匀浆，取小份测定放射性。结果见图8。
实施例10
用N-壬基-1，5-亚胺基-D-葡糖醇治疗Gaucher氏病
用N-壬基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-葡糖醇(N-壬基-DNJ)通过口服或非肠道地给药治疗患有Gaucher’s病的个体，该病临床上通过脾肿大和伴有在网状内皮细胞中异常葡糖脑苷脂累积的典型的网状细胞增生进行诊断。剂量从基础水平的10mg／kg／天慢慢提高到可观察到治疗效果，临床症状的改善或经活组织检查发现网状内皮细胞内的葡糖脑苷脂减少表明治疗效果。根据患者的临床反应取消或重新开始用N-壬基-DNJ进行治疗。
文中引用的每篇和所有专利、专利申请以及公开出版物此处全文引入作为参考。尽管参考具体实施方案已公开了本发明，但很显然本领域技术人员可以在不脱离本发明的实际精神和范围的情况下提出发明的其他实施方案和变化。附录的权利要求书应解释为包括所有这些实施方案和等同变化。

Claims (24)

1．有效量葡糖苷酶抑制剂、葡糖基转移酶抑制剂或破坏蛋白折叠的试剂在制备抑制病毒产生的药物中的用途，所述病毒在位于受感染宿主细胞的胞内膜中的酶合作下进行复制。
2．有效抗葡糖苷酶或抗葡糖基转移酶量的1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物在制备抑制病毒产生的药物中的用途，所述病毒在受感染宿主细胞的胞内膜中的酶协助下进行复制，所述衍生物有如下通式：
Figure 9881304200023
其中R1选自下列基团
(m)氢；
(n)烷基；
(o)链烯基；
(p)烷氧基；
(q)酰基；
(r)芳基；
(s)芳烷基；
(t)芳酰基；和
(u)芳烷氧基；和
(v)杂环基和R3，R4和R5可以相同或不同，选自下列基团
(w)酰基；和
(x)芳酰基；和
R6是氢、或烷基、链烯基、酰基、芳酰基和芳烷基基团，
其中所述烷基和链烯基基团是线型或分枝的，取代或非取代的，所述链烯基有1到6个双键；所述酰基和杂环基任选被卤素、羟基、C1-10烷基、C1-10亚烷基、C1-10酰基和C1-10烷氧基取代；和所述化合物的对映异构体或立体异构体，和所述化合物、对映异构体或立体异构体的生理上可接受的盐或溶剂化物。
3．权利要求2的用途，其中所述1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物在R1上被一个烷基基团所取代。
4．权利要求3的用途，其中所述1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物有如下通式
Figure 98813042000311
5．权利要求4的用途，其中所述1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物在R3、R4、R5和R6位上被氢取代。
6．权利要求2的用途，其中所述1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物有如下通式
Figure 98813042000312
7．权利要求6的用途，其中所述1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇在R3、R4、R5和R6位上被氢取代。
8．权利要求1-7的用途，其中在R3、R4和R5至少有一个是酰基。
9．权利要求2的用途，其中将1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物给药给哺乳动物宿主细胞。
10．权利要求9的用途，其中将1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物给药给人类宿主细胞。
11．权利要求2的用途，其中将1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇衍生物在体内给药给所述的宿主细胞。
13．权利要求2的用途，其中所述宿主细胞被属于黄病毒类的一种病毒感染。
14．权利要求12的用途，其中在宿主细胞内的黄病毒选自黄热病毒、登革病毒1-4、日本脑炎病毒、墨累溪谷脑炎病毒、Rocio病毒、西尼罗热病毒、圣·路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、羊跳跃病病毒、波瓦生病毒，鄂木斯克出血热病毒和Kyasanur森林出血热病毒。
15．权利要求12的用途，其中所述宿主细胞被丙型肝炎病毒感染。
16．权利要求2的用途，其中所述宿主细胞被属于瘟病毒类的一种病毒感染。
17．权利要求2的用途，其中所述宿主细胞被在其内质网或环绕内质网腔的膜协助下复制至少部分其病毒结构的病毒所感染。
18．权利要求2的用途，其中所述宿主细胞被在其高尔基体或高尔基体的腔膜协助下复制至少部分其病毒结构的病毒所感染。
19．有效量1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物在制备药物中的用途，所述药物用于将抗葡糖苷酶或抗葡糖基转移酶的药剂递送给需要其的脊椎动物的肝细胞。
20．有效抗葡糖苷酶或抗葡糖基转移酶量的1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇的衍生物在制备治疗牛病毒性腹泻病毒感染的细胞的药物中的用途，其中所述衍生物选自N-烷基、N-酰基、N-芳基、N-芳烷基和N-芳酰基衍生物。
21．权利要求19的用途，其中病毒感染的细胞是牛单核细胞。
22．有效抗病毒量动物细胞葡糖苷酶抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于保护被从动物细胞的内膜获得病毒组分的病毒感染的动物不会患上所述病毒感染留下的后遗症之一的癌症。
22．权利要求21的用途，其中所述葡糖苷酶抑制剂选自1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡糖醇及其衍生物。
23．有效的葡糖基转移酶抑制量的N-壬基-1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-葡萄糖醇在制备治疗动物溶酶体脂类存储疾病的药物中的用途。
24．权利要求24的用途，其中所述动物患有Tay-Sach氏病、Gaucher氏病、Krabbe氏病或Fabry氏病。
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