KR101755133B1 - 이미노슈가 및 바이러스성 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

Abstract

뎅기 바이러스에 의해 유발되거나 그와 관련된 바이러스성 감염을 이미노슈가를 사용하여 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

Description

이미노슈가 및 바이러스성 질환을 치료하는 방법{IMINOSUGARS AND METHODS OF TREATING VIRAL DISEASES}

<관련 출원>

본 출원은 2009년 2월 23일자로 출원된 미국 가출원 제61/202,367호 및 2009년 9월 4일자로 출원된 미국 가출원 제61/272,255호를 우선권으로 주장하며, 둘 다 본원의 참고문헌으로 전체로서 삽입된다.

본 출원은 이미노슈가 및 이미노슈가로 바이러스성 감염을 치료 또는 예방하는 방법, 특히 이미노슈가 및 뎅기(Dengue) 바이러스에 관련된 바이러스성 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

뎅기 바이러스성 감염을 치료 또는 예방하는 방법은 치료를 요하는 환자에게 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염 유효량을 투여하는 것을 포함한다:

상기 식에서,

R은 치환 또는 비치환된 옥사알킬기이거나; 또는

R은

이고

(여기서, R₁은 옥사알킬기이며;

X_{1 -5}는 H, NO₂, N₃, 또는 NH₂로부터 독립적으로 선택된 것이고;

Y는 부재 또는 카보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C₁-알킬기이며; 및

Z는 결합 또는 NH에서 선택된 것이되; 단 Z가 결합일 경우, Y는 부재이고, 단 Z가 NH일 경우에는, Y는 카보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C₁-알킬기이다); 및

W_{1 -4}는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 할로알킬기, 치환 또는 비치환된 알카노일기, 치환 또는 비치환된 아로일기, 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일기로부터 독립적으로 선택된 것이다.

용어의 정의

별도의 언급이 없는 경우, "한(a)" 또는 "하나(an)"는 "하나 이상"을 의미한다.

본원에서 사용한, 용어 "바이러스성 감염"은 바이러스가 건강한 세포에 침투하여 세포의 번식 기구를 사용하여 증식 또는 복제하고 궁극적으로 세포를 용해시켜 세포사와, 바이러스 입자의 방출 및 새로 생성된 자손 바이러스에 의한 다른 세포의 감염을 유발하는 질환 상태를 말한다. 특정 바이러스에 의한 잠복 감염 또한 바이러스성 감염의 가능한 결과이다.

본원에서 사용한, 용어 "바이러스성 감염을 치료 또는 예방"은 특정 바이러스의 복제를 억제하는 것, 바이러스 전달을 억제하는 것, 또는 바이러스가 숙주 내에 자리잡는 것을 예방하는 것, 및 바이러스성 감염으로 유발된 질환의 증상을 완화 또는 경감하는 것을 의미한다. 치료는 바이러스성 적하의 감소, 사망률 및/또는 이환률의 감소가 있다면 치료적인 것으로 간주된다.

IC50 또는 IC90(억제 농도 50 또는 90)은 각각 바이러스성 감염의 50% 또는 90% 감소를 달성하는데 사용된 치료제, 예컨대 이미노슈가의 농도이다.

관련 출원

본 출원은 2009년 2월 23일자로 출원된, 미국 가출원 제61/202,367호를 참고문헌으로 전체로서 삽입한다.

개시

본 발명자들은 특정 이미노슈가, 예컨대 데옥시노지리마이신 유도체가 뎅기 1-4 바이러스에 대하여 효과적일 수 있다는 것을 밝혀냈다.

특히, 이미노슈가는 뎅기 1-4 바이러스에 의해 유발되거나 그와 관련된 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 뎅기 바이러스에 감염된 환자의 생존률 또는 생존 가능성을 증가시킬 수 있다.

뎅기 바이러스

뎅기 바이러스는 플라비리데(Flaviridae)과의 플라비바이러스(Flavivirus)속에 속하며 뎅기 출혈열(DHF)를 유발한다. 뎅기 바이러스는 네개의 밀접하게 관련된 항원형을 포함하며, 통상적으로 뎅기 1, 뎅기 2, 뎅기 3 및 뎅기 4로 지칭된다. 하나에 의한 감염으로부터의 회복은 그 항원형에 대해 일생 동안의 면역을 제공하지만, 다른 세개에 의한 감염에 대해서는 오직 부분적이고 일시적인 보호만을 부여한다. 순차적 감염은 DHF를 유발하는 더 심각한 질환의 위험을 증가시킨다는 우수한 증거가 존재한다. 최근 생겨난 DHF 전염병은 네가지 뎅기 바이러스 모두가 풍토적인 아메리카 및 아시아에서 우려를 증가시키고 있다. DHF는 몇몇 나라에서 아이들의 입원 및 죽음의 주된 원인이 되었다. 2007년에, 아메리카에서 890,000건을 초과하는 뎅기 사례들이 보고되었으며, 이 중 26,000 사례가 DHF였다.

뎅기는 일차적으로 이집트숲모기(Aedes aegypti mosquito)에 의해 전염되고 인간에게 가장 흔한 모기-매개성 바이러스성 질환이다. 세계적으로, 25억의 사람들-세계 인구의 40%-이 이집트숲모기가 흔하고 뎅기가 전염될 수 있는 따뜻한 지역에 살고 있다. 열대지방의 도시 및 그곳의 인간과 모기의 수의 급속한 성장은 어느 때보다도 더 많은 수의 사람들이 이 벡터와 접촉하게 초래하고 있다. 모기 벡터 및 바이러스 모두의 지리적인 확산은 세계적인 유행성 뎅기열의 재발병 및 뎅기 출혈열(DHF)의 출현을 야기해 왔다.

이미노슈가

많은 실시양태에서, 이미노슈가는 N-치환 데옥시노지리마이신일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, N-치환 데옥시노지리마이신은 하기 화학식의 화합물일 수 있다:

상기 W_{1 -4}는 수소, 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 할로알킬기, 치환 또는 비치환된 알카노일기, 치환 또는 비치환된 아로일기, 또는 치환 또는 비치환된 할로알카노일기로부터 독립적으로 선택된 것이다.

몇몇 실시양태에서, R은 치환 또는 비치환된 알킬기, 치환 또는 비치환된 시클로알킬기, 치환 또는 비치환된 아릴기, 또는 치환 또는 비치환된 옥사알킬기로부터 선택된 것일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, R은 1개 내지 16개의 탄소 원자, 4개 내지 12개의 탄소 원자 또는 8개 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 알킬기 및/또는 치환 또는 비치환된 옥사알킬기일 수 있다. 용어 "옥사알킬"은 1개 내지 5개 또는 1개 내지 3개 또는 1개 내지 2개의 산소 원자를 함유할 수 있는 알킬 유도체를 지칭한다. 용어 "옥사알킬"은 히드록시기 및 메톡시기를 말단으로 하는 알킬 유도체를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, R은 -(CH₂)₆OCH₃, -(CH₂)₆OCH₂CH₃, -(CH₂)₆O(CH₂)₂CH₃, -(CH₂)₆O(CH₂)₃CH₃, -(CH₂)₂O(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₂O(CH₂)₆CH₃,; -(CH₂)₂O(CH₂)₇CH₃; -(CH₂)₉-OH; -(CH₂)₉OCH₃로부터 선택된 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

몇몇 실시양태에서, R은 분지 또는 비분지, 치환 또는 비치환된 알킬기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 알킬기는 C6-C20 알킬기; C8-C16 알킬기; 또는 C8-C10 알킬기일 수 있는 장쇄 알킬기일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, R은 장쇄 옥사알킬기, 즉 1개 내지 5개 또는 1개 내지 3개 또는 1개 내지 2개의 산소 원자를 함유할 수 있는 장쇄 알킬기일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, R은 하기 화학식을 가질 수 있다:

여기서 R₁은 치환 또는 비치환된 알킬기이며;

X_{1 -5}는 H, NO₂, N₃, 또는 NH₂로부터 독립적으로 선택된 것이고;

Y는 부재 또는 카보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C₁-알킬기이며; 및

Z는 결합 또는 NH에서 선택된 것이되; 단 Z가 결합일 경우, Y는 부재이고, 단 Z가 NH일 경우에는 Y는 카보닐을 제외한 치환 또는 비치환된 C₁-알킬기이다.

몇몇 실시양태에서, Z는 NH이고 R₁-Y는 치환 또는 비치환된 알킬기, 예컨대 C2-C20 알킬기 또는 C4-C12 알킬기 또는 C4-C10 알킬기이다.

몇몇 실시양태에서, X₁은 NO₂이고 X₃는 N₃이다. 몇몇 실시양태에서 각 X₂, X₄, 및 X₅는 수소이다.

몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 미국 특허 공개 출원 제2007/0275998호에 개시된 DNJ 유도체일 수 있으며, 참고문헌으로 전체로서 삽입된다. 몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 도 1에 도시된 화합물 중 하나일 수 있다. 이미노슈가, 예컨대 데옥시노지리마이신 유도체는 예컨대 미국 특허 제5,622,972호, 제5,200,523호, 제5,043,273호, 제4,994,572호, 제4,246,345호, 제4,266,025호, 제4,405,714호, 및 제4,806,650호, 및 미국 공개 특허 출원 제US2007/0275998호에 개시된 것과 같이 합성될 수 있으며, 모두가 본원에 전체로서 삽입된다.

몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 무기 또는 유기산으로부터 유래된 염의 형태일 수 있다. 제약상 허용가능한 염 및 염 형태를 제조하기 위한 방법은 예를 들어 문헌(Berge et al. (J. Pharm . SCi . 66:1-18, 1977))에 개시되어 있다. 적절한 염의 예로는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 디글루코네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 메실레이트, 및 운데카노에이트.

몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 전구약물의 형태로 사용될 수 있다. DNJ 유도체의 전구약물, 예컨대 6-인산화된 DNJ 유도체는 미국 특허 제5,043,273호 및제5,103,008호에 개시되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 제약상 허용가능한 운반체 및/또는 동물에게 조성물을 전달하는데 유용한 성분을 추가로 포함하는 조성물의 일부로 사용될 수 있다. 인간에게 조성물을 전달하는데 유용한 수많은 제약상 허용가능한 캐리어 및 다른 동물 예컨대 소에게 조성물을 전달하는데 유용한 성분은 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 조성물에 그러한 캐리어 및 성분의 추가는 당업계의 통상의 기술 수준 내이다.

몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 이미노슈가를 본질적으로 구성할 수 있으며, 이는 이미노슈가가 조성물 내 유일한 유효 성분이라는 것을 의미할 수 있다.

또다른 실시양태에서, 이미노슈가는 하나 이상의 추가 항바이러스 화합물과 같이 투여될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 이미노슈가는 예컨대 미국 공개 2008/0138351; 2009년 3월 25일자로 출원된 미국 출원 제12/410,750호 및 2009년 3월 27일자로 출원된 미국 가출원 제61/202,699호에 개시된 것과 같은 리포좀 조성물에서 사용될 수 있다.

이미노슈가는 바이러스가 침범한 세포 또는 개체에 투여될 수 있다. 이미노슈가는 바이러스의 형태형성을 억제하거나 개체를 치료할 수 있다. 치료는 동물에서 바이러스 감염을 감소, 약화 또는 저하할 수 있다.

뎅기 바이러스에 감염될 수 있는 동물은 척추동물, 예컨대 설치류 및 인간을 포함하는 영장류를 포함하는 포유류를 포함한다.

본 발명의 방법으로 동물 또는 동물 세포에 투여되는 이미노슈가의 양은 뎅기 바이러스의 세포에서의 형태형성을 억제하는데 효과적인 양일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "억제"는 이미노슈가의 부재에서 보이는 검출 가능한 생물학적 활성의 감소 및/또는 제거를 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "유효량"은 나타낸 효과를 달성하는데 필요한 이미노슈가의 양을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "치료"는 환자의 증상을 감소 또는 완화, 악화 또는 진행을 예방, 원인물질을 억제 또는 제거, 또는 뎅기 바이러스가 없는 환자에서 그와 관련된 감염 또는 장애를 예방하는 것을 지칭할 수 있다.

그러므로, 예를 들어, 뎅기 바이러스에 의해 유발되거나 그와 관련된 감염의 치료는 감염 요소의 파괴, 그것의 성장 또는 성숙의 억제 또는 방해 및 그것의 병리학적 영향의 중화를 포함할 수 있다. 세포 또는 동물에게 투여될 수 있는 이미노슈가의 양은 바람직하게는 그것의 투여로 동반되는 장점보다 더 큰 독성 효과를 유도하지 않는 양이다.

제약 조성물 내 유효 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자에 대해서 원하는 치료 반응을 달성하는데 효율적인 적절량의 활성 화합물(들)을 투여하기 위해서 차이가 날 수 있다.

선택된 용량 수준은 이미노슈가의 활성, 투여 경로, 치료하는 증상의 심각성, 및 치료하는 환자의 증상과 이전 병력에 달려있을 수 있다. 그러나, 화합물(들)의 용량을 원하는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 것보다 더 낮은 수준으로 시작하여 원하는 효과가 달성될 때까지 점차 용량을 증가시키는 것은 당업계 내의 기술이다. 만약 원한다면, 유효 1일 용량은 투여 목적으로 복수회 용량으로, 예를 들어 하루에 2번 내지 4번 투여와 같이 분할될 수 있다. 그러나, 이는 특정 환자에 대한 특정 용량 수준은 체중, 일반적인 건강, 식이요법, 투여 시간 및 경로, 및 다른 치료제와의 조합 및 치료하는 증상 또는 질환의 심각성을 포함하는 여러 가지 인자에 달려있을 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 성인 인간 1일 투여량은 체중 10 킬로그램 당 약 1 마이크로그램 내지 약 1 그람, 또는 약 10 mg 및 100 mg 사이의 범위의 이미노슈가일 수 있다. 물론, 세포 또는 동물에 투여되어야 하는 이미노슈가의 양은 당업자가 잘 이해하고 있는 수많은 인자, 예컨대 이미노슈가의 분자량 및 투여 경로에 달려있을 수 있다.

본 발명의 방법에서 유용한 제약 조성물은 경구 고형 제제, 점안제, 좌제, 에어로졸제, 국소제 또는 다른 유사한 제제로 전신성으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 파우더, 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 겔, 용액, 현탁액, 시럽 등의 성상(physical form)일 수 있다. 이미노슈가에 추가로, 그러한 제약 조성물은 약 투여를 용이하게 하고 증진시키는 것으로 알려진 제약상 허용가능한 운반체 및 다른 성분을 함유할 수 있다. 다른 가능한 제제, 예컨대 나노입자, 리포좀 방출 적혈구, 및 면역학적 기초 시스템이 또한 이미노슈가를 투여하는데 사용될 수 있다. 그러한 제약 조성물은 많은 경로로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 동맥내, 경막내, 및 주사 및 주입 기술을 제한 없이 포함한다. 예로서, 제약 조성물은 경구, 국소, 비경구, 전신성 또는 폐 경로로 투여될 수 있다.

이 조성물들은 1회 용량 또는 다른 시간으로 투여되는 복수회 용량으로 투여될 수 있다. 뎅기 바이러스에 대한 조성물의 억제 효과가 지속될 수 있기 때문에, 숙주 세포는 최소한으로 영향받게 하는 반면 바이러스 증식은 지연시킬 수 있도록 투여 요법을 조정할 수 있다. 예로서, 동물에게 본 발명의 조성물의 1회 분을 1주에 한번씩 투여할 수 있으며, 이로써 숙주 세포 기능은 단지 1주에 한번 짧은 기간 동안만 억제되는 반면, 바이러스 증식은 일주일 내내 지연된다.

본원에 기술된 실시양태는 추가적으로 하기 실시예로 설명되지만, 이에 제한되지는 않는다.

(실시예)

1. N-노닐 DNJ의 합성

방법 : 50-ml, 자석 교반기를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 DNJ(500 mg), 에탄올(100 mL), 노나날(530 mg), 및 아세트산(0.5 mL)을 채웠다. 반응 혼합물을 40-45℃로 가열하였고 30-40분 동안 질소 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각하였고 Pd/C를 첨가하였다. 반응 플라스크를 배기하였고, 풍선 내 수소 가스로 대체하였다. 이 과정을 세 번 반복하였다. 최종적으로, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite) 패드를 통해 여과하였고 에탄올로 세척하였다. 여과액을 진공 속에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피(230-400 메시(mesh) 실리카 겔)로 정제하였다. 디클로로메탄 내 메탄올의 용매 구배(10-25%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고, 진공 속에서 농축시켜 순수한 생성물(420 mg)을 얻었다. 반응의 완결은 박층 실리카 겔 판; 용리액; 메탄올:디클로로메탄 = 1:2를 사용하는 박층크로마토그래피(TLC)로 관찰하였다.

2. N-7-옥사데실 DNJ의 합성

2a. 6-프로필옥시-1-헥사놀의 합성

방법 : 500-ml, 자석 교반기를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 1,6-헥산디올(6.00 g), 포타슘 tert-부톡시드(5.413 g)를 채웠다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였고, 그 후 1-요오도프로판(8.63 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70-80℃로 가열하였고 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응의 완결 후, 반응 혼합물에 물을 첨가하였고, 에틸 아세테이트(2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층들을 진공 속에서 농축시켜서 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 디클로로메탄에 용해하였고 물, 그 다음 염수로 세척하였고, 소듐 술페이트로 건조하였다. 유기 층을 진공 속에서 농축하여 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 230-400 메시 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 헥산 내 에틸 아세테이트의 용매 구배(10-45%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 순수한 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고, 진공 속에서 농축시켜 순수한 6-프로필옥시-1-헥사놀(품목 D-1029-048, 1.9 g, 25%)을 얻었다. 반응의 완결은 박층크로마토그래피(TLC)(용리액: 헥산 내 60% 에틸 아세테이트)로 관찰하였다.

2b. 6-프로필옥시-1-헥사날의 제조

방법 : 50-ml, 자석 교반기를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 6-프로필옥시-1-헥사놀(1.0 g), PDC(4.7 g), 디클로로메탄(10 mL), 셀라이트(1.0 g), 및 소듐 아세테이트(100 mg)를 채웠다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에서 5분 동안 교반하였다. PDC(4.70 g)를 반응 혼합물에 첨가하였고, 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응의 완결 후에, 반응 혼합물을 칼럼(230-400 메시 실리카 겔)에 곧바로 로드하였다. 에틸 아세테이트 내 디클로로메탄의 용매 구배(10-20%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 순수한 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고 진공 속에서 농축시켜 순수한 6-프로필옥시-1-헥사날(품목 D-1029-050, 710 mg, 71%)을 얻었다. 반응의 완결은 박층크로마토그래피(TLC)(용리액: 헥산 내 60% 에틸 아세테이트)로 관찰하였다.

2c N-7-옥사데실-DNJ의 합성

방법 : 50-ml, 자석 교반기를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 DNJ(500 mg), 에탄올(15 mL), 6-프로필옥시-1-헥사날(585 mg), 및 아세트산(0.1 mL)을 채웠다. 반응 혼합물을 40-45℃로 가열하였고 질소 하에서 30-40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 상온으로 냉각하였고 Pd/C를 첨가하였다. 반응 플라스크를 배기하였고, 풍선 내 수소 가스로 대체하였다. 이 과정을 세 번 반복하였다. 최종적으로, 반응 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응 혼합물을 셀라이트(Celite) 패드를 통해 여과하였고 에탄올로 세척하였다. 여과액을 진공 속에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 칼럼 크로마토그래피(230-400 메시 실리카 겔)로 정제하였다. 디클로로메탄 내 메탄올의 용매 구배(10-40%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고, 진공 속에서 농축시켜 순수한 생성물(품목: D-1029-052 (840 mg))을 얻었다. 반응의 완결은 박층크로마토그래피(TLC)(용리액: 디클로로메탄 내 50% 메탄올)로 관찰하였다.

3. N-(9-메톡시)-노닐 DNJ의 합성

3a 9-메톡시-1-노나놀의 제조

방법 : 500-ml, 자석 교반기 및 교반바(stir bar)를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 디메틸 술폭시드(100 mL) 및 H₂O(100 mL) 내 1,9-노난디올(10.00 g, 62.3 mmol)를 채웠다. 이것에 H₂O(10 mL) 내 소듐 히드록시드(5.0 g, 125.0 mmol)의 용액을 실온에서 천천히 첨가하였다. 소듐 히드록시드의 첨가 동안 반응 혼합물은 열을 발생하여 온도가 약 40℃로 올랐다. 혼합물을 한 시간 동안 교반하였고, 그 후 반응 혼합물의 온도를 약 40℃로 유지하면서 디메틸 술페이트(16.52 g, 131 mmol)를 네 번에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. TLC 관찰은 반응이 25% 전환인 것으로 나타났다. 이 단계에서 추가 디메틸 술페이트(24.78 g, 196.44 mmol)을 첨가하였고 생성된 혼합물을 실온에서 추가 24시간 동안 교반하였다. 반응의 완결 후에, 소듐 히드록시드(물 중 10% 용액)를 반응 혼합물에 첨가하여 용액의 pH를 11-13으로 조정하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였고 디클로로메탄(3 x 100 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층들을 H₂O(200 mL), 염수(150 mL)으로 세척하였고, 무수 소듐 술페이트(20 g)로 건조하였고, 진공 속에서 여과 및 농축하여 미정제 생성물(14 g)을 수득하였다. 미정제 생성물을 250-400 메시 실리카 겔을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 헥산 내 에틸 아세테이트의 용매 구배(10-50%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 순수한 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고 진공 속에서 농축시켜 순수한 9-메톡시-1-노나놀(품목 D-1027-155, 2.38 g, 21.9%)을 얻었다. 반응의 완결은 박층 실리카 겔 판; 용리액 : 헥산 내 60% 에틸 아세테이트를 사용하는 박층크로마토그래피(TLC)로 관찰하였다.

3b. 9-메톡시-1-노나날의 제조

방법 : 50-ml, 자석 교반기 및 자석바를 갖춘 1구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 9-메톡시-노나놀(1.0 g, 5.9 mmol), 디클로로메탄(10 mL), 분자 체(1.0 g, 3A), 소듐 아세테이트(0.1 g)를 채웠다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에서 5분 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 피리디늄 디클로메이트(4.7 g, 12.5 mmol)를 채웠고 밤새 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응의 완결 후에, 반응 혼합물을 실리카 겔 층(약 15 g)을 통해 여과하였다. 여과액을 진공 속에서 증발시켜 미정제 화합물을 얻었다. 이를 실리카 겔 칼럼(250-400 메시, 40 g)을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 헥산 내 에틸 아세테이트의 용매 구배(10-50%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 순수한 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고, 진공 속에서 농축시켜 9-메톡시-노나날(품목: D-1027-156, 553 mg, 54.4%)을 얻었다. 반응의 완결은 박층 실리카 겔 판; 용리액: 헥산 내 60% 에틸 아세테이트를 사용하는 박층크로마토그래피(TLC)로 관찰하였다.

3c N-(9-메톡시)-노닐 DNJ의 합성

방법 : 50-ml, 자석 교반기 및 자석바를 갖춘 2구 둥근 바닥 플라스크에 실온에서 DNJ(300 mg, 1.84 mmol), 에탄올(20 mL), 9-메톡시-1-노나날(476 mg, 2.76 mmol)을 채웠다. 반응 혼합물을 질소 하에서 5-10분 동안 교반하였고 실온에서 Pd/C를 첨가하였다. 반응 혼합물을 배기하였고, 풍선을 사용하여 수소 가스로 대체하였다. 이 과정을 세 번 반복하였고 그 후 반응 혼합물을 실온에서 대기 수소 하에 교반하였다. 반응의 진행은 TLC(주석 1)로 관찰하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 층을 통해 여과하였고 에탄올(20 mL)로 세척하였다. 여과액을 진공 속에서 농축시켜 미정제 생성물을 얻었다. 미정제 생성물을 250-400 메시 실리카 겔(20 g)을 사용하는 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 에틸 아세테이트 내 메탄올의 용매 구배(5-25%)를 사용하여 생성물을 칼럼으로부터 용리하였다. 원하는 순수한 생성물을 함유하는 모든 분획물을 합하였고, 진공 속에서 농축시켜 황백색 고체를 얻었다. 이 고체를 에틸 아세테이트(20 mL) 중에 배산시키고, 여과시키고 고진공으로 건조시켜 백색고체(품목: D-1027-158 (165.3 mg, 28.1%))를 얻었다. 반응의 완결은 박층 실리카 겔 판; 용리액; 디클로로메탄 내 50% 메탄올을 사용하는 박층크로마토그래피(TLC)로 관찰하였다.

4. 뎅기 바이러스에 대한 이미노슈가의 효과

도 2는 NB-DNJ, NN-DNJ, 및 N7-O-DNJ에 의한 뎅기 바이러스에 대한 세포 보호를 도시한다.

방법. 바이러스-유도 세포변성 효과(CPE)-억제 분석을 UV 화합물의 0.122 내지 500 μM 이하의 농도에서 수행하였다.

화합물을 뎅기 바이러스 유형 2(DENV2), 뉴기니 C 균주에 대한 억제에 대해 스크리닝하였다. 2%의 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1x 변형 이글 배지(1x modified Eagle medium)(MEM, 깁코)를 사용하여 베로 세포(Vero cell)의 증식으로 바이러스 모액을 만들었고 표준 플라크 분석을 사용하여 역가측정하였다. 바이러스 모액은 사용하기 전까지 -80℃에서 저장하였다.

아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 마나사스, 버지니아)에서 얻은 베로 세포(아프리카산 녹색 원숭이 신장 상피 세포주)를 분석 전에 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 24시간 동안 세포 배양 처리된 96-웰(well) 평면 바닥 플레이트에 평판배양 하였다. 시험을 2%의 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 변형 이글 배지에서 500 μM의 화합물로 시작하여, 0.122 μM까지 감소하여 완료했다. 분석 날에, 배지를 흡입하였고 세포를 다양한 농도의 화합물로 처리하였다. 37℃에서 약물 전처리의 1시간 후에, 뎅기 바이러스를 낮은 감염다중도(MOI)로 세포에 첨가하였다. 감염 후 1시간에, 세포를 세척하였고 화합물을 함유하는 배지를 첨가하였다. 분석은 6일 동안 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 전개되도록 하였는데, 이동안 미처리 바이러스 감염된 대조용 웰은 CPE를 보였다. 감염 후 기간 후에, 배양물 상등액을 플레이트로부터 제거하였고 바이러스 유도된 세포 손상(세포질 효소 락테이트 탈수소효소의 방출)에 대한 제조사의 추천에 따라 LDH 분석(사이토톡스96, 프로메가, WI)으로 분석하였다. 화합물로 처리된 세포 또는 대조군의 세포변성 효과 백분율을 계산하고 비교하는데 OD 판독을 사용하였다. 실험은 UV 화합물이 투여량 의존성 방식으로 뎅기 바이러스로 인한 죽음으로부터 세포를 보호하는데 효과적임을 입증한다.

도 3은 NB-DNJ, NN-DNJ, 및 N7-O-DNJ에 대한 세포 독성 데이터를 도시한다.

방법. 0.122 내지 500 μM 이하의 농도의 NB-DNJ, NN-DNJ 및 N7-O-DNJ을 베로 세포에 대한 세포독성에 대하여 실험했다. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 마나사스, 버지니아)에서 얻은 베로 세포(아프리카산 녹색 원숭이 신장 상피 세포주)를 분석 전에 24시간 동안 세포 배양 처리된 96-웰 평면 바닥 플레이트에서 평판배양 하였다. 테스트를 2%의 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 변형 이글 배지에서 500 μM의 화합물로 시작하여, 0.122 μM까지 감소하여 완료했다. 세포를 37℃, 5% CO₂ 배양기 내에서 배양하였고, 유도된 세포 손상(세포질 효소 락테이트 탈수소효소의 방출)에 대한 제조사의 추천에 따라 플레이트를 LDH 분석(사이토톡스96, 프로메가, WI)으로 분석하였다. 화합물로 처리된 세포 또는 대조군의 세포변성 효과 백분율을 계산하고 비교하는데 OD 판독을 사용하였다. 실험은 N7-O-DNJ 및 NB-DNJ가 베로 세포에게 비-독성임을 입증한다. NN-DNJ는 약 20 μM 위의 농도에서 세포에 독성을 보여주기 시작한다.

도 7은 N7-O-DNJ; N9-DNJ 및 NAP-DNJ에 의한 뎅기 바이러스 방출의 억제에 대한 데이터를 도시한다.

방법. 대조군 베로 세포 배양물 및 100 μM의 화합물로 처리된 베로 세포 배양물을 바이러스에 감염시켰고 7일 동안 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 배양했다. 화합물로 처리된 바이러스에 감염된 세포 배양물로부터의 감염성 바이러스 입자의 생산 억제를 플라크 분석으로 측정하였다.

바이러스 플라크 분석을 2%의 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1x 변형 이글 배지(깁코) 내에 웰 당 5x10⁵ 세포 수로 6-웰 플레이트에서 평판배양된 베로 세포에서 수행하였다. 화합물로 처리된 감염된 세포 배양물로부터 수집된 상등액으로부터 역가되기 위한 바이러스를 세포 배양 배지에서 희석하였고 100 μl 부피로 세포에 접종하였고 한 시간 동안 37℃에서 흡착하게 했다. 세포를 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1x 변형 이글 배지(깁코) 내 0.6% 아가로스에 덮어씌웠다. 세포를 감염시키고 죽인 감염성 바이러스 입자 각각을 나타내는 죽은 세포의 플라크를 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 성장시켰고 세포 단층을 뉴트럴 레드로 생-염색시켜 가시화하였다. 실험은 감염성 뎅기 바이러스의 방출이 UV 이미노슈가 화합물의 처리 후에 상당히 감소됨을 입증한다.

도 9는 하기 UV 이미노슈가 화합물에 의한 뎅기 바이러스 방출의 억제에 대한 데이터를 도시한다: NB-DNJ (UV-1); NN-DNJ (UV-2); N7-O-DNJ (UV-3); N9-DNJ (UV-4); NAP-DNJ (UV-5). 대조군 베로 세포 배양물 및 도시한 농도의 UV 화합물로 처리된 베로 세포 배양물을 바이러스에 감염시켰고 7일 동안 37℃에서 5% CO₂ 배양기 내에서 배양했다. 화합물로 처리된 바이러스에 감염된 세포 배양물로부터의 감염성 바이러스 입자의 생산 억제를 플라크 분석으로 측정하였다. 바이러스 플라크 분석을 2%의 우태아혈청, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1x 변형 이글 배지(깁코) 내에 웰 당 5x10⁵ 세포로 6-웰 플레이트에서 평판배양된 베로 세포에서 수행하였다. 화합물로 처리된 감염된 세포 배양물로부터 수집된 상등액으로부터 역가측정되어야 하는 바이러스를 세포 배양 배지에서 희석하였고 100 μl 부피로 세포에 접종하였고 한 시간 동안 37℃에서 흡착하게 했다. 세포를 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 1x 변형 이글 배지(깁코) 내 0.6% 아가로스에 덮어씌웠다. 세포를 감염시키고 죽인 감염성 바이러스 입자 각각을 나타내는 죽은 세포의 플라크를 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 성장시켰고 세포 단층을 뉴트럴 레드로 생-염색시켜 가시화하였다. 실험은 감염성 뎅기 바이러스의 방출이 UV 이미노슈가 화합물의 처리 후에 상당히 감소됨을 입증한다.

도 10 및 11 A-C는 UV-4(N9-DNJ)에 의한 뎅기 바이러스에 대한 마우스의 보호를 도시한다. 이 모델에서, 알파/베타 인터페론 및 IFN-감마 모두에 대한 수용체가 결여된 129/Sv 마우스인 AG129 마우스를 정맥 내 주사를 통해 뎅기 2 균주 S221에 감염시킨다. 마우스는 감염 후 4-5일에 TNF-매개 급성/조기 사망으로 죽으며, 문헌(Shresta, S., et al., J Virol, 2006. 80(20): p. 10208-17)을 보라. 각 실험군은 성별이 통일되고 5-6주 된 5마리의 마우스를 함유했다. 첫 번째 N9-DNJ 투여량이 경구로 투여된지 30분 후에 마우스에 꼬리 정맥을 통해 DENV2 균주 S221의 10¹¹ 게놈 등가물을 정맥내 주사하였다. N9-DNJ를 200, 100, 50 및 10 mg/kg으로 하루에 2번 경구로 투여하였다. 항바이러스성 화합물 리바비린 100 mg/kg을 하루에 한번 피하로 주었고 PBS-유일 군과 함께 양성 대조군으로 포함되었다. 실험 동안에 심각한 질환을 나타내는(20% 체중 감소, 극심한 무기력, 구겨진 가죽, 또는 마비로 측정되는) 동물은 안락사하였다. 마우스는 통계상으로 모든 약물 농도에서 생존에 상당한 호전을 보였다: 100 mg/kg (p=0.002 vs. PBS) 및 10 mg/kg (p=0.034 vs. PBS).

* * *

비록 앞서 말한 것은 특정 바람직한 실시양태를 나타낸 것이지만, 본 발명이 이렇게 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 당업자가 개시된 실시양태에 대한 다양한 변형을 행할 수 있고 그러한 변형이 본 발명의 범위 내로 의도되는 것이 있을 수 있다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개, 특허 출원 및 특허는 참고문헌으로 전체로서 삽입된다.

도 1(A)-(E)는 하기 이미노슈가의 화학식을 도시한다: A) N-부틸 데옥시노지리마이신(NB-DNJ 또는 UV-1); B) N-노닐 데옥시노지리마이신(NN-DNJ 또는 UV-2); C) N-(7-옥사데실)데옥시노지리마이신(N7-O-DNJ 또는 N7-DNJ 또는 UV-3); D) N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신(N9-DNJ 또는 UV-4); E) N-(N-{4'-아지도-2'-니트로페닐}-6-아미노헥실)데옥시노지리마이신(NAP-DNJ 또는 UV-5).
도 2는 NB-DNJ, NN-DNJ 및 N7-O-DNJ에 의한 세포 보호 대 뎅기 바이러스를 나타내는 플롯이다.
도 3은 NB-DNJ, NN-DNJ 및 N7-O-DNJ의 세포 독성의 플롯이다.
도 4는 NN-DNJ의 합성 반응식이다.
도 5A-D는 N7-O-DNJ의 합성을 도시한다. 특히, 도 5A는 N7-O-DNJ을 야기하는 반응 순서를 도시하고; 도 5B는 6-프로필옥시-1-헥사놀의 제조를 도시하고; 도 5C는 6-프로필옥시-1-헥사날의 제조를 도시하고; 도 5D는 N7-O-DNJ의 합성을 도시한다.
도 6A-C는 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신의 합성에 관한 것이다. 특히, 도 6A는 9-메톡시-1-노나놀의 제조를 도시하고; 도 6B는 9-메톡시-1-노나날의 제조를 도시하고; 도 6C는 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신의 합성을 도시한다.
도 7은 N7-O-DNJ, N9-DNJ 및 NAP-DNJ에 의한 뎅기 바이러스 방출의 억제 데이터를 도시한다.
도 8은 NB-DNJ(UV-1), NN-DNJ(UV-2), N7-O-DNJ(UV-3), N9-DNJ(UV-4) 및 NAP-DNJ(UV-5)에 대한 뎅기 바이러스에 대한 IC50 값을 나타내는 표이다.
도 9는 하기 UV 이미노슈가 화합물에 의한 뎅기 바이러스 방출의 억제 데이터를 도시한다: NB-DNJ(UV-1); NN-DNJ(UV-2); N7-O-DNJ(UV-3); N9-DNJ(UV-4); NAP-DNJ(UV-5).
도 10은 UV-4(N9-DNJ)에 의한 뎅기 바이러스에 대한 마우스의 보호를 도시한다.
도 11A-C는 UV-4(N9-DNJ)에 의한 뎅기 바이러스에 대한 마우스의 보호에 관한 것이다.

Claims (4)

1. 유효량의 N-(9-메톡시노닐)데옥시노지리마이신 또는 그의 제약상 허용가능한 염을 포함하는, 대상체에서 뎅기(Dengue) 바이러스성 감염의 치료를 위한 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스성 감염이 뎅기 2 바이러스에 의해 유발되는 것인 제약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 포유류인 제약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 제약 조성물.

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