KR20010033028A

KR20010033028A - 막-관련 바이러스 복제의 억제

Info

Publication number: KR20010033028A
Application number: KR1020007006382A
Authority: KR
Inventors: 블럼버그바루크에스; 블록티모시엠; 드윅레이몬드에이; 메타어난드; 플라트프랜시스; 버터즈테리디; 지쯔만니콜
Original assignee: 더 챈슬러 마스터즈 앤드 스칼라스 오브 더 유니버시티 오브 옥스포드; 토마스 제퍼슨 유니버시티; 블럼버그 바루크 에스.
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-10
Publication date: 2001-04-25
Also published as: WO1999029321A9; JP2001525367A; BR9813508A; EP1037636A4; EP1037636A1; AU761748B2; AU1721599A; WO1999029321A1; CA2312423A1; US6465487B1; CN1290168A

Abstract

본 발명은 숙주 세포 막-발생 바이러스의 형태 발생 및 이에 의한 감염을, 숙주 세포 글루코시다아제 또는 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 억제하는 화합물을 사용하여 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 억제하는 화합물을 사용하여 지질 저장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

막-관련 바이러스 복제의 억제{INHIBITION OF MEMBRANE-ASSOCIATED VIRAL REPLICATION}

전세계적으로 4천만명 이상이 C형 간염 바이러스(HCV)에 만성 감염되어 있으며, 선진국의 공중 위생에 가장 심각한 위협을 가하는 것 중 하나가 이 바이러스이다[Hoofnagle et al. (1997) New Engl J Med 336:347-356]. 미국에서는 C형 간염에 감염되어 매년 10,000 명 이상이 사망하며(Hepatitis C Treatment, Washington Post, November 11, 1997, at A2), 효과적인 조치가 없는 한, 사망자 수는 향후 20년 내에 세 배에 이를 것으로 예상된다. 만성 HCV는 또한 간암 발병을 증가시킨다. 전세계적으로 4천만명 이상이 선진국의 공중 위생에 가장 심각한 위협 중 하나인 HCV에 만성 감염되어 있다[Hoofnagle et al.(1997) New Engl J Med 336:347-356]. HCV 환자 중 85%는 감염이 계속 진전되고, 이들 중 20% 이상은 감염 발병 20년 내에 만성 감염이 경화증이 된다. 북아메리카인 중 대략 3.9 백만명이 만성 감염되어 있으며, 현재 미합중국에서 행해지는 간 이식은 주로 C형 간염의 감염에 따른 합병증 때문이다.

HCV는 플라비비리다에(Flaviviridae) 과에 속하는 RNA 바이러스이다. 각 분리체는 밀접하게 관련되어 있으나 상이한 바이러스 게놈 개체군으로 구성되어 있다. 이러한 유전적 다양성 때문에, 바이러스는 숙주의 면역 체계를 피하여 높은 비율로 만성 감염시킬 수 있다.

HCV 감염증의 치료는 수나 효과 면에서 효과적인 치료법이 제한되어 있다. HCV 감염증의 일반적인 치료법에는 인터페론-알파 투여가 포함된다. 그러나, 일터페론-알파는 HCV-감염 환자의 약 20%에만 사용이 제한되고[Hoofnagle et al.(1997) New Engl J Med 336:347-356], 이 화합물로 치료하더라도 장기간 효과가 있는 것은 환자의 5% 뿐이다. 또한, 인터페론-알파의 합병증 및 한계로 인하여 치료시 사용이 크게 제한된다. 인터페론-알파 및 리바비린 (1-α-D-리보푸라노실-1 H-1,2,4-트리아졸-3-카르복사미드)의 투여를 포함하는 실험적 치료에 따르면, HCV 감염증 재발 환자의 반에만 장기간 효과를 보였다(Hepatitis C Treatment Washingtion Post, November 11, 1997, at A2). 인터페론 효과가 실망스러우므로, 효과가 우수하고 독성이 낮은 치료법의 연구에 박차를 가해야 함이 명백하다. 따라서, HCV 감염증 치료에 효과적인 치료법이 크게 요구된다.

HCV 만성 감염 환자 뿐 아니라, HBV 만성 감염된 환자도 3억 5천만명 이상이다. 이들 중 1억 5천만명 이상이 치료법 없이 간질환으로 사망하는 것으로 보인다. 대부분의 HCV 보균자 경우처럼, 선진국에는 2천만명 정도의 HBV 보균자가 있다.

다수의 HCV 감염자는 HBV에도 감염된다. HBV/HCV 복합 감염증 치료는 특히 연구 가치가 있는데, HBV 및 HCV 바이러스의 치료법이 서로 크게 다르기 때문이다. HBV는 헤파드나바이러스(hepadnavirus)지만, HCV는 페스티바이러스(pestivirus)이다. HBV는 DNA-함유 바이러스로, 이의 게놈은 DNA-의존성 RNA 폴리머라아제 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라아제(즉, 역전사효소) 복합체를 사용하여 감염 세포의 핵에서 복제된다. HCV는 RNA-함유 바이러스로, 이의 게놈은 하나 이상의 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 타입을 사용하여 감염 세포의 세포질에서 복제된다. HBV 감염증 및 HCV 감염증이 동시에 자주 발생함에도 불구하고, HBV 감염증 치료에 효과적인 것으로 공지된 다수의 화합물은 HCV에는 효과적이지 못하다. 예를 들어, 라미부딘(lamivudine, 뉴클레오시드 유사체 3TC)은 HBV 감염증 치료에 유용하나, HCV 감염 치료에는 유용하지 못하다. 항바이러스제에 대한 HBV 및 HCV의 감수성 차는 의심할 바 없이 이들의 유전에 근거한 복제 차이와 관련이 있다. HBV 및 HCV 감염증을 모두 효과적으로 치료하는 치료법이 특히 매우 필요하다. 감염된 동물 세포의 세포 내막(intracellular membrane)과 관련된 막으로부터 외피(envelope)를 얻는 동물 바이러스는 가축 산업에 큰 손실을 야기한다(Sullivan et al. (1995) Virus Res 38: 231-239). 소의 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus: BVDV), 전형적인 돼지 열병 바이러스(swine fever virus), 보더 질환 바이러스(border disease virus) 및 돼지 콜레라 바이러스(hog cholera virus)와 같은 페스티바이러스 및 플라비바이러스가 이러한 동물 바이러스에 포함된다.

HCV가 속하는 플라비바이러스(flavivirus) 그룹은, 절지동물 벡터에 의하여 전파되는 다수의 인간 질환의 원인이 되는 물질을 포함하는 것으로 알려져 있다. 플라비바이러스에 의한 인간 질환에는 다양한 출혈성 열병, 간염 및 뇌염이 포함된다. 인간에게 이러한 질환을 일으키는 것으로 알려진 바이러스로는, 예를 들어 황열병 바이러스(yellow fever virus), 뎅그열 바이러스 1-4(dengue viruses 1-4), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 머리 벨리 뇌염 바이러스(Murray Valley encephalitis virus), 로시오 바이러스(Rocio virus), 웨스트 나일 열병 바이러스(West Nile fever virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 틱-본 뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus), 루핑 일 바이러스(Louping ill virus), 파와산 바이러스(Powassan virus), 옴스크 출혈열 바이러스(Omsk hemorrhagic fever virus) 및 키아사누르 포리스트 질병 바이러스(Kyasanur forest disease virus)가 포함된다. 따라서, 인간 뿐 아니라 플라비바이러스 또는 페스티바이러스로 감염된 동물도 치료해야 할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명은, 감염 세포의 세포 내막(intracellular membrane)과 관련된 막으로부터 외피(envelope)를 얻는 바이러스의 형태발생(morphogenesis) 억제 방법을 제공하며, 이 방법은 세포에 소포체(endoplasmic reticulum)와 관련된 글루코시다아제 효소의 활성을 억제하기에 유효한 양만큼 글루코시다아제 억제제를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 일실시형태에서, 이 바이러스는, C형 간염 바이러스, 소의 바이러스성 설사 바이러스, 전형적인 돼지 열병 바이러스, 보더 질환 바이러스 또는 돼지 콜레라 바이러스와 같은 플라비바이러스 및 페스티바이러스로 구성되는 그룹에서 선택된다. 다른 실시형태에서, 막은 소포체의 루멘을 둘러싸는 막 및 골지체(Golgi apparatus)의 루멘을 둘러싸는 막으로 구성되는 그룹에서 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 글루코시다아제 억제제는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 또는 N-알킬, N-아실, N-아로일, N-아르알킬, 및 O-아실 유도체로 구성되는 그룹에서 선택되는 이의 유도체이다.

본 발명은, 소포체(ER)와 관련된 내부 세포막으로부터 외피를 얻는 바이러스의 형태발생 억제 방법을 포함한다. 이 방법은 세포의 소포체(endoplasmic reticulum)와 관련된 글루코시다아제 효소의 활성을 억제하기에 유효한 양만큼 글루코시다아제 억제제를 세포에 투여함으로써, 바이러스의 형태발생을 억제하는 것을 포함하여 이루어진다. 인간의 간 세포 및 소의 단핵구(monocyte)를 포함하는(이에 제한되지는 않는다.) 바이러스 감염된 포유류 세포가 특히 치료 대상이다.

본 발명은 또한, 바이러스-감염 세포의 ER과 관련된 막으로부터 외피를 얻는 것을 특징으로 하는 바이러스에 감염된 동물의 치료 방법을 포함한다. 이 방법은, 동물의 바이러스-감염된 세포의 소포체를 갖는 글루코시다아제 효소의 활성을 억제하기에 유효한 양만큼 글루코시다아제 억제제를 동물에 투여함으로써, 동물의 바이러스 감염증을 줄이거나, 없애는 것을 포함하여 이루어진다. 동물은 바람직하기는 돼지, 소 및 특히 인간과 같은 포유류이다.

본 발명의 방법은, 바이러스의 형태발생 억제 또는 ER과 관련된 막으로부터 외피를 얻는 어떤 바이러스로 감염된 동물의 치료에 유용하다. 플라비바이러스 및 페스티바이러스는 ER과 관련된 막으로부터 외피를 얻으므로, 본 발명의 방법은 플라비바이러스 및 페스티바이러스에 의한 감염증의 형태발생 억제 및 치료에 특히 유용할 것으로 생각된다. 플라비바이러스에 의한 감염증에는 황열병 바이러스, 뎅그열 바이러스 1-4, 일본 뇌염 바이러스, 머리 벨리 뇌염 바이러스, 로시오 바이러스, 웨스트 나일 열병 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 틱-본 뇌염 바이러스, 루핑 일 바이러스, 파와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스 및 키아사누르 포리스트 질병 바이러스에 의한 감염증이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 페스티바이러스에 의한 감염증에는, HCV, 풍진 바이러스, BVDV, 전형적인 돼지 열병 바이러스, 보더 질환 바이러스, 및 돼지 콜레라 바이러스에 의한 감염증이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 1,5-디데옥시-1,5이미노-D-글루시톨의 N-알킬 유도체로 간 세포를 약물 표적화(targeting)하여, 글루코시다아제 억제제 또는 글루코실트랜스퍼라아제 억제제를 동물의 간 세포에 약물 표적화하기 위한 방법이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 유도체는 N-노닐-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨이다.

본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 글루코실- 또는 갈락토실-연결된 지질이 환자의 세포에 축적되는 지질 저장 질환의 치료 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 한 실시형태에 있어서, 이 방법은, 동물의 감염 세포에 N-노닐-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체를 글루코실트랜스퍼라아제-억제 유효량만큼 투여하여 상기 세포 내 당지질 생성을 억제함으로써 동물의 리소좀 저장 질환을 치료하는 단계를 포함하여 이루어진다. 본 발명의 이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 동물은 다크 사크(Tay-Sachs), 가우처(Gaucher's), 크라베(Krabbe's) 또는 파브리(Fabry's) 질환이다.

본 발명의 또다른 실시형태에 따르면, 동물 세포의 내막으로부터 바이러스 성분을 얻는 바이러스에 의하여 감염된 포유류를, 상기 바이러스에 의한 감염 속발증(sequelae) 중 하나인 암 발생으로부터 보호하기 위한 예방법이 제공되며, 동물의 바이러스 감염 세포에 유효량의 항바이러스성 동물 세포 글루코시다아제-억제제를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 본 발명의 이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 항바이러스성 글루코시다아제 억제제는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 및 이의 유도체로 구성되는 그룹에서 선택된다.

도면의 간단한 설명

도 1은, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)로 감염된 매딘 다비 소 신장[Madin Darby Bovine Kidney(MDBK)] 세포에서 DNJ 유도체 N-부틸-DNJ(도 1a) 및 N-노닐-DNJ "578" (도 1b)의 항바이러스 효과를 나타내고,

도 2는 DNJ 유도체로 처리한 감염 MDBK 세포 배양액 내에 감염성 BVDV 분비를 나타낸다. Y축은 처리된 계에서 관찰되는 플라크의 수를, 억제제가 없는 수퍼네이트(supernate) 감염에 따른 플라크의 %로서 나타낸다. X축은 플라크 어세이에 사용되는 억제제의 농도이다. IC50은 그래프 아래에 기재한다. 도 2a: N-부틸-DNJ에 의한 억제; 및 도 2b: N-노닐-DNJ 에 의한 억제.

도 3은 BVDV 플라크 형성에 대한 N-부틸-DGJ(N-부틸-데옥시갈락토노지리마이신)의 효과를, 세라마이드-특이적 글루코실트란스퍼라아제 활성이 완전히 억제되는 680 마이크로그람의 농도까지 나타낸 것이다. Y축은 처리된 계에서 관찰되는 플라크의 수를, 억제제가 없는 수퍼네이트 감염에 따른 플라크의 %로서 나타낸다. X축은 플라크 어세이에 사용되는 억제제 농도를 나타낸다.

도 4는 감염 세포 배양액에서 BVDV 플라크 형성에 대한 데옥시만노지리마이신(DMJ)의 농도를, 처리 세포를 ECA, 당-결합 렉틴 복합체(a complex sugar-binding lectin)의 치사 효과로부터 보호하는 농도까지 증가시킨 경우 효과를 나타낸다. Y축은 처리된 계의 플라크의 수를, 억제제가 없는 플라크 어세이 수퍼네이트(Y=100%) 감염에 따른 플라크의 %로서 나타낸다. X축은 어세이에 사용되는 억제제 농도를 나타낸다.

도 5는 비-감염(도 5a); 비-처리(도 5b) BVDV - 감염 세포; 및 N-부틸-DNJ 처리(도 5C) BVDV-감염 세포의 세포 배양액 수퍼네이트 안과 세포 내의 바이러스성 물질의 비교 감염도를 나타낸다.

도 6은 N-부틸 DNJ(도 6a) 및 N-노닐-DNJ(도 6b) 처리를 멈춤에 따른 감염 세포 내 BVDV 재생성을 나타낸다: ◆= 약물 사용; ◇=약물 무처리

도 7은 다른 세포 타입에 의한 방사성 표지된 억제제의 흡수(uptake)를 비교한 것이다. ◆HepG2의 NN-DNJ; ■MDBK의 NN-DNJ; ▲MDBK의 NB-DNJ; ●HepG2의 NB-DNJ

도 8은 Balb C 마우스의 장기에서 투여 30, 60 및 90분 후의 방사선 표지된 이미노 당 N-노닐-DNJ 및 N-부틸-DNJ 분포를 나타낸다. Y축 값은 X 축과 같은 각 장기와 관련있는 방사성이다. 이 결과는 장기 무게에 따라 표준화된다.

도 9는 대표적인 플라비비리다(Flaviviridae) 바이러스의 폴리프로틴 서열의 구성을 나타낸다.: (a) 페스티바이러스 BVDV와 관련된 서열; 및 (b) C형 간염 바이러스와 관련된 서열.

바람직한 실시형태의 상세한 설명

바이러스의 외피 당단백을 합성하고 적당히 접히도록(fold) 하기 위하여, 숙주 세포 글리코시다아제를 필요로 하는 바이러스로 감염된 경우, 숙주 세포에 이러한 효소의 억제제를 투여함으로써 치료할 수 있다. 표적 바이러스는, 소포체와 관련된 내부 세포막과 연계하여 이의 외피 성분을 얻는 모든 바이러스이다. 바람직한 바이러스는 플라비바이러스 또는 페스티바이러스 강에 속하는 바이러스이다.

세포의 "ER과 관련된 막"은 세포의 ER의 루멘을 둘러싸는 막, 골지체(GA)의 루멘을 둘러싸는 막, ER로부터 GA로 지나가는 소낭(vesicle)의 루멘을 둘러싸는 막, GA로부터 ER로 지나가는 소낭의 루멘을 둘러싸는 막, GA 또는 ER로부터 세포의 원형질막으로 지나가는 소낭의 루멘을 둘러싸는 막, GA 또는 ER로부터 세포의 핵막으로 지나가는 소낭의 루멘을 둘러싸는 막, 또는 GA 또는 ER로부터 세포의 미토콘드리아막으로 지나가는 소낭의 루멘을 둘러싸는 막을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법을 적용하여, 숙주 세포의 내막 중 어떤 것으로부터 유도를 통하여 어떤 형태발생 성분을 얻는 바이러스의 생성을 억제하는 것을 고려할 수 있다.

세포의 "ER과 관련된 글루코시다아제 효소"는, 세포의 ER 내에 끼워넣어지거나(embed), 이의 내강쪽(luminal side)에 묶이거나(bound), 이와 관련된 막 내에 함유되는 글루코시다아제 효소를 의미한다. 예를 들어, 포유류의 α-글루코시다아제 I 및 포유류의 α-글루코시다아제 II가 포유류 세포의 ER과 관련된 글루코시다아제 효소이다.

본 발명의 방법에 따라 치료되는 바이러스-감염된 동물 세포는, 세포의 내막과 관련된 글루코시다아제 효소, 바람직하기는 소포체(ER)와 관련된 효소를 포함하여 이루어지는 모든 세포가 가능하다. 인간의 간 세포 및 소의 단핵구를 포함(이에 제한되지 않음)하는 포유류 세포의 치료가 특히 바람직하다.

글루코시다아제에 억제 효과를 나타내는 물질은, 이들이 글루코오스의 구조 유사체이기 때문에 이러한 효과를 갖는 것으로 생각된다. 이러한 물질 중 하나는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨(데옥시노지리마이신으로 명명하기도 함)로 명명되며, 하기에서 "DNJ"로 칭하는 이미노 당이다. 다수의 DMJ 유도체가 기재되어 있다. DNJ 및 이의 알킬 유도체는 N-연결된 올리고사카라이드 처리 효소, α-글루코시다아제 I 및 α-글루코시다아제 II[Saunier et al.(1982) J Biol Chem 257:14155-14161; Elbein(1987) Ann Rev Biochem 56:497-534]의 효과적인 억제제이다. 이러한 글루코시다아제는 포유류 세포의 소포체과 관련있다. DNJ의 N-부틸 및 N-노닐 유도체는 또한 골지와 관련된 글루코실트랜스퍼라아제도 억제할 수 있다.

DNJ 유도체를 사용하여 호흡기 신시튬 바이러스(respiratory syncytial virus: RSV)로 감염된 포유류를 치료하는 방법은 기재되어 있다(Bryant et al. 의 미합중국 특허 제5,622,972호). DNJ는 글루코오스 유사체이므로 글루코시다아제에 대하여 억제 작용을 보이는 것으로 생각된다. 그러나, Bryant는, DNJ 유도체가 관찰되는 항-RSV 활성을 보이는 메카니즘을 개시하지 않는다. RSV, 파라믹소바이러스는 RSV-감염 세포의 원형질막으로부터 이의 외피를 얻는다.

인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 고양이과 백혈병 바이러스, 말의 감염성 빈혈증 바이러스 및 양과 염소의 렌티바이러스와 같은 비-결손 레트로바이러스(non-defective retroviruses)의 복제를 방해하는 DNJ 및 N-메틸-DNJ의 용도가 또한 개시되어 있다(U.S. Patents Nos. 5,643,888 및 5,264,356; Acosta et al.(1994) Am J Hosp Pharm 51:2251-2267).

조직 배양액 중의 인간 간아세포종(hepatoblastoma) 세포로부터의 인간 B형 간염 바이러스(HBV) 분비가, 숙주 생존성을 해치지 않는 조건 하에 소포체(ER) 중에서 α-글루코시다아제 활성 억제제에 민감하다는 것을 이미 밝힌 바 있다(Block et al. 1994). B형 간염 바이러스(HBV) 감염된 간 세포는, DNA를 함유하지 않는 과량의 비-감염성 "하부-바이러스" 아티클 뿐 아니라 감염성, 뉴클레오캡시드-함유 비리온을 분비한다. 이러한 입자는 모두 ER 콤파트먼트 또는 중간 콤파트먼트와 같은 ER-후 콤파트먼트로부터 출아되는(bud) 것으로 생각된다[Huovila et al.(1992) J Cell Biol 118:1305-1320; Patzer et al. (1986) J Virol 58:884-892]. HepG2 세포에서 유도되며, 일반적으로 2.15 세포의 소포체(ER)와 관련된 하나 이상의 글루코시다아제 효소 또는 글루코실트랜스퍼라아제 효소의 활성 억제에 의하여, 성숙한 HBV가 빠져나가는 것이 억제된다[Lu et al. (1995) Virology 213:660-665; Lu et al.(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:2380-2385].

연구에 따르면, DNJ 유도체의 항-HIV 성질은, 세포로부터 HIV의 직접적 출아 억제보다는, 부적절한 HIV 외피 단백질의 당가공(glycoprocessing)에 따른 결과이다[Dedera et al. (1990) AIDS Res Hum Retrovir 6:785-794; Fischer et al. (1995) J Virol 69:5791-5797; Taylor et al. (1994) Antimicrob Agents Chemother 38:1780-1787].

DNJ의 한 유도체, 즉 N-부틸-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨(NBDNJ)은, 안정한 세포 감염된(transfected) HepG2 세포로부터 성숙한 HBV 비리온이 빠져나가는 것을 방지하지만, 하부 바이러스 입자가 빠져나가는 것은 방지하지 않는다[Block et al.(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2235-2239]. 따라서, NBDNJ가 존재하더라도, 세포질막을 통하여 출아되는 것으로 생각되는 HIV 비리온의 형태발생은 영향받지 않는 것으로 보인다. 그러나, NBDNJ에 노출된 HIV-감염 세포로부터 빠져나온 바이러스 입자는, NBDNJ에 노출되지 않은 세포로부터 빠져나온 HIV 입자에 비하여 감염성이 크게 떨어진다(Dedera et al., supra; Fisher et al., supra; Taylor et al., supra). 이러한 연구를 통하여, NBDNJ의 항-HIV 성질은, 세포에서 HIV가 출아하는 것을 직접적으로 억제한다기보다는 부적절한 표적 세포의 바이러스 융합에 따른 결과임을 알 수 있다.

더욱 최근에 본 발명자는, HBV 감염된 마못(woodchuck)의 동물 실험을 통하여, 글루코시다아제 억제제의 항-바이러스 효과를 증명하였다. 마못 간염 바이러스(WHV)로 만성 감염된 마못을, ER α-글루코시다아제 억제제로 치료하면, 바이러스 외피 당당백의 적절한 접힘(folding) 및 수송(transport)이 중단되고, 외피으로 싸인 감염성 바이러스의 분비가 방지된다(Block et al., 1998).

HIV 및 RSV와의 경우와는 완전하고도 명백히 다르게, 적당량의 글루코시다아제만 억제하면, HBV 및 BVDV 분비가 다량 억제되었다. 이를 통하여, HIV 및 RSV 등과 달리, 내부막으로부터 출아되는 바이러스에서는 소량의 외피 바이러스 단백질만을 중단해도 바이러스 분비를 충분히 억제할 수 있음이 제시된다. 이것은, 본 발명자의 증거가, 중단된 HBV 및 BVDV 바이러스 단백질은, 바이러스 분비의 "우세한 네거티브(dominant nagative)" 독물로서 작용하여, 약물 자체만큼 항바이러스성 약물로 고려할 수 있다는 것을 제시한다는 사실에 기인한다.

ER α-글루코시다아제는 초기 당단백에 부착되어 있는 N-글리칸 사슬의 말단 글루코오스 잔기를 단계적으로 제거한다. 이를 통하여, 당단백은 배타적으로 모노-글루코실화된 당단백에 결합하는 ER 캐페론 칼넥신 및 칼레티쿨린과 상호작용할 수 있다. 칼넥신과의 상호작용은, 당단백의 전부는 아니라도 일부의 바른 접힘에 중요하며, 글루코시다아제 억제제는 특히 이에 의존하는 단백질의 표적화에 사용될 수 있다. N-연결된 글리칸은 당단백의 운명 및 기능에 큰 역할을 한다. 역할 중 한가지는 렉틴-유사 캐페론 단백질 칼넥신 및 칼레티큘린과 초기 당단백의 상호작용을 매개함으로써 단백질의 접힘을 돕는 것이다. 이러한 상호작용은, N-부틸-DNJ 및 N-노닐-DNJ와 같은 물질로 α-글루코시다아제의 활성을 억제하여, 일부의 단백질이 소포체(ER) 내에서 잘못 접히거나 보유되도록 함으로써 막을 수 있다. 본 발명자들은, B형 간염 바이러스(HBV) 외피 당단백 중 하나가 N-노닐-DNJ-유도된 잘못된 접힘으로 인해 in vitro에서 바이러스의 형성 및 분비가 방지되며, 이러한 억제제는 글리코실화를 변형(alter)하여, 만성 HBV 감염 동물 모델의 바이러스 수준을 낮춘다는 것을 알게 되었다.

α-글루코시다아제 억제에 의하여 유도되는 외피 단백질 변형에 대한 HBV의 뛰어난 감수성과, 관찰된 항-바이러스 효과를 얻기 위하여 효소를 큰 범위까지 억제할 필요가 없다는 사실을 통하여, 본 발명자들은, 바이러스의 감수성은 접히는 과정이 ER에서 바이러스가 외피를 올리고머화하고 조립해야 한다는 사실에 기인 가능하다는 것을 알게 되었다. HIV 및 RSV 경우와 달리, 약간 잘못 접힌 외피 단백질은 적절한 봉함 공정을 충분히 막을 수 있으며, 억제제가 숙주 세포 단백질에 미치는 효과에 비하여 바이러스 어셈블리에 미치는 반대 효과를 증대시키는데, 항-바이러스 억제제 농도에서 숙주 세포 단백질이 손상되지는 않는 것으로 보인다. 본 발명자들은, 메카니즘 연구를 통하여, ER과 같은 세포 내막으로부터 외피를 얻는 다른 바이러스는, 이들의 하나 이상의 당단백이 칼넥신-매개 접힘에 의존한다면, ER α-글로코시다아제 억제에 대하여 감수성이 동등하다는 것을 제안한다.

HBV 및 HCV은 라이프 사이클이 완전히 다르지만, 세가지 공통점이 있다.: 간을 표적으로 하고, ER 및 다른 내막으로부터 출아되며, 이의 외피 당단백(들)이 칼넥신-의존성 경로를 통하여 접힌다. 따라서, HBV에 대하여 항-바이러스 효과를 갖는 것으로 나타난 동일한 억제제가, 제시된 동일한 메카니즘을 통하여 HCV를 억제할 수 있는지를 본 발명자들이 조사하게 되었다.

5 또는 6 및 11의 N-연결된 글리코실화 부위를 각각 함유하는 두가지 HCV 외피 당단백질 E1 및 E2는 모두, 생성 접힘 과정(productive folding, Choukhi et al., 1998)동안 칼넥신과 상호작용한다. 충분한 세포 배양액 복제 시스템이 부족하여, HCV 입자 어셈블리의 이해는 매우 제한된다. 그러나, 복합 글리칸의 부재, ER에서의 발현된 HCV 당단백질의 편재, 및 세포 표면상에 이러한 단백질의 부재를 통하여, 초기의 비리온 형태발생이 ER로부터 세포내 소낭으로 출아(budding)됨으로써 일어난다는 것이 제시된다. 또한, 성숙한 E1-E2 헤테로다이머는 ER을 떠나지 않으며, E1 및 E2의 C-말단에서 모두 ER 함유 신호가 확인되었다.

이는, 본 발명자들이 다른 ER-출아 바이러스, 소의 바이러스 설사 바이러스(BVDV), 인간 C형 간염 바이러스(HCV)의 조직 배양 대용물에 미치는 글루코시다아제 억제제의 효과를 조사하도록 하였다. 인간 HCV 복제를 도울 수 있는 적당한 세포 배양 시스템이 없고, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)는, 이들이 모두 고도의 국부 단백질 영역 상동관계(Miller et al., 1990), 공통 복제 방법과, 아마도 동일한 바이러스 봉함의 하부-세포 위치를 공유하므로, HCV의 FDA 승인 모델 유기체 역할을 한다(도 1). BVDV 에 대한 항바이러스 효과를 갖는 것으로 밝혀진 화합물은 HCV 치료제로서의 가능성이 높다.

HCV와 같이, BVDV는 작고 봉함되어 있는 양성-스트랜드 RNA 바이러스이며, 플라비비리다에(Flaviviridae)의 모든 바이러스처럼 폴리단백질(polyprotein)의 N-말단 부위에 구조 단백질과 C-말단에 비-구조 또는 복제 단백질을 갖는다. BVDV 폴리단백질은, 두개의 헤테로다이머-형성 외피 단백질 gp25(E1) 및 gp53(E2)의 암호화 영역에 6개의 잠재적인 N-글리코실화 부위와, 기능이 알려지지 않은 친수성 분비 단백질, gp48(EO)의 암호화 영역에 8개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 갖는다. 어떤 이러한 당단백질에 부착되어 있는 올리고사카라이드의 구조는 결정되어야 한다. BVDV는 ER α-글루코시다아제 억제제에 대하여 감수성이 더 클 수도 있는 것으로 판명되었다. 이러한 사실과, 사용되는 억제제가 in vitro에서 간-타입의 세포에 의하여 우선적으로 취해지며, in vivo에서 간에 장기간 보유된다는 사실로부터, 글루코시다아제 억제제가, 근거가 광범위한 항바이러스성 간염 약물로 사용될 수 있다는 놀라운 가능성을 기대할 수 있다.

본 명세서에서는 글루코시다아제 억제에 대한 BVDV의 감수성을 기재하고, ER-출아 바이러스가 글리칸 처리에 선택적으로 의존하는 가능한 이유를 논의한다. 본 발명자들은, 조직 배양액의 포유류 세포를 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)에 노출함에 따른 세포독성(cytotoxicity)이, 글루코시다아제 억제제를 조직 배양 배지에 첨가함으로써 방지될 수 있다는 것을 발견하였다. 하기 실시예에 사용된 글루코시다아제 억제제는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨(DNJ) 유도체, 특히 N-부틸-DNJ(NBDNJ)가 포함된다. 또한, NBDNJ를 사용할 때, 숙주 세포에 대한 독성이 있다 하더라도 거의 관찰되지 않는 조건 하에서 BVDV-유도된 세포독성을 억제할 수 있었다. BVDV는 C형 간염 바이러스(HCV)의 허용된 조직 배양액 모델이므로[Henzler, H.-J. 및 K. Kaiser(1998) Nature Biotech 16:1077-1078], BVDV의 형태발생을 억제하는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 HCV의 형태발생 억제에도 유용하다.

본 발명의 방법을 실시하기에 효과적인 조성물은 동물 글루코시다아제 억제제, 바람직하기는 포유류 글루코시다아제 억제제를 포함하여 이루어진다. 본 발명의 방법에 특히 고려되는 글루코시다아제 억제제로는, 하기 화학식을 갖는 DNJ, 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 및 이의 유도체

(단, 상기 식에서 R¹은

(a) H;

(b) 알킬;

(c) 알케닐;

(d) 알콕시;

(e) 아실;

(f) 아릴;

(g) 아르알킬;

(h) 아로일; 및

(i) 아르알콕시; 및

(j) 헤테로고리 기로 구성되는 그룹에서 선택되고;

R³, R⁴, R⁵및 R⁶은 동일하거나 상이하며,

(k) 아실; 및

(l) 아로일로 구성되는 그룹에서 선택되며,

상기 알킬 및 알케닐기는 탄소수 1 내지 14이며, 치환 또는 비치환 직쇄 또는 분지쇄이고, 상기 알케닐기는 이중 결합 1 내지 6개를 가지고; 상기 아릴, 아르알킬 및 아로일기는 탄소수 7 내지 14이며, 헤테로고리기는 선택적으로 할로겐, 히드록시, C_1-10알킬; C_1-10알킬렌; C_1-10아실 또는 C_1-10알콕시로 치환된다.);

상기 화합물의 오란 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체, 또는 상기 화합물, 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체의 생리학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물이 포함된다.

DNJ의 N-알킬, N-아실, N-아로일, N-아르알킬 및 O-아실 유도체가 바람직하다. 특히 바람직한 DNJ의 유도체는, N-부틸-DNJ이다. 다른 바람직한 DNJ 유도체는, 본 명세서에서 N-노닐-DNJ 또는 NN-DNJ로 명명한 1,5-디데옥시-1,5-노닐일이미노-D-글루시톨이 있다.

예를 들어 미국 특허 제 5,622,972호에 기재되어 있는 DNJ 유도체에는 하기 화합물이 포함된다.

1,5-디데옥시-1,5-부틸이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-부틸이미노-4R,6-O-페닐메틸렌-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-메틸이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-헥실이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-노닐일이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-(2-에틸부틸이미노)-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-벤질옥시카르보닐이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-페닐아세틸이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-벤조일이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-에틸말로닐이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-히드로신나모일이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-메틸말로닐이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-부틸이미노-4R,6-O-페닐메틸렌-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-(페녹시메틸)카르보닐이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-에틸부틸이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-헥실이미노-4R,6-O-페닐메틸렌-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-(2-메틸펜틸)이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-(3-니코티노일)이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-신나모일이미노-D-글루시톨;

1,5-디데옥시-1,5-(4-클로로페닐)아세틸이미노-D-글루시톨; 및

1,5-디데옥시-1,5-(4-비페닐)아세틸이미노-D-글루시톨.

이 화합물은 이미노-보호된 종 또는 이미노 보호된 종의 디- 및 테트라- 아세테이트류, 프로피오네이트류, 부티레이트류, 이소부티레이트류로서 사용된다.

DNJ 유도체의 합성 방법이 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 5,622,972호, 4,246,345호, 4,266,025호, 4,405,714호 및 4,806,650호와, 1992년 3월 16일에 출원된 미국 특허 출원 07/851,818호에 기재되어 있다.

기본적인 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 상의 치환체는 항바이러스제로서의 화합물의 효능(potency)에 영향을 줄 수 있으며, 또한 상기 분자를 다른 기관보다는 한 기관에 대해 우선적으로 표적화 할 수 있다. 예를 들어, N-부틸-치환된 DNJ는 BVDV 바이러스의 세포내 생성을 억제함에 있어서 N-노닐-치환된-DNJ보다 효능이 낮다(도 1 및 실시예 2). 실시예 1에는 다양한 치환된 화합물의 효능을 비교하기 위한 방법이 제공되어 있다. N-노닐-치환된 DNJ는 간 세포에 의하여 우선적으로 취해진다(도 7 및 실시예 7). 다양하게 치환된 DNJ의 우선적인 약물 표적화(targeting) 성질을 결정하기 위한 방법이 실시예 8 및 도 8에 제공되어 있다.

본 명세서에 기재된 DNJ 유도체는 유리 아민 형태 또는 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있다. 약제학적 염 및 염의 형태를 제조하기 위한 방법은 문헌[Berge, S. et al.(1977) J Pharm Sci 66(1):1-18]에 제공되어 있다. 염 형태는 예를 들어 DNJ 유도체의 HCl 염으로 설명한다. DNJ 유도체는 미국 특허 제5,043,273호 및 5,103,008호에 기재된 6-포스포릴화된 유도체와 같은 프로드러그 형태로 사용할 수도 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함하여 이루어지는 조성물 및 이 조성물을 동물에 수송하기 위하여 유용한 성분을 더욱 포함하여 이루어지는 조성물을 명백히 고려한다. 조성물을 인간에 수송하기에 유용한 많은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 이 조성물을 소(cattle)과 같은 다른 동물에 수송하기에 유용한 성분은 본 분야에서 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 이러한 담체 및 성분을 추가하는 것은 당업자 수준에서 용이하다.

본 발명의 방법은 DNJ 유도체 및 추가의 항바이러스성 화합물을 사용하는 것을 포함하여 이루어진다. 추가의 항바이러스성 화합물은 현재 알려진 모든 항바이러스성 물질 또는 알려지는 모든 항바이러스성 물질이 가능하다. 예를 들어, 추가의 항바이러스성 화합물은 인터페론-알파, 리바비린, 라미푸딘, 브레펠딘 A, 모넨신, 튜비루마브^TM(Tuvirumab^TM)(Protein Design Labs), 펜시클로버^TM(Penciclovir^TM)(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA), 팜시클로버^TM(Famciclovir^TM)(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA), 베타세론^TM(Betaseron^TM)(Chiron Corp.), 세라디그마-HBV^TM(Theradigm-HBV^TM)(Cytel, La Jolla, CA), 아데포버 디피복실(Adefovir Dipivoxil)(GS 840, Gilead Sciences, Foster City, CA), 인트론 A^TM(Intron A^TM)(schering Plough), 로페론^TM(Roferon^TM)(Roche Labs), 베타 인터페론, BMS 200,475(Bristol Myers Squibb), 로부카버^TM(Bristol Myers Squibb), FTC(Triangle, Inc.), DAPD(Triangle, Inc.), 티모신 알파 펩티드, 글리코비르(Glycovir)[Block et al.(1994) Proc Natl Acad Sci 91:2235-2240], 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor)(Martin et al. (1993) Hepatology 18:775-780), "면역-시토킨"(Guidotti et al.(1994) J Virol 68:1265-1270), CDG[Fourel et al. (1994) J Virol 68:1059-1065] 등이 가능하다.

지질 저장 질환의 치료

복합 지질의 글루코실 또는 갈락토실 잔기가 조직에 축적되어 있는 지질 축적증(lipidoses) 또는 지질 저장 질환은, 본 발명의 글루코실트랜스퍼라아제 억제 화합물, 특히 본 발명의 방법에 따른 N-노닐-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨을 사용하여 치료할 수 있다. 지질 축적즈응로는 다음과 같은 것들이 있다.

가우처 질환(Gaucher's Disease)

세망내피 세포(reticuloendothelial cells)에서 비정상적인 글루코세레브로사이드의 축적을 일으키며, 임상적으로 간비종대증, 피부 색소침착, 골격병변 및 검열반에 의하여 나타나는 지질 신진대사의 가족성의 상염색체성 열성 질환이다.

이들 질환의 근원적인 결함은, 일반적으로 글루코세레브로사이드를 글루코오스 및 세라미아드로 가수분해하는 글루코세레브로시다아제의 활성이 부족하다는 것이다. 일반적인 병리학적 발견은 광범위한 세망조직 세포 과형성(hyperplasia)이다. 이 세포는 글루코세레브로사이드 및 원섬유 세포질(fibrillar cytoplasm)로 채워져있고, 모양이 다양하며, 하나 또는 수개의 편심 위치한 작은 핵을 갖는다. 이러한 세망 조직 세포는 간, 비장, 림프절 및 골수에서 발견된다.

크라베 질환(Krabbe's Disease)(갈락토실세라마이드 지질축적증)

갈락토세레브로사이드 β-갈락토시다아제의 결핍에 따른 2차적인 가족성 지질 저장 질환. 진행성 지연, 마비(paralysis), 실명, 난청 및 가구상 마비(pseudobulbar palsy)를 특징으로 하는 치명적인 소아 질환으로 나타난다.

파브리 질환(Fabry's Disease)(갈락토실갈락토실글루코실 세라마이드 지질축적증)

당지질이 많은 조직에 축적되는 가족성 지질 대사 질환. 이 대사성 질환은, 트리헥소실세라마이드의 대사에 필요한 리소좀 효소 α-갈락토시다아제의 결핍에 의하여 발생한다. 질환자는 피부병변 및 각막 혼탁(corneal opacities)이 나타난다.

타이-사크 질환(Tay-Sachs Disease):(GM2 강글리오사이드증)

효소 헥소사미니다아제 A의 결핍에 의해 발생하며, 뇌에서 강글리오사이드(글루코오스 및 갈락토오스로 구성되는 올리고사카라이드를 포함하여 이루어지는 복합 스핑고지질) 축적을 일으키는 가족성 열성 질환.

본 발명의 방법에 따라 동물 또는 동물 세포에 투여되는 항바이러스제의 양은, 세포 내의 ER 또는 다른 내막과 관련된 글루코시다아제 효소의 활성을 억제하기에 유효한 양이다. 본 발명의 방법에 따른 동물 또는 동물 세포에 투여되는 글루코실트랜스퍼라아제 억제제의 양은 세포 내의 ER 또는 다른 내막과 관련된 글루코실트랜스퍼라아제 효소 활성을 억제하기에 충분한 양이다. 본 명세서에서 사용되는 "억제"라는 용어는, 본 발명에 따른 DNJ 유도 화합물의 부재시 나타나는 생물학적 활성의 검출가능한 감소 및/또는 제거를 의미한다. "유효량"이라는 용어는 지시한 효과를 얻기에 필요한 조성물의 양을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"라는 용어는, 대상의 증상을 감소시키거나 없애고, 증상의 악화 또는 진전을 방지하고, 원인이 되는 물질의 억제 또는 제거, 또는 감염이나 질병이 없는 대상의 감염 또는 질병의 방지를 의미한다.

따라서, 예를 들어, 지질축적증 환자의 치료는, 치료 환자의 감염 세포의 지질 축적 감소, 진행성 질환 방지가 될 수 있다. 바이러스성 감염 치료에는 감염 병원체의 파괴, 이의 성장 또는 성숙 억제 또는 방해, 이의 병리학적 효과의 무효화(neutralization) 등이 포함된다. 세포 또는 동물에 투여되는 조성물의 양은, 독성 작용이 이의 투여에 따른 효과보다 크지 않은 양이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 활성 성분의 실제 투여용량 수준은 변화가 가능한데, 특정 환자에게 바람직한 치료 효과가 나타나기에 효과적인 양의 활성 화합물(들)을 투여한다.

투여량 수준은, 선택한 화합물의 활성, 투여 경로, 치료 상태의 경중 및 치료 환자의 상태 및 이전 병력에 따라 선택한다. 그러나, 화합물(들)의 투여량을 바람직한 치료 효과를 얻기 위하여 필요한 것보다 낮은 수준에서 시작하여, 바람직한 효과가 얻어질 때까지 점차 증가시키는 것이 이 기술분야에서 일반적이다. 필요하다면, 일일 유효 투여량을 투여를 위하여 다수의 투여량, 예를 들어 하루에 2 내지 4회 투여량으로 나눌 수 있다. 그러나, 특정 환자의 특정한 투여량 수준은 체중, 건강, 식이, 투여 시간 및 경로, 다른 약물과의 병용, 치료하려는 질환의 경중을 포함하는 다양한 인자에 달려있다. 성인의 일일 투여용량은 일반적으로 체중 킬로그람 당 글루코시다아제 억제제 약 일 마이크로그람 내지 약 일 그람, 바람직하기는 약 10 mg 내지 100mg 의 범위이다. 물론, 세포 또는 동물에 투여되는 조성물의 양은 당업자에게 잘 알려진 글루코시다아제 억제제의 분자량, 투여 경로 등과 같은 다양한 인자에 달려있다.

본 발명의 방법에 사용되는 약제학적 조성물은 경구 고형 제제, 안약, 좌제, 에어로졸, 국소 또는 다른 유사한 제제로 전신 투여할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은, 글루코시다아제- 또는 류코실트란스퍼라아제-억제제에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약물 투여를 용이하게 하고 개선하기 위하여 공지된 다른 성분을 함유할 수 있다. 나노입자(nanoparticles), 리포좀, 재밀봉된 적혈구(resealed erythrocytes), 및 면역학에 기초한 시스템과 같은 다른 가능한 제제를 본 발명의 방법에 따른 글루코시다아제- 또는 글루코실트랜스퍼라아제-억제제를 투여하기 위하여 사용할 수도 있다. 이러한 약제학적 조성물은 모든 공지된 경로로 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 "비경구"라는 용어는 피하, 정맥내, 동맥내, 근육내, 초내와, 주사 및 주입 기술을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 경구, 국부, 비경구, 전신성(systemically) 또는 폐의 경로로 투여할 수 있다.

이러한 조성물은 본 발명의 방법에 따라 일회 투여량이나, 다른 시간에 투여하는 다수 투여량으로 투여할 수 있다. 조성물의 바이러스에 대한 억제 효과가, 조성물의 일반적인 숙주 세포 단백질의 글루코실화에 대한 억제 효과보다 오래 가므로, 투약 계획은, 바이러스 증식은 방해되고 숙수 세포 단백질의 글루코실화에는 최소한의 영향만을 주도록 조절할 수 있다. 예를 들어, 동물에 본 발명의 조성물의 투여량을 일주일에 한 번 투여함으로써, 바이러스 증식은 일주일 내내 억제되고, 숙주 세포 단백질 글루코실화는 일주일에 한번 단기간 동안만 억제될 수 있다.

이러한 조성물 투여의 장점 중 하나는, 이를 통하여 바이러스 기능보다는 숙주 효소가 억제된다는 것이다. 바이러스는 돌연변이 가능하여, 항바이러스제에 의한 억제에 감수성 있는 바이러스의 기능이, 후대의 바이러스에서 이에 대한 내성이 생기도록 변이될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 예를 들어, HIV 바이러스의 AZT와 같은 특정 항-바이러스제에 견디도록 변이되는 능력은 상세히 기록되어 있다. 본 발명의 방법은, 이 방법에 사용되는 조성물이 바이러스에 의하여 라이프 사이클의 일부로 사용하는 숙주 세포의 기능을 표적으로 한다는 장점을 갖는다. 이러한 숙주의 기능, 즉 숙주 세포의 ER과 관련된 숙주의 글루코시다아제가 촉매 작용하는 글루코실화 또는 숙주 세포의 ER과 관련된 숙주의 글루코실트랜스퍼라아제가 촉매작용하는 글루코실 이동(glucosyl transfer)은, 바이러스 게놈의 돌연변이에 따른 변화에 영향받지 않는다. 따라서, 본 발명의 조성물에 의한 억제에 내성이 있는 바이러스 균주가 생길 가능성이 적다.

실험 절차

본 발명에서 관찰된 바에 따르면, 조직 배양액에서 MDBK 세포 단일층에 플라크를 형성하는 BVDV의 능력을 NBDNJ가 억제하였다. 예를 들어, BVDV에 노출되었으나 NBDNJ에는 노출되지 않은 두 배양액에는, 감염 세포 함유 웰 중에 16 및 25 바이러스성 플라크가 있었다. BVDV에 노출되고 감염 직후에 NBDNJ에 노출된 세포 배양액은 플라크가 보이지 않았고, 중성 레드 염색(neutral red staining)으로 평가시, 세포 단일층은 건강하고 생존가능한 것으로 보였다.

이 실험에서, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)를 HCV의 대용물로 사용하였다. HCV는 인간 및 침팬지 이외의 동물에서나 조직 배양액에서 증식의 신뢰성이 없으므로, 조직 배양액 내에서 HCV 대용물을 사용해야 한다. HCV와 같이, BVDV는 ER에서 출아하는 것으로 생각되는 페스티바이러스이다[Harasawa et al.(1995) Microb Immunol 39:979-985]. BVDV는, 바이러스 학자에 의하여 조직 배양액에 사용하기에 생화학적으로 가장 유사한 HCV 대용물로 간주되고[Suzich et al.(1993) J Virol 67:6152-6158; Donis(1995) Vet Clinics N Amer 11:393-423], 미국 식품의약국의 전문가로부터의 비공식적인 의견을 포함하여, 일류 전문가들에 의하여 HCV의 허용가능한 대용물로 인식된다.

HCV의 대용물로 사용되는 것과는 별도로, BVDV는 또한 중요한 동물 병원체이다[Donis (1995) Vet Clinics N Amer 11:393-423]. BVDV 감염으로 인해 미국에서는 가축에 큰 손실이 있다[Sullivan et al. (1995) Virus Res 38:231-239].

이미노 당 유도체 N-부틸-데옥시노지리마이신(NB-DNJ) 및 N-노닐데옥시노지리마이신(NN-DNJ)은, 마딘 다비 소 신장[Madin Darby Bovine Kidney:MDBK] 세포에 대한 BVDV의 세포변성 효과를 크게 억제한다. 플라크 감소 및 수율 어세이(실시예 2)에서, 노닐 화합물(IC50=2.5μM)은 부틸 화합물(IC50=115μM)보다 46배의 효능이 있는 것으로 나타났다.

N-노닐-DNJ은 세포-계 어세이에서 N-부틸-DNJ보다 효능이 훨씬 큰 글루코실트랜스퍼라아제 활성 억제제이며, 글루코실트랜스퍼라아제 활성을 억제하면 많은 리소좀 당지질 저장 질환의 치료에 유용하다는 점에서(F.M.Platt, G.R. Neises, G.Reinkensmeier, M.J. Townsend, V.H. Perry, R.L. Proia, B. Winchester, R.A. Dwek, T.D.Butters(1997) Science 276:428-431), 노닐 DNJ 및 DNJ의 다른 알킬 사슬 유도체는 타이-사크, 가우처 질환, 파브리 질환 등과 같은 리소좀 당지질 저장 질환의 치료에 유용할 것으로 생각된다. NB-DNJ 및 NN-DNJ 화합물은 모두 ER α-글루코시다아제 뿐 아니라 당스핑고지질(glycosphingolipid) 생합성에 관계되는 세라마이드 특이적 글루코실트랜스퍼라아제를 억제하므로, 이러한 약물이 항바이러스 작용을 나타내는 경로를 확립하는 것이 필요하다. N-부틸-디옥시갈락토노지리마이신(NB-DGJ), 글루코실트랜스퍼라아제만을 표적으로 하는 억제제를 사용하여 약물학적으로 두 경로가 밝혀졌다. 플라크 감소 어세이에서, NB-DGJ는 BVDV 플라크 형성에 효과가 없었다(도 3). 사용된 NB-DGJ 농도는,¹⁴C-팔미테이트-표지된 NB-DGJ-처리 MDBK 세포 중에 Glc-세라마이드 및 강글리오사이드의 투여량-의존성 감소에 의하여 나타나는 바와 같이, 글루코실트랜스퍼라아제를 완전히 억제하기에 충분하였다(도시하지 않음). 이를 통하여, NB-DNJ 및 NN-DNJ에서 관찰되는 항바이러스 효과는, N-글리칸 처리와 관계되는 ER α-글루코시다아제의 억제 때문임을 알 수 있다.

데글루코실화를 위한 다른 경로를 제공하여 글루코시다아제-억제된 글리칸까지도 복합-타입 올리고사카라이드로 더욱 처리되도록 할 수 있는 효소인 골지 엔도-α-만노시다아제는, MDBK 세포에 상당한 수준이 존재하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 모든 단백질이 반드시 이러한 경로를 이용 가능한 것은 아니다. 예를 들어, VSV-G 단백질은 MDBK 세포에서 카스타노스페르민 부과된 글루코시다아제 방해동안 엔도-H-감수성이다. 따라서, NB-DNJ 및 NN-DNJ로 MDBK 세포를 처리하면, BVDV 외피 당단백질이 바이러스성 분비에 중요한 복합-타입 N-글리칸을 얻는 것을 막을 수도 있다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, 플라크 감소 어세이에 골지 만노시다아제 I 억제제 데옥시만노지리마이신(DMJ)을 사용하였다(도 4). N-글리칸 생합성의 초기 단계를 방해하지 않고 복합-타입 N-글리칸 형성을 억제하는 DMJ는 BVDV 플라크 형성에 효과가 없다. 이것은, NB-DNJ 및 NN-DNJ의 항바이러스 효과가 복합 N-글리칸 형성 전단계에 의하여 매개된다는 것을 의미한다.

NB-DNJ는 숙주 세포 효소를 표적으로 하므로, 바이러스 수용체를 포함하는 다른 N-글리코실화 숙주 단백질이 기능적으로 손상될 수 있다. 그러한 경우, 바이러스는 숙주 세포에 들어가지 못하게 된다. 이러한 가능성을 시험하기 위하여, MDBK 세포를 바이러스 감염 6일 전까지 1mg/ml의 NB-DNJ의 부재 또는 존재 하에 증식시켰다. 약물로 전처리하면 바이러스 도입이 억제되지 않았고(데이타는 도시하지 않음), 바이러스 수용체가 글루코시다아제-억제된 세포에서 기능하는 것으로 나타났다.

B형 간염 바이러스(BBV)로 감염된 글루코시다아제-억제된 HepG2 세포에서, 외피에 싸인 바이러스의 분비가 억제되고, 바이러스 DNA가 세포 내에 형성된다. 그러나, 축적된 DNA가 전염성 입자 내에 함유되는지는 명백하지 않은데, 조직 배양액 내에서 HBV 입자의 감염성을 결정하기 어렵기 때문이다.

BVDV 분비를 억제하면 세포 내에 바이러스성 물질을 축적시킬 수도 있으며, 이런 경우에, 이 물질이 전염성인지 시험하기 쉽다. 감염된 비처리 및 NB-DNJ-처리 세포를 철저히 세척하고, 이틀 및 삼일 후에 동결-해동하여 용해시켰다. 수율 어세이를 통하여, 세포 용해물 및 상청액의 플라스 형성 단위(pfu) 수를 측정하였다(도 5). 비처리 세포에서는, 이틀 후에 대부분의 전염성 바이러스 물질(97% 이상)이 세포 내부에서 회수되었고, 삼 일 후에 전염성 바이러스 물질의 삼분의 일이 상청액에서 검출되었다. 특히, NB-DNJ-처리 세포에는 이틀 후에 검출가능한 전염성 물질이 함유되어 있지 않았고, 삼 일 후에도 전염성 물질이 거의 없었다. 배양 배지에서 전염성 물질은 전혀 발견되지 않았다. 이러한 데이터를 통하여, BVDV가 전염성 상태로 억제제-처리된 세포 내에 축적되지 않는다는 것을 알 수 있다.

BVDV로 감염된 세포는, NB-DNJ가 배양 배지에 있으며 글루코시다아제가 억제되는 한, 전염성 바이러스를 축적하거나 분비하지 않는다. 본 발명자들은, 억제제 제거 후, 글루코시다아제 차단 효과로부터 바이러스가 회수되고 분비가 시작되기까지 얼마나 걸리는지를 결정하고자 하였다. 감염 세포는 1mg/ml NB-DNJ 또는 30㎍/ml NN-DNJ로 이틀동안 처리한 후(즉, 미처리 대조구 안에 플라크가 완전히 형성될 때까지), 약물-함유 배지를 제거하고, 약물이 없거나(약물 무) 약물을 함유하는(약물 유) 배지에 놓았다. 이어서, 이 배지를 특정 시점에서 제거하고, 플라크 감소 및 수율 어세이를 통하여 전염성 물질을 어세이하였다. 약물 제거 24시간 후까지 전염성 물질은 전혀 검출되지 않았고, 24시간 내지 48시간의 시점에서 바이러스가 생겨나기 시작했다(도 6).

이미노 당은 글루코시다아제의 가역적인 억제제로, 글루코실트랜스퍼라아제 활성은 약물 제거 후 2시간 내에 정상 정도로 회복되었다. 그러나, N-노닐-DNJ 및 N-부틸 DNJ의 항바이러스 효과는 제거 2시간 후에 오랫동안 지속되었고(도 6), HBV에 대해 주목되었다(Lu et al. (1997)). 따라서, 이미노 당 억제제의 항바이러스 효과는, 약물 제거 후, 세포 내에 남아있는 수명이 긴 결손 바이러스 당단백질에 의하여 실질적으로 매개된다는 것이 제안된다. 이러한 수명이 긴 결손 당단백질은 우세한 음성 형태로 작용하며, 따라서 이들 자체를 확실한 항바이러스제로 고려할 수 있다. 결손 당단백질이 항바이러스제로 작용하는 것은 진보성이 있으며, 이러한 바이러스로 인한 감염의 치료 및 신규한 치료의 발전에 유용하다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 설명한다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 것으로, 이를 통하여 본 발명이 제한되는 것이 아니라, 본 명세서에 교시된 바에 따라 명백한 모든 변형이 포함되는 것으로 보아야 한다.

본 출원은 1997년 12월 11일자로 출원된 미국 가특허출원 제 60/069,245호를 우선권으로 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 숙주 세포에서 글루코시다아제 활성을 억제하는 화합물을 사용하는 바이러스 감염의 치료법에 관한 것이다. 또한, 감염 세포에서 글루코실트랜스퍼라아제 활성을 억제하는 화합물을 사용하는 지질 저장 질환(lipid storage disease)의 치료법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 및 이의 유도체의 용도에 관한 것이다.

물질 및 방법

세포, 바이러스 및 억제제. 비-세포병변성(ncp) BVDV-없는 MDBK 세포 및 세포병변성(cp) BVDV 바이러스(균주 NADL)는 Dr. John McCauley(Institute of Animal Health, Compton, UK)가 제공하였다. MDBK 및 HepG2 세포는, 10%의 태아 소 혈청(PAA Laboratories, Austria)을 함유하는 RPMI 1640 배지(GEBCO/BRL) 안에 유지하였는데, 이 배지는 선별되었으며, BVDV 및 BVDV-특이 항체의 존재에 대하여 음성으로 밝혀졌다. N-부틸-데옥시노지리마이신(NBDNJ) 및 N-노닐-데옥시노지리마이신(NN-DNJ)는 Monsanto Searle에 의하여 제공되었다. NB-DNJ는 배지에 용해하여 사용 직전에 여과하였다. NN-DNJ는 에탄올 중의 13mg/ml 저장 용액으로 만들고, 사용 전에 배지로 희석하였다. N-부틸-디옥시할락토지리마이신(N-butyl-deoxygalactojifimycin)(NB-DGJ) 및 디옥시만노지리마이신(DMJ)을 Boehringer Mannheim(독일)사에서 구입하여, 물로 각각 200mM 및 100mM 저장 용액으로 만들었다. 이들을 배지로 희석하고, 사용 직전에 여과하였다. NB-[U-¹⁴C]데옥시노지리마이신(비 활성 4.4mCi/mmol) 및 데옥시노지리마이신(DNJ)은 G.D.Searle에게서 얻었다.

인간 HCV 복제를 도울 수 있는 적당한 세포 배양 시스템이 없는 상황에서, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)는, 이들이 모두 고도의 국부 단백질 영역 상동관계(Miller et al., 1990), 공통 복제 방법과, 아마도 동일한 바이러스 봉함의 하부-세포 위치를 공유하므로, HCV의 FDA 승인 모델 유기체 역할을 한다(도 1). BVDV 에 대한 항바이러스 효과를 갖는 것으로 밝혀진 화합물은 HCV 치료제로서의 가능성이 높다.

플라크 감소 및 수율 어세이. MDBK 세포는 억제제가 존재 또는 부재하는 여섯개의 웰 플레이트(도면의 범례 참조)에서 성장시켰으며, cp BVDV(moi=0.005; 웰당 500 pfu)로 1시간동안 37℃에서 감염시켰다. 이어서, 접종물을 성장 배지 단독 또는 성장 배지 및 항바이러스제와 함께 두고, 이삼일동안 억제제의 존재 또는 부재하에 배양하였다(플라크 감소 어세이). 현미경을 사용하여 눈으로 플라크를 계수한 후, 분비된 감염성 바이러스를 함유하는 상청액을 웰로부터 옮겨, 6개의 웰 플레이트에서 MDBK 세포의 새로운 단일층을 감염시키기 위하여 사용하였다. 3일 후, 얻어진 플라크를 현미경으로 계수하였다(수율 어세이).

실시예 1

항바이러스성 항-글루코시다아제의 존재가 BVDV에 노출된 MDBK 세포 단일층에서 플라크 형성에 미치는 효과

MDBK 세포[ATTC 기탁 번호(accession number) 22 CCL F11859, BVDV-무]를 24-웰 트레이(trays)의 각 웰에서 반-융합(semi-confluence)으로 배양하여, 세포 단일층을 형성하였다. 사용된 배지는 10%(v/v) 말 혈청을 포함하여 이루어지는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)였다.

배양 배지에 현탁시킨 BVDV의 NADL 균주(ATCC 기탁 번호 NADL 534 VR) 밀리리터당 약 500 내지 약 1,000 플라크 형성 단위(PFU)를 포함하는 바이러스 저장 용액의 희석액을 포함하여 이루어지는 접종물의 존재 하에 1시간동안 세포를 배양하여, 1 이하의 다양한 감염(moi)으로(플라크-형성 조건), 약 10⁵세포를 BVDV, NADL 균주 감염시켰다. 이어서, 접종물을 배양 배지 단독 또는, 도 5의 축에 표시한 양의 약물(NBDNJ 밀리리터당 1000 마이크로그람까지)을 더욱 포함하여 이루어지는 배양 배지에 놓았다. 감염 3일 후, 에탄올 중의 0.2%(w/v) 결정 바이올렛으로 염색 전후에 현미경을 사용하여 세포 단일층을 관찰하고, 바이러스-유도된 플라크의 수를 측정하였다(도 5). NBDNJ에 노출된 세포는, 트리판(trypan) 염료 배제 및 MTT 어세이로 측정했을 때와 같이(CC50 또는 MTT 활성에 대한 생존성을 50% 떨어뜨리기 위하여 필요한 약물의 양으로 보고된 결과) 생존가능하였다. 이러한 실험 결과는 하기 표 및 도 1에 나타낸다.

N-부틸-DNJ 처리, NBDNJ에 노출된 세포는 NBDNJ 밀리리터당 1,000마이크로그람에 노출.

바이러스 희석	세포 내에서 관찰된 PFUNBDNJ에 비노출	세포 내에서 관찰된 PFUNBDNJ에 노출
10^-0	C	~100s, 100s
10^-1	(100-1000), 400	0, 0
10^-2	50, 45	0, 0
10^-3	1?, 10	0, 0
10^-4	0, 0	0, 0
바이러스 무	0, 0	0, 0
주: "C"는 융합 세포 용해가 관찰된 것을 의미한다."1?"는 단일 PFU를 나타낼 수 있는 작은 세포 용해 영역이 존재함을 의미한다."s"는 MDBK 세포 단일층이 BVDV PFU로 감염된 경우에 일반적으로 관찰되는 것보다 작은 플라크가 존재함을 의미한다.

실시예 2

N-부틸-DNJ 및 N-노닐-DNJ의 존재하에 전염성 BVDV의 분비

MDBK 세포를 24-웰 트레이(trays)의 각 웰에서 반-융합(semi-confluence)으로 배양하였다. 이어서, 세포를 배양 배지에 현탁된 BVDV의 NADL 균주 약 500 PFU 존재 하에 37℃에서 1시간동안 세포를 배양함으로써 BVDV로 감염시켰다. 이어서, 접종물을 배양 배지 단독 또는, 표 2 및 표 3에 각각 나타낸 농도의 NBDNJ 및 NNDNJ를 함유하는 배양 배지에 놓았다. 3일 후, 상청액을 제거하여, 6-웰 플레이트의 새로운 NDBK 단일층을 감염시키기 위하여 사용하였다. 3일 후, 플라크 계수를 위하여 에탄올 중의 0.2%(w/v) 결정 바이올렛을 사용하고, 생존성을 위하여 0.2% 중성 레드를 사용하여, 염색 전후에 현미경을 사용하여 세포 단일층을 관찰하였고, 바이러스-유도된 플라크의 존재 및 수를 측정하였다. 그 결과는, 억제제-없는 플라크 어세이 상청액(=100%)으로의 감염에 따른 플라크의 수를 %로 나타내었다. 이러한 실험 결과는 표 2 및 표 3와, 도 1A 및 도 1B의 그래프에 나타낸다.

두번 관찰한 것은 콤마로 분리함.

밀리리터당 마이크로그람웰당 첨가된 NBDNJ	0 10 50 200 1000 1000
웰당 첨가된 PFU	~500 ~500 ~500 ~500 ~500 0
웰당 관찰된 PFU	500,C 200,500+, 10,20, 0,0, 0,0, 0,0, 500+,C 500+,500+ 20,40 0,0 0,0 0,0
주: "C"는 융합 세포 용해가 관찰되었음을 나타낸다.

N-노닐-DNJ의 존재가 BVDV에 의한 플라크 형성에 미치는 효과

밀리리터당 마이크로그람웰당 첨가된 NNDNJ	0 0.4 2.0 10 50 50
웰당 첨가된 PFU	~500 ~500 ~500 ~500 ~500 0
웰당 관찰된 PFU	200,500+ 50,100, 100,50, 0,0, 0,0, 0,0, 500+,C 500,200 50,50 0,0 0,0 0,0
주: "C"는 융합 세포 용해가 관찰되었음을 나타낸다. N-노닐-DNJ 글로코시다아제 억제제(Glycobiology Institute, Oxford University "Compound 578"), 두번의 관찰은 콤마로 분리한다.

플라크 형성을 50% 억제하는 NB-DNJ 농도(IC₅₀)를 측정하니 밀리리터당 약 20 마이크로그람이었다. 50% 의 MDBK 세포의 치사를 유도하는 NB-DNJ의 농도(CC₅₀)를 계산하니, 밀리리터당 1000 마이크로그람이었다. N-노닐-DNJ의 IC₅₀값은 밀리리터당 약 0.75마이크로그람이었고, CC₅₀의 값은 밀리리터당 약 100 마이크로그람이었다.

NB-DNJ 또는 NN-DNJ에 세포를 노출시킴으로써, 바이러스-유도된 플라크의 수가 감소한 것인지, 크기만이 감소한 것인지는 명백하지 않다. BVDV로 감염되고, 밀리리터당 200 마이크로그람 NB-DNJ 또는 밀리리터당 10 마이크로그람 NN-DNJ에 노출된 세포에서 세포변성 효과는 육안으로 관찰되지 않았다. 밀리리터당 1000 마이크로그람 NB-DNJ에 세포를 노출시키는 경우, 독성이 측정되지 않았다. 밀리리터당 50 마이크로그람 NN-DNJ에 세포를 노출시키는 경우, 바이탈 염색(vital staining)으로 독성 효과가 정량되지는 않았지만, 단일층의 세포가 "긴장된(stressed)" 형태였다.

실험 결과에 따르면, NN-DNJ 및 NN-DNJ는 매우 효과적인 항-BVDV 약물임을 알 수 있다. BVDV 감염이, 조직 배양액에 이용가능하고 HCV 감염에 가장 상응하는 모델이고, BVDV 및 HCV는 생화학적으로, 바이러스학적으로, 유전학적으로 매우 유사하므로, 이러한 데이터를 통하여, NN-DNJ 및 NB-DNJ는 또한 매우 효과적인 항-HCV 약물임이 명백하다.

실시예 3

NB-DGJ를 이용한 세라마이드-특이적 글루코실트랜스퍼라아제의 억제에 대한 대조 어세이

MDBK 세포는¹⁴C-팔미테이트 N-부틸-데옥시갈락토노지리마이신(NB-DNJ)에 융합하여 배양하였다. 세포를 PBS로 세번 세척하고, 플라스크에서 벗겨내어, CHCl₃:MeOH(2:1, v/v)로 섭씨 4도에서 밤새 추출하였다. 1차 추출액을 얻어 추가의 CHCl₃:MeOH(2:1, v/v) 0.5ml를 실온에서 3시간동안 첨가하였다. 추출액을 결합하여 분취량을 섬광-계수하였다(scintillation-counted). 시료를 200,000 cpm으로 조절하고, 질소하에 건조하고, 10㎕의 CHCl₃:MeOH(2:1, v/v) 로 재현탁하고, TLC(CHCl₃:MeOH, 2:1, v/v)로 분리하였다. 방사선표지된 지질을 X-선형광촬영법(fluorography)으로 검출하였고, 관찰한 Glc-세라마이드 및 강글리오사이드의 투여량-의존성 감소(데이터는 도시하지 않음)에 따르면, 세라마이드-특이적 글리코실트랜스퍼라아제는 항바이러스 효과가 없는 농도에서 억제되었다.

실시예 4

DMJ를 이용한 복합 당 형성 억제에 대한 대조 어세이

MDBK 세포를 300㎍/ml DMJ의 부재/존재 하에 3일간 배양하였다. 세포를, GalΒGaINAc 에피토프를 인식하는 에리트리나 크리스타갈리(Erythrina cristagalli: ECA) 렉틴(28㎍/ml 및 280㎍/ml)으로 염색하고, FACS 로 분석하였다. 렉틴 저농도에서, 염색 강도의 이동으로 렉틴을 이용할 수 있는 결합 부위(즉, 복합 글리칸)의 감소가 표시되었다. 렉틴 고농도에서, DMJ가 존재하여 렉틴 결합으로 인한 세포의 치사를 보호할 수 있었다. 결과를 도 4에 도시한다.

실시예 5

감염 후 NB-DNJ-처리된 세포의 내부 및 외부의 바이러스 물질의 감염도

비-감염(A) 및 BVDV-감염(B 및 C)된 MDBK 세포를 1mg/ml의 NB-DNJ의 부재(A 및 B) 또는 존재(C) 하에 이틀 또는 삼일동안 배양하였다. 상청액을 저장하고, 세포를 세척하여 동결-해동을 통해 용해하였다. 수율 어세이를 실시하여, 상청액(S/N) 및 세포 용해물의 플라크-형성 단위 수를 측정하였다. 결과를 도 5에 플롯한다.

실시예 6

NB-DNJ 또는 NN-DNJ로 감염 세포를 처리 후 BVDV의 재형성

감염된 MDBK 세포(500 pfu/웰)를 (A) 1 mg/ml N-부틸-DNJ 또는 (B) 30㎍/ml N-노닐-DNJ의 존재하에 이틀동안 배양하였다. 약물-함유 배지를 제거하고, 약물이 없는(약물 무) 또는 약물 함유(약물 유) 배지에 놓았다. 배지를 지정 시점에서 제거하고, 플라크 감소 및 수율 어세이로 전염성 물질을 어세이하였다. 결과는 도 6에 도시한다.

실시예 7

다른 세포 타입의 방사성 표지된 억제제 흡수(uptake)

MDBK 및 HepG2 세포를 12-웰 플레이트에서 융합 배양하였고,¹⁴C-NB-DNJ 및 H³-NN-DNJ(100000 cpm/웰)에서 지정 시간동안 배양하였다. 상청액을 제거하고 유지시켰다. 세포를 PBS(2x500㎕)로 세척하고, 500㎕의 얼음처럼 찬 10% 과염소산/2% 인텅스텐산(phosphotungstic acid)으로 고정하고, 500㎕의 얼음처럼 찬 에탄올 로 두 번 세척하고, 공기건조하였다. 500㎕의 0.5M NaOH를 사용하여 실온에서 밤새 세포를 용해하였다. 상청액에서 방사성 퍼센트를 계수하고, PBS 세척하고, 용해된 세포를 액체 섬광계수법으로 결정하였다. 결과는 도 7과 같다.

실시예 8

N-[³H]N-DNJ의 제조

DNJ(61μmol)를 노닐알데하이드(1.2몰 당량)으로 1몰당량의 나트륨 시아노보로[³H]하이드라이드(Amersham, 10Ci/mmol)의 존재하에 3시간동안 실온에서 환원적으로 아민화하였다. 양이온-교환 및 역-상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 삼중수소-표지된 NN-DNJ를 반응혼합물에서 정제하였다. 생성물은 HPLC로 방사능 순도 95% 이상이었고, 화합물 구조는 질량 분광분석법 및¹H-NMR로 확인하였다. 비 활성은 145mCi/mmol이었다.

실시예 9

방사성표지 이미노 당의 기관 분포

방사성표지된 NN-DNJ 및 NB-DNJ를 진공 중에 건조하고, 마우스 전혈(Becton Dickenson)에 재현탁하고, 1분동안 얼음 상에서 초음파처리하였다. 이 현탁액을 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하고, 방사성을 확인하여, 여과액은 전형적인 회수율 78% 내지 95% 였다. 이 여과액을 Balbc 마우스에 경구 가바즈(마우스당 1-3μCi)로 투여하고, 30, 60 및 90분 후에 마우스를 경부 탈구(cervical dislocation)로 치사시켜, 장기를 떼어냈다. 장기를 칭량하고, Ultra-Turrax 호모제나이저를 사용하여 0.2-0.4g/ml로 물에 균질화하였다. 방사성 결정을 위하여 분취량을 취하였다. 결과는 도 8에 도시한다.

실시예 10

N-노닐-1,5-이미노-D-글루시톨을 사용한 가우처 질환의 치료

임상적으로 비종 및 세망 내피 세포에 비정상적으로 글루코세레브로사이드가 축적된 전형적인 세망조직 세포 과형성으로 진단받은 가우처 질환자를 N-노닐-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨(N-노닐-DNJ)를 경구 또는 비경구 투여하여 치료하였다. 투여량은, 기본 수준 10mg/kg/일로부터, 임상 증후의 개선 또는 생체 검사시 세망 내피 세포에서의 글루코세레브로사이드 감소 등으로 나타나는 치료 효과가 관찰될 때까지 점차 증가시켰다. 환자의 임상 반응에 따라 N-노닐-DNJ 치료를 줄이거나 다시 시작한다.

본 명세서에 인용된 특허, 특허 출원 및 공개에 개시된 내용은, 각각 또는 모두가 본 명세서에 참고로 전체적으로 병합되어 있다. 본 발명은 특정 실시형태를 참조로 개시하고 있으나, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 한, 본 발명의 다른 실시형태 및 변형이 당업자에게 가능하다는 것은 명백하다. 특허청구범위는 이러한 실시형태 및 이에 상당하는 변형을 모두 포함한다.

Claims

유효량의 글리코시다아제 억제제, 글루코실 트랜스퍼라아제 억제제 또는 단백질 접힘을 방해하는 물질을, 감염된 숙주 세포의 세포사이의 막에 위치한 효소와 연계하여 복재되는 바이러스의 생성을 억제하기 위한 약물 제조에 사용하는 용도.
하기 화학식을 갖는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체

(단, 상기 식에서 R¹은

(m) 수소;

(n) 알킬;

(o) 알케닐;

(p) 알콕시;

(q) 아실;

(r) 아릴;

(s) 아르알킬;

(t) 아로일; 및

(u) 아르알콕시; 및

(v) 헤테로고리 기로 구성되는 그룹에서 선택되고;

R³, R⁴및 R⁵은 동일하거나 상이하며,

(w) 아실; 및

(x) 아로일로 구성되는 그룹에서 선택되고,

R⁶는 수소, 또는 알킬, 알케닐, 아실, 아로일 또는 아르알킬기이고,

상기 알킬 및 알케닐기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 치환 또는 비치환되며, 상기 알케닐기는 이중 결합 1 내지 6개를 가지고; 상기 아릴 및 헤테로고리기는 선택적으로 할로겐, 히드록시, C_1-10알킬; C_1-10알킬렌; C_1-10아실 또는 C_1-10알콕시로 선택적으로 치환된다.);

상기 화합물의 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체, 및 상기 화합물, 거울상 이성질체 또는 입체 이성질체의 생리학적으로 허용가능한 염 또는 용매 화합물인 항-글루코시다아제 또는 항-글루코실 트랜스퍼라아제 유효량을 감염된 숙주 세포의 세포사이의 막에 위치한 효소와 연계하여 복재되는 바이러스의 생성을 억제하기 위한 약물 제조에 사용하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체는 R¹이 알킬기로 치환되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 3항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체는 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 4항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체는 R³, R⁴, R⁵및 R⁶가 수소 라디칼로 치환되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체가 하기 화학식을 갖는 것을 특징으로 하는 용도.
제 6항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체는 R³, R⁴, R⁵및 R⁶가 수소기로 치환되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, R³, R⁴및 R⁵중 하나 이상이 아실기인 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체가 포유류 숙주 세포에 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 9항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체가 인간 숙주 세포에 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체가 상기 숙주 세포에 in vivo 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 플라비바이러스(flavivirus) 그룹에 속하는 바이러스로 감염되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 12항에 있어서, 상기 숙주 세포 내의 플라비바이러스(flavivirus)는 황열병 바이러스(yellow fever virus), 뎅그열 바이러스 1-4(dengue viruses 1-4), 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 머리 벨리 뇌염 바이러스(Murray Valley encephalitis virus), 로시오 바이러스(Rocio virus), 웨스트 나일 열병 바이러스(West Nile fever virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 틱-본 뇌염 바이러스(tick-borne encephalitis virus), 루핑 일 바이러스(Louping ill virus), 파와산 바이러스(Powassan virus), 옴스크 출혈열 바이러스(Omsk hemorrhagic fever virus) 및 키아사누르 포리스트 질병 바이러스(Kyasanur forest disease virus)로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 12항에 있어서, 상기 숙주 세포가 C형 간염 바이러스로 감염되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 페스티바이러스(pestivirus) 그룹에 속하는 바이러스에 의하여 감염되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 숙주 세포가, 소포체 또는 숙주 세포 내에서 소포체의 루멘을 둘러싸는 막과 연계하여 바이러스 구조 중 적어도 일부를 복제하는 바이러스에 의하여 감염되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 2항에 있어서, 상기 숙주 세포가, 골지체 또는 숙주 세포 내의 골지체의 루멘 막과 연계하여 바이러스 구조 중 적어도 일부를 복제하는 바이러스에 의하여 감염되는 것을 특징으로 하는 용도.
유효량의 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨의 N-알킬 유도체를, 필요시 척추동물의 간 세포에 항글리코시다아제 또는 항글루코실트랜스퍼라아제를 송달하기 위한 약물의 제조에 사용하는 용도.
N-알킬, N-아실, N-아릴, N-아르알킬 및 N-아로일 유도체로 구성되는 그룹에서 선택되는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 유도체인 항-글루코시다아제 또는 항-글루코실트랜스퍼라아제 유효량을, 소의 바이러스성 설사 바이러스(bovine viral diarrhea virus)로 감염된 세포의 치료를 위한 약물 제조에 사용하는 용도.
제 19항에 있어서, 상기 바이러스-감염된 세포는 소의 단핵구인 것을 특징으로 하는 용도.
항바이러스 유효량의 동물 세포 글루코시다아제 억제제를, 동물 세포의 내막으로부터 바이러스 성분을 얻는 바이러스로 감염된 동물을 상기 바이러스에 의한 감염 속발증(sequelae) 중 하나인 암 발생으로부터 보호하기 위한 약물의 제조에 사용하는 용도.
제 21항에 있어서, 상기 글루코시다아제 억제제는 1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨 및 이의 유도체로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
N-노닐-1,5-디데옥시-1,5-이미노-D-글루시톨의 글루코실트랜스퍼라아제 억제 유효량을 동물의 리소솜 지질 저장 질환을 치료하기 위한 약물 제조에 사용하는 용도.
제 23항에 있어서, 상기 동물의 질환이 타이-사크 질환(Tay-Sach's disease), 가우처 질환(Gaucher's disease), 크라베 질환(Krabbe's disease) 또는 파브리 질환(Fabry's disease)인 것을 특징으로 하는 용도.