JP3860226B2 - ヒト免疫不全症ウイルス感染の予防または治療の方法 - Google Patents
ヒト免疫不全症ウイルス感染の予防または治療の方法 Download PDFInfo
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Description
技術分野
本発明は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）感染の予防または治療の必要のある哺乳動物に、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、またはその同一分子２個を脱水素することにより得られる酸化ダイマーの有効量を投与することよりなる、ＨＩＶ感染の予防または治療の方法に関する。
背景技術
１型ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ−１）に対するグルタチオン（ＧＳＨ）およびその前駆体を含む抗酸化剤の潜在的な阻害効果については、ここ数年間研究されてきた。初期の研究では、Ｄ−ペニシルアミン、２，３−ジメルカプト−１−プロパノールやＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）のような還元剤は、ＨＩＶ−１の末端の繰り返し配列（ＬＴＲ）に支配されるウイルスの遺伝子転写を阻害することが見いだされている（FEBS Letters 1988; 236: 282-286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919-927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884-4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990）。これらの初期の基礎的な研究に対応するように、ＨＩＶに感染した個体の血漿、末梢血球、および肺上皮内層液のＧＳＨレベルの減少が報告されている（Biol Chem Hoppe-Seyler 1989; 370: 101-108, AIDS Res Human Retrovituses 1992; 2: 305-311, Lancet 1989; II: 1294-1298）。ＧＳＨは細胞内の主要な抗酸化剤としてばかりでなく、免疫システムの調節剤としても知られている（J Immunol 1985; 135: 2740-2747）。こうしたことから、ＨＩＶに感染した個体のＧＳＨ欠乏をグルタチオン前駆体で変化させることは、ＨＩＶの生体内増殖を阻害する合理的な治療戦略の仮説のひとつであった（AIDS Res Human Retroviruses 1992; 8: 209-215, Blood 1995; 86: 258-267, Blood 1996; 87: 4746-4753）。このようなことから、さらに、ＮＡＣのようなＧＳＨのプロドラッグのＨＩＶ−Ｉに対する阻害効果が調べられている。これらの化合物は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）またはフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）によって潜伏しているプロウイルスから誘導されるＨＩＶ−１遺伝子の転写を阻害できることが示されている。これは、細胞の潜伏期にあるＨＩＶ−１感染のモデルである（Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990, Cell 1990; 61: 127H276）。注意すべきこととして、最近、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＡＣによるＨＩＶ−１増殖亢進が報告されている（AIDS 1997; 11: 33-41）。
最近の研究によれば、ＨＩＶ−１の複製がリンパ性網内組織内で継続的に活性であることが示された（Nature 1993; 362: 355-358, Nature 1993; 312: 359-362）。したがって、いわゆる後期の感染細胞からの大量のウイルス生産と、それに引き続くさらなる感染の繰り返しを遮断することなしに、潜伏しているＨＩＶ−Ｉプロウイルスを非複製状態に保つのみではＨＩＶ−１感染を有意に変化させることは困難であろう。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の進行を減速させるには、後期の感染細胞の除去が最も重要であろうと示唆されていた（Science 1996; 272: 1962）。しかしながら、多数の抗ＨＩＶ−Ｉ化学療法剤の候補が記述されてはきたが、未だにＨＩＶ−Ｉそれ自身およびＨＩＶ−１感染細胞の選択的な除去を示す化合物はなかった。同様に、多種の抗酸化剤の抗ＨＩＶ−１効果を記述する各種の報告があったが（FEBS Letters 1988; 236: 282-286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919-927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884-4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990）、急性のＨＩＶ−１感染を阻止すると報告された化合物はなかった。
式（Ｉ）、
（式中のＲは炭素原子１−１０個の直鎖状、分岐状、もしくは環状の炭化水素基、または芳香族基で置換された炭素原子１−５個の直鎖状もしくは分岐状の炭化水素基である。）
で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、または式（Ｉ）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステルの２分子間の脱水素によって得られる酸化ダイマーは、抗酸化剤として直接的に、または唯一のＧＳＨプロドラッグとして作用し、それによって活性酸素やフリーラジカルによる障害によって引き起こされる肝障害、白内障、腎障害、心や肝の再灌流障害、不整脈、ならびに喘息のような肺障害の予防または治療作用を示すことが知られている（WO 88/00182（米国特許No. 4,927,808）およびWO 92/18420（米国特許No. 5,631,234））。特に、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（γ−ＧＣＥ）は白内障（Ophthalmic Res 1991; 23: 51-58）、肝障害（Res Com Chem Pathol Pharmacol 1993; 82: 49-64）、心や肝の再灌流障害（Brit J Pharmacol 1991; 104: 805-810, J Am Coll Cardiol 1994; 24: 1391-1397, Circulation Res 1994; 74: 806-816, Transplantation 1992; 54: 414-418）ならびに喘息（Am Rev Respir Dis 1992; 145: 561-565）に対して有効であると報告されてきた。しかしながら、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物のＨＩＶ感染に対する効果については報告されていない。
発明の開示
本発明の発明者らは、上記のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物を代表するγ−ＧＣＥの抗ＨＩＶ−Ｉ効果を、（１）活発にＨＩＶ−Ｉを産生しているヒトＴ−リンパ球株、すなわち慢性ＨＩＶ感染における後期感染細胞からのＨＩＶ−Ｉ産生モデル、および（２）ＨＩＶ−１を接種したヒトＴ−リンパ球、すなわち急性ＨＩＶ−１感染モデルを使用してインビトロで検討した。そして、（１）γ−ＧＣＥは他のグルタチオンのプロドラッグや他の報告された抗酸化剤とは異なり、慢性ＨＩＶ−１感染に対して新規な二相性の抑止効果を示したこと；すなわち、ｉ）ＧＳＨもＧＳＨ前駆体も阻害効果を示さない２．５ｍＭ濃度までの高投与量では、γ−ＧＣＥは感染細胞に対して選択的な細胞変性効果によりＨＩＶ−１の産生を強力に阻害する一方、同じ濃度では非感染細胞の生存率や増殖には影響しなかった、ii）低濃度（２００−４００μＭ）では、γ−ＧＣＥは慢性的にＨＩＶ−１を発現している細胞のウイルス産生を、それらの生存率には影響せずに有意に抑止した、そしてiii）感染細胞と非感染細胞の間の毒性を発現する投与量の閾値の差は１０倍以上であること；ならびに（２）Ｔ−リンパ球の急性ＨＩＶ−１感染において使用された比較的に高いγ−ＧＣＥの投与量ではＨＩＶ−１の増殖を完全に阻止し、細胞をＨＩＶ−１により誘導される細胞死から救済し、かつ、かかる濃度のγ−ＧＣＥはＨＩＶ−１の感染性を４時間以内に直接的に阻止すること、をみいだした。この結果はγ−ＧＣＥが抗ＨＩＶ−１剤として優れた性質を持っていることを示している。いいかえると、γ−ＧＣＥは他の抗ＨＩＶ−１化学療法剤がこれまで達成できなかったＨＩＶ増殖の３つの重要な因子のすべてを遮断することが可能である。すなわち、ＨＩＶ自体を不活性化して急性感染を阻止し、感染細胞からのウイルス産生を抑制し、そしてＨＩＶ−１産生細胞を選択的に死滅させるのである。
したがって、本発明は上記知見に基づくもので式（Ｉ）
（式中のＲは炭素原子１−１０個の直鎖状、分岐状、もしくは環状の炭化水素基、または芳香族基で置換された炭素原子１−５個の直鎖状もしくは分岐状の炭化水素基である。）
で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、または式（Ｉ）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステルの２分子間の脱水素によって得られる酸化ダイマーを、ＨＩＶ感染を予防もしくは治療する効果のある投与量で、その必要のある哺乳動物へ投与することよりなる、新規のもしくは無症状の感染も含む、ＡＩＤＳのようなＨＩＶ感染の予防もしくは治療方法である。
【図面の簡単な説明】
以下の結果は二つの独立の実験の平均値である。
図１のパネルＡは、２．５ｍＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）、ＧＳＨ（三角形）およびＮＡＣ（矩形）が対象（白丸）と比較して、非感染ヒトＴ−リンパ細胞株Ｈ−９の増殖に悪影響を及ぼさないことを示している。
パネルＢは、８００μＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）が、慢性的に感染し、ＨＩＶ−１を高度に発現しているＨ−９／IIIＢ株（ＨＩＶ−１株のひとつであるＨＩＶ−１IIIBに感染したＨ−９株）の増殖を、対照（白丸）に比して劇的に阻害していることを示している。同時に、処置の１２日後に有意な細胞の増殖が観察されず、細胞の生存率は４０％以下に減少しており（データは示されていない）、γ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する強力な細胞変性作用を示している。
図２は、５ｍＭにおけるγ−ＧＣＥの非感染Ｈ−９細胞（Ａ）に対する生存率と増殖からみた細胞毒性が、４００μＭにおける感染しているＨ−９／IIIＢ細胞（Ｂ）に対する生存率と増殖について示されている値とほぼ等しく、感染細胞は非感染細胞に比べて約１２．５倍もγ−ＧＣＥに対して感受性であることを示しており、このことはγ−ＧＣＥのＨ９細胞のＨＩＶ−１産生細胞に対する選択毒性があることを意味する（矩形：γ−ＧＣＥ、菱形：対照）。
図３は、１．２５ｍＭ（Ａ）または２．５ｍＭ（Ｂ）のγ−ＧＣＥ（黒丸）がＨＩＶ−１産生性Ｈ−９細胞の生存率を選択的に減少させ、Ｈ−９／IIIＢ細胞からのＨＩＶ−１（ｐ２４抗原で代表される）の対数関数的な産生をほとんど完全に遮断していることを示している。一方、ＧＳＨ（三角形）もＮＡＣ（矩形）も活発なＨ−９／IIIＢ細胞のＨＩＶ−１産生を１．２５ｍＭ（Ａ）で抑圧することはできず；むしろそれらは２．５ｍＭ（Ｂ）においては対照（白丸）に比してウイルスの産生を増加させており、γ−ＧＣＥの新規な抗ＨＩＶ−１剤としての特徴を示している。
図４は、２００μＭ（黒矩形）または４００μＭ（黒丸）のγ−ＧＣＥが、Ｈ−９／IIIＢ細胞の活発なＨＩＶ−１産生（ｐ２４抗原で代表される）を、（実施例３で述べられたように）Ｈ−９／IIIＢ細胞の生存率と増殖に影響することなく顕著に阻害することを示す。これは、高い濃度でもウイルスの発現を変えられなかった図３でのＧＳＨやＮＡＣの結果とは明確な対照をなす。かくして、γ−ＧＣＥはＧＳＨプロドラッグとして、感染細胞にとって毒性のない低濃度でさえも、活発かつ継続的なＨＩＶ−１産生に対して効果があることを示した。
図５は、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）がＨＩＶ−１の増殖（ＨＩＶ−１のｐ２４抗原の全量によって代表される）を感染後２１日間完全に遮断したことを示し、一方４００−８００μＭのγ−ＧＣＥ（それぞれ黒三角および黒矩形）の存在では急性の感染は顕著には阻害されず（パネルＣ）；そして１．６ｍＭのγ−ＧＣＥを加えた細胞は活発に成長を続け、全実験過程を通じて高い生存率を保ったのに対し、大量のＨＩＶ−１産生性の対照細胞（白丸）の増殖については、細胞の増殖障害（パネルＡ）および細胞死（パネルＢ）を示した。
図６は、２．５ｍＭ（黒丸）および１．２５ｍＭ（三角形）のγ−ＧＣＥでの４時間の前処理により、直接的にＨＩＶ−１を完全不活化することができ、急性感染実験ではこれらの前処置されたウイルスでは急性の感染を起こさないことを示している。他方、ウイルスの６２５μＭのγ−ＧＣＥ（矩形）での前処理では、対照（白丸）に比して発症のいくらかの遅れを示したのみであった。
実施の形態
上記式（Ｉ）で、Ｒは炭素原子１−１０個の直鎖状、分岐状、もしくは環状の炭化水素基、または芳香族基で置換された炭素原子１−５個の直鎖状または分岐状の炭化水素基を表す。また、酸化ダイマーとは、２個の上記式（Ｉ）の同一分子が、脱水素化によってジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が形成されたダイマーをいう。
上記式（Ｉ）に示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物またはその酸化ダイマーは、例えばＷＯ８８／００１８２（米国特許４９２７８０８号）、特開昭６４−１９０５９号公報（特許第２５６９０６０号）および特開昭６４−２６５１６号公報（特公平８−５５３０９０号）に記載されている方法に従って製造される。
上記式（Ｉ）において、Ｒの特定の例はメチル基、エチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、イソプロピル基、２−メチル−２−プロペニル基、シクロヘキシル基、およびベンジル基を含む。上記式（Ｉ）で示された化合物は、特定のＲ基が結合しているすべてのγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物を含むが、典型的な化合物の例にはγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステルが含まれる。
上記式（Ｉ）のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物もしくはその酸化ダイマーを本発明の医薬品として使用する場合、これらの化合物はそれらの遊離形または薬理学的に許容される酸もしくは塩基付加塩の形で用いられる。塩の形式で使用する場合には、付加される酸もしくは塩基は無機または有機の化合物のいずれであってもよく、それらが塩として使用されたときに十分に有効で、無毒もしくは低毒性であればいかなる意味でも制限はない。
上記式（Ｉ）で表される化合物またはその酸化ダイマーは、経口的に、非経口的に、または呼吸器管を経由して、薬理学的に許容される担体、賦形剤、溶剤、希釈剤、着色剤、保存剤、中和剤、安定剤と混合した望ましい形態で、本発明に係る予防と治療のために投与される。
経口製剤は、錠剤、顆粒剤、粉剤、およびカプセルのような固形製剤、またはシロップ、エリキシル剤、乳剤および懸濁剤のような液体製剤のいずれでもよい。また、非経口製剤は、注射剤、座薬、または外用皮膚製剤でもよい。これらの製剤は、上記式（Ｉ）で表される化合物もしくはその酸化ダイマーに、薬理学的に受容される佐薬を添加して通常の方法で作成できる。さらに、これらの製剤は既知の方法によって、徐放性の製剤に形成することもできる。
経口投与のための固形製剤は、上記式（Ｉ）の化合物またはその酸化ダイマーをラクトース、澱粉、結晶セルロース、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、燐酸水素カルシウム、メタ珪酸マグネシウムアルミニウム、乳酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、およびカオリンのような賦形剤と混合して粉剤にしてもよく、必要ならばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、蔗糖、アルギン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのような崩壊剤を添加してから造粒して顆粒剤に形成される。
錠剤はこれらの粉剤や顆粒をそのまま、またはタルクやステアリン酸マグネシウムのような光沢剤を添加して成形する。さらに、上記の顆粒もしくは錠剤を腸溶性製剤を形成するためにメチルメタアクリレート共重合体またはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートのような基材で被覆することができ、または、徐放性製剤を形成するためにエチルセルロースまたは硬化油で被覆することができる。
カプセル剤は粉剤や顆粒を充填した硬カプセルや、上記一般式（Ｉ）の化合物またはその酸化ダイマーをグリセリン、ポリエチレングリコール、またはオリーブ油などに懸濁もしくは溶解し、ゼラチンフィルムで被覆することにより製造することもできる。
経口投与用の液剤は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーを、グリセリンやソルビトールのような甘味剤とともに水に溶解したシロップとしてもよく、エタノールもしくは精油を加えたエリキシールとしても、あるいはポリソーブ８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、またはアラビアゴム等を添加して乳化剤または懸濁剤として製造してもよい。
注射剤は皮下、筋肉内、静脈内もしくは動脈内の一回投与量用の、または長期もしくは短期の継続注入用製剤として、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーを注射剤用の蒸留水で、燐酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸、乳酸、または乳酸ナトリウムのようなｐＨ調節剤、グルコースや食塩のような等張剤、あるいは重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、もしくはエチレンジアミン四酢酸ナトリウムのようなＳＨ基安定化剤とともに溶解し、無菌ろ過の後に、アンプルもしくはポリエチレンまたはガラスの容器に充填して製造される。さらに、使用時に調製するタイプの注射剤は、デキストリン、サイクロデキストリン、マンニトール、ゼラチン等の添加に引き続いて真空中で凍結乾燥することによって製造することができる。加うるに、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーは、既知の方法によってリポソームまたは微小球に収容された注射用剤としてもよい。
座薬は上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーをポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸のモノ、ジ、もしくはトリグリセリド、またはカカオバターと加熱溶融し、可塑化のために冷却するか、大豆油、ポリエチレングリコールその他に懸濁または溶解した後に、ゼラチンなどで被覆して製造することができる。
外用皮膚製剤は上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーをポリエチレングリコール、白ワセリン、または液状パラフィン等に添加して製造され、軟膏、クリーム剤、またはゲル状に製剤される。
呼吸管を経由して投与される製剤は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーの微細な顆粒を、通常の吸入方法によって投与される。この医薬品を有効成分とする微細な粒子は、粒径が０．５−５０μｍのエアロゾルまたは粉剤とすることが望ましい。エアロゾルを製造する装置の例としては、超音波およびジェット噴霧タイプのネブライザーや低級アルカンまたはフッ化アルカンを推進剤として使用する噴霧器がある。さらに、粉剤は自然吸入の、または強制的な吸入による簡単な吸入器で投与される。
上記式（Ｉ）で示される化合物もしくはその酸化ダイマーの本医薬品製剤における濃度には格別な制限はないが、一般には０．１−７０重量％、好ましくは０．１−５０重量％が製剤の濃度として好適である。さらに、その投与量にも制限はないが、０．０１−５ｇ／日／患者、好ましくは０．１−２．５ｇ／日／患者が好適である。連続的な注入を除いては、投与回数は通常１日当たり１−４回である。
実施例
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例１ γ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する選択的毒性
非感染ヒトＴ−リンパ細胞株Ｈ−９、またはＨＩＶ−１株であるＨＩＶ−１IIIBに感染したＨ−９細胞（Ｈ−９／IIIＢ）（Science 1984; 224:497-500）を２４もしくは９６ウェルの組織培養プレートに２−２．５×１０5／ｍｌの密度で播き込み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中で、各濃度のγ−ＧＣＥ、ＧＳＨ、またはＮＡＣの存在下または非存在下で培養した。
２−３日毎に、５０−８０％の細胞培養上清を除去し、同一濃度の被験化合物を含む同量の新鮮な培地を加えて培養を続けた。同一時点で、相対的な細胞増殖能を計算するために、トリパンブルー色素排除試験により生存細胞を計数した。同時に、全細胞数に対する生存細胞数の百分率として細胞の生存率を調べた。
最初に、γ−ＧＣＥの非感染Ｈ−９細胞の生存率と増殖への影響を、ＧＳＨやＮＡＣと比較して評価した。２．５ｍＭ濃度で、γ−ＧＣＥは細胞の生存率と増殖に悪影響を及ぼさなかった（図１Ａ）。これらの結果はＧＳＨまたはＮＡＣの結果と全く同様である。６日間の培養を通じて、いずれの場合でも生細胞は最低値が９１．７５±０．４５％（ＮＡＣ処理細胞；４日目）で９０％未満には低下せず、γ−ＧＣＥの非感染Ｔ−リンパ細胞に対する低毒性を示している。
次に、慢性的に感染し、高度にＨＩＶ−１を産生している細胞株、Ｈ−９／IIIＢを用いて上記と同様な実験を行った。驚くべきことに、非感染のＨ−９細胞とは対照的に、Ｈ−９／IIIＢ細胞はγ−ＧＣＥの細胞毒性効果に顕著に高い感受性を示した。図１Ｂに示したように、８００μＭという低い濃度のγ−ＧＣＥにより、細胞の増殖は劇的に阻害された。６日目には、細胞増殖は対照の４０％未満のレベルに減少した。結局、処置の１２日後には、有意な細胞増殖は観察されなかった。同様に、細胞生存率は９日後には４０％未満に低下した（データは示されていない）。このことはγ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する相対的に高い細胞毒性を示している。
γ−ＧＣＥのＨ−９およびＨ−９／IIIＢ細胞に対する細胞毒性を比較するため、各細胞株に対して等価な細胞毒性を示す二つの投与量を決定すべく、各濃度のγ−ＧＣＥについて検討した。５ｍＭのγ−ＧＣＥのＨ−９細胞に対する細胞毒性が、Ｈ−９／IIIＢ細胞に対して４００μＭで示された値とほぼ等価であることが観察された（図２）。γ−ＧＣＥ処理の６日後には、両細胞株とも相対的な細胞増殖能がいくらか低下し、生存率もわずかに低下した。結局、Ｈ−９／IIIＢ細胞はγ−ＧＣＥに対し、非感染細胞に比して約１２．５倍感受性であることが示された。このことはγ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する選択的な毒性を示している。
以上の結果を総合すると、８００μＭから２．５ｍＭの濃度のγ−ＧＣＥは、一方では非感染のＨ−９細胞には影響しないのに、Ｈ−９／IIIＢ細胞の生存率を変更できることが示された。
実施例２ ＨＩＶ−１産生Ｈ−９細胞の増殖と生存能を選択的に阻害する濃度でのγ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１の強力な産生阻害
実施例１でのγ−ＧＣＥの特異的な細胞毒性作用の発見に引き続き、かかるＨＩＶ−１の産生を抑制する選択的な毒性の有効性を評価した。
Ｈ−９／IIIＢ細胞を十分にリン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中に、１．２５または２．５ｍＭのγ−ＧＣＥ、ＧＳＨ、またはＮＡＣの存在下もしくは非存在下で、１×１０5／ｍｌの密度で再懸濁した。Ｈ−９／IIIＢ細胞は常に大量のウイルス粒子を産生しているので、これらの実験を実施するのにＴＮＦ−αやＰＭＡのような因子による刺激は必要でなかった。２日および４日後に培養上清を取り出し、遠心して細胞や破片を除き、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の定量によって評価した。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の測定は敏感な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（デュポン）を使用して実施された。
ＧＳＨもＮＡＣも激しいＨ−９／IIIＢのＨＩＶ−１産生を抑制できなかった。むしろ２．５ｍＭでは、それらはウイルスの産生を増加した。このことは以前の報告と一致する（AIDS 1997;ll: 33-41）。しかしながら、１．２５または２．５ｍＭのγ−ＧＣＥは、明らかにその細胞毒性作用により、Ｈ−９／IIIＢ細胞からのＨＩＶ−１の対数関数的な産生をほとんど完全に阻止した（図３）。これらのデータはγ−ＧＣＥの抗ＨＩＶ−１剤としての新規な特性を示す。
実施例３ ＨＩＶ−１産生Ｈ−９細胞の生存率に作用しない投与量でのγ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１産生の有意な抑制
γ−ＧＣＥは潜在的な抗酸化剤であるので、γ−ＧＣＥの非毒性範囲内でのＨＩＶ−１のＬＴＲに指令された転写の阻害は、同様に予想されていた。しかしながら、このような一定の高いレトロウイルスの産生を、このようなタイプの化合物が阻害するのは困難であろうとも予想されていた。
Ｈ−９／IIIＢ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中に、０．２または０．４ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下もしくは非存在下で、２×１０5／ｍｌの密度で播き込んだ。実験開始３日および６日後に培養上清の試料を採取し、上述のように分析した。３日目には各細胞懸濁液の７２％を取り除き、対応するＧＳＨのプロドラッグとともに新鮮な培地を加えた。６日目のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の全産生量は、６日目の生データに３日目の分の希釈倍率をかけて求めた。
低濃度のγ−ＧＣＥで処理したＨ−９／IIIＢ細胞については、図４に示されている。予想されたように、γ−ＧＣＥは低濃度（２００μＭおよび４００μＭ）でＨ−９／IIIＢ細胞による激しいＨＩＶ−１の産生を顕著に阻害した。一方、高濃度のＧＳＨやＮＡＣでもウイルスの発現は変化しなかった（図３）。細胞の生存率は、かかるγ−ＧＣＥ処置によっても、いずれの投与量でも有意な影響はない（＞８６％）。４００μＭにおいてのみ（図２Ｂにおいて示されているように）細胞増殖の遅延が観察されたが、２００μＭでは見られなかった（データは示されていない）。これらの結果は、活発かつ継続的なＨＩＶ−１の産生に対するＧＳＨプロドラッグとしてのγ−ＧＣＥの有効性を低濃度においても示すものである。
実施例４ 急性ＨＩＶ−１感染のγ−ＧＣＥによる阻害
もし、γ−ＧＣＥがＨＩＶ−１産生細胞を有効に除去するのであれば、急性の感染時にＨＩＶ−１が細胞の全集団に拡散するのを予防することが予測される。この仮説を実証すべく、急性感染試験が実施された。
これらの実験のために、Ｈ−９／IIIＢ分離株を使う代わりに、特定のウイルスの附属遺伝子とその翻訳産物を欠いており、そのあるものは感染の初期相を変化させることがわかっている、ＨＩＶ−１のＮＬ４−３株（J. Virol. 1986; 59: 284-291）を用意した。
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３株のウイルスの保存株を調製し、以前に記述されたようにタイターを測定した（Hum Gene Ther 1995; 6: 1561-1571）。Ｈ−９細胞（３×１０5細胞）を、各種の濃度のγ−ＧＣＥとともに、またはそれを加えずに、１ｍｌの増殖培地中に懸濁し、２４ウェルの組織培養プレートのチャンバーに播き込んだ。３０ｐｇのＨＩＶ−１ｐ２４抗原を含むウイルス懸濁液を、最初の感染のために各チャンバーに添加した。感染は３７℃で一夜実施され、その後細胞はＰＢＳで一回、さらに増殖培地で一回洗浄された。最後の洗浄の上清は、０日の時点のものとして保存された。洗浄された細胞は、対応する培地に再懸濁され、３７℃でさらに培養を続けた。３日目に一回、細胞計数とＨＩＶ−１ｐ２４抗原定量のために、細胞懸濁液および培養上清が採取された。細胞増殖、生存率、およびウイルス産生の測定は、すでに述べたように実施した。採取の日には、各ウェルに２００μｌの細胞懸濁液が残され、細胞増殖を支持するために、対応する濃度のγ−ＧＣＥを含む８００μｌの新鮮な培地が添加された。ただし、１８日目には細胞懸濁液４００μｌが残され、６００μｌの培地が各ウェルに添加された。したがって、各時点の細胞数は、細胞の継代数を考慮し、集積された希釈倍率に基づいて定量された。
γ−ＧＣＥがない場合には、Ｈ−９細胞に感染後１２−１５日に、ウイルス産生の噴出の引き金がひかれる。一方、４００−８００μＭのγ−ＧＣＥの存在下では、急性の感染は顕著には阻害されなかったが、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥの場合には、感染後２１日間にわたり完全にＨＩＶ−１の増殖を阻止した（図５、パネルＣ）。全実験を通じ、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下の細胞は活発に増殖を続け、高い生存率を保った。一方、大量のＨＩＶ−１を産生している対照の細胞の増殖については、増殖阻害（図５、パネルＡ）、および細胞死が認められた（図５、パネルＢ）。１５日まで、およびその後においても、活発なＨＩＶ−１産生をともなうすべての対照細胞培養では合胞体形成が顕著であった。１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下では、培養中に顕著な合胞体形成は観察されなかった（データは示していない）。
実施例５ γ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１の直接不活性化
これらの急性ＨＩＶ−１感染試験の結果はもう一つの可能性を高めた。すなわち、γ−ＧＣＥは感染過程の前段階または感染過程で、ＨＩＶ−１の感染性を不活性化するかもしれないということである。かかるγ−ＧＣＥの不感染化効果の検討のために、我々はもう一つの系統の実験を計画し、実施した。
６ｎｇのＨＩＶ−１ｐ２４抗原を含むＨＩＶ−１ウイルスの保存株（ＮＬ４−３）を、γ−ＧＣＥの存在下もしくは非存在下で、２０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で４時間、３７℃で前処理した。その後、前処理したそれぞれのウイルス懸濁液を１０ｍｌ用い、γ−ＧＣＥのない１ｍｌの細胞懸濁液で、前述したのと同様な方法で、Ｈ９細胞の急性感染を行った。全過程を通じてγ−ＧＣＥを添加することなしに、前述したのと同様な手順に従い、培養細胞のサンプリングと維持も行った。
驚くべきことに、１．２５ｍＭまたは２．５ｍＭでの４時間のγ−ＧＣＥ処理により、ＨＩＶ−１の感染性は喪失し、感染後１５日においてもウイルス産生を起こさなかった。最低の濃度（６２５μＭ）でさえも、γ−ＧＣＥはＨ−９細胞でのＨＩＶ−１増殖をある程度遅延させた。しかしながら、同一濃度でのγ−ＧＣＥによる１時間の前処理では、顕著なウイルス感染性に対する阻害を示さなかった（データは示していない）。これらのデータはＨＩＶ−１粒子に対するγ−ＧＣＥの直接的な不活性化効果を示し、おそらくはそれが急性のＨＩＶ−１感染実験において観察された阻害効果に関わっているのであろう。
本発明は、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）感染の予防または治療の必要のある哺乳動物に、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、またはその同一分子２個を脱水素することにより得られる酸化ダイマーの有効量を投与することよりなる、ＨＩＶ感染の予防または治療の方法に関する。
背景技術
１型ヒト免疫不全症ウィルス（ＨＩＶ−１）に対するグルタチオン（ＧＳＨ）およびその前駆体を含む抗酸化剤の潜在的な阻害効果については、ここ数年間研究されてきた。初期の研究では、Ｄ−ペニシルアミン、２，３−ジメルカプト−１−プロパノールやＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）のような還元剤は、ＨＩＶ−１の末端の繰り返し配列（ＬＴＲ）に支配されるウイルスの遺伝子転写を阻害することが見いだされている（FEBS Letters 1988; 236: 282-286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919-927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884-4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990）。これらの初期の基礎的な研究に対応するように、ＨＩＶに感染した個体の血漿、末梢血球、および肺上皮内層液のＧＳＨレベルの減少が報告されている（Biol Chem Hoppe-Seyler 1989; 370: 101-108, AIDS Res Human Retrovituses 1992; 2: 305-311, Lancet 1989; II: 1294-1298）。ＧＳＨは細胞内の主要な抗酸化剤としてばかりでなく、免疫システムの調節剤としても知られている（J Immunol 1985; 135: 2740-2747）。こうしたことから、ＨＩＶに感染した個体のＧＳＨ欠乏をグルタチオン前駆体で変化させることは、ＨＩＶの生体内増殖を阻害する合理的な治療戦略の仮説のひとつであった（AIDS Res Human Retroviruses 1992; 8: 209-215, Blood 1995; 86: 258-267, Blood 1996; 87: 4746-4753）。このようなことから、さらに、ＮＡＣのようなＧＳＨのプロドラッグのＨＩＶ−Ｉに対する阻害効果が調べられている。これらの化合物は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）またはフォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）によって潜伏しているプロウイルスから誘導されるＨＩＶ−１遺伝子の転写を阻害できることが示されている。これは、細胞の潜伏期にあるＨＩＶ−１感染のモデルである（Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990, Cell 1990; 61: 127H276）。注意すべきこととして、最近、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＮＡＣによるＨＩＶ−１増殖亢進が報告されている（AIDS 1997; 11: 33-41）。
最近の研究によれば、ＨＩＶ−１の複製がリンパ性網内組織内で継続的に活性であることが示された（Nature 1993; 362: 355-358, Nature 1993; 312: 359-362）。したがって、いわゆる後期の感染細胞からの大量のウイルス生産と、それに引き続くさらなる感染の繰り返しを遮断することなしに、潜伏しているＨＩＶ−Ｉプロウイルスを非複製状態に保つのみではＨＩＶ−１感染を有意に変化させることは困難であろう。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の進行を減速させるには、後期の感染細胞の除去が最も重要であろうと示唆されていた（Science 1996; 272: 1962）。しかしながら、多数の抗ＨＩＶ−Ｉ化学療法剤の候補が記述されてはきたが、未だにＨＩＶ−Ｉそれ自身およびＨＩＶ−１感染細胞の選択的な除去を示す化合物はなかった。同様に、多種の抗酸化剤の抗ＨＩＶ−１効果を記述する各種の報告があったが（FEBS Letters 1988; 236: 282-286, AIDS Res Human Retroviruses 1990; 7: 919-927, Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 4884-4888, Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 986-990）、急性のＨＩＶ−１感染を阻止すると報告された化合物はなかった。
式（Ｉ）、
で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、または式（Ｉ）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステルの２分子間の脱水素によって得られる酸化ダイマーは、抗酸化剤として直接的に、または唯一のＧＳＨプロドラッグとして作用し、それによって活性酸素やフリーラジカルによる障害によって引き起こされる肝障害、白内障、腎障害、心や肝の再灌流障害、不整脈、ならびに喘息のような肺障害の予防または治療作用を示すことが知られている（WO 88/00182（米国特許No. 4,927,808）およびWO 92/18420（米国特許No. 5,631,234））。特に、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（γ−ＧＣＥ）は白内障（Ophthalmic Res 1991; 23: 51-58）、肝障害（Res Com Chem Pathol Pharmacol 1993; 82: 49-64）、心や肝の再灌流障害（Brit J Pharmacol 1991; 104: 805-810, J Am Coll Cardiol 1994; 24: 1391-1397, Circulation Res 1994; 74: 806-816, Transplantation 1992; 54: 414-418）ならびに喘息（Am Rev Respir Dis 1992; 145: 561-565）に対して有効であると報告されてきた。しかしながら、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物のＨＩＶ感染に対する効果については報告されていない。
発明の開示
本発明の発明者らは、上記のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物を代表するγ−ＧＣＥの抗ＨＩＶ−Ｉ効果を、（１）活発にＨＩＶ−Ｉを産生しているヒトＴ−リンパ球株、すなわち慢性ＨＩＶ感染における後期感染細胞からのＨＩＶ−Ｉ産生モデル、および（２）ＨＩＶ−１を接種したヒトＴ−リンパ球、すなわち急性ＨＩＶ−１感染モデルを使用してインビトロで検討した。そして、（１）γ−ＧＣＥは他のグルタチオンのプロドラッグや他の報告された抗酸化剤とは異なり、慢性ＨＩＶ−１感染に対して新規な二相性の抑止効果を示したこと；すなわち、ｉ）ＧＳＨもＧＳＨ前駆体も阻害効果を示さない２．５ｍＭ濃度までの高投与量では、γ−ＧＣＥは感染細胞に対して選択的な細胞変性効果によりＨＩＶ−１の産生を強力に阻害する一方、同じ濃度では非感染細胞の生存率や増殖には影響しなかった、ii）低濃度（２００−４００μＭ）では、γ−ＧＣＥは慢性的にＨＩＶ−１を発現している細胞のウイルス産生を、それらの生存率には影響せずに有意に抑止した、そしてiii）感染細胞と非感染細胞の間の毒性を発現する投与量の閾値の差は１０倍以上であること；ならびに（２）Ｔ−リンパ球の急性ＨＩＶ−１感染において使用された比較的に高いγ−ＧＣＥの投与量ではＨＩＶ−１の増殖を完全に阻止し、細胞をＨＩＶ−１により誘導される細胞死から救済し、かつ、かかる濃度のγ−ＧＣＥはＨＩＶ−１の感染性を４時間以内に直接的に阻止すること、をみいだした。この結果はγ−ＧＣＥが抗ＨＩＶ−１剤として優れた性質を持っていることを示している。いいかえると、γ−ＧＣＥは他の抗ＨＩＶ−１化学療法剤がこれまで達成できなかったＨＩＶ増殖の３つの重要な因子のすべてを遮断することが可能である。すなわち、ＨＩＶ自体を不活性化して急性感染を阻止し、感染細胞からのウイルス産生を抑制し、そしてＨＩＶ−１産生細胞を選択的に死滅させるのである。
したがって、本発明は上記知見に基づくもので式（Ｉ）
で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物、または式（Ｉ）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステルの２分子間の脱水素によって得られる酸化ダイマーを、ＨＩＶ感染を予防もしくは治療する効果のある投与量で、その必要のある哺乳動物へ投与することよりなる、新規のもしくは無症状の感染も含む、ＡＩＤＳのようなＨＩＶ感染の予防もしくは治療方法である。
【図面の簡単な説明】
以下の結果は二つの独立の実験の平均値である。
図１のパネルＡは、２．５ｍＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）、ＧＳＨ（三角形）およびＮＡＣ（矩形）が対象（白丸）と比較して、非感染ヒトＴ−リンパ細胞株Ｈ−９の増殖に悪影響を及ぼさないことを示している。
パネルＢは、８００μＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）が、慢性的に感染し、ＨＩＶ−１を高度に発現しているＨ−９／IIIＢ株（ＨＩＶ−１株のひとつであるＨＩＶ−１IIIBに感染したＨ−９株）の増殖を、対照（白丸）に比して劇的に阻害していることを示している。同時に、処置の１２日後に有意な細胞の増殖が観察されず、細胞の生存率は４０％以下に減少しており（データは示されていない）、γ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する強力な細胞変性作用を示している。
図２は、５ｍＭにおけるγ−ＧＣＥの非感染Ｈ−９細胞（Ａ）に対する生存率と増殖からみた細胞毒性が、４００μＭにおける感染しているＨ−９／IIIＢ細胞（Ｂ）に対する生存率と増殖について示されている値とほぼ等しく、感染細胞は非感染細胞に比べて約１２．５倍もγ−ＧＣＥに対して感受性であることを示しており、このことはγ−ＧＣＥのＨ９細胞のＨＩＶ−１産生細胞に対する選択毒性があることを意味する（矩形：γ−ＧＣＥ、菱形：対照）。
図３は、１．２５ｍＭ（Ａ）または２．５ｍＭ（Ｂ）のγ−ＧＣＥ（黒丸）がＨＩＶ−１産生性Ｈ−９細胞の生存率を選択的に減少させ、Ｈ−９／IIIＢ細胞からのＨＩＶ−１（ｐ２４抗原で代表される）の対数関数的な産生をほとんど完全に遮断していることを示している。一方、ＧＳＨ（三角形）もＮＡＣ（矩形）も活発なＨ−９／IIIＢ細胞のＨＩＶ−１産生を１．２５ｍＭ（Ａ）で抑圧することはできず；むしろそれらは２．５ｍＭ（Ｂ）においては対照（白丸）に比してウイルスの産生を増加させており、γ−ＧＣＥの新規な抗ＨＩＶ−１剤としての特徴を示している。
図４は、２００μＭ（黒矩形）または４００μＭ（黒丸）のγ−ＧＣＥが、Ｈ−９／IIIＢ細胞の活発なＨＩＶ−１産生（ｐ２４抗原で代表される）を、（実施例３で述べられたように）Ｈ−９／IIIＢ細胞の生存率と増殖に影響することなく顕著に阻害することを示す。これは、高い濃度でもウイルスの発現を変えられなかった図３でのＧＳＨやＮＡＣの結果とは明確な対照をなす。かくして、γ−ＧＣＥはＧＳＨプロドラッグとして、感染細胞にとって毒性のない低濃度でさえも、活発かつ継続的なＨＩＶ−１産生に対して効果があることを示した。
図５は、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ（黒丸）がＨＩＶ−１の増殖（ＨＩＶ−１のｐ２４抗原の全量によって代表される）を感染後２１日間完全に遮断したことを示し、一方４００−８００μＭのγ−ＧＣＥ（それぞれ黒三角および黒矩形）の存在では急性の感染は顕著には阻害されず（パネルＣ）；そして１．６ｍＭのγ−ＧＣＥを加えた細胞は活発に成長を続け、全実験過程を通じて高い生存率を保ったのに対し、大量のＨＩＶ−１産生性の対照細胞（白丸）の増殖については、細胞の増殖障害（パネルＡ）および細胞死（パネルＢ）を示した。
図６は、２．５ｍＭ（黒丸）および１．２５ｍＭ（三角形）のγ−ＧＣＥでの４時間の前処理により、直接的にＨＩＶ−１を完全不活化することができ、急性感染実験ではこれらの前処置されたウイルスでは急性の感染を起こさないことを示している。他方、ウイルスの６２５μＭのγ−ＧＣＥ（矩形）での前処理では、対照（白丸）に比して発症のいくらかの遅れを示したのみであった。
実施の形態
上記式（Ｉ）で、Ｒは炭素原子１−１０個の直鎖状、分岐状、もしくは環状の炭化水素基、または芳香族基で置換された炭素原子１−５個の直鎖状または分岐状の炭化水素基を表す。また、酸化ダイマーとは、２個の上記式（Ｉ）の同一分子が、脱水素化によってジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）が形成されたダイマーをいう。
上記式（Ｉ）に示されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物またはその酸化ダイマーは、例えばＷＯ８８／００１８２（米国特許４９２７８０８号）、特開昭６４−１９０５９号公報（特許第２５６９０６０号）および特開昭６４−２６５１６号公報（特公平８−５５３０９０号）に記載されている方法に従って製造される。
上記式（Ｉ）において、Ｒの特定の例はメチル基、エチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、イソプロピル基、２−メチル−２−プロペニル基、シクロヘキシル基、およびベンジル基を含む。上記式（Ｉ）で示された化合物は、特定のＲ基が結合しているすべてのγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物を含むが、典型的な化合物の例にはγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステルが含まれる。
上記式（Ｉ）のγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物もしくはその酸化ダイマーを本発明の医薬品として使用する場合、これらの化合物はそれらの遊離形または薬理学的に許容される酸もしくは塩基付加塩の形で用いられる。塩の形式で使用する場合には、付加される酸もしくは塩基は無機または有機の化合物のいずれであってもよく、それらが塩として使用されたときに十分に有効で、無毒もしくは低毒性であればいかなる意味でも制限はない。
上記式（Ｉ）で表される化合物またはその酸化ダイマーは、経口的に、非経口的に、または呼吸器管を経由して、薬理学的に許容される担体、賦形剤、溶剤、希釈剤、着色剤、保存剤、中和剤、安定剤と混合した望ましい形態で、本発明に係る予防と治療のために投与される。
経口製剤は、錠剤、顆粒剤、粉剤、およびカプセルのような固形製剤、またはシロップ、エリキシル剤、乳剤および懸濁剤のような液体製剤のいずれでもよい。また、非経口製剤は、注射剤、座薬、または外用皮膚製剤でもよい。これらの製剤は、上記式（Ｉ）で表される化合物もしくはその酸化ダイマーに、薬理学的に受容される佐薬を添加して通常の方法で作成できる。さらに、これらの製剤は既知の方法によって、徐放性の製剤に形成することもできる。
経口投与のための固形製剤は、上記式（Ｉ）の化合物またはその酸化ダイマーをラクトース、澱粉、結晶セルロース、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、燐酸水素カルシウム、メタ珪酸マグネシウムアルミニウム、乳酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、およびカオリンのような賦形剤と混合して粉剤にしてもよく、必要ならばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、蔗糖、アルギン酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムのような崩壊剤を添加してから造粒して顆粒剤に形成される。
錠剤はこれらの粉剤や顆粒をそのまま、またはタルクやステアリン酸マグネシウムのような光沢剤を添加して成形する。さらに、上記の顆粒もしくは錠剤を腸溶性製剤を形成するためにメチルメタアクリレート共重合体またはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートのような基材で被覆することができ、または、徐放性製剤を形成するためにエチルセルロースまたは硬化油で被覆することができる。
カプセル剤は粉剤や顆粒を充填した硬カプセルや、上記一般式（Ｉ）の化合物またはその酸化ダイマーをグリセリン、ポリエチレングリコール、またはオリーブ油などに懸濁もしくは溶解し、ゼラチンフィルムで被覆することにより製造することもできる。
経口投与用の液剤は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーを、グリセリンやソルビトールのような甘味剤とともに水に溶解したシロップとしてもよく、エタノールもしくは精油を加えたエリキシールとしても、あるいはポリソーブ８０、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、またはアラビアゴム等を添加して乳化剤または懸濁剤として製造してもよい。
注射剤は皮下、筋肉内、静脈内もしくは動脈内の一回投与量用の、または長期もしくは短期の継続注入用製剤として、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーを注射剤用の蒸留水で、燐酸水素ナトリウム、燐酸二水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩酸、乳酸、または乳酸ナトリウムのようなｐＨ調節剤、グルコースや食塩のような等張剤、あるいは重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、もしくはエチレンジアミン四酢酸ナトリウムのようなＳＨ基安定化剤とともに溶解し、無菌ろ過の後に、アンプルもしくはポリエチレンまたはガラスの容器に充填して製造される。さらに、使用時に調製するタイプの注射剤は、デキストリン、サイクロデキストリン、マンニトール、ゼラチン等の添加に引き続いて真空中で凍結乾燥することによって製造することができる。加うるに、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーは、既知の方法によってリポソームまたは微小球に収容された注射用剤としてもよい。
座薬は上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーをポリエチレングリコール、ラノリン、脂肪酸のモノ、ジ、もしくはトリグリセリド、またはカカオバターと加熱溶融し、可塑化のために冷却するか、大豆油、ポリエチレングリコールその他に懸濁または溶解した後に、ゼラチンなどで被覆して製造することができる。
外用皮膚製剤は上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーをポリエチレングリコール、白ワセリン、または液状パラフィン等に添加して製造され、軟膏、クリーム剤、またはゲル状に製剤される。
呼吸管を経由して投与される製剤は、上記式（Ｉ）の化合物もしくはその酸化ダイマーの微細な顆粒を、通常の吸入方法によって投与される。この医薬品を有効成分とする微細な粒子は、粒径が０．５−５０μｍのエアロゾルまたは粉剤とすることが望ましい。エアロゾルを製造する装置の例としては、超音波およびジェット噴霧タイプのネブライザーや低級アルカンまたはフッ化アルカンを推進剤として使用する噴霧器がある。さらに、粉剤は自然吸入の、または強制的な吸入による簡単な吸入器で投与される。
上記式（Ｉ）で示される化合物もしくはその酸化ダイマーの本医薬品製剤における濃度には格別な制限はないが、一般には０．１−７０重量％、好ましくは０．１−５０重量％が製剤の濃度として好適である。さらに、その投与量にも制限はないが、０．０１−５ｇ／日／患者、好ましくは０．１−２．５ｇ／日／患者が好適である。連続的な注入を除いては、投与回数は通常１日当たり１−４回である。
実施例
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例１ γ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する選択的毒性
非感染ヒトＴ−リンパ細胞株Ｈ−９、またはＨＩＶ−１株であるＨＩＶ−１IIIBに感染したＨ−９細胞（Ｈ−９／IIIＢ）（Science 1984; 224:497-500）を２４もしくは９６ウェルの組織培養プレートに２−２．５×１０5／ｍｌの密度で播き込み、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０組織培養培地中で、各濃度のγ−ＧＣＥ、ＧＳＨ、またはＮＡＣの存在下または非存在下で培養した。
２−３日毎に、５０−８０％の細胞培養上清を除去し、同一濃度の被験化合物を含む同量の新鮮な培地を加えて培養を続けた。同一時点で、相対的な細胞増殖能を計算するために、トリパンブルー色素排除試験により生存細胞を計数した。同時に、全細胞数に対する生存細胞数の百分率として細胞の生存率を調べた。
最初に、γ−ＧＣＥの非感染Ｈ−９細胞の生存率と増殖への影響を、ＧＳＨやＮＡＣと比較して評価した。２．５ｍＭ濃度で、γ−ＧＣＥは細胞の生存率と増殖に悪影響を及ぼさなかった（図１Ａ）。これらの結果はＧＳＨまたはＮＡＣの結果と全く同様である。６日間の培養を通じて、いずれの場合でも生細胞は最低値が９１．７５±０．４５％（ＮＡＣ処理細胞；４日目）で９０％未満には低下せず、γ−ＧＣＥの非感染Ｔ−リンパ細胞に対する低毒性を示している。
次に、慢性的に感染し、高度にＨＩＶ−１を産生している細胞株、Ｈ−９／IIIＢを用いて上記と同様な実験を行った。驚くべきことに、非感染のＨ−９細胞とは対照的に、Ｈ−９／IIIＢ細胞はγ−ＧＣＥの細胞毒性効果に顕著に高い感受性を示した。図１Ｂに示したように、８００μＭという低い濃度のγ−ＧＣＥにより、細胞の増殖は劇的に阻害された。６日目には、細胞増殖は対照の４０％未満のレベルに減少した。結局、処置の１２日後には、有意な細胞増殖は観察されなかった。同様に、細胞生存率は９日後には４０％未満に低下した（データは示されていない）。このことはγ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する相対的に高い細胞毒性を示している。
γ−ＧＣＥのＨ−９およびＨ−９／IIIＢ細胞に対する細胞毒性を比較するため、各細胞株に対して等価な細胞毒性を示す二つの投与量を決定すべく、各濃度のγ−ＧＣＥについて検討した。５ｍＭのγ−ＧＣＥのＨ−９細胞に対する細胞毒性が、Ｈ−９／IIIＢ細胞に対して４００μＭで示された値とほぼ等価であることが観察された（図２）。γ−ＧＣＥ処理の６日後には、両細胞株とも相対的な細胞増殖能がいくらか低下し、生存率もわずかに低下した。結局、Ｈ−９／IIIＢ細胞はγ−ＧＣＥに対し、非感染細胞に比して約１２．５倍感受性であることが示された。このことはγ−ＧＣＥのＨＩＶ−１産生細胞に対する選択的な毒性を示している。
以上の結果を総合すると、８００μＭから２．５ｍＭの濃度のγ−ＧＣＥは、一方では非感染のＨ−９細胞には影響しないのに、Ｈ−９／IIIＢ細胞の生存率を変更できることが示された。
実施例２ ＨＩＶ−１産生Ｈ−９細胞の増殖と生存能を選択的に阻害する濃度でのγ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１の強力な産生阻害
実施例１でのγ−ＧＣＥの特異的な細胞毒性作用の発見に引き続き、かかるＨＩＶ−１の産生を抑制する選択的な毒性の有効性を評価した。
Ｈ−９／IIIＢ細胞を十分にリン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中に、１．２５または２．５ｍＭのγ−ＧＣＥ、ＧＳＨ、またはＮＡＣの存在下もしくは非存在下で、１×１０5／ｍｌの密度で再懸濁した。Ｈ−９／IIIＢ細胞は常に大量のウイルス粒子を産生しているので、これらの実験を実施するのにＴＮＦ−αやＰＭＡのような因子による刺激は必要でなかった。２日および４日後に培養上清を取り出し、遠心して細胞や破片を除き、ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の定量によって評価した。ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の測定は敏感な酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）（デュポン）を使用して実施された。
ＧＳＨもＮＡＣも激しいＨ−９／IIIＢのＨＩＶ−１産生を抑制できなかった。むしろ２．５ｍＭでは、それらはウイルスの産生を増加した。このことは以前の報告と一致する（AIDS 1997;ll: 33-41）。しかしながら、１．２５または２．５ｍＭのγ−ＧＣＥは、明らかにその細胞毒性作用により、Ｈ−９／IIIＢ細胞からのＨＩＶ−１の対数関数的な産生をほとんど完全に阻止した（図３）。これらのデータはγ−ＧＣＥの抗ＨＩＶ−１剤としての新規な特性を示す。
実施例３ ＨＩＶ−１産生Ｈ−９細胞の生存率に作用しない投与量でのγ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１産生の有意な抑制
γ−ＧＣＥは潜在的な抗酸化剤であるので、γ−ＧＣＥの非毒性範囲内でのＨＩＶ−１のＬＴＲに指令された転写の阻害は、同様に予想されていた。しかしながら、このような一定の高いレトロウイルスの産生を、このようなタイプの化合物が阻害するのは困難であろうとも予想されていた。
Ｈ−９／IIIＢ細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中に、０．２または０．４ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下もしくは非存在下で、２×１０5／ｍｌの密度で播き込んだ。実験開始３日および６日後に培養上清の試料を採取し、上述のように分析した。３日目には各細胞懸濁液の７２％を取り除き、対応するＧＳＨのプロドラッグとともに新鮮な培地を加えた。６日目のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の全産生量は、６日目の生データに３日目の分の希釈倍率をかけて求めた。
低濃度のγ−ＧＣＥで処理したＨ−９／IIIＢ細胞については、図４に示されている。予想されたように、γ−ＧＣＥは低濃度（２００μＭおよび４００μＭ）でＨ−９／IIIＢ細胞による激しいＨＩＶ−１の産生を顕著に阻害した。一方、高濃度のＧＳＨやＮＡＣでもウイルスの発現は変化しなかった（図３）。細胞の生存率は、かかるγ−ＧＣＥ処置によっても、いずれの投与量でも有意な影響はない（＞８６％）。４００μＭにおいてのみ（図２Ｂにおいて示されているように）細胞増殖の遅延が観察されたが、２００μＭでは見られなかった（データは示されていない）。これらの結果は、活発かつ継続的なＨＩＶ−１の産生に対するＧＳＨプロドラッグとしてのγ−ＧＣＥの有効性を低濃度においても示すものである。
実施例４ 急性ＨＩＶ−１感染のγ−ＧＣＥによる阻害
もし、γ−ＧＣＥがＨＩＶ−１産生細胞を有効に除去するのであれば、急性の感染時にＨＩＶ−１が細胞の全集団に拡散するのを予防することが予測される。この仮説を実証すべく、急性感染試験が実施された。
これらの実験のために、Ｈ−９／IIIＢ分離株を使う代わりに、特定のウイルスの附属遺伝子とその翻訳産物を欠いており、そのあるものは感染の初期相を変化させることがわかっている、ＨＩＶ−１のＮＬ４−３株（J. Virol. 1986; 59: 284-291）を用意した。
ＨＩＶ−１ＮＬ４−３株のウイルスの保存株を調製し、以前に記述されたようにタイターを測定した（Hum Gene Ther 1995; 6: 1561-1571）。Ｈ−９細胞（３×１０5細胞）を、各種の濃度のγ−ＧＣＥとともに、またはそれを加えずに、１ｍｌの増殖培地中に懸濁し、２４ウェルの組織培養プレートのチャンバーに播き込んだ。３０ｐｇのＨＩＶ−１ｐ２４抗原を含むウイルス懸濁液を、最初の感染のために各チャンバーに添加した。感染は３７℃で一夜実施され、その後細胞はＰＢＳで一回、さらに増殖培地で一回洗浄された。最後の洗浄の上清は、０日の時点のものとして保存された。洗浄された細胞は、対応する培地に再懸濁され、３７℃でさらに培養を続けた。３日目に一回、細胞計数とＨＩＶ−１ｐ２４抗原定量のために、細胞懸濁液および培養上清が採取された。細胞増殖、生存率、およびウイルス産生の測定は、すでに述べたように実施した。採取の日には、各ウェルに２００μｌの細胞懸濁液が残され、細胞増殖を支持するために、対応する濃度のγ−ＧＣＥを含む８００μｌの新鮮な培地が添加された。ただし、１８日目には細胞懸濁液４００μｌが残され、６００μｌの培地が各ウェルに添加された。したがって、各時点の細胞数は、細胞の継代数を考慮し、集積された希釈倍率に基づいて定量された。
γ−ＧＣＥがない場合には、Ｈ−９細胞に感染後１２−１５日に、ウイルス産生の噴出の引き金がひかれる。一方、４００−８００μＭのγ−ＧＣＥの存在下では、急性の感染は顕著には阻害されなかったが、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥの場合には、感染後２１日間にわたり完全にＨＩＶ−１の増殖を阻止した（図５、パネルＣ）。全実験を通じ、１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下の細胞は活発に増殖を続け、高い生存率を保った。一方、大量のＨＩＶ−１を産生している対照の細胞の増殖については、増殖阻害（図５、パネルＡ）、および細胞死が認められた（図５、パネルＢ）。１５日まで、およびその後においても、活発なＨＩＶ−１産生をともなうすべての対照細胞培養では合胞体形成が顕著であった。１．６ｍＭのγ−ＧＣＥ存在下では、培養中に顕著な合胞体形成は観察されなかった（データは示していない）。
実施例５ γ−ＧＣＥによるＨＩＶ−１の直接不活性化
これらの急性ＨＩＶ−１感染試験の結果はもう一つの可能性を高めた。すなわち、γ−ＧＣＥは感染過程の前段階または感染過程で、ＨＩＶ−１の感染性を不活性化するかもしれないということである。かかるγ−ＧＣＥの不感染化効果の検討のために、我々はもう一つの系統の実験を計画し、実施した。
６ｎｇのＨＩＶ−１ｐ２４抗原を含むＨＩＶ−１ウイルスの保存株（ＮＬ４−３）を、γ−ＧＣＥの存在下もしくは非存在下で、２０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ中で４時間、３７℃で前処理した。その後、前処理したそれぞれのウイルス懸濁液を１０ｍｌ用い、γ−ＧＣＥのない１ｍｌの細胞懸濁液で、前述したのと同様な方法で、Ｈ９細胞の急性感染を行った。全過程を通じてγ−ＧＣＥを添加することなしに、前述したのと同様な手順に従い、培養細胞のサンプリングと維持も行った。
驚くべきことに、１．２５ｍＭまたは２．５ｍＭでの４時間のγ−ＧＣＥ処理により、ＨＩＶ−１の感染性は喪失し、感染後１５日においてもウイルス産生を起こさなかった。最低の濃度（６２５μＭ）でさえも、γ−ＧＣＥはＨ−９細胞でのＨＩＶ−１増殖をある程度遅延させた。しかしながら、同一濃度でのγ−ＧＣＥによる１時間の前処理では、顕著なウイルス感染性に対する阻害を示さなかった（データは示していない）。これらのデータはＨＩＶ−１粒子に対するγ−ＧＣＥの直接的な不活性化効果を示し、おそらくはそれが急性のＨＩＶ−１感染実験において観察された阻害効果に関わっているのであろう。
Claims (7)
- 式（Ｉ）
（式中のＲは炭素原子１−１０個の直鎖状、分岐状、もしくは環状の炭化水素基、または芳香族基で置換された炭素原子１−５個の直鎖状もしくは分岐状の炭化水素基である。）
で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステル化合物または式（Ｉ）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエステルの２分子間の脱水素によって得られる酸化ダイマーを有効成分として含有する、哺乳動物のＨＩＶ感染の予防もしくは治療剤。 - Ｒが炭素原子数１−１０のアルキル基である請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
- Ｒがエチル基である請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
- 哺乳動物がヒトである請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
- 該ＨＩＶ感染が新規のＨＩＶ感染である請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
- 該ＨＩＶ感染が無症状のＨＩＶ感染である請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
- 該ＨＩＶ感染がＡＩＤＳを伴うＨＩＶ感染である請求の範囲第１項記載の予防もしくは治療剤。
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